Procédures modérées

Une laminectomie de quatre heures, quatre anesthésies, des jeûnes hydriques allant jusqu'à seize heures et des ponctions de liquide céphalorachidien : trois macaques à longue queue subissent ces actes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin du projet. Un virus adéno-associé leur est injecté dans l'espace sous-arachnoïdien pour provoquer une atteinte des ganglions de la racine dorsale, que l'équipe cherche à visualiser par IRM. Chaque jour, l'animal est isolé de ses congénères le temps d'évaluer sa vision et sa motricité faciale, et une seconde technique de cathétérisation, moins documentée, est essayée juste avant la mise à mort. Le porteur présente ce projet comme un gain de bien-être qui supprimera le recours à la chirurgie, alors que son protocole repose sur une chirurgie lourde et se termine par le prélèvement du cerveau et des ganglions.

Objectifs

Ce projet a pour but d’investiguer la possibilité d'un suivi en IRM (imagerie par résonance magnétique) de la neurotoxicité induite par l'injection intrathécale d'un AAV (Virus adéno-associé) au niveau des ganglions spinaux de la racine dorsale (GRD), chez le primate non humain. Les AAVs sont des vecteurs viraux dont le plasmide a été modifié de manière à en diminuer la pathogénicité, supprimer la capacité de réplication, et surtout permettre au vecteur d'exprimer un gène d'intérêt dans les cellules de l'hôte. Dans le cadre de thérapie génique visant le système nerveux central, les AAVs peuvent être injectés directement en intrathécale (=dans l’espace sous-arachnoïdien). Cependant, de récentes recherches ont montré une toxicité au niveau des GRD, lors du passage en clinique de certains médicaments, mais aussi chez le primate non humain. Cette toxicité a pris la forme de dégénérescence neuronale ou axonale, et elle ne peut être investiguée que par enregistrement électrophysiologique invasif ou par une inspection microscopique des GRD post-mortem. Le but de ce projet est d’investiguer la possibilité d’observer cette toxicité par IRM chez le primate non humain. Il est en effet possible que de nouvelles séquences d'IRM permettent de mettre à jour une désorganisation des fibres nerveuses au niveau spinal liée à cette toxicité, comme cela a déjà été montré dans le cas d'Alzheimer. Une telle méthode non-invasive permettrait un meilleur suivi de la toxicité potentielle de nouveaux AAV. Cela représentera une meilleure maitrise scientifique du suivi des thérapie génique, et une limitation du recours à des méthodes invasives pour les animaux. Enfin, ce projet va permettre de comparer deux méthodes de cathétérisations intrathécale en région lombaire : une méthode chirurgicale invasive, et une méthode moins décrite dans la littérature mais ne nécessitant pas de chirurgie. En effet, des méthodes de cathétérisations peuvent être nécessaire afin d’injecter de manière lente un AAV dans le système nerveux centrale. La deuxième méthode étant moins décrite, elle doit être comparée à la première méthode et ne sera testée qu'au moment de la mise à mort de l'animal. Une fois maitrisée, cette méthode produira un net gain en termes de bien-être animal, en supprimant le recours à la chirurgie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’investiguer l’observation de la dégénérescence des GRD par IRM suite à l’injection d’un AAV. L’IRM est une méthode non-invasive et pourra être utilisée dans des études précliniques pour détecter la neurotoxicité d’un AAV sans avoir besoin d’euthanasier l’animal en fin de procédure ou de le soumettre à des examens électrophysiologiques invasifs. Plus réalistement, l'IRM agirait comme une première sélection permettant d’objectiver une suspicion de toxicité pour certains candidats AAV. De plus, cette méthode permettrait d'enrichir les études d'efficacités sur l'expression des transgènes chez les animaux, en permettant un suivi longitudinal de la toxicité neuronale des AAV. Une telle méthode diagnostique permettrait de faire la différence entre une lésion temporaire et une lésion définitive, ce qui permettrait de raccourcir la durée d'investigation nécessaire et d'enrichir la qualité scientifique des données. Les séquences d’IRM utilisées se feront avec un système 1.5T. Ce système permet, par rapport à un système 3T d’obtenir des images de diffusion de meilleure qualité du fait de l’homogénéité du champ magnétique . De plus, nous ajouterons au protocole une qualification de la graisse, qui nous donnera un taux de graisse avant et après injection des AAVs dans les muscles pour pouvoir observer les conséquences indirectes de l’atteinte des DRG. A la vue de la taille relativement fine des structures analysées, un focus sera mis sur l’acquisition d’images avec une résolution spatiale importante. L’injection de l’AAV sera réalisée par une cathétérisation intrathécale suite à une laminectomie. Cette méthode permet d’assurer que tout le produit est bien injecté dans l’espace sous-dural. Cependant, cette méthode étant assez invasive (nécessitant une chirurgie longue), une seconde méthode de cathétérisation sera évaluée (collecte de LCS propre, injection de marqueur coloré). Cette deuxième méthode est moins documentée et moins connue, et sera donc réalisée juste avant l’euthanasie de l’animal. Si cette deuxième méthode fonctionne, elle pourra permettre dans le futur de réaliser des injections intrathécales longues et répétées, en réduisant l'invasivité pour l’animal.

Procédures

Les animaux subieront des anésthésies. Deux d'entre elles dureront environ 1h (pour l'imagerie IRM), la chirurgie lourde sera d'une durée de 4h environs et la dernère anesthésie sera réalisé avant l'euthanasiedes animaux. Les prélèvements sanguins se feront sur animaux anesthésiés. Les prélèvements de liquide cerebrospinale se feront pendant la chirurgie et avant l'euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés pour chacun des actes qu’ils subiront (IRM et injection de l’AAV), ce qui représente un total de 4 fois sur la totalité du projet. Ceci nécessitera une mise à jeun (diète hydrique). Lors des IRM, l’animal présentera un risque d’hypothermie dans la machine ou lors du transport de son hébergement à la salle d’IRM . L’injection intrathécale de l’AAV et la collecte de LCS présentent un risque de douleur ou de réactions locales au site de la chirurgie. Éventuellement, une réaction systémique de type fièvre peut apparaître les jours suivants les administrations. De plus, les animaux pourraient présenter des signes cliniques neurologiques dus à la méthode d’injection, ainsi qu’au potentiel dommage provoqué par l’AAV au niveau des ganglions dorsaux (même si les travaux publiés jusqu'alors chez le primate ne font pas état de troubles visibles). Un suivi neurologique sera réalisé tout au long de l’étude afin de surveiller de près ce paramètre. Lors de l’évaluation neurologique quotidienne, les animaux devront être isolés de leurs congénères le temps d’évaluer leur vision et motricité faciale. Les prises de sang peuvent provoquer un hématome au site de prélèvement. Les animaux seront sous anesthésie lors de celle-ci.

Devenir

Afin de pouvoir corréler les résultats observés à l’IRM, les animaux seront mis à mort à la fin du projet. Les ganglions dorsaux seront récoltés ainsi que le cerveau, d’une part pour investiguer sur la présence du transgène injecté (afin de valider que l’AAV est bien présent dans les tissus nerveux) et d’autre part afin de réaliser de l’histologie pour observer et corréler la dégénérescence neuronal et axonal, avec les résultats d’imagerie IRM. De plus, pour valider la deuxième méthode de cathétérisation, du bleu de méthylène sera injecté dans le cathéter à la fin de la procédure. L’observation de la présence de bleu de méthylène au niveau des tissus nerveux, ainsi que le prélèvement de LCS propre, permettra de valider la méthode d’injection.

Remplacement

Cette étude permet de développer une méthode de détection de la neurotoxicité de manière non invasive grâce à l’IRM. Cette étude est nécessairement réalisée chez l'animal, car elle a pour but ultime le raffinement de protocoles en expérimentation animale. La ressemblance physiologique du système nerveux et immunitaire du primate avec celui de l’homme permettra ensuite de transférer les méthodes développées aux essais cliniques chez l'humain.

Réduction

Dans cette étude, 3 animaux seront utilisés lors de cette étude afin de pouvoir répondre à des objectifs scientifiques. Cela permettra de rapprocher différents possibles niveaux de toxicité neuronale avec leur valeur en signal IRM correspondante et permettra d'établir des corrélations. Étant donné qu'un seul type d'AAV sera utilisé, Il n'est pas nécessaire d'utiliser plus d'animaux que cela. Enfin, une méthode de cathétérisation moins invasive, mais moins documenté, sera réalisé sur ces animaux avant leurs euthanasies, afin de pouvoir confirmer que cette méthode fonctionne par l’injection de bleu de méthylène. L’observation des tissus nerveux sera une étape clef de la validation de ce protocole. Ce projet permet donc de ne pas mettre à mort des animaux dans le seul but de valider cette méthode de cathétérisation.

Raffinement

Les animaux utilisé dans ce projet ont déjà été utilisé pour d’autres projets et sont donc habitués au contact ainsi qu’aux manipulations avec les techniciens d’animalerie. Ils seront hébergés et socialisés dans des volières conformes à la réglementation. Un fond musical sera diffusé en journée. L’entretien sanitaire des hébergements et le contrôle des paramètres environnementaux seront réalisés quotidiennement. Les animaux disposeront d’eau de boisson à volonté. Un aliment adapté à l’espèce et au poids de l’animal, ainsi que des fruits et légumes frais, seront distribués quotidiennement. Des jouets seront mis à disposition et renouvelés une fois par semaine. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse et de le prendre en charge. Un score neurologique sera mis en place en place à cet effet. Il permet d’évaluer précisément les fonctions suivantes : l’état de conscience de l’animal, sa posture, la coordination motrice et équilibre de l’animal, la motricité des membres et enfin un examen rapproché permet d’évaluer la neuro-ophtalmologie (oscillation des yeux, tailles des pupilles etc..). Ce score prend aussi en compte des signes cliniques plus classique tel que des fèces liquides ou des vomissements. Les mises à jeûn hydrique n’excèderont pas les 16h. Si nécessaire, du sirop et/ou des fruits pourront être distribués tôt le matin pour les animaux dont l'anesthésie est en fin de matiné ou dans l'après-midi. Un minimum de 3 jours de repos sera accordé suite aux anesthésies. Le jour des prélèvements de LCS, de sang ainsi que le jour de la chirurgie, les animaux recevrons de la buprénorphine afin de limiter toute douleurs potentiel. L’analgésie pourra être prolongé jusqu’à trois jour suivant la chirurgie afin de prévenir de toute douleur. Les volumes de prélèvement de LCS ainsi que de sang respecteront des normes et des volumes précis. Des points limites spécifiques seront définis et si nécessaire pourront amener une euthanasie des animaux. Lors des anesthésies, il sera suivi au minimum la fréquence cardiaque, la saturation en oxygène ainsi que la température rectale des animaux. Des coussins chauffants, ainsi que des couvertures pourront être mise en place. Enfin, un relais d’oxygène sera mis en place si nécessaire.

Choix des espèces

Le but de ce projet est d’investiguer l’observation d’une neurotoxicité par IRM suite à l’injection d’AAV chez le primate on humain. La proximité phylogénétique de l’homme et du primate non humain permet d’obtenir des résultats prédictibles au niveau neurologiques et immunitaires. Les animaux utilisé seront des jeunes adultes ou adultes, afin que le système nerveux central et immunitaire soient suffisamment développés.

100 chats et 100 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous réutilisés à l'issue. Ils reçoivent le produit testé jusqu'à trois fois par semaine, par voie orale, injectable, nasale ou cutanée, subissent un suivi clinique hebdomadaire avec prise de température rectale et peuvent faire l'objet de quatre prélèvements sanguins dans une même journée, soit douze par semaine. Les effets attendus chez eux comprennent sédation, apathie, vomissements et diarrhée, pour un produit dont la fonction déclarée est de calmer l'animal pendant le trajet jusqu'à la clinique vétérinaire. Le porteur affirme que ces essais ont un caractère de "stricte nécessité" parce que la réglementation impose de les conduire sur l'espèce de destination du produit, et qu'ils alimenteront le dossier d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Dans le cadre de la mise au point de nouvelles formulations à usage vétérinaire, le présent projet vise à mener des études d'efficacité conformément aux exigences réglementaires énoncées dans le Règlement (UE) 2019/6 du Parlement européen et du Conseil du 11 décembre. Ces études sont essentielles pour caractériser l'activité ou les effets pharmacologiques attendus des produits vétérinaires et pour définir la posologie efficace. L'objectif principal de ce projet est de déterminer l'efficacité de produits apaisants sur des animaux sains. Pour ce faire, nous réaliserons des études de dose détermination et de dose confirmation. Ces études permettront de déterminer la quantité optimale du produit nécessaire pour obtenir les effets pharmacologiques désirés, tout en assurant la sécurité et le bien-être des animaux participants. Il est important de souligner que seules les études sur des animaux sains seront abordées dans le cadre de cette demande d'autorisation de projet. Cette approche garantit une évaluation précise de l'efficacité des produits vétérinaires sans interférences liées à des conditions médicales préexistantes chez les animaux. En résumé, le projet vise à répondre aux exigences réglementaires en matière d'évaluation de l'efficacité des produits vétérinaires tout en respectant les normes éthiques et en assurant le bien-être des animaux participants. Les résultats obtenus contribueront à la mise sur le marché de nouvelles formulations vétérinaires efficaces et sécuritaires, bénéficiant ainsi à la santé et au bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet contribue au développement et à la mise à disposition de produits pharmaceutiques sûrs et efficaces auprès des vétérinaires et des propriétaires d’animaux de compagnie en accord avec les exigences réglementaires pour la mise sur le marché de ces produits. Dans le cadre du développement de nouveaux produits ou amélioration de produits existants sur le marché, les bénéfices envisagés de cette procédure seront: - la meilleure connaissance et compréhension du fonctionnement de ces produits (dose, voie d’administration, adjuvants/excipients, innocuité, efficacité, mécanisme d’action) et - d’améliorer les conditions de transport de l’animal entre son lieu de vie et la clinique vétérinaire et - la réalisation des études nécessaires à la constitution du dossier d'autorisation de mise sur le marché (AMM).

Procédures

La durée maximale d'une étude avec un seul principe actif donné sera de 6 mois, en fonction de la durée de traitement et/ou de son efficacité. En fonction du produit testé, les animaux seront soumis à différentes interventions nécessaires à la bonne évaluation de son efficacité, selon les réglementations en vigueur. L’ensemble des interventions possibles, et variables selon le produit évalué, sont les suivantes : - Des administrations de produits pour toutes les voies avec un maximum de trois administrations par semaine et des périodes de washout (minimum 24h) entre chaque administration : durée environ 5 minutes entre 2 chiens et ou 2 chats Les voies d’administration peuvent être orale (ou per os), parentérale (entre autres sous-cutanée, intramusculaire, ou intraveineuse), nasale, topique (par exemple spot-on, pour-on, collier, patch) - Suivi clinique régulier a minima 1 par semaine et si nécessaire de façon plus rapproché, associé ou non à une prise de température rectale et une pesée, permettant de surveiller et d’évaluer l’état de santé des animaux, - Prélèvements de Sang : - chiens chats : 2 minutes par prélèvement, maximum 4 prélèvements sur une journée si les animaux sont coopératifs (soit maximum de 12 prélèvements de sang par semaine avec 24h heures de récupération entre chaque série de prélèvement)

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une douleur transitoire aux sites d’injection lors de l’administration du produit testé, d’anesthésique ou de médication, liée à l’introduction d’une aiguille. Suite à l’administration du produit testé, les animaux pourront présenter des signes cliniques liés à l’action de la molécule testée tels que sédation, apathie, diminution de l’activité, des signes digestifs (vomissement, diarrhée) qualifiés d’effets indésirables. Ces nuisances pourront être répétées car plusieurs administrations pourront être réalisées selon la posologie envisagée. Le suivi de la température par voie rectale pourra causer de l’inconfort temporaire. Enfin, lors du suivi régulier des animaux, les nuisances envisagées seront fonction du type de prélèvements réalisés telle qu’une douleur transitoire liée à l’introduction de l’aiguille (ex : prise de sang), le cas échéant.

Devenir

l'ensemble des animaux seront réutilisés

Remplacement

La recherche bibliographique et l’usage de méthodes alternatives in vitro seront considérés afin de limiter autant que possible la réalisation d’études sur animaux. Néanmoins cette procédure a un caractère de stricte nécessité : elle ne peut pas, pour le moment, être remplacée par des méthodes alternatives car elle répond à l’obligation réglementaire ou scientifique d’être conduite sur l’espèce de destination du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux en étude sera défini par les lignes directrices en vigueur (textes réglementaires pour les études pivot), ou justifié par des tests statistiques : le nombre maximum d’animaux par groupe sera calculé par le biostatisticien en fonction du design de l’étude, des données préliminaires d’efficacité issues de tests ou de la littérature, de la variabilité du critère de jugement, de la différence minimale qu’il est cliniquement intéressant de mettre en évidence entre les groupes, de la puissance (en général 1- beta 80%) et du risque alpha (5% en situation bilatérale et 2.5% en situation unilatérale) conformément à la procédure interne «Détermination du nombre de sujets nécessaires». Dans tous les cas, le nombre maximal d’animaux par groupe sera de 15 animaux.

Raffinement

Les mesures de raffinement utilisées sont : - Une période d’acclimatation adaptée aux conditions de l’étude - Habituation des chats aux prélèvements de sang sur animaux vigiles. - socialisation des carnivores domestiques à l’aide d’une période de jeu dans une pièce dédiée par du personnel qualifié. - Enrichissement des box afin d’améliorer le confort des animaux (musique, jouets adaptés...). - renforcement positif (récompenses ou caresses) - Observation quotidienne des animaux avec examen/suivi clinique - Mise en place de points limites adaptés et précisément définis qui pourront être réévalués en fonction des observations recueillies.

Choix des espèces

De façon réglementaire, les essais d’efficacité doivent être menés sur la ou les espèces cibles (chat et chien). L’objectif de l’utilisation du produit est de faciliter le transport de l'animal quelque soit son âge jusqu’au vétérinaire. De ce fait, tous les âges, à partir d’un animal sevré, pourront être envisagés

Deux heures de chirurgie cérébrale par animal, pour implanter des fibres optiques après injection intracérébrale : 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique des douleurs, un inconfort, une perte de poids possible et une mobilité réduite les deux jours suivant l'opération. Elles inhalent ensuite du protoxyde d'azote ou un gaz témoin, dans une boîte en plexiglas qu'il qualifie lui-même d'anxiogène, pour observer en direct l'activité de leurs neurones et clarifier les mécanismes d'un gaz déjà employé en clinique psychiatrique. Le choix de la souris repose sur des homologies avec l'humain dans l'organisation des systèmes de neurotransmission, et sur le fait que la technologie d'imagerie n'est validée que dans cette espèce.

Objectifs

Outre la souffrance engendrée, l’impact socio-économique croissant des maladies psychiatriques liées au stress telles que la dépression et le trouble de stress post-traumatique est particulièrement important. La découverte de nouveaux traitements efficaces, sûrs et d’action rapide pour lutter contre ces troubles psychiatriques est donc toujours un enjeu majeur, en particulier devant l’efficacité toute relative des traitements actuels. Récemment, certaines études cliniques ont pu montrer que l’exposition au protoxyde d’azote (gaz hilarant) induisait une amélioration clinique des symptômes de la dépression dans les heures suivants l’exposition et maintenue au moins 2 semaines voire plusieurs mois pour certains patients. Si la littérature est moins abondante, certaines études suggèrent également un potentiel effet facilitateur de l’exposition au protoxyde d’azote sur la réduction des mémoires intrusives liées au trauma, conférant un intérêt certain pour le traitement du trouble de stress post-traumatique. Si cette efficacité doit continuer d’être documentée en clinique, il est egalement important de clarifier les mécanismes neurobiologiques susceptibles de participer aux effets thérapeutiques ou indesirables du traitement dans un cadre expérimental contrôlé. Malgré son utilisation en routine comme agent anesthesique et anxiolitique, les mécanismes d’action du protoxyde d'azote sont en effet assez méconnus. L’objectif de ce projet sera donc d’appliquer, pour la première fois, une technique d’imagerie cellulaire in vivo chez l’animal éveillé afin de caractériser comment l’exposition aigue à ce gaz modifie l’activité des neurones responsables de la libération des principaux neurotransmetteurs du cerveau. Cette étude pilote est importante car elle conditionnera la faisabilité d’études futures utilisant les mêmes outils dans un contexte pathologique.

Bénéfices attendus

Bien qu’utilisé en routine dans certaines applications médicales comme calmant et anesthésique, l’effet du protoxyde d’azote sur le système nerveux central reste très mal caracterisé. Cette étude sera la première a implémenter une technologie d’imagerie cellulaire in vivo pour apporter des réponses claires sur les effets aigus de cette molécule, en particulier sur les principaux neurotransmetteurs du cerveau. Par ailleurs, étant donné que le protoxyde d’azote commence à être utilisé dans des protocoles de recherche clinique afin d’étudier ses propriétés antidépressantes, il est fondamental de mieux connaitre ce fonctionnement. A la fois pour informer sur les mécanismes neurobiologiques susceptibles de participer à cette action therapeutique, mais également sur les dangers potentiels de cette utilisation, ce qui est difficile à anticiper sans une idee claire de son action centrale.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections intracérébrales et à l’implantation de fibres optiques sous anesthésie générale, l’intervention durant environ 120 minutes.

Impact sur les animaux

- Injections intra-cérébrales et implantations de fibres optiques : la chirurgie est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure (pour l’implantation de la fibre optique, l’injection seule étant bien tolérée). Les animaux récupèrent cependant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) sont faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.

Devenir

Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à l’issue des enregistrements mesurant les effets de l'exposition au gaz témoin ou au protoxyde d'azote en vue du prélevement des cerveaux afin de réaliser des marquages cellulaires.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des systèmes de neurotransmission et les structures cérébrales visées dans le projet.

Réduction

Les effectifs (65 par groupe et par sexe, soient 260 au total) ont été calculés pour garantir la fiabilité statistique de nos conclusions . Ces effectifs prennent par ailleurs en compte qu’il faut mitiger les déviations potentielles des coordonnées ciblées lors des implantations et des injections cérébrales, correspondant à un taux de succès de 75%.

Raffinement

En plus des normes en vigueur, l'hébergement des souris sera enrichi avec des buchettes en bois et du matériel de nidification additionnel. En ce qui concerne les chirurgies stéreotaxiques, les soins pré- et post-opératoires sont bien établis afin de minimiser les risques de porter atteinte au bien-être de l’animal (antalgie, anesthésie locale, traitement anti-inflammatoire et antibiotique si nécessaire), et la formation rigoureuse de l’expérimentateur assure un respect de ces bonnes pratiques. Les points limites bien établis permettront de s'assurer de l'arrêt de l'expérimentation pour tout animal montrant des signes objectifs de souffrance. Une attention accrue sera portée aux animaux pour les soins post-opératoires. De la nourriture appétante et riche en énergie pour les souris (biscuits) sera deposée dans la cage d'hébergement des souris après opération en guise de récompense et pour stimuler leur rétablissement. Le même type de récompense sera sporadiquement administré aux souris pendant les phases d'habituation aux dispositifs expérimentaux afin de minimiser le caractère anxiogène de la boîte en plexiglas.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris font de cette espèce le modèle animal le plus pertinent pour ce projet, en particulier de part l’organisation cellulaire et la connectivité des systèmes de neurotransmission. Les outils permettant notamment l’application d’imagerie cellulaire in vivo de ces systèmes est par ailleurs validé dans cette espèce. Toutes les souris commenceront le projet à 10 semaines, c’est-à-dire l’âge adulte.

Toutes tuées pour extraire leur cerveau et vérifier que la lentille optique était au bon endroit, 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux opérations du crâne d'environ deux heures, reçoit un inhibiteur de la synthèse des protéines, et vit isolée en cage individuelle entre huit et seize semaines pendant les phases d'entraînement. Les séances consistent à explorer une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires, vingt à quarante minutes par jour pendant environ huit semaines. Le porteur retient un effectif de 96 souris sur la base d'un taux de réussite d'implantation attendu de 50 %, et affirme que l'étude de ces circuits cérébraux exige un "organisme entier vivant".

Objectifs

L’objectif de cette saisine est de mettre en évidence le phénomène de marquage et capture synaptique (STC) chez l’animal vigile et de caractériser pour la première fois son implication fonctionnelle dans l’association temporelle de trace mnésique. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de l’activité calcique de neurones de l’hippocampe une région essentielle pour encoder la mémoire, (3) en présence ou en l’absence d’un inhibiteur de la synthèse protéique selon les environnements et les jours de tests, permettant ainsi d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle (et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés) en comparant les résultats obtenus dans les environnements sans inhibition et avec inhibition. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes sous-tendant l’association temporelle des traces mnésiques, un élément fondamental pour comprendre comment se forme la mémoire autobiographique, comment chaque individu peut voyager dans le temps de ses souvenirs et comment il peut s’adapter aux conditions présentes et futures en se basant sur ses expériences passées

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et une injection (subcutanée ou intrapéritonéale) entre les 2 séances d’exploration lors des entrainements et lors du test. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 20 à 40 minutes, ~8 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées lors des phases d’entrainements et tests après chirurgie (pour une durée comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celles-ci ont été influencées par l’apprentissage.

Remplacement

L’étude de circuits cérébraux et de leur implication dans lacmémoire et les réponses comportementales et physiologiques ne peut être réalisée qu’à partir de cerveau et d’organisme entier vivant.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 96 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système d'imagerie et notre expérience ; minimum 48 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse (isoflurane) est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologique de la mémoire, de la formation des souvenir et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utliser des stades plus spécifiques du développement (précoce ou tardif).

Pour bloquer la transmission de la dengue, du Zika et de la fièvre jaune en immunisant contre une protéine du moustique, 295 souris C57BL/6J vont être utilisées dans ce second établissement, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune est endormie pour recevoir cinq moustiques sur la peau, puis prélevée par ponction dans l'orbite de l'œil à trois, six et neuf jours après les piqûres. Le porteur indique que l'infection virale peut provoquer perte de poids, immobilité, mauvais état corporel et troubles neurologiques. Le vaccin universel contre tous les flavivirus qu'il annonce reste un objectif de long terme, quand l'infection des souris figure au protocole immédiat.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.

Ouvertes sous anesthésie pour que leurs embryons reçoivent une injection intracrânienne suivie d'une impulsion électrique, les femelles gestantes de ce projet risquent l'avortement ou une mise bas prématurée. 2 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur note que les embryons peuvent ressentir une douleur de courte durée au moment de l'injection, leur crâne étant "encore totalement mou à ce stade", et que les cerveaux sont prélevés sur les souriceaux trois à cinq jours après la naissance pour cultiver des explants. Il affirme que ces cultures "permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais", pour un effectif déclaré de 2 100 animaux.

Objectifs

Des altérations de la neurotransmission sont à la base de toutes les pathologies du cerveau. Le contrôle de la neurotransmission permet d’adapter les réponses des neurones et donc du cerveau aux modifications de l’environnement. Les microglies, qui sont les macrophages du cerveau, sont fortement impliquées dans le contrôle de la fonction synaptique. Un tel contrôle est important pour la physiologie du cerveau puisque les microglies représentent jusqu'à 20 pourcent des cellules du cerveau et qu'elles contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. En particuliers, les microglies sont nécessaires à la régulation des synapses inhibitrices : quand l’activité neuronale augmente, un rétro contrôle induit une augmentation du nombre de récepteurs au neuromédiateurs aux synapses inhibitrices ; ce rétro-contrôle ne peut pas se faire sans cytokines produites par les microglies. Le présent projet s’appuie sur ces observations et cherche à mieux comprendre les mécanismes de la régulation des synapses inhibitrices et à décrire les interactions morphologiques et fonctionnelles entre la microglie et les synapses.

Bénéfices attendus

Les microglies sont les macrophages du cerveau. Elles representent jusqu’à 20 pourcent des cellules selon les régions du cerveau. En permanence, elles envoient et retractent leurs prolongements qui contactent en permanence 1 à 10 pourcent des synapses. Pourtant, on ne sait pas encore à quoi servent ces interactions. Notre projet permettra de le comprendre. De plus, les microglies sont activées dans la quasi-totalité si ce n’est dans toutes les pathologies du cerveau, et elles ne sont donc plus dans un état physiologique. Il est donc probable qu’une perte des fonctions microgliales fasse partie de l’étiologie des pathologies du cerveau. Comprendre ces fonctions physiologiques a donc un intérêt majeur dans la compréhension des pathologies.

Procédures

Les femelles gestantes subiront une chirurgie unique sous anesthésie et analgésie d’une durée de 30 minutes. Les embryons subiront lors de cette chirurgie une injection intracrânienne suivie d’une impulsion électrique (électroporation in utéro). Les animaux seront ensuite euthanasiés par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes subiront une unique chirurgie pouvant entraîner un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie (détresse respiratoire, mauvais endormissement, etc.). Les femelles pourront également ressentir de la douleur en post-opératoire avec également un risque infectieux ou de dessiccation. Au cours de cette chirurgie, les embryons seront manipulés afin de réaliser une électroporation in utero (injection d’une solution intracrânienne suivie d’une application d’un courant électrique sur la tête). Les embryons seront susceptibles de ressentir de la douleur de courte durée lors de l’injection. Il est à noter que le crâne est encore totalement mou à ce stade. Un risque d’avortement ou de mise bas prématuré existe également avec ce type de chirurgie.

Devenir

Nos études se fondent sur des cultures d'explants de cerveaux ou de cellules de cerveau dissociées. Il est donc indispensable d'euthanasier les animaux pour extraire leur cerveau.

Remplacement

Les études des interactions entre les microglies et les synapses doivent se faire dans un système qui récapitule les interactions spatiales et temporelles qui ont lieu dans le cerveau. A notre connaissance, ces interactions ne sont pas reproduites dans des systèmes en culture, mais sont acceptables dans des cultures organotypiques que nous utiliserons. De plus, nous souhaitons étudier l'importance cytokines et des mouvements des microglies et nous utiliserons des outils génétiques disponibles chez la souris qui permettent de les étudier.

Réduction

Nous utiliserons 2100 souris. Notre projet s'appuie sur des cultures d'explants qui permettent de réduire considérablement le nombre de souris utilisées puisqu'une seule souris permet de réaliser plusieurs essais. La taille des échantillons est calculée sur la base de nos études précédentes.

Raffinement

Les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de papier kraft ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons systématiquemnet de raffiner nos procédures pour optimiser le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études . Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la structure de bien être animale et ou la vétérinaire pourra être sollicitée. Les animaux sont hébergés dans des conditions standard : Hébergement en cages ventilées individuellement (moins de 6 souris/cages) - Salle d’hébergement en surpression - Cycle nycthémère de 12h (7h - 19h) - Hygrométrie de 55 plus ou moins 5 pourcent - Température 22 plus ou moins 2C - Change litière/abreuvement/nourriture 1 fois par semaine + vérification quotidienne - Enrichissement du milieu : papier kraft.

Choix des espèces

La souris est choisie pour plusieurs raisons dont les plus importantes sont la disponibilté des modèles transgéniques et de manipulations génétiques multiples, et l'existence de nombreuses études antérieures qui nous permettent d'étayer notre projet. Les électroporation in utéro se font entre 13,5 et 15, 5 jours après fécondation (début du 3eme tiers de la gestation) , au moment où les neurones qui nous interessent sont générés. Les cultures organotypiques de cerveaux se réalisent à partir de cerveaux de souris 3 à 5 jours après la naissance et on sait que dans ces conditions, les régulations microglies-synapses sont conservées .

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe implante une tumeur sous la peau du flanc sur animal vigile, puis mesure cette tumeur deux à trois fois par semaine pendant qu'elle grossit, avec gêne à la mobilité, frottement, ulcération et nécrose possibles. Le porteur écrit qu'aucun dommage majeur n'est attendu, les produits testés étant déjà évalués chez l'être humain dans un essai clinique qu'il référence. Ces études servent à compléter des dossiers réglementaires auprès de l'ANSM et de la FDA, puis une demande d'autorisation de mise sur le marché.

Objectifs

Le Projet est une étude Préclinique de Pharmacologie expérimentale. Il a pour principal but de valider le mécanisme d'action de différents candidats Immunothérapeutiques via l'étude de l'activité antitumorale et de la réponse immunitaire induite sur souris porteuses de tumeurs. Nos candidats immunothérapeutiques seront administrés sous forme de cellules à récepteur antigénique chimérique (CAR), peptidique ou sous forme d'anticorps. Ces candidats seront spécifiques de différents antigènes de tumeurs déterminés par des études de recherche cognitive.

Bénéfices attendus

Ce projet de Pharmacologie s'inscrit dans une phase de développement préclinique de différents candidats immunothérapeutiques destinés à lutter contre les différentes formes de cancer chez l'Homme. Ces études, nous permettront la complétion de dossiers réglementaires pour obtenir l'accord de l'Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM (France) ou FDA (US)) pour évaluer l'efficacité de nos candidats immunothérapeutiques dans des phases cliniques sur des patients atteints de cancers. D'autre part elles seront constitutives d'une partie du dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché (AMM). En effet, ces produits d'immunothérapie devront répondre à des normes internationales de qualité scientifique et clinique qui seront étroitement évaluées par les autorités de santé pour la délivrance de l'AMM.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une procédure comprenant l'identification (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animal), des pesées (animaux vigiles, 2 à 3/semaine, 1 minute/animale), des traitements (animaux vigiles, en injection sous cutanée, intrapéritonéale ou intraveineux en fonction du produit testé et du schéma de traitement qui est à déterminer : dose unique ou dose répétée), d'implantation de tumeurs sous cutanées (animaux vigiles, 1 fois, 1 minute/animale) et de mesures tumorales (animaux vigiles, 2 à 3 fois/semaine, 1 minute/animale). Pour certaines études, un suivi de la réponse dans le sang pourra être envisagé. Pour cela un prélèvement de sang périphérique sera effectué à la veine retro-mandibulaire. En fonction de la cinétique, au maximum une fois par semaine en respectant les volumes autorisés : 0.5% du poids de l'animal pour un intervalle d'une semaine, 0.75% pour 2 semaines et 1% pour 3-4 semaines. Les animaux seront ensuite mis à mort pour le prélèvement de sang et organes en point finale pour les évaluations pharmacologiques ex vivo.

Impact sur les animaux

Les agents thérapeutiques utilisés au cours de ce projet ayant déjà montré leur innocuité chez la souris sont en cours d'évaluation chez l'Homme (NCT05672459). De ce fait, aucun dommage majeur / effet indésirable lié au traitement n'est attendu dans le cadre de nos études. Cependant, une nuisance qui sera surveillée et contrôlée par le suivi et le respect des points limites, peux intervenir après injection de cellules tumorales et développement de la tumeur en sous cutanée sur le flanc de la souris (gêne à la mobilité lors du grossissement de la tumeur, frottement ulcération et nécrose). Il est important de noter que l'expérimentation animale sera utilisée de manière rationnelle et selon les réglementations en vigueur qui garantissent un traitement éthique de l'animal de laboratoire (application des 3R), avec pour objectif le raffinement, la réduction de l'utilisation de l'animal de laboratoire ou son remplacement par des modèles in vitro (ou autres) lorsque cela est possible.

Devenir

En fin d'étude les animaux seront mis à mort et certains organes (rate, poumons, foie, ganglions, sang, cerveau, tumeurs) seront prélevés pour des études de Pharmacocinétiques et de Pharmacodynamie.

Remplacement

Dans un premier temps, les différents candidats immunothérapeutiques feront l'objet d'une sélection et d'un développement préclinique in vitro, sur divers modèles cellulaires, afin de confirmer leur fonctionnalité. Par la suite, les modèles murins ayant leurs propres limitations pour les études de toxicologie sur des cibles humaines, des méthodes in vitro et/ou ex vivo seront mises en place avec l'utilisation notamment de culture 3D organoïdes, cellules primaires humaines ou banque de protéines d'expression sur modèles cellulaires.

Réduction

Chaque étude fera l'objet d'une rédaction de protocole expérimental, afin de garantir l'optimisation des expériences. L'optimisation du nombre d'animaux : entre 5 et 10 souris par groupe seront utilisées pour évaluer et interpréter l'efficacité antitumorale des différents candidats. La réduction des répétitions inutiles et optimisation du nombre d'animaux contrôles entre les différentes expériences réalisées dans les mêmes conditions. Les critères d'optimisation du nombre d'animaux contrôles vont dépendre du design de l'expérience (nombre de groupes expérimentaux) et des résultats des expériences précédentes / antérieures. La réduction du nombre d'animaux ne devra néanmoins pas se faire au dépend de la fiabilité des résultats. Lorsque cela est possible, et principalement pour les souris provenant de fournisseurs agréés, l'utilisation d'animaux homogènes (même sexe, même âge, même état sanitaire) sera privilégiée. Cette précaution sera prise afin de réduire autant que faire se peut la variabilité d'un individu à l'autre. Le nombre d'animaux utilisé dans les études a été déterminé pour permettre une étude statistique non paramétrique. Pour les études qui impliquent la comparaison de 2 groupes nous utiliserons un test de Mann-Whitney et pour les études impliquant des comparaison multi-groupes, nous utiliserons un test de Kruskal-Wallis avec correction de Dunn.

Raffinement

Utilisation des mesures de raffinement suivantes chaque fois que possible : - Procédures non invasives - Assurer les soins pré-, per- et postopératoires adéquats - Recours à l'anesthésie / analgésie - Application des points limites établis préalablement - Utilisation des procédures d'euthanasie appropriées - Utilisation de litière chirurgicale pour limiter les frottements/blessures/ulcérations de la tumeur lié à la litière - Utilisation de portoirs et cages ventilées - Enrichissement du milieu (maison, matériel de nidification) - Désinfection à l'aide de désinfectant iodé - Application d'Aluspray en aide à la cicatrisation

Choix des espèces

Les différents candidats immunothérapeutiques seront d'abord évalués par des tests cellulaires in vitro pour confirmer leur fonctionnalité et leur innocuité. Néanmoins, il n'existe pas actuellement de tests de remplacement ou d'alternatives à l'utilisation d'animaux de laboratoire pour étudier la réponse immunitaire et l'efficacité antitumorale. Ces deux critères sont essentiels et critiques pour évaluer le potentiel thérapeutique réel des immunothérapies développées. Aujourd'hui, la souris est le principal modèle utilisé / étudié en recherches anticancéreuses et en immunologie. Pour notre projet, nous utiliserons des modèles de souris, dans lesquelles de nombreux modèles de tumeurs ont été isolés / développés et sont parfaitement caractérisés. Souris adultes entre 5 et 10 semaines : âge compatible avec le monitoring d'une réponse immunitaire et l'implantation de cellules tumorales en sous cutanées ou injection intraveineuse.

Élevées sans aucune cachette sous une lumière colorée de 3 000 lux douze heures par jour, 240 jeunes seiches européennes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'il ne peut pas enrichir les bacs, un abri permettant aux animaux d'échapper à la lumière et ruinant du même coup l'expérience. Toutes sont tuées par refroidissement progressif, dix à quinze minutes entre l'anesthésie sous six degrés et la mort sous quatre, pour prélever et fixer leurs tissus. Parmi les bénéfices annoncés, le projet doit "optimiser les conditions d'élevage et d'hébergement" d'une espèce dont le porteur précise que les standards restent en cours d'élaboration.

Objectifs

Parmi les animaux aquatiques, les céphalopodes montrent des capacités de camouflage complexes et uniques. Le camouflage est permis par les motifs colorés qui sont dynamiques et changeants. Les couleurs sont dues aux pigments contenus dans les chromatophores, organes dont l’activité est contrôlée directement par le cerveau, permettant ainsi des modifications rapides des motifs. Notre espèce est la seiche européenne dont le développement et les premiers mois de vie se déroulent en milieu côtier. La pigmentation de la peau par les chromatophores a lieu dès la phase embryonnaire et les motifs se complexifient après éclosion, en lien avec les facteurs environnementaux directs, comme la lumière et le fond sur lequel elles vivent. Ce projet a pour objectif de tester différents facteurs comme l’effet d’un éclairement de “couleur” différente et la couleur du bac sur le niveau de pigmentation des animaux au cours de leur développement après éclosion. Par une expérimentation conduite sur des juvéniles de seiche, nous déterminerons si la “couleur” différente de la lumière d’éclairement et la couleur du bac modifient 1) les régulations moléculaires en lien avec la synthèse des pigments et 2) la couleur générale adaptée au fond et au type de lumière. Ce projet permettra une meilleure connaissance des adaptations et des effets des changements environnementaux sur le cycle de vie de ces animaux marins, il permettra d’élaborer des hypothèses évolutives et fonctionnelles sur l’influence du facteur couleur du bac et couleur de la lumière au cours du développement, chez l’embryon et chez le juvénile après éclosion. Ce projet permettra également d’optimiser les conditions d’élevage et de maintien des juvéniles Des caméras situées au-dessus des bacs permettent d’évaluer l’intensité de pigmentation des juvéniles en expérimentation par acquisitions d’images.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’identifier si la couleur de la lumière et la couleur du bac sont des facteurs importants dans le contrôle de la mise en place de la pigmentation. L’approche par l’expression des gènes permet de tester les régulations moléculaires mises en place par l’animal face à son environnement et de les corréler avec la pigmentation observée (plus ou moins foncée) et son comportement de camouflage. Il a été montré chez des poissons que la “couleur” d’éclairement et la couleur du bac entrainaient des différences de pigmentation. Nous avons observé une pigmentation plus importante des jeunes seiches élevées sur bac de couleur noire et nous souhaitons confirmer ou infirmer cette observation. Tester chez la seiche l’ effet éventuel de la “couleur” de lumière et de la couleur du fond permettrait d’apporter des éléments de réponse à la mise en place et la régulation des motifs colorés, qui conditionnent chez l’adulte la qualité du camouflage. En plus de mieux comprendre les facteurs conditionnant la mise en place des motifs colorés, ce projet permettra d’optimiser les conditions d’élevage et d’hébergement et le bien-être animal de cette espèce pour laquelle les standards d’élevage sont en cours d’élaboration.

Procédures

Les animaux sont soumis à des éclairages différents (photopériode de 12h de lumières et 12h de nuit). Les animaux ne subissent aucune intervention avant leur mise à mort. Lorsqu’ils sont retirés des bacs à l’épuisette, ils sont immédiatement transférés dans un récipient. La mise à mort dérogatoire par le froid amène progressivement les animaux vers une anesthésie (

Impact sur les animaux

Trois prélèvements manuels à l’épuisette d’une durée de 10 à 20 secondes sont prévus par aquarium sur toute la durée de l’expérimentation, ce qui peut occasionner un stress passager. En l’absence de cachettes, on ne peut exclure que l’éclairement appliqué avec une intensité peu élevée d’environ 3000 lux et le type de couleur d’éclairement puissent occasionner une nuisance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus. Pour étudier l’expression des gènes dans les tissus, il est nécessaire que les organes soient extraits et fixés, ce qui implique la mise à mort des animaux. Il n’est pas possible de prélever une partie de l’animal sans causer des dommages irréversibles (pas de survie après prélèvement des organes/tissus d’intérêt).

Remplacement

Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à comprendre la mise en place chez la seiche des motifs colorés qui constituent un élément fort du comportement de camouflage. Le développement requiert l’implication des organes du système nerveux (entre autres) qui contrôle ces éléments cutanés. Il s’agit donc d’un projet nécessitant un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle

Réduction

La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés tous les jours dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œufs nécessaires pour réaliser cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’éviter de la répéter ultérieurement si les résultats n’étaient pas satisfaisants. Expérimentalement et statistiquement, le nombre de 10 animaux par groupe est un minimum afin de respecter les limites acceptables de la validité scientifique.

Raffinement

Les juvéniles éclosent dans leur aquarium d’origine (où ont été déposés les œufs); ils ne sont donc pas déplacés. Ils sont nourris à satiété avec des crevettes de taille adaptée (petites crevettes et mysis sp.) deux fois par jour (matin et après-midi). L’acquisition de données relatives à la pigmentation des animaux est réalisée sur photos prises par une caméra directement installée au-dessus du bac afin de limiter l’intervention humaine. Les rations sont réévaluées quotidiennement pour adapter la quantité d’aliment distribué à la biomasse de l’aquarium. Il n’est pas possible d’ajouter un enrichissement physique sous la forme de cachettes diverses (pièces en plastique) car cela contrecarrerait les objectifs du projet en permettant aux animaux de ne plus être sous l’influence de la lumière. L’éclairement est appliqué sur une période de 12h ; l’intensité de l’éclairement est d’environ 3000 lux grâce à la mise en place d’un variateur permettant la modulation de l’intensité. La mise en route ou l’arrêt de l’éclairement s’effectue sur une période de 30 min. Le bien être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.

Choix des espèces

Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. La seiche européenne pond des œufs sur nos côtes. Contrairement à d’autres espèces de céphalopodes comme les pieuvres, il n'y a pas de larves chez les seiches et les juvéniles se développent en 2 mois maximum ce qui permet de réaliser des observations. Les individus du projet sont des juvéniles après éclosion, pour évaluer la pigmentation et son contrôle nerveux, l’animal étant en lien direct avec les facteurs environnementaux.

Injectées d'antigènes, prélevées par ponction dans l'orbite de l'œil sous anesthésie à quatorze, vingt-huit et quarante-deux jours, puis exposées à cinq moustiques chacune pendant qu'elles sont endormies : 295 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf jours après les piqûres, de nouveaux prélèvements rétro-orbitaires suivent, puis des biopsies de peau, pour un objectif que le porteur situe à long terme, un vaccin universel contre tous les flavivirus. Une partie des souris fournit le sérum, collecté par ponction dans le cœur juste après leur mise à mort, sérum ensuite injecté à d'autres souris exposées aux mêmes moustiques. Toutes sont tuées, les dernières par dislocation cervicale sous anesthésie après le prélèvement de la peau, avant tout réveil.

Objectifs

Le projet de recherche permettra de tester une nouvelle stratégie de lutte contre tous les flavivirus, tel que la dengue, le Zika et la fièvre jaune. L’objectif est de déterminer l’effet d’une immunisation contre un nouveau facteur de transmission chez le moustique et de déterminer le mécanisme. Ces données fourniront la base nécessaire au développement d’une stratégie vaccinale contre tous les flavivirus. Il sera réalisé sur deux établissements.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à court terme sont : i) Identifier une cible vaccinale contre tous les flavivirus, ii) Comprendre l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur la transmission. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin universel contre tous les flavivirus, lesquels infectent un demi-milliard de personnes et en tuent 250000 par an.

Procédures

D'abord, nous optimiserons l’immunisation contre le facteur de transmission. La procédure durera 42 jours. Nous injecterons les souris avec des antigènes et ferons des prélèvements sanguins à 14, 28 et 42 jours par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie volatile. Ensuite, nous testerons l’effet de l’optimisation sur la transmission d’un flavivirus par piqûre de moustique. La procédure durera 52 jours. Les souris seront injectées avec les antigènes, exposées aux moustiques sous anesthésie générale et nous effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqûre des prélèvements par ponction rétro-orbitaire sous anesthésie. Puis, nous déterminerons si la protection contre la transmission est liée à l’immunité humorale (c.-à-d. les anticorps), en testant l’effet d’une immunisation passive par injection de sérum immune sur la transmission par piqûre. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, collecterons le sang par ponction cardiaque après euthanasie, injecterons le sérum immun dans d’autres souris, exposerons ce second lot de souris aux piqûres de moustiques et effectuerons à 3, 6 et 9 jours post piqure de moustiques des prélèvements sanguin par prélèvement retro-orbitaires sous anesthésie. Enfin, nous décrypterons comment l’immunisation contre le facteur de transmission affecte l’infection de la peau par piqûre du moustique. La procédure durera 52 jours. Nous injecterons les souris avec les antigènes, les exposerons aux piqûres de moustiques sous anesthésie et collecterons des biopsies cutanées à l'endroit de piqures de moustiques avec des punch et sous anesthésie. Les animaux seront sacrifiés juste après la réalisation des biopsies.

Impact sur les animaux

- Il est possible qu'une douleur légère soit occasionnée lors d'injection de l'anesthésique ou de l’antisérum. Toutes les autres interventions seront réalisées sous anesthésie. -Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, stress, comportement anormal, troubles neurologiques liés à l’infection par le virus.

Devenir

Les souris dans toutes les procédures seront mises à mort sous anesthésie. Toutes les souris dédiées à la production des sérums seront prélevées par ponction intracardiaque juste après leur mise à mort. Les souris seront mises à mort après la réalisation de biopsies cutanées sous anesthésie et avant leur réveil.

Remplacement

Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun modèle, à par le modèle animal, ne nous permettra de faire un test d’immunisation. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires, supportant notre hypothèse, sur des modèles in vitro. De plus, nous caractériserons la fonction des gènes régulés identifiés par le scRNAseq (expérience 4) sur des modèles in vitro en utilisant des cellules primaires.

Réduction

-Afin de réduire le nombre de souris, nous allons utiliser une seule dose (la plus élevée) dans les groupes contrôles pour déterminer les meilleures conditions d’immunisation (procédure 1) -Dans les procédures 2, 3 et 4, nous exposerons chaque souris à 5 moustiques pour réduire le nombre d’animaux nécessaire aux tests de survie et à la collecte des biopsies de peau.

Raffinement

-Les souris seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées avant les prélèvements sanguins ou leur exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffants et une lampe chauffante pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et desséchement de la cornée. En dehors des expériences, le suivi des souris s’effectuera chaque jour. - Les souris infectées seront mises à mort après la collecte des biopsies cutanées par dislocation cervicale sous anesthésie. - Nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée. - Les souris seront maintenues par 3 à 5 individus / cage avec de la litière et des enrichissements en alternance. Nous changerons la litière tous les 3 jours.

Choix des espèces

Nous allons utiliser des souris C57BL/6J. Contrairement aux autres modèles d’infection pour les flavivirus, ces souris ne sont pas immunodéprimées. Les modèles de transmission des flavivirus utilisent généralement des souris transgéniques avec une immunité innée déficiente. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. De plus, nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter les C57BL/6J par piqûre de moustique. Par ailleurs, les souris sont des animaux de petites tailles, faciles à manipuler. Les constantes physiologiques seront facilement mesurables avec des outils adaptés. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate, une piqûre par plusieurs moustiques simultanément et leur manipulation.

Deux chirurgies du crâne de deux heures chacune, puis une injection sous-cutanée quotidienne pendant six à neuf semaines : 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une lentille optique implantée dans le cerveau et vivent seules en cage individuelle huit à seize semaines, avec une alimentation contrôlée pour rester motivées à chercher des récompenses dans une enceinte de test. Le porteur affirme que son dispositif miniature a "gommé" la plupart des limitations éthiques de l'imagerie in vivo et n'entrave pas les comportements normaux de la souris, quand l'isolement prolongé et la restriction alimentaire figurent au même protocole. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et vérifier que la lentille était bien placée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer de quelle manière un traitement antidépresseur peut modifier le traitement de l’information et les codes neuronaux de la région cérébrale appelé hippocampe, une région essentielle pour la mémoire et l’adaptation aux conditions de stress. Cet objectif sera réalisé à travers (1) l’étude du comportement de souris traitées à un antidépresseur ou à un placebo lors de l’exposition à de nouveaux environnements couplée à (2) l’enregistrement simultané de neurones de la région d’intérêt. Pour cela, nous allons utiliser une technologie de pointe basée sur un système ultra miniaturisé et portatif permettant d’imager de manière longitudinale l’activité individuelle de multiples neurones en même temps chez l’animal libre de ses mouvements. La plupart des limitations habituelles éthiques et techniques liées à l’imagerie in vivo ont été gommées grâce à la conception de notre système d’imagerie : miniaturisation (moins de 2 cm et de 2 grammes) permettant de le placer directement sur la tête de l’animal de manière amovible comme un chapeau et sans entraver sans comportement normal. En outre, il permet de visualiser simultanément, à haute résolution et de manière répétée un nombre important de neurones par animal (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques implantables.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’apporter des éléments de connaissances des mécanismes et impacts des antidépresseurs à des niveaux cognitifs et neuronale permettant de comprendre comment les antidépresseurs peuvent induite leurs effets thérapeutiques et à l’avenir créer de nouvelles apporches favorisant ces effets

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 interventions chirurgicales (d’envrion 2h chacune) et un traitement antidépresseur quotidien par voie subcutanée pendant 6 à 9 semaines. Entrainements et tests comportementaux correspondant à une exploration libre de la souris d’une enceinte à la recherche de récompenses alimentaires (séance quotidienne de 30 à 40 minutes, ~6 semaines)

Impact sur les animaux

- Les chirurgies stéréotaxiques permettant l’injection du vecteur et l’implantation de la lentille optique avec son receptacle peuvent induire des douleurs post-opératoires légères à modérées avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal, les animaux étant traités avec un analgésique et récupérant rapidement de ce type de chirurgie. - Encombrement du système d’imagerie lors des tests, qui reste toutefois limité et léger (fibre optique et réceptacle seuls : < 0,2 g, miniscope < 2g), et n’entrave pas les mouvements et comportements normaaux de la souris après une première séance d’habituation. - Souris isolées après l’implantation du réceptacle, lors des phases d’entrainements et lors des tests (souris hébergées en cage individuelle pour une durée totale comprise entre 8 et 16 semaines). - Douleur légère au niveau du site d’injection (ip, sc)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer le cerveau pour confirmer par histologie le bon positionnement de la lentille optique dans la zone cérébrale à imager puis doser l’expression de protéines cérébrales et comment celle-ci a été influencée par le traitement antidépresseur.

Remplacement

Ce modèle s'intéressant à l’activité du cerveau, aux effets cognitifs et comportementaux à la suite de traitement antidépresseur. Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques. En outre, le nombre d'animaux pourra être réduit en fonction des résultats et notamment de l’efficacité de l’implantation (maximum 104 souris avec un taux de succès attendu de 50% d’après la société du système et notre expérience ; minimum 52 souris avec un taux de succès de 100%).

Raffinement

Les méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont optimisés : Les injections/implantations intracérébrales se feront sous anesthésie générale par des chercheurs formés et expérimentés. Les animaux recevront un traitement analgésique avant l’intervention chirurgicale, un traitement anti-inflammatoire après l’intervention et 24 heures après. Pendant la chirurgie, chaque animal sera placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie et les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire (si reprise de poids déficiente ou température élevée, traitement antibiotique de penicilline). En cas de plaie, les animaux recevront un traitement analgésique. La plaie est désinfectée par l’application de bétadine dermique. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être (hypothermie, prostration...) et intervenir si nécessaire (injection de saline pour l’hydratation, nourriture appétente...). Les injections sous-cutanées sont préférées aux intra-péritonéales pour leur plus grande sûreté et leur moindre invasivité. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites sont appliqués: les animaux surveillés sont pesés et oscultés quotidiennement (hydratation, température, état de la blessure si blessure). La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. D’un point de vue scientifique, le système utilisé représente la méthode d’imagerie de résolution neuronale la plus moderne, performante et spécifique, permettant de visualiser simultanément à haute résolution un nombre important de neurones (jusqu’à plusieurs centaines) offrant ainsi une qualité de données et une puissance statistique inatteignable avec les autres techniques d’imagerie.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des pathologies psychiatriques. En outre, les traitements de référence ont démontré leur efficacité dans cette espèce. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes sous-tendant les effets cognitifs et thérapeutiques des antidépresseurs qui sont prescrits en premier lieu pour la dépression majeure de l’adulte chez l’homme.

Un morceau de queue d'environ un millimètre coupé au ciseau chirurgical sur animal vigile, à dix jours de vie : tous les souriceaux nés dans ce projet subissent ce prélèvement pour génotypage. 370 souris porteuses d'un transgène humain lié à la maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 120 reçoivent des injections directement dans l'œil sous anesthésie, 280 passent trois ou quatre séances d'imagerie, 90 subissent une heure d'enregistrement de potentiels évoqués, et le porteur reconnaît que ces manipulations peuvent provoquer inflammation, opacité cornéenne ou paupières mi-closes. Quarante souris passent des "examens d'acuité visuelle" à trois reprises dans leur vie, sans que le RNT précise en quoi ils consistent.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative caractérisée par des troubles cognitifs et psychocomportementaux entraînant une perte d’autonomie. L’incidence de cette maladie est en augmentation avec le vieillissement de la population. Un diagnostic précoce représente un véritable enjeu de santé public. Aussi, déterminer des signes de diagnostic précoce, est indispensable pour le traitement dans les meilleurs délais des patients atteints de la maladie d'Alzheimer. Lors des études précédentes, il a été découvert qu’un modèle murin (souris) de la maladie d'Alzheimer, présentait des altérations au niveau rétine dès l’âge de 6 mois avec l’apparition de protéines Tau phosphorylés, ainsi qu’un déficit visuel accompagné d’un retard de la transmission synaptique au niveau de la couche des photorécepteurs de la rétine. Le but du présent projet est de comprendre le mécanisme de ces changements physiologiques précoces durant la maladie d'Alzheimer et de visualiser les protéines Tau phosphorylé (enchevêtrements) in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le cadre de ce projet sont d’établir un nouvel outil de diagnostic précoce de la maladie d’Alzheimer ainsi que de comprendre le mécanisme de ces changements physiologiques précoces durant la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques présentent un phénotype dommageable. Ces souris peuvent souffrir de déficit moteur à partir du 7ème mois. Au 10ème jour après la naissance, un prélèvement caudal d’environ un mm coupé au ciseau chirurgical à bout pointu sur animal vigile pour génotypage sera réalisé. Quelques secondes seront nécessaires pour réaliser cet acte. Tous les animaux naissants seront soumis à cet acte une seule fois dans leurs vies. Durant cette étude des examens d’acuité visuelle seront réalisés sur des souris vigiles. Quarante animaux seront soumis à cet examen d'une duré de quelques minutes trois fois dans leurs vie. Les examens d’imageries seront réalisé sur 280 souris anesthésiés. La procédure d'imagerie dure 5 à 10 min, le groupe de quarante souris non injecté sera soumis a ce test 3 fois dans leurs vie, les 240 souris injecté seront quant à elle soumise 4 fois à l'examen d'imagerie. Les injections en intraveineuses des molécules d’intérêt sur animal vigile sont une procédure à durée de moins d'une minute, cela concernera 120 souris. Les injections intraoculaire des molécules d’intérêt seront réalisés sur 120 animaux anesthésiés , cette procédure dure 5 à 10min. L'enregistrement des potentiels évoqués se fera une seule fois sur 90 animaux sous anesthésie générale, la durée de l'enregistrement est d'une heure. Des analgésiques seront donnés aux animaux afin de réduire la sensation de douleur. Les 370 souris seront euthanasiées par différentes méthodes réglementaires selon les besoins expérimentaux.

Impact sur les animaux

Les animaux développent une pathologie neurodégénérative avec l’âge et pourront donc présenter une perte de poids après le 7ème mois de vie ainsi qu’un déficit cognitif pouvant entraîner une agressivité accrue. Les animaux seront soumis à une biopsie caudale (environ 1mm) afin de réaliser l’identification génétique des animaux et à un transport de courte durée. Pendant les anesthésies, il est possible que les animaux présentent des difficultés respiratoires ou une mauvaise réaction à l'anesthésie pouvant aller jusqu’à l’arrêt cardio-respiratoire (très rare). Au cours de l’étude, et suite aux manipulations (imagerie de l’œil, injection intra-veineuse/intra-oculaire, etc.) une atteinte oculaire est possible telle que : inflammation, opacité cornéenne, paupières mi-closes, etc.

Devenir

La totalité des animaux seront euthanasiés en fin de période de maintien par différentes méthodes réglementaires pour la réalisation des différentes analyses.

Remplacement

Les animaux serviront à comprendre la réponse physiologique de la rétine ainsi que le développement de nouveaux marqueurs rétiniens lors de la maladie d’Alzheimer. La fonction rétinienne sera étudiée par imagerie et électrophysiologie in-vivo chez ce modèle. L’objectif de cette étude concerne l’exploration des relations cellulaires au sein de la rétine à ce jour aucun modèle cellulaire n’est assez complexe pour se substituer à mimer la rétine.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été établie et le nombre d’animaux utilisé a été estimé à 370 animaux en vue d’atteindre un compromis entre une puissance élevée et un nombre d’animaux nécessaire. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (cotons, tunnel en carton et un bâton en bois) alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine à partir du 7ème mois. La première pesée sera prise comme référence. L’atmosphère est contrôlée pour les conditions d’hébergement (température et hygrométrie stable). Les animaux bénéficieront si nécessaire d’une anesthésie gazeuse ou fixe par injection intrapéritonéale. Deux différents analgésiques seront aussi administrés pour réduire la douleur pendant les expérimentations. Tous signes d’inconfort ou d’atteinte oculaire sera pris en compte tels que l'apparence et la position anormale : poil ébouriffé, perte de poids (à partir de 6 mois), dos courbé, couché sur le côté ; comportements anormaux : agressivité soudaine, isolement, réduction de la mobilité. Les points limites sont : atteinte oculaire (cataracte, inflammation...), léthargie, immobilité, perte de 20 pour cent de poids et difficultés respiratoires (gasps). Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées et de notre expérience sur ce modèle dans notre laboratoire.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’être physiologiquement similaire à l’Homme. En plus la souris modèle présente un transgène humain. Ce modèle fait partie des modèles les plus utilisés pour l’étude de la maladie d’Alzheimer. Les souris seront étudiées à trois différents âges : - 3 mois : âge où un début de gliose et de perte synaptique sont observé - 6 mois : âge auquel les enchevêtrements sont observés avec un début de déficit cognitif - 9 mois : âge correspondant à une perte neuronale Ces âges ont été bien définis dans la littérature