Procédures modérées

Jusqu'à sept prélèvements sanguins en vingt-quatre heures et sept anesthésies par animal : 50 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent les composés par gavage, injection intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse caudale ou dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, et peuvent être hébergées en cage métabolique. Le porteur annonce qu'aucune dégradation de leur état de santé n'est attendue, tout en listant les effets non prédictibles possibles, perte de poids, hypothermie ou hyperthermie, comportement anormal, vocalisations. L'objet réel est de mesurer où va une molécule dans le corps avant une première administration humaine, à raison de 580 études par an, un rythme que le RNT chiffre sans le justifier.

Objectifs

L’objectif du projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques et/ou les concentrations tissulaires d’entités thérapeutiques chimiques ou biologiques après administration chez la souris. Dans la recherche préclinique et la recherche de candidats, ces paramètres sont essentiels pour la sélection et l’évaluation des candidats médicaments. Les entités testées sont préalablement analysées lors de tests in-vitro. Une première sélection est ainsi réalisée pour n’administrer aux animaux que des entités avec des caractéristiques favorables en terme pharmacocinétique. Ces études préliminaires permettent d’objectiver les processus d’absorption, de dégradation, de distribution et d’élimination de chaque entité afin de prédire le comportement de ces entités chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une stratégie globale de caractérisation de nouveaux composés en vue de la première administration chez l’homme, c’est donc une étape clé dans le cycle de vie de tout médicament en développement. Nous estimons réaliser 580 études par an répartie sur les trois procédures décrites dans le projet, soit 50600 animaux sur cinq ans.

Bénéfices attendus

A court terme, les expérimentations de ce projet permettront de déterminer les paramètres essentiels pour l’avancée du développement préclinique pour les entités testées. Ces résultats permettront de sélectionner les candidats potentiels ainsi que les doses et les voies d’administration les plus adaptées. A long terme, les entités sélectionnées constitueront la base pour un traitement applicable à l'Homme.

Procédures

Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : Durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques o par voir orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique), intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée: Durée 30 secondes sur animaux vigiles. Unique ou répétée max 2 ou 3 fois par jour selon la voie o par voie intraveineuse à la veine caudale sur animal vigile: Durée 30 secondes. Unique ou répétée max 2 fois par jour o par voie intraveineuse au sinus rétro orbitale : Durée 30 secondes sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Maximum deux administrations par sinus. Cette technique ne sera utilisée que très occasionnellement et seulement sur justification scientifique. Prélèvements de sang o via la veine caudale en microsampling: Durée 30 secondes sur animal vigile. Maximum 7 fois sur 24h. o via ponction cardiaque en phase terminale : Durée 1 minute sous anesthésie générale gazeuse ou chimique. Les volumes et la fréquence des prélèvements seront selon les critères de la consigne en vigueur. Les volumes seront généralement de 20 à 50 µL. Le volume total prélevé n'excédera pas 7.5% du volume estimé de sang total de l'animal sur une période de 24 heures. Des périodes de récupération seront mises en place entre les prélèvements. • Anesthésie pour imagerie : anesthésie gazeuse de 30 minutes maximum ; 7 anesthésies maximum par animal sur la durée de l'étude.

Impact sur les animaux

Aucune dégradation de l'état de santé de l'animal n’est attendue par l’application des procédures de ce projet. Toutefois dans ces phases précoces de développement, des effets secondaires non prédictibles peuvent survenir : perte de poids, hypo- ou hyperthermie, comportement anormal (animaux hypo ou hyperactifs), vocalisations. Tout effet observé sera noté selon une grille spécifique et donnera lieu à une action adaptée à la gravité des signes ; les points-limite anticipés permettent de limiter la nuisance à un niveau de gravité modéré au maximum. Au cours des études, les animaux peuvent être soumis à une ou plusieurs anesthésie(s), des administrations et des prélèvements sanguins, ou un hébergement en cage à métabolisme, qui peuvent induire un certain stress (manipulation de l'animal, administration orale, cage métabolique) ou une douleur passagère lié au geste lui-même (injection de l'administration ou réalisation du prélèvement); ces nuisances sont de niveau léger, à modéré par leur cumul.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures. D’une part, les études nécessitant des prélèvements d’organes ne permettent pas une réutilisation D’autre part, le but de ces études étant de générer les premières données PK sur les composés étudiés, il n’est pas possible d’anticiper une période de wash-out permettant une réutilisation. De plus, l’homogénéité d’âge des animaux utilisés en étude est nécessaire pour limiter la variabilité et ainsi augmenter la fiabilité des résultats et la comparaison entre études appartenant à un même projet scientifique.

Remplacement

De nombreux tests in vitro existent et permettent de sélectionner les entités d'intérêt uniquement sur la base de leurs caractéristiques pharmacocinétiques, notamment l'absorption et le métabolisme. Il n'existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de déterminer l'ensemble des propriétés pharmacocinétiques d'un composé d'intérêt. Seul un modèle animal peut permettre de caractériser ces entités et discriminer celles qui pourront être envisagées pour un traitement chez l’homme.

Réduction

Les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d'interaction du composé avec la cible d'intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). Cette approche préalable permet de réduire fortement le nombre d’entités à tester. La forte sensibilité des méthodes analytiques permet la mise en œuvre de techniques de prélèvements sanguins de volumes réduits autorisant la réalisation de prélèvements répétés sur un même animal. Il est ainsi possible d’obtenir une cinétique complète à partir d’un seul animal. Cela augmente aussi la robustesse des données obtenues pouvant mettre en évidence une éventuelle variabilité inter-individuelle. Le nombre d’animaux s’appuie sur des recommandations internationales dans le domaine de la pharmacocinétique et des publications scientifiques (European Medicines Agency). Autant que possible, il est réduit au minimum scientifique de 3 animaux par groupe pour les études de pharmacocinétique et 5 animaux par groupe pour les études de biodistribution par imagerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés conformément aux standards réglementaires de la directive n°2010/63/UE. Ils seront groupés dans des cages contenant de l'enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Les animaux feront l'objet d'une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Les locaux d'hébergement font l'objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d'hébergement et d'animaux sentinelles. Des soins adaptés seront donnés aux animaux affectés, par ou sous l'autorité du vétérinaire désigné ou mis à mort selon les recommandations définies dans la consigne en vigueur. Un plan d'action sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile. Les procédures potentiellement douloureuses ou source d'inconfort ou de stress se feront sous anesthésie gazeuse. Le nombre de manipulations sur l'animal sera réduit au strict nécessaire. Le projet sera mis en œuvre par du personnel qualifié et habilité conformément à la réglementation en vigueur. De plus, les procédures sont fortement améliorées grâce à l’organisation de formations complémentaires pour le personnel en relation directe avec les animaux sur les techniques d’administrations et de prélèvements de liquides biologiques.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus communément utilisées lors d’essais de pharmacocinétique préclinique. De nombreuses publications le démontrent comme suit: • Surgical and pharmacological animal models used in drug metabolism and pharmacokinetics, K.A. Landskroner, P. Hess, and A. Treiber, Xenobiotica, 2011; 41(8): 687–700. • Experimental models for predicting drug absorption and metabolism - Saeed Alqahtani, Loqman A Mohamed & Amal Kaddoumi, Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. (2013) 9(10):1241-1254. Le choix de l’espèce est dicté par différents impératifs : - techniques : quantités de composé disponibles - scientifiques : comparaison de résultats pharmacodynamiques et pharmacocinétiques chez la même espèce animale, homologie de récepteur de l’espèce choisie avec le récepteur humain. Le stade adulte sera utilisé par défaut (à partir de 7 semaines) car c’est celui qui permet de déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l’espèce pour une entité donnée. Toutefois, il sera possible d’utiliser des animaux à un stade plus précoce (âgés de 15 jours) pour établir des données d’exposition spécifique à un modèle ou une cible thérapeutique.

Pour savoir si la présence d'un congénère modifie la consommation d'héroïne, 1 910 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit au moins une chirurgie sous anesthésie générale, injection intracérébrale d'une heure trente, implantation d'électrodes ou de fibres optiques de trois heures, pose de cathéter d'une heure, puis porte un capuchon de ciment dentaire sur le crâne. Une partie s'auto-administre l'héroïne, d'autres sont placés en position d'observateurs. Le porteur indique que la surconsommation peut conduire à une overdose et à la mort, que les rats sont isolés après l'opération et que leur alimentation reste contrôlée pour les garder motivés. Il justifie le recours au rat par le fait qu'il "s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l'humain" et par l'interdiction, en France, de fournir des drogues d'abus dans une expérimentation humaine.

Objectifs

Le rôle du contexte social dans la consommation de drogue n’est pas bien déterminé. Chez le rat, la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques, que les rats émettent pour communiquer les uns avec les autres, diminue la consommation de cocaïne, de même que la présence physique d’un congénère avec lequel il peut interagir. Cette diminution est d’autant plus forte lorsque le congénère est inconnu plutôt que familier (c’est à dire le partenaire de cage). Ces effets peuvent varier en fonction du type de drogue ou de son mode d’administration. On observe ainsi à l’opposé une augmentation de la consommation d’alcool chez le rat mis en présence d’un congénère. Ce projet vise à évaluer l’impact de ces contextes sociaux sur la consommation d’un autre type de drogue, l’héroïne. Le noyau subthalamique (NST) est impliqué dans les comportements de recherche et consommation de drogue et son implication dans l’influence de la présence d’un congénère ou la diffusion d’un enregistrement de vocalises ultrasoniques a été mis en évidence. Ses connections avec d’autres structures cérébrales, pourraient, elles aussi, être impliquées dans ces processus. Le but de ce projet est donc de caractériser les réseaux cérébraux liés au NST responsables des modulations de la prise d’héroïne dans les contextes sociaux décrits précédemment. Nous utiliserons différentes techniques afin d’évaluer sélectivement le rôle de chaque connexion. Notre objectif est également de mettre en évidence d’éventuelles différences en fonction du sexe des individus, en étudiant à la fois des rats mâles et femelles. Dans son ensemble, ce travail conduira à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques d’un effet du contexte social, déterminant pour la réduction des risques de consommation de drogues.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est de découvrir quels sont les substrats cellulaires et moléculaires du NST et de son réseau pour mieux comprendre les processus émotionnels en lien ou non avec la prise de drogue, notamment l’effet du contexte social, qui peut être protecteur ou non en fonction de la drogue consommée. Pour cela, nous utiliserons la présence d’un observateur, qui permet une approche plus écologique et plus réaliste de la consommation de drogue chez l'humain. L’identité du congénère variera en fonction de sa familiarité, de son sexe et de son historique de consommation afin de déterminer l’impact de chaque paramètre social sur la consommation d’héroïne. En plus d’améliorer les modèles animaux d’addiction, ce projet générera des résultats à fort impact translationnel, apportant de nouvelles perspectives sur la physiopathologie de l’addiction, des potentiels effets réducteurs de risques des interactions sociales et confirmera le potentiel de la manipulation du NST pour le traitement de cette pathologie. Il permettra aussi de mieux comprendre les potentiels effets secondaires de la manipulation du NST. De plus, il permettra de mettre en évidence le rôle du NST dans la motivation et les comportements sociaux, et d’appréhender de nouvelles bases neurales de certains troubles liés, comme celui du spectre autistique.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet seront soumis au moins une fois à un acte chirurgical, réalisée sous anesthésie générale. Ces interventions peuvent être de différents types : injection intracérébrale (1h30), implantation d’électrodes ou de fibres optiques (3h), pose de cathéter (1h).

Impact sur les animaux

* Les nuisances attendues sont les conséquences « classiques » à court terme des interventions chirurgicales. Durant les jours suivant l’opération, les animaux peuvent perdre un peu de poids, présenter une activité réduite. Dans le cas de l’implantation de fibres optiques, de même que celle des électrodes, les animaux peuvent ressentir une gêne due au poids du chapeau protecteur fait en ciment dentaire. Plus rarement, les animaux peuvent présenter un saignement au niveau des cicatrices. En général, ces nuisances s’estompent en 2-3 jours. Les animaux sont isolés durant cette période. * Un autre type de nuisance, pouvant engendrer du stress, est l’appariement fait entre les animaux de façon aléatoire à la réception des individus. Lorsque l’alimentation devient contrôlée (les animaux ne sont pas restreints, mais pas ad libitum), un sujet très dominant peut empêcher son partenaire de cage de s’alimenter correctement. * Les matériaux utilisés pour fabriquer et maintenir les cathéters ou fibres optiques ou électrodes, peuvent parfois engendrer des ‘bagarres’ entre partenaires de cage. En effet, les éléments en plastique, plus ou moins mous, les constituant, peuvent être ‘rongés’ par l’un des rats, provoquant ainsi une gêne et/ou un stress chez l’autre individu * La consommation d’héroïne n’induit pas d’augmentation générale de l’activité de l’animal, mais au contraire peut avoir un effet sédatif. Ces effets diminuent rapidement (environ 1h) après la dernière dose auto-administrée. * La surconsommation de drogue peut conduire à une overdose et la mort de l’animal. * Après une perte de contrôle de la consommation de drogue (protocole d’escalade de la consommation), l’animal n’ayant pas accès ad-libitum à la drogue, il peut présenter des symptômes de manque. * Les injections éventuelles d’analgésiant et d’anesthésique, de même que l’entretien du cathéter peuvent également engendrer du stress.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort après les études comportementales afin de vérifier que les injections des virus et implantations de fibres optiques et le cas échéant, d’électrodes d’enregistrement aient été correctement localisées. Cela est nécessaire afin de confirmer que les effets observés sur les comportements des rats soient liés aux structures cérébrales ciblées.

Remplacement

Ce projet a pour but d'étudier l'état fonctionnel d'un réseau cérébral dans une pathologie précise. L'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigile et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, ne pouvant être remplacé pour ce genre d’étude. Le recours à des méthodes invasives exclut de fait les études chez le sujet humain, d’autant qu’il est interdit en France de fournir des drogues d’abus dans le cadre d’expérimentation humaine.

Réduction

L’expertise acquise dans l’équipe sur ce type d’expérience nous a permis de fixer a priori le nombre d’animaux nécessaires. Par expérience, 10 animaux sont nécessaires par condition testée pour permettre de mettre en évidence un effet comportemental dans les protocoles d'auto-administration de drogues ; ce nombre prenant en compte l’exclusion de certains individus suite à d’éventuels problèmes inhérents à ce type d’étude (infection, cathéter bouché etc…). Pour les études combinant auto-administration et optogénétique et electrophysiologiques, 15 animaux par condition testée sont nécessaires pour anticiper de possibles mauvais placements des fibres ou électrodes. Pour la photométrie, 5 animaux par groupes sont suffisants. Les rats observateurs naïfs à la drogue pourront venir d’autres protocoles de l’équipe après accord de la SBEA (Structures chargées du Bien Etre des Animaux) afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaire. Les rats observateurs non naïfs à la drogue seront les mêmes que les rats sujets qui s’auto-administreront la drogue.

Raffinement

Les animaux auront une période d'acclimatation à l'animalerie ainsi qu'aux expérimentateurs avant le début des expérimentations afin de réduire au maximum le stress potentiel. La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques. Une grille de score sera utilisée systématiquement en période post-opératoire, ainsi que tout au long de l’expérimentation pour le suivi du bien-être des animaux, afin de surveiller au mieux les animaux et prendre les décisions les plus adaptées sans attendre. La souffrance des animaux sera limitée au maximum par une surveillance quotidienne. Les animaux seront hébergés si possible par 2 dans leur cage à l'animalerie, avec accès ad libitum à l'eau. La nourriture sera contrôlée afin de garder les animaux motivés. Les cages sont enrichies grâce à la présence d'objets divers et variés (bâtonnets en bois, rouleau en carton…changés régulièrement afin de diversifier au maximum l'environnement des animaux). La gestion de la douleur pendant et après les procédures douloureuses et les expérimentations est toujours prise en compte par des personnels compétents et sera améliorée si besoin par injection d'analgésiques spécifiques.

Choix des espèces

Le rat est un modèle animal de choix pour l'étude de l'addiction. En effet, les modèles comportementaux de référence sont connus et maîtrisés, et il existe de nombreux tests comportementaux permettant de tester les différents symptômes de la pathologie. Par ailleurs, l'étude des comportements de consommation, qu'ils soient physiologiques ou pathologiques, requiert par définition que l'animal soit vigil et libre de ses mouvements. Le rongeur, et plus particulièrement le rat, est donc un modèle de choix, puisqu'il s'auto-administre l'ensemble des agents toxicologiques consommés par l’humain. De plus le rat est un animal social dont le comportement se rapproche de l’humain, avec mise en place d’un système hiérarchique et organisé, un communication visuelle, olfactive, auditive et tactile. C’est un bon modèle d’étude du comportement social. Afin d'améliorer la précision de nos chirurgies, et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous réaliserons nos expériences chez des rats adultes (>7-8 semaines), un stade du développement cérébral en adéquation avec notre question scientifique.

56 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un capteur cardiaque implanté sous anesthésie, puis subit échocardiographies, mesures de pression artérielle et prélèvements sanguins répétés, et vingt-quatre d'entre eux une ligature de l'artère coronaire gauche que le porteur reconnaît potentiellement létale. L'intoxication par la ciguatoxine peut provoquer diarrhées, troubles neurologiques et cardiovasculaires, les rats perdant plus de 15 % de leur poids étant alors mis à mort. Le porteur revendique de vouloir "exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole" et prévoit le prélèvement des tissus cardiaques, neuronaux, adipeux et musculaires après la mise à mort.

Objectifs

La ciguatera (CG) est une maladie induite par les ciguatoxines (CTXs), naturellement prduites par certaines algues (microscopiques). Elles sont responsables d'intoxication alimenatire non bactérienne aux fruits de mer la plus courante dans le monde. L'explosion du trafic maritime, s'accompagnant de l'augmentation du volume des eaux de ballast transportées et mélangées, contribue considérablement à la propagation du plancton des zones tropicales contaminées, plus particulièrement d'Asie et d'Asie du Sud-Est, vers les côtes tempérées sujettes au réchauffement climatique. La CG, pourrait largement se propager, nottamment en méditérranée et prendre la forme d'une pandémie. L'absence de tests de détection rapide augmente l’exposition à la CG. De plus, aucun traitement ciblé n'est actuellement disponible en raison d'un manque d'identification précise des mécanismes moléculaires, physiologiques et pathologiques associés. La CG se manifeste par de multiples symptômes indéfinis (gastro-intestinaux, cardiaques, neuronaux, cutanés et inflammatoires), accentués en cas d'antécédents cliniques. Plusieurs cibles de canaux ioniques (canaux sodiques, potassiques et calciques), protéines essentielles au bon fonctionnement des cellules sont suspectées dans la CG. Les CTXs seraient capables de moduler l’activité de ces protéines canal pour modifier, notamment, les flux ioniques responsables du fonctionnement cardiaque et neuronal. Notre objectif est de caractériser le mode d’action et conséquences des CTXs sur la fonction cardiaque/vasculaire et le système nerveux in vivo. Nous souhaitons savoir si les effets liés à une intoxication aux CTXs et nottament à la Ciguatoxine 1B (CTX1B), peuvent être modulés par différents traitements préventifs et curatifs. Dans un second temps, ceci pourrait permettre de déterminer de nouveaux outils de diagnostic de la CG ainsi que de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser in vivo la nature des effets induits par une intoxication à la Ciguatoxine 1B (CTX1B). En particulier, nous determinerons la nature des altérations cardiaques (structurelle et/ou fonctionnelle) et vasculaires ainsi que le rôle des atteintes du système nerveux autonome dans ces conséquences délétères. A partir ders pélèvements sanguins, nous determinerons si certains marqueurs sanguins sont augmentés/diminués après une contamination à la CTX1B. De récentes études cliniques ont montrées une augmentation de lactate dans le sang évoquant une hypoxie tissulaire en rapport avec une insuffisance cardiovasculaire. Le suivi ECG nous permettra de voir si la CTX1B module le rythme cardiaque chez les sujets contaminés. Les prélèvements post-mortem permettrons de faire une exploration plus approfondie des tissus cardiaques et neuronaux, afin de voir les effets directs de la CTX1B, mais aussi sur les tissus adipeux et du muscle squeletiques pour détecter le site de stockage de la CTX1B dans l’organisme.

Procédures

La totalité des animaux (soit 56 animaux) seront tous soumis aux mêmes gestes techniques : échocardiographie (environ 15 min/ animal), électrocardiogramme (ECG, recueil des données pendant 24h/animal de façon non invasive) par télémétrie, prélèvement de sang (quelques secondes/animal), mesure non invasive de la pression artérielle (environ 15 minutes/animal). Ces gestes techniques seront chacun réalisés à 3 reprises sur la durée du protocole expérimental (19 jours pour 32 animaux et 24 jours pour 24 animaux). Vingt-quatre animaux seront soumis à ces gestes techniques à 4 reprises ainsi qu'à une chirurgie via la ligature de l'artère coronaire gauche. Il existe un risque que cette chirurgie nécessaire à l'induction d'une sensibilisation aux arythmies cardiaques soit léthale. Cette chirurgie, d'environ 1 heure/ animal, nécessitera une anesthésie générale des animaux. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire. De plus, la totalité des animaux sera soumise à une chirurgie nécessitant une anesthésie générale pour l'implantation du capteur permettant le recueil des paramètres ECG d'une durée d'environ 25 min/ animal. Des soins particuliers leur seront administrés en pré et post-opératoire afin d'éviter toute douleur de l'animal.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront d'une part ressentir les symptômes classiques de la CG chez l’Homme, tels que : - Troubles gastro intestinaux (48-72h post infection) - Troubles neurologiques (48-72h post infection) - Troubles cardiovasculaires. (48-72h post infection). Ces troubles, notamment gastro intestinaux, peuvent induire des phénomènes de diarrhées pouvant mener à une perte de poids de l’animal. Si une perte de poids > 15% du poids initial est constatée, alors le point limite de l’expérimentation sera atteint et nécessitera la mise à mort de l’animal. Les groupes d'animaux sensibilisés pour les arythmies cardiaques via la ligature d'une artère coronaire ont un risque élevée de mortalité inhérent à la procédure. Le projet necessite l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique uniquement pendant l'enregistrement de l'ECG (24h/ acquisition).

Devenir

A la fin des protocoles expérimentaux tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer des prélèvements post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires).

Remplacement

La CG est une pathologie syndromique incluant de nombreux effets systémiques. Il n’existe pour l'heure pas de modèle in vitro sur lequel ont été relevés les effets cardiaques, effets vasculaires et effets sur le système nerveux autonome grâce à un modèle capable de mimer les conditions physiopathologiques induites par la Ciguatoxines 1B (CTX1B). .

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux via l'utilisation d'outils statistiques et en couplant plusieurs approches (echocardiographie, ECG par télémétrie, prélèvement de sang, mesure non invasive de pression arterielle), compatibles entre elles, et effectuables sur un même animal. Un suivi dans le temps sera également éffctué. L'ensemble des animaux sera prélevé post-mortem (tissus cardiaques, neuronaux, adipeux, musculaires) pour exploiter au maximum chaque animal inclu dans le protocole.

Raffinement

Notre objectif est de réduire au strict minimum la détresse imposée aux animaux. Les rats seront hébergés par groupes de 3 par cages dans un environnement calme, sous contrôle de luminosité, de l'hygrométrie et de la température, de manière appropriée avec un enrichissement du milieu (barre de bois, cabane, carré de ouate) permettant de répondre à leurs besoins physiques et comportementaux. Après chirurgie pour mise des télétransmetteurs, les animaux seront placés en couveuse thermorégulée et surveillés pendant un minimum de 3 heures. Les animaux seront surveillés quotidiennement et les points limites établis dans ce projets seront appliqués. Nous allons fournir les soins per- et post-opératoires appropriés via l'administrations d'anesthésiques et d'analgésiques. Nous évaluerons entre autres les critères de souffrance animale communément utilisés (rythme cardio- respiratoire, reprise de mouvement, un état de prostration, l’hydratation). En cas de détresse anormale, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, après analgésie.

Choix des espèces

Le modèle de rat Wistar est un modèle largement caractérisé sur le plan cardio-vasculaire, dont un nombre important de travaux est décrit dans la littérature (inculant ceux du laboratoire). La physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme (régulations et structure morpho-fonctionnelle, régulation par le système nerveux autonome). Le modèle rat a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo selon les mêmes techniques exploratoires employées chez l’homme. Les animaux entreront dans le protocole à un stade mature pour éviter tout problème lié au développement.

240 porcs en croissance-finition vont être utilisés, chacun exposé à deux vagues de chaleur simulées de quatre jours à 32 °C, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent deux prises de sang sous contention, six mesures d'épaisseur de lard dorsal à l'échographe et des prises de température, dans une salle maintenue au-delà de leur zone de confort thermique. L'objectif déclaré est de valider un outil d'aide à la décision alimentaire censé atténuer les effets des canicules sur les performances, le bien-être des animaux non-humains et le revenu des éleveurs. Aucun n'est tué à l'issue du protocole. Les 240 rejoignent le parcours d'élevage puis l'abattoir, leur destination étant la consommation.

Objectifs

En Bretagne, la majorité des bâtiments d’élevages de porcs sont seulement équipés de systèmes de ventilation (statiques ou dynamiques) qui peuvent devenir insuffisants pour dissiper la chaleur produite par les animaux en périodes estivales et notamment pendant les vagues de chaleur. Ces épisodes touchent en particulier les stades physiologiques ayant un niveau métabolique élevé (truies en maternité, porcs en finition) avec des effets importants (immédiats et retardés) sur le bien-être et les performances des animaux. Les effets d’une exposition à un stress thermique de type vague de chaleur diffèrent de manière importante par rapport aux effets d’un stress chronique. En effet, les réponses physiologiques mises en place pendant l’exposition courte à la chaleur a des conséquences à long terme sur le reste de la vie productive des animaux une fois le challenge thermique terminé. Ces effets sont particulièrement visibles lorsque les animaux sont exposés à des vagues de chaleur caniculaires, i.e., évènements pendant lesquels la température reste élevée pendant la nuit. Il est ainsi nécessaire d’adapter la conduite alimentaire avant et pendant la vague de chaleur pour limiter les effets à long terme sur les le bien-être, les performances des animaux et le revenu des éleveurs. A l’heure actuelle, les solutions nutritionnelles pour lutter contre les effets de la chaleur (augmentation de la densité nutritionnelle, supplémentation avec des additifs fonctionnels, ...) existent mais sont adaptés à des exposition à la chaleur longues (exposition chronique) et restent relativement coûteuses dans le contexte Breton. Par ailleurs, les effets de la chaleur varient d’un individu à l’autre . En pratique, cette variation interindividuelle implique qu’au sein d’une même bande d’animaux, une individualisation de l’application des stratégies nutritionnelles pourrait permettre d’améliorer le rapport coût/bénéfice de ces options d’adaptation. L'objectif de ce projet est de tester chez le porc en croissance des stratégies d'alimentation individualisées pour lutter contre les effets des vagues de chaleur estivales. Notre hypothèse est que la prise en compte des différences inter-individuelles de tolérance à la chaleur chez le porc permet d'améliorer l'efficacité des stratégies nutritionnelles appliquées lors d’une exposition au chaud.

Bénéfices attendus

Le projet va permettre de faire la preuve de concept qu'une alimentation individualisée des porcs peut permettre d'attenuer les effets des vagues de chaleur estivales sur leur performance, leur bien être et leur santé.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à : - des prises de sang (2 fois au maximum par animal, contention d'une durée maximale de 2 minutes), - des mesures d'épaisseur de lard dorsal par échographe (6 fois par animal, maintien en cage de 5 minutes) - des prises de température (variable selon les animaux; uniquement si l'animal à un rythme des ventilation pulmonaires dépasse une valeur anormale). Les animaux seront exposés à un challenge thermique expérimental (4 jours à 32°C) pour simuler les vagues de chaleur estivales observées actuellement dans les élevages de porcs.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus du projet sur les animaux sont les suivants : - 1/ l'exposition à une température ambiante (32°C) supérieure à la limite supérieure de la zone de confort thermique des animaux pendant 2 périodes de 4 jours consécutifs pour mimer des vagues de chaleur estivales. Conformément aux objectifs du projet, cette exposition à 32°C va induire un stress thermique pour l'animal. - 2/ la contention des animaux pour 2 prises de sang/animal (2 min max) et 6 mesures d'épaisseur de lard/animal (5 min max) par du personnel compétent formé sur l'espèce porcine. Cette contention va momentanément limiter la possibilité pour l'animal d'exprimer un comportement normal de son espèce

Devenir

Les animaux sont destinés à la consommation. Les animaux suivent le parcours d’élevage.

Remplacement

- Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses de thermorégulation (le porc ne possède pas de glandes sudoripares actives). - Nous avons choisi de travailler sur le porc en croissance finition car ce stade représente la plus grande partie des effectifs animaux au sein d'un élevage de porc et est connu pour être très sensible à la chaleur (en particulier en finition) - Nous avons choisi de travailler sur des animaux croisés et à la fois sur les mâles entiers et les femelles pour produire des résultats compatibles avec les populations en production.

Réduction

Le nombre d’animaux (n= 240) et le dispositif expérimental mis en place ont été déterminés sur la base d’essais antérieurs et permettent d’atteindre le niveau de précision souhaité pour évaluer les effets de l’alimentation malgré la forte variabilité interindividuelle généralement observée dans ce type d'étude L'effectif a été calculé en prenant en compte qu'une partie des porcs (40 porcs/répétition) ne sera finalement pas retenue pour l'essai à l'issue de la période d'adaptation.

Raffinement

Cette expérimentation est réalisée dans une salle avec des équipements (station d'alimentation automatique, système de pesée automatique, abreuvoirs connectés) permettant de mesurer les performances individuelles d'animaux élevés en un seul groupe en conditions proches de celles rencontrées pratiquement en élevage. L’ensemble des procédures sera réalisé par du personnel expérimenté et en respectant des points limites afin de réduire la souffrance et la douleur des animaux. Les mesures de raffinement consisteront à réduire le plus possible l’intensité et la durée de la douleur ou du stress que peuvent engendrer les interventions. La durée des contentions des porcs sera limitée à 5 minutes pour les mesures d'épaisseur de lard . Les prises de sang seront stoppées au bout de 2 minutes

Choix des espèces

La cible de l'étude est le porc en croissance-finition. Dans notre essai, nous allons donc utiliser des animaux croisés Pietrain x (Large-White x Landrace), un croisement très répandu dans les élevages commerciaux français. Les animaux utilisés sont des porcs en croissance jusqu'à la phase de finition (soit de 25 à 115 kg). Ce stade physiologique est celui pour lequel l'outil d'aide à la décision a été développé et il faut donc utiliser le type d'animaux cible dans l'expérimentation.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune subissant deux chirurgies du crâne puis cinq à six semaines dans une cage divisée par une cloison de plexiglas, une souris par compartiment. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. La première chirurgie dure environ 45 minutes, la seconde de 90 à 120 minutes, et une sédation d'une heure sert à fixer une prothèse sur la tête, que l'animal apprend ensuite à porter au cours de séances de deux à six minutes avant une tâche comportementale que le porteur qualifie de légèrement désagréable. Le bénéfice annoncé, repérer un oubli anormal comme marqueur précoce de la maladie d'Alzheimer, reste une piste pour des travaux ultérieurs, quand la séparation des congénères et les deux ouvertures du crâne sont, elles, programmées.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est une affection progressive et mortelle, représentant la maladie neurodégénérative la plus répandue. Un diagnostic précoce s'avère crucial dans la recherche préclinique et clinique sur la MA, car il ouvre une fenêtre thérapeutique opportune pour initier des interventions avant l'installation d'un déclin cognitif sévère. L'accumulation de la protéine bêta-amyloïde dans la partie frontale du cerveau est associée à une perte de mémoire rapide, constituant un symptôme précoce de la MA détectable par des évaluations cognitives expérimentales et cliniques bien avant l'apparition d'une démence sévère. En effet, les déficits d'apprentissage et de mémoire sont parmi les premiers signes signalés par les proches des patients. Fondée sur ces découvertes et sur des données préliminaires obtenues dans notre laboratoire, qui indiquent une activité neuronale anormale dans diverses conditions pathologiques, notre étude actuelle vise à explorer les changements des circuits cérébraux liés à l'intégration d'informations nécessaires à la consolidation de la mémoire et à l'oubli.

Bénéfices attendus

Ainsi, l'oubli précoce pourrait constituer une cible potentielle pour des études précliniques visant à prévenir ou retarder l'émergence de formes plus graves de la maladie d'Alzheimer (MA). Nos recherches antérieures et actuelles sur le rôle des modifications de l'excitabilité neuronale dans le processus de formation de la mémoire nous conduisent à proposer une exploration des altérations des circuits du cortex préfrontal en tant que marqueur précoce d'un oubli anormal dans la MA. En se basant sur les données obtenues, nous pourrions identifier des cibles prometteuses pour de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront deux interventions chirurgicales sous anesthésie : la première intervention durera environ 45 minutes ; la deuxième intervention durera de 90 à 120 minutes. Ils subiront également une intervention sous sédation (sans acte invasif, d'une durée d'environ 60 minutes) pour la pose d’une prothèse sur la tête. Après la deuxième intervention chirurgicale et jusqu'à la réalisation des études d'imagerie calcique et de comportement, les animaux seront placés dans des cages collectives séparées en deux zones par une séparation en plexiglas transparent (deux souris par cage, une souris par zone) pendant une période de 5 à 6 semaines. Ils seront progressivement entraînés (lors de séances de durée croissante de 2 à 6 minutes) à accepter la pose d'un objet sur leur tête. Ils effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d’environ 6 minutes en présence de l’appareil d’imagerie (posé sur la tête). Ils seront ré-exposés au même dispositif de comportement le lendemain et 14 jours plus tard (pendant environ 6 minutes) afin d'évaluer leur mémoire.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux interventions chirurgicales : le risque d’inconfort, de douleur, d’infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront endormis une fois de plus, ce qui pose un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale qui est légèrement désagréable et stressante pour l’animal. Celui-ci est entraîné à porter l'appareil d'imagerie sur sa tête, ce qui représente une contrainte pour sa posture. La pose de la prothèse implique également une contrainte pour l'animal et nous oblige à adapter les conditions d'hébergement.

Devenir

Toutes les souris seront euthanisiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la formation et le stockage de la mémoire dans le cerveau et leur changement dans MA. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) qui se prête facilement à la modification de son ADN, iii) possédant un néocortex, la partie la plus récente et la plus évoluée du cortex cérébral chez les mammifères, iv) adapté aux approches expérimentales invasives. En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives si possibles. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent à tous ces critères. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones et leur altération dans MA. De plus, nous étudions le stade précoce de la maladie, lorsque les symptômes n'apparaissent pas nécessairement chez l'homme. Le tissu post-mortem humain n'est pas disponible et les biopsies ne sont pas pratiquées pour cette condition. Les modèles informatiques actuellement disponibles ne permettent pas la modélisation au niveau du cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, le recours à l'animal est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de n'utiliser qu'un nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison, nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. analyse effectuée en petits lots avec une expérience par jour). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire, selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant.

Raffinement

Les mesures de raffinement comprennent observation quotidienne des animaux et vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) en utilisant des critères généraux ainsi que des signes cliniques spécifiques à la manipulation. Les critères pour évaluer la souffrance incluent l'apparence et le comportement général de l'animal. Tout signe de souffrance, de douleur ou de détresse (comme un comportement inhabituel ou un pelage négligé) entraînera une réponse immédiate et adaptée. Cela peut inclure des mesures conservatoires comme isoler temporairement l'animal, administrer du glucose, le réchauffer dans une couveuse ou soigner les blessures en cas de bagarre avec d'autres animaux. Si l'état de l'animal ne s'améliore pas après ces mesures, l'expérimentateur décidera de l'euthanasier si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l'équipe des soigneurs. Les animaux sont manipulés quotidiennement avant les expériences pour réduire leur niveau de détresse. Les conditions d'hébergement sont adaptées en maintenant les animaux dans des cages collectives contenant des enrichissements tels que des tubes en carton et du matériel pour la nidification. Pour intégrer de nouvelles techniques de raffinement, les expérimentateurs reçoivent une formation régulière et consultent des sites éducatifs comme NC3R.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous souhaitons exploiter un modèle impliquant la production d'amyloïde bêta. À ce jour, la souris est la seule espèce mammifère pour laquelle il est possible, de manière routinière, de modifier l'ADN et pour laquelle les modèles créés ont été caractérisés au niveau comportemental et moléculaire. Les souris auront entre 8 et 10 semaines au début des procédures (c'est-à-dire la chirurgie) et entre 14 et 18 semaines au moment du test comportemental. Selon les données précédemment rapportées et nos données préliminaires sur le développement de la pathologie, il s'agit de l'âge auquel les animaux commencent à développer les premiers signes de la maladie avant l'apparition de la maladie grave. Nous voulons étudier la phase précoce qui se situe vers 14-18 semaines d'âge. Les animaux seront utilisés pour un test de comportement qui nécessite l'utilisation d'animaux adultes. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les études publiées et les expériences antérieures dans notre équipe.

Établir le dossier préclinique d'une molécule anticancéreuse avant de premiers essais chez l'humain passe ici par six modèles de cancer colorectal humain greffés sous la peau de souris privées de système immunitaire. 540 souris de cinq à six semaines vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au 56e jour ou plus tôt si un point limite est atteint. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse, puis trois injections dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, sur animal vigile. Le porteur indique que l'efficacité du produit a déjà été validée sur lignées cellulaires "par toutes les techniques pertinentes", et que le passage chez la souris devient "nécessaire" pour l'évaluer sur un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer colorectal est l’un des cancers le plus fréquent dans le monde avec, en 2020, 1,93 millions de nouveaux cas et 916 000 de décès. En France, il constitue le troisième cancer le plus fréquent chez l’homme et le deuxième cancer le plus fréquent chez la femme. La mise en place du programme de dépistage organisé en France permet la prise en charge des patients à un stade précoce et améliore ainsi le pronostic de ces patients. Malgré cela la majorité des patients sont diagnostiqués alors que la maladie est à un stade avancé, diminuant fortement l’espérance de vie des patients, et cela en dépit des avancées thérapeutiques. Récemment, de nouveaux traitements ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire. Le présent projet vise à établir évaluer l’efficacité cette nouvelle molécule dans ces différents modèles de cancer colorectal humain chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration de l’efficacité anti-tumorale d’une nouvelle molécule dans le traitement des cancers colorectaux. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ce produit dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) (durée < 1 minute) - 3 injections intraveineuses (animal vigile) du composé testé ou intrapéritonéales du contrôle positif + contention (durée < 5 minutes)

Impact sur les animaux

- Douleur de courte durée lors de l’injection des cellules tumorales en sous cutanée (quelques secondes maximum) - Injection dans la veine caudale : douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable) - Douleur de courte durée lors de l’injection intrapéritonéale (quelques secondes maximum) - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (quelques minutes maximum) - Perte de poids < 10% et transitoire (moins de 24h) suite à l’injection de notre produit sous forme liposomale - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre produit a été validé sur les lignées cellulaires par toutes les techniques pertinentes pour l’étude de notre produit. Le passage chez la souris, est désormais nécessaire pour évaluer l’effet du produit sur un organisme entier.

Réduction

La procédure sera réalisée sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. La partie mise au point sera réalisée de façon séquentielle afin d’arrêter cette mise au point dès que la prise tumorale sera suffisante.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Les souris seront observées trois fois par semaine en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…), des critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. Lors des manipulations, les souris seront anesthésiées sous vapeur d'Isoflurane. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mise en place des mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si souffrance animale, de la buprénorphine sera injectée aux souris. Chaque cage présentera des enrichissements (cotons de nidation, tunnel).

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude des cancers. La souris immunodéprimée (déprouvue de système immunitaire) est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.