Procédures modérées

Infestés volontairement par deux espèces de nématodes gastro-intestinaux, 40 agneaux subissent des prises de sang à la jugulaire deux fois par semaine et des prélèvements du contenu du rumen par une sonde enfoncée dans l'œsophage. Ils relèvent d'un niveau de souffrance modéré et passent des périodes en case individuelle sur caillebotis, parfois enfermés dans une chambre respiratoire pour mesurer le méthane qu'ils émettent. Le porteur écrit que l'infestation parasitaire n'entraîne aucune douleur ni nuisance, tout en fixant comme points limites une anémie sous 18 % d'hématocrite, une perte de 15 % du poids en trois semaines et l'apparition de diarrhées. Tous sont abattus à la fin de l'essai pour compter les parasites de leur tube digestif et analyser leur muscle, la qualité de la viande figurant parmi les résultats attendus d'un aliment destiné à la commercialisation.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester un prototype d’aliment contenant un sous-produit de l’agro-industrie chez des agneaux en croissance, parasités et non parasités par des nématodes gastro-intestinaux (NGIs). Des mesures de quantités ingérées, de digestibilité, d’émission de méthane entérique, de bilan azoté, de performance, de parasitisme et de qualité de la viande seront réalisées in vivo ou après abattage. Une de nos hypothèses de travail est que le parasitisme augmente indirectement la production de méthane chez les ruminants. Nous chercherons donc à savoir dans quelle mesure le parasitisme par les NGIs augmente les émissions de méthane tout en affectant négativement la santé digestive des animaux. La seconde hypothèse est que la présence de métabolites secondaires bioactifs en concentration suffisante dans la ration contribue à moduler les fermentations ruminales, réduire l’émission de méthane et perturber la biologie des NGIs. Dans ce cadre, nous testerons un prototype d’aliment incluant un sous-produit de l’industrie de la vigne (issus de l’économie circulaire et locale) riche en composés polyphénoliques et préalablement sélectionné pour sa capacité à réduire à la fois les émissions de méthane et le parasitisme (études in vitro réalisées au préalable afin de choisir le meilleur sous-produit parmi 16 d’entre eux, sous-produits ayant un effet à la fois sur les larves et œufs de 2 espèces de NGIs et la production de méthane). Dans notre étude, des analyses de composition du microbiote ruminal et de la qualité de la viande seront également réalisées pour accéder aux mécanismes d’action et aux performances des animaux, respectivement. Tous les ingrédients présents dans le prototype d’aliment testé ont une autorisation de mise sur le marché en tant que complément alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont dans un premier temps une réduction des émissions de méthane et une perturbation de la biologie des NGIs chez les animaux alimentés avec le prototype d’aliment riche en polyphénols. Ce prototype est formulé pour garantir une bonne productivité des agneaux (gain de poids des animaux), et une bonne qualité de la viande (à travers le profil en acides gras du muscle notamment). De par la présence du prototype riche en polyphénols, il est aussi attendu des changements dans la composition du microbiote ruminal entre les animaux parasités et non parasités et ceux alimentés avec ou sans le prototype. L’aspect innovant de ce projet est lié à la valorisation de sous-produits de l’agro-industrie dans l’alimentation animale, mais aussi à la compréhension du lien entre la production de méthane, le parasitisme et le microbiote ruminal. A moyen terme, cette expérimentation a pour but de mettre sur le marché un aliment qui pourrait conduire à prévenir le parasitisme, réduire l’utilisation des anthelminthiques de synthèse, améliorer la santé des animaux, contribuer à réduire les émissions de gaz à effet de serre, en promouvant l’économie circulaire et locale à travers la valorisation de sous-produits non utilisés pour l’alimentation humaine. D’un point de vue sanitaire, les anthelminthiques de synthèse sont les médicaments couramment utilisés en médecine vétérinaire pour gérer les infestations parasitaires. Cependant, des métabolites ou des molécules non dégradées se retrouvent dans les produits dédiés à la consommation humaine (viande, lait, fromage), et peuvent impacter indirectement la santé humaine. Pour certaines molécules, des conséquences environnementales ont aussi été signalées. Des temps d’attente sont donc à respecter avant de commercialiser et consommer ces produits animaux. De plus, ces dernières années, une multiplication des résistances aux anthelminthiques de synthèse est observée dans les élevages ovins et caprins. Pour pallier à ces problèmes, l’exploitation dans la ration de métabolites secondaires bioactifs comme les polyphénols (flavonoïdes, tanins) naturellement présents dans certaines ressources végétales est une méthode alternative prometteuse à l’emploi des traitements chimiques. Ces métabolites sont en effet connus pour impacter et affecter les parasites et donc à terme améliorer la santé des animaux.

Procédures

Les prises de sang se feront deux fois par semaine après trois semaines de la phase 3 et pendant la phase 4, à hauteur de 5mL. Le contenu ruminale par sonde oesophagienne sera prélevé entre chaque phase, entre 5 et 10mL. Les fèces seront collectées, à une quantité minimale de 3 grammes pour les analyses de parasitologies.

Impact sur les animaux

La procédure de mesure d'ingestion et de digestibilité implique une période de mesures individuelles en dispositif de case individuelle sur caillebotis en bois (qui sera soit placée dans la chambre respiratoire, soit placée au sol). Ce dispositif individuel peut entrainer du stress aux animaux lié à leur isolement partiel malgré une installation dans une même pièce. Pour pallier à ce stress, des phases d’habituation au dispositif seront mises en place. De plus, la stalle permet aux agneaux de se lever et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir, se sentir et de s’entendre. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde œsophagienne. Ce prélèvement peut engendrer du stress physique, une douleur ponctuelle et une diminution de l’ingestion L’ensemble de ces manipulations dure 1 à 3 minutes par animal et sera réalisée par du personnel compétent. Les prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. Même si les prélèvements se feront à une fréquence faible (deux fois par semaine) par du personnel expérimenté, il est possible de provoquer des hématomes, induisant une douleur légère. L’acte d’infestation parasitaire n’entraine aucune douleur ou nuisances à l’animal. Les 2 espèces de NGIs utilisées dans le protocole sont naturellement présentes dans les élevages et pourraient avoir des conséquences pathophysiologiques différentes. L’espèce de l’abomasum (Haemonchus contortus) est hématophage et peut provoquer avant tout une anémie ; l’espèce intestinale (Trichostrongylus colubriformis) peut induire des lésions des muqueuses et des perturbations de la physiologie digestive (mal digestion/mal absorption) pouvant conduire à des diarrhées. Une perte d’appétit et une perte de poids dues à la présence de ces parasites peuvent se traduire par des changements de comportements et aussi par des signes cliniques (anémie, diarrhée).

Devenir

Tous les animaux seront abattus à l'issue de la procédure afin de permettre des prélèvements de contenus ruminaux et intestinaux (pour quantification et étude des parasites présents et des différents stades associés), ainsi que des prélèvements de tissus musculaires.

Remplacement

Plusieurs essais in vitro ont été réalisés en amont de cet essai pour choisir le sous-produit à tester in vivo (essais de fermentation ruminale in vitro pour évaluer le potentiel de réduction des émissions de CH4 et essai in vitro pour évaluer le potentiel anthelmintique sur 2 espèces de parasites). L’étude in vivo est indispensable pour étudier le lien entre le parasitisme et les émissions de méthane (aucun essai in vitro ne regroupe les deux aspects) ainsi que les effets sur la croissance des agneaux et sur le microbiote ruminal. La mesure in vivo de digestibilité est la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages et des rations. Des méthodes alternatives (in vitro) existent pour classer différents aliments en fonction de leur digestibilité mais sont moins fiables. La mesure de digestibilité in vivo est incontournable pour une caractérisation fine et l'établissement utilisateur a obtenu l'accréditation du comité d’éthique régional. De nombreuses mesures ne sont possibles qu’en expérimentation in vivo : bilan azoté (analyses sur les urines, les fèces et le sang), mesures de parasitologie (évaluation individuelle indirecte de la charge parasitaire par analyses coproscopiques sur les fèces et suivi de l’anémie par prise de sang), étude des performances zootechniques (gain de poids) et de la qualité de la viande sur la carcasse. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux).

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé et réduit au minimum pour : - S’assurer d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour des analyses statistiques fiables des paramètres de parasitologie (mesure de coproscopie individuelle) et de pathophysiologie (hématocrite) sur les animaux infestés - Tenir compte de la variabilité individuelle observée dans la composition du microbiote digestif - Assurer des répétitions pour obtenir la puissance statistique nécessaire pour arriver à faire le lien entre infestation parasitaire et émission de méthane - Etudier et différencier les effets avec et sans le prototype d’aliment riche en polyphénols, mais aussi avec et sans infestation parasitaire. Comme la variabilité entre animaux est plus importante pour l'ingestibilité que pour la digestibilité (la variabilité entre animaux de l’ingestibilité est de l’ordre de 9 % alors que celui de la digestibilité est de l’ordre de 3 %), il est recommandé d’utiliser un minimum de 8 animaux. Ce nombre est aussi le minimum d’individus requis pour interpréter les données liées aux infestations par les NGIs. Des conséquences cliniques trop sévères associées aux parasites pouvant entrainer le retrait de l’expérimentation d’un animal, 2 animaux parasités par période expérimentale seront gardés en réserve, alimentés avec et sans le prototype d’aliment riche en polyphénols. 4 comparaisons seront réalisées d’un point de vue statistique. Une première entre les animaux parasités et les animaux non-parasités nourris sans le prototype, une seconde identique mais nourris avec le prototype, une troisième entre les animaux parasités, avec et sans le prototype, et une quatrième entre les animaux non-parasités, avec et sans le prototype. Des analyses de comparaison de moyennes et de variances sont prévues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d’expérimentation agréé. La taille des stalles de digestibilité est adaptée au gabarit de l’animal, permet aux agneaux de se lever et de se coucher sans entrave. Les animaux peuvent se voir, s’entendre, se sentir et interagir. Ils auront eau et alimentation à volonté, et une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les fèces et les urines seront récoltés tous les jours dans les bacs situés sous le caillebotis, pesés, et échantillonnés. L’état de santé des agneaux sera évalué quotidiennement par un animalier habilité. Tout changement de comportement (abattement, baisse d’appétit), comportement anormal, ou signe subclinique (ex diarrhée) considéré comme points limites sera signalé et pris en charge, consigné dans le cahier d’expérimentation. Des évaluations comportementales et des mesures sanguines et fécales permettront de surveiller la santé globale de l’animal et d’objectiver les conséquences. Les mesures sanguines permettront de contrôler toute anémie importante (hématocrite

Choix des espèces

L’étude vise à tester un prototype d’aliment pour ruminant, qui réduirait le parasitisme et les émissions de méthane. Notre étude a pour objectif de faire le lien entre ces 2 problématiques via un essai in vivo, car aucune expérimentation in vitro n’est possible pour étudier ces 2 paramètres ensemble. D’autres mesures seront réalisées telles que l’ingestion, le gain de poids vif, le bilan azoté et la qualité de la viande : ces mesures sont impossibles à obtenir sans l’utilisation d’animaux. Les ovins sont des petits ruminants très sensibles au parasitisme, c’est pourquoi ils seront notre espèce dans cette étude. Le modèle de l’agneau en croissance permet de se placer au plus près des conditions d’élevage et de mesurer les impacts sur la productivité des animaux à travers leur gain de poids. Agneaux en croissance (entre 3 et 4 mois en début d’essai et 6 à 7 mois en fin de l’essai en fonction des périodes). Ce stade est favorable pour étudier les effets d’un prototype d’aliment sur la performance animale en vue de la commercialisation des carcasses.

Chacun des 15 360 poulets reçoit, à son arrivée, une dose exacte de bactérie pathogène administrée par une sonde de gavage. Tous relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec pour effets attendus un retard de croissance, une boiterie notée au Gait Score et des fèces plus liquides. L'objet déclaré est de caler un modèle d'infection reproductible chez le poulet de chair à croissance rapide, afin d'y tester des additifs alimentaires censés remplacer les antibiotiques et améliorer les "performances zootechniques". 1 250 oiseaux sont tués pour des biopsies du foie, de la rate et de la moelle osseuse, et les 14 110 autres partent, à 32 jours, dans le circuit alimentaire humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer un modèle répétable d’inoculation d’une souche pathogène d’E. cecorum, afin d’en préciser et d’en mesurer les effets sur les poulets de chair. Le modèle d’inoculation doit permettre de tester des solutions alternatives à l’utilisation d’antibiotique, en favorisant l’intégrité intestinale dans le but de prévenir la translocation d’E. cecorum.

Bénéfices attendus

L’efficacité des additifs alimentaires apportés dans la ration des poulets de chair vis-à-vis des impacts des pathologies liées à E. cecorum sera évaluée par rapport au lot témoin. On attendons un effet positif sur : - Les performances zootechniques des animaux (poids moyen, gain moyen quotidien, consommation, journalière et l’indice de consommation) - La qualité de l’intégrité intestinale - La qualité du système locomoteur

Procédures

Durée prévue du protocole : 32 jours Mesures prévues : 0/ Les animaux seront infectés par voie orale, à la mise en place. Chaque animal sera inoculé par voie orale de façon individuelle par sonde de gavage, ainsi la quantité réelle administrée correspondra à la dose exacte de bactérie (et sera donc contrôlé et répétable). Soit 1 intervention de 3h en parallèle de la mise en place. 1/ Pesée (4 interventions de 2h) des animaux par case (64 animaux) le jour de leur arrivée, à 10 jours d’âge et 21 jours d’âge, et la veille de leur départ, afin d’établir pour chaque case le poids moyen des poulets, leur croissance et l’indice de consommation. Les éventuels morts seront ramassés chaque jour et pesés individuellement. Ils seront pris en compte dans le calcul des indices. 2/ Des écouvillons cloacaux à 0 et 5 jours d’âge (2 interventions de 2h) pour mesure la qualité d’infection. 3/ Des prélèvements de fèces à 10, 21 et 32 jours d’âge (3 interventions de 1h) : la boite est placée dans chaque case la veille de la récolte. Les fientes prélevées permettront de mesures des facteurs de l’intégrité intestinale. 4/ L’infection d’E. cecorum sera évaluée grâce à des biopsies au niveau du foie, de la rate, et de la moelle osseuse seront réalisées sur un total de 48 oiseaux, à 10 et 21 jours d’âge (2 interventions de 1h). Au total, il y aura 5 interventions à des âges différents, représentant 17h d'intervention : J0 : Pesée + Mise en place + Ecouvillons cloaquaux = 4h ; J5 : Ecouvillons cloaquaux = 2h ; J10 Pesée + Prélèvement fèces + Biopsies = 3h + 1h ; J21 : Pesée + Prélèvement fèces + Biopsies = 3h + 1h ; J32 : Pesée + Prélèvement fèces = 3h.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront montrer les effets indésirables suivants : un retard de croissance, une moindre mobilité des animaux (notation de boiterie via le Gait Score) et un aspect des fèces plus liquide.

Devenir

Procédure 1 : Nombre d'animaux qui seront autopsiés au total sur le projet : 1250 (à différents âges pour des biopsies). Nombre d'animaux gardés en vie (replacés afin d’être valorisés dans le circuit alimentaire humain, étant conforme au paquet hygiène ) : 14110.

Remplacement

Avant de tester un additif sur poulet, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poulets nous travaillons avec des modèles in vitro (analyses en laboratoire) permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés in vivo, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux. De plus, compte tenu de notre expérience d’essai (plus de 20 ans de données dans nos fermes de recherche zootechniques), nous avons accès à une très grande quantité de données. Toutes ces data nous permettent de réaliser des tests statistiques avant chaque essai, pour valider que nous aurons une probabilité importante d’obtenir des résultats significatifs avec le plus faible nombre d’animaux possible.

Réduction

Nous utilisons au total 15 360 poulets sur ce projet. L'utilisation d'animaux homogènes sur les plans biologiques et sanitaire, nous permet de réduire la variabilité d'un individu à l'autre et donc d’obtenir un nombre minimum d’individus par lot. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les poulets seront élevées dans le respect de la réglementation : logées sur aire avec copeaux et auront constamment accès à une eau propre ainsi qu’à l’aliment. Ils vivront en groupe et ne seront pas isolées. La surveillance des animaux se déroulera de manière très rapprochée puisque des prélèvements sont prévus toutes les semaines et une surveillance quotidienne sera faite par l’animalier.

Choix des espèces

Les infections à Enterococcus cecorum provoquent spécifiquement chez le poulet (Gallus gallus) des problèmes locomoteurs associés à une altération du bien être animal, et une baisse des performances zootechniques. Les poulets utilisés auront de 1 à 32 jours d’âge, soit la durée classique d’élevage d’une poulet de chair standard.

Tués au terme d'une dernière intervention menée sous anesthésie sans réveil, pour que leurs organes soient prélevés, 720 souris et 720 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont ovariectomisées à quatre semaines pour reproduire une ménopause, reçoivent des hormones jusqu'à six mois, subissent de deux à quatre chirurgies et passent des séjours de vingt-quatre heures en cage métabolique individuelle, jusqu'à deux fois par semaine. S'y ajoutent jusqu'à vingt-quatre prélèvements de sang, à la queue ou à la veine saphène, sur animal vigile. Le porteur teste des molécules dont ses clients ne lui communiquent ni la nature ni les effets secondaires possibles, prévoit trente études sur cinq ans, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer la taille des groupes, arrêtée à huit animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.

Procédures

Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. Si un animal présentait des symptômes pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière, isolé et soigné si besoin selon les symptômes. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h ou si un point limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux lors des contentions.

Choix des espèces

Ces procédures seront effectuées chez des animaux « normaux » et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes, de l’un de ses sous-types, ou de l’une de ses voies d’action (nucléaire ou membranaire). Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter toute imprégnation hormonale. Le traitement hormonal sera administré 1-2 semaines après l’ovariectomie et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.

Des souris de 8 à 12 semaines sont retenues pour un muscle jugé proche de celui de l'humain, et pour un stade jeune adulte qui favorise la pousse tumorale. Elles sont 60, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une bague à l'oreille, un prélèvement au bout de la queue, puis une greffe de cellules tumorales dans le flanc, avant vingt et un jours de pesées quotidiennes et de mesures de tumeur trois fois par semaine, maintenue à la main une quinzaine de secondes à chaque fois. La tumeur peut affaiblir l'animal jusqu'à l'empêcher d'atteindre sa nourriture, et la mise à mort sert à prélever un tissu musculaire que le porteur indique ne pas pouvoir analyser sur un animal vivant.

Objectifs

Le développement d’une tumeur au sein du corps humain a des répercussions sur l’organisme entier. Plus particulièrement, il a été démontré que la croissance d’une tumeur conduit à une fonte du tissu musculaire notamment en altérant les capacités de régénération musculaire. Nous avons observé qu’un groupe de gènes est capable de favoriser la régénération musculaire. L’objectif du projet est d’évaluer l’impact de l’expression de ces gènes sur le système musculaire chez un modèle murin de greffe de cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Le développement d’une tumeur engendre une fonte et une faiblesse du tissu musculaire, réduisant drastiquement la qualité et la durée de vie des patients ainsi que l’efficacité des traitements. Les bénéfices attendus sont donc d’avoir une meilleure compréhension des dysfonctionnements musculaires impliqués et de concevoir de nouvelles thérapies non pharmacologiques.

Procédures

Avant le début de la procédure, les souriceaux sont identifiés par la pose d’une bague à l’oreille et un prélévement est effectué afin d’identifier la génétique de chaque individu. Ces deux procédures sont réalisées lors de la même anesthésie générale, d'une durée inferieure à 1 minute par animal. Des cellules tumorales seront greffées dans le flanc des animaux. Cette procédure n’est réalisée qu’une fois par animal et sous anesthésie générale (durée totale de l’anesthésie inférieure à 5 minutes par animal, l’injection dure une quinzaine de secondes). Cette implantation va engendrer le développement d’une tumeur qui va provoquer une perte de poids. Le poids des souris, sera mesuré tous les jours et le diamètre des tumeurs 3 fois par semaine, pendant 21 jours ou jusqu’à un point limite. Pour permettre ces mesures, les animaux seront maintenus à la main pendant une quinzaine de secondes.

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables modérés sont attendus du fait d’un cumul d’actes (pose de la bague d’identification, prélèvement du bout de la queue, contentions, injections, mesures des tumeurs, anesthésies), qui induisent du stress. Le développement de la tumeur peut induire une perte de poids et diminuer les défenses immunitaires. La fonte musculaire peut engendrer une faiblesse de l’animal et une difficulté à accéder à la nourriture et au biberon.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort car le projet nécessite une analyse détaillée du tissu musculaire qui ne peut pas être réalisée sur un animal vivant.

Remplacement

Afin d’évaluer les effets de la perte de poids et de la fonte musculaire induites par le cancer, nous n’avons d’autres choix que d’utilisé un système intégré, en l’occurrence le modèle murin. En effet, il est impossible de modéliser une perte de poids à l’aide de modèle in vitro.

Réduction

L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales. Des analyses statistiques ont été réalisées afin de déterminer le nombre minimal requis pour générer des résultats significatifs.

Raffinement

Les protocoles les moins invasifs et les moins douloureux possibles sont privilégiés. Le prélevement pour identification de la génétique de chaque individu est réalisé sous anesthésie générale. Les procédures expérimentales utilisées incluent un recours systématique à l'anesthésie générale adaptée lors de l’inoculation des cellules tumorales. Avant le début de l’expérimentation, les animaux seront habitués à être manipulés pendant une semaine dans le but de réduire leur stress lorsque l’expérimentateur devra les manipuler dans le cadre des suivis de pousse tumorale. Une fois les implantations réalisées, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin de repérer au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. L‘implantation des cellules cancéreuses impliquant le développement tumoral et une fonte musculaire, un suivi de poids des souris sera effectué quotidiennement ainsi que de volume des tumeurs trois fois par semaine. De la nourriture et un hydrogel seront déposés à même la litière afin de prendre en compte la réduction de la mobilité de l’animal et le risque de ne plus pouvoir accéder facilement à la nourriture avec le développement de la tumeur. Une grille de cotation des critères de bien être est utilisée pour déterminer les points limites de manière objective. Notre expérience montre que cette stratégie est suffisamment prédictive pour que l’ensemble des animaux soit inclus dans l’étude.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris car elle présente un tissu musculaire très proche de celui de l’Homme dans sa structure et son fonctionnement. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines, nous permettant de mener nos projets sur un stade jeune adulte avec des muscles complètement développés. De plus, le stade jeune adulte favorise la pousse tumorale.

Dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, avec des cellules Natural Killer affaiblies pour qu'elles ne rejettent pas la greffe, 100 souris femelles de sept à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des lymphocytes T humains porteurs d'un gène de mort, puis le médicament censé déclencher ce gène, en deux injections au plus sous anesthésie et analgésie, avec trois pesées en dix jours et un prélèvement de sang pour douze d'entre elles. Cette étude pilote vise à montrer qu'on peut détruire à volonté des cellules thérapeutiques devenues dangereuses chez un patient, la preuve ayant déjà été obtenue in vitro puis chez la souris avec un gène rapporteur fluorescent. Toutes sont tuées pour que leurs tissus et organes soient prélevés.

Objectifs

Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement de maladies est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever les LT des patients pour les modifier génétiquement et les lui réinjecter dans le but de reconnaître puis d'éliminer les cellules cancéreuses. Leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tels que la production massive de cytokines suivie par des neurotoxicités. Dans ce projet nous souhaitons démontrer la possibilité de pouvoir éliminer de façon contrôlée les cellules T génétiquement modifiées si des effets adverses apparaissaient. Pour contrôler ces cellules en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvées. L’activation du gène suicide par le médicament va déclencher la mort du LT. Nous avons validé le concept in vitro en substituant le gène suicide par un gène rapporteur fluorescent et montré que notre médicament permettait d’activer ce gène rapporteur en activant un signal fluorescent dans la cellule. Puis, in vivo, chez la souris nous avons confirmé que ce médicament est capable d'induire l'expression de ce gène rapporteur. L’objectif de ce projet est de déterminer l'efficacité de notre médicament à induire la mort de LT humains équipés, cette fois-ci, d'un gène suicide après une greffe chez la souris .

Bénéfices attendus

Le bénéfice de cette étude pilote préclinique est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.

Procédures

Les souris seront soumises à 3 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile) à J0, J5 et J10. Deux injections maximum sur animal anesthésié et analgésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Un prélèvement de sang sur animal anesthésié sera réalisé sur 12 animaux.

Impact sur les animaux

Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et du médicament ainsi que le prélèvement de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.

Remplacement

Des tests in vitro réalisés ont montré que le médicament utilisé est capable d'activer le signal de mort dans des lymphocytes T humains modifiés. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.

Réduction

Il s'agit d'une étude pilote répartie en deux étapes comportant un effectif de 100 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 10 animaux maximum tout en permettant une analyse à l'aide d’outils statistiques appropriés sur les prélèvements analysés.

Raffinement

Les souris seront acclimatées au moins 7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Durant les 10 jours de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.

Choix des espèces

Afin de pouvoir greffer des lymphocytes T humains, une immunodéficience est nécessaire. Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéprimée caractérisée par une absence des cellules T fonctionnelles et des lymphocytes B, une diminution des activités des cellules présentatrices d’antigènes, des cellules myéloïdes et des cellules Natural Killer. Ces caractéristiques évitent le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-20 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.

Une injection sous la peau chaque jour pendant sept semaines, de la septième à la quatorzième semaine de vie : 96 souris subissent ce traitement, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est anesthésiée, reçoit de l'insuline en intraveineuse, puis est mise à mort cinq minutes plus tard. Le porteur reconnaît que la répétition des injections est "le point critique" du protocole, la faible stabilité de la molécule empêchant l'usage de pompes implantables, et il annonce des seringues fines et des points d'injection variables. Il qualifie les autres procédures de "classe légère" et parle d'un "modèle murin présentant une cardiomyopathie diabétique", sans dire comment ce diabète et cette atteinte du cœur sont obtenus.

Objectifs

Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être impliquée dans la prolifération et le remodelage cellulaire, la beta caténine, dans le développement de la cardiomyopathie diabétique. A l’aide d’un modèle murin présentant une cardiomyopathie diabétique (hypertrophie et dysfonction diastolique), nous allons déterminer si l’inhibition de la beta caténine avec un inhibiteur pharmacologique (ICG-001) améliore les paramètres cardiaques. Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant au développement de la cardiomyopathie chez les patients présentant un diabète de type deux et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.

Bénéfices attendus

Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux maladies cardiovasculaires, les complications cardiaques ont été largement étudiées dans une multitude de contextes physiopathologiques. Les publications sur le rôle de la beta-caténine dans l’hypertrophie cardiaque liée au diabète de type deux sont quasi inexistantes dans la littérature scientifique. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer avec a la clé de nouveaux traitements. Nos résultats préliminaires obtenus dans un modèle murin de cette pathologie montrent que la voie de la beta-caténine est augmentée dans les cœurs malades comparé aux cœurs sains. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité de la beta-caténine pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer le risque cardiaque chez les patients présentant un diabète de type 2. Une telle approche sera bénéfique pour les patients diabétiques mais aussi pour la population générale en promulguant des recommandations pour les personnes à risque.

Procédures

Dans les deux procédures de cette saisine, une dose journalière de l’inhibiteur de la beta-caténine ou du véhicule sera délivrée par injection en sous cutané et ce pendant sept semaines, de 7 à 14 semaines d’âge. Pour le groupe dédié au test de résistance à l’insuline, les animaux seront anesthésiés et injectés avec de l’insuline en intraveineuse et seront euthanasiés 5 min post injection.

Impact sur les animaux

Le point critique est la répétition des injections en sous-cutané. La stabilité faible de l’ICG ne permet pas d’utiliser des pompes alzet. Afin de limiter la souffrance liée à la répétition des injections, nous utiliserons des seringues microfine pour insuline, nous ferons varier les points d’injection et utiliserons un volume d’injection faible injecté. Les autres procédures sont de classe légère, il y a peu d’effets indésirables attendus.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.

Remplacement

Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des cardiomyocytes en culture. Ce modèle de culture permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle de la beta-caténine dans l’hypertrophie des cardiomyocytes et également de la détermination des mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu . L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 96 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de l’apparition des complications cardiaques associées dans notre modèle murin de cardiomyopathie diabétique, et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation. Nous utiliserons des tests non paramétriques pour tester la valeur statistique de nos données.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance chez les animaux, un suivi clinique quotidien des animaux est réalisé par du personnel formé. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux et avec un enrichissement adapté à leur besoin. Pour les expérimentations, les gestes invasifs sont réalisés sous une couverture anesthésique analgésique adaptée.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (diabète de type 2 et cardiomyopathie pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence cardiaque d’une dysfonction adipocytaire à l’origine dans notre modèle murin en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. De plus, la délétion du gène causant la cardiomyopathie diabétique, n’a été réalisé que dans le modèle murin. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition de la beta-caténine. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur à 7 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition sur le cœur au cours du développement de l’organisme.

1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après leur mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux chimiothérapies ou un immunostimulant dans l'abdomen, puis subissent de trois à neuf prélèvements de sang dans l'orbite de l'œil, sans anesthésie. Le porteur décrit des effets de la chimiothérapie qui peuvent durer plusieurs mois, diminution du poids, altérations du comportement et du pelage, et cherche à comprendre comment ces traitements dérèglent la moelle osseuse avant l'apparition d'une leucémie secondaire. Il écrit aussi que "les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux".

Objectifs

La chimiothérapie permet de guérir un grand nombre de cancers. Actuellement une grande partie de ces traitements ne sont toujours pas « ciblés » sur la tumeur. Ils empêchent la multiplication des cellules du cancer ce qui est l’objectif désiré, mais empêchent aussi la multiplication de certaines cellules saines notamment dans la moelle osseuse. La moelle osseuse est le lieu de fabrication des cellules du sang à partir des cellules souches. La chimiothérapie fait baisser transitoirement les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes (désignés sous le terme de lignées sanguines). Malheureusement, dans un certain nombre de cas rares, les traitements anti-cancéreux sont eux-mêmes à l’origine du développement de maladies cancéreuses de la moelle osseuse comme les leucémies aigues et les myélodysplasies dites secondaires des années après la guérison du premier cancer. Ce projet vise à comprendre comment la chimiothérapie affecte les cellules de la moelle et la production des lignées sanguines avant l’apparition d’une maladie leucémique secondaire. Pour mener à bien notre projet, nous allons étudier la production des trois lignées sanguines issues de la moelle osseuse, suivre les dérèglements induits au cours du temps par la chimiothérapie et la comparer à un autre facteur perturbant la production des lignées sanguines temporairement et qui n’induit pas de maladies leucémiques secondaires. Nous souhaitons étudier la quantité des cellules souches de la moelle, avant et après traitement par chimiothérapie et par l’agent perturbateur. Les cellules souches sont une population rare, capable de fabriquer toutes les autres lignées, mais aussi de se maintenir tout au long de la vie. Notre hypothèse est que la chimiothérapie diminue le nombre de cellules souches et que cette diminution favorise à son tour le développement précoce de la leucémie en favorisant des cellules qui prolifèrent plus. Notre projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, les phases précoces du développement leucémique favorisé par la chimiothérapie. Une meilleure compréhension de ces phases précoces permettra de surveiller les patients porteurs de cancers traités par chimiothérapie et ainsi de prévenir la survenue d’un second cancer, souvent fatal, chez des patients souvent guéris d’une première maladie grave. De plus, la capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié.

Bénéfices attendus

La capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié. Nous pensons que notre projet à son terme apportera des avancées significatives dans ce domaine et participera ainsi à l’amélioration du traitement du cancer et notamment des leucémies . Il permettra de mieux connaître ce qui induit l’apparition de leucémie secondaire et comment le prévenir.

Procédures

Dans ce projet, les souris vigiles recevront 2 traitements par voie intra-péritonéale. Le 1er traitement sera administré à raison d’une injection par jour pendant 3 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) puis 4 mois après ce 1er traitement les souris recevront un 2ème traitement. En fonction de la molécule, ce 2nd traitement sera administré à raison d’une injection par semaine pendant 6 semaines ou d’une injection à jour 1 et jour 3 ou d’une injection unique (durée de chaque injection inférieure à 10 sec) . Entre 3 et 9 prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, sans anesthésie, seront aussi effectués. Un prélèvement sanguin après le premier traitement et entre 2-6 prélèvements une fois par mois maximum après le deuxième traitement. Chaque prélèvement sanguin se fera en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous administrerons aux souris deux chimiothérapies et un immuno-stimulateur par voie intra-péritonéale. La douleur sera une nuisance directe associée à cet acte. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage qui peuvent durer sur plusieurs mois. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique est généralement observée pendant 3 jours après traitement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques (cellules sanguines) matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, l’hématopoïèse se développent durant des mois ou des années et il n’est pas encore possible de les reproduire in-vitro. C’est chez elle que des premiers résultats précliniques ont été obtenus pour modéliser les leucémies secondaires. Il n’existe donc pas de méthode alternative à l’expérimentation animale. En revanche, notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur de nombreuses observations cliniques chez des patients ayant reçu de la chimiothérapie pour le traitement de leur cancer.

Réduction

Le choix des traitements et leurs doses dans ce projet provient des résultats positifs de notre précédente étude. Nous effectuerons des suivis longitudinaux des souris, minimisant leur utilisation. L’évaluation du nombre d’animaux nécessaire est aussi le fruit d’analyses statistiques basés sur le résultat de précédentes expériences effectuées dans notre laboratoire ou dans la littérature. Ainsi nous avons identifié que 8 animaux étaient suffisants pour avoir assez de pouvoir statistiques.

Raffinement

Des protocoles d’intervention en cas de début de souffrance seront mis en place (réchauffement, enrichissement de l’alimentation et du milieu), ainsi que des critères stricts d’arrêt de l’expérimentation en suivant une grille de score. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de l’hématologie, les animaux sont suivis trois fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique avec apparition de fièvre est généralement observée mais que nous n’avons jamais observée dans les doses que nous utilisons. La surveillance à l’aide de la grille de score permettra de réduire au minimum la souffrance animale : dès qu’un signe de souffrance débutante sera détecté, l’expérimentation sera interrompue. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, nous arrêterons les traitements administrés, et si les symptômes persistent, l'animal sera mis à mort dans les 24h heures .

Choix des espèces

Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, il n’est pas encore possible de reproduire in vitro l’hématopoïèse car elle se développent durant des mois ou des années et dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in-vitro. L’hématopoièse dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in vitro. De plus, l’induction de code-barres ou du rapporteur de cycle cellulaire se fait in vivo, grâce à deux lignées de souris spécifique excluant la possibilité de modèle in vitro. A noter cependant que notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur l’étude de nombreuses cohortes cliniques de patients traités pour le cancer et ayant développé ensuite un cancer secondaire. Les animaux seront adultes. Nous souhaitons étudier l’effet de la chimiothérapie sur les cellules souches hématopoïétiques à l’âge adulte car c’est l’âge de survenue des cancers secondaires.

150 lapins vont recevoir dans le derme, vigiles ou anesthésiés, des produits de comblement destinés au marché de la chirurgie esthétique et reconstructrice, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent ensuite des scanners sous anesthésie générale, jusqu'à trois le premier jour, un par jour les quinze jours suivants, un par semaine pendant deux mois, puis un par mois jusqu'à la fin de l'étude. Le porteur situe ce travail sur un marché "en constante évolution" et parle d'un "enjeu de santé publique", en citant la restauration du visage après un accident et la perte de graisse faciale liée au VIH. 140 lapins sont tués pour l'analyse histologique du site d'injection, les 10 autres pouvant être adoptés ou replacés si aucun prélèvement n'est requis.

Objectifs

Le marché mondial de la chirurgie reconstructrice est en constante évolution avec des demandes pour des procédures de moins en moins invasives. Les dermal fillers (remplisseurs cutanés) sont généralement utilisés pour des traitements peu invasifs, tels que la restauration du volume du visage dans des cas de dégradations physiques sévères (lésions postaccidentelles, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ... ). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc un enjeux de santé publique. Ce projet a pour objectif de tester et d’évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur le modèle lapin. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance et potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections dans le derme. Lors de ce projet, l'imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l'évolution (volume, hauteur, étalement, densité et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera aux développements de nouveaux produits dermatologiques de comblements et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer des produits plus performants et persistants.

Procédures

Les animaux pourront être vigiles ou anesthésiés lors de l’injection des produits expérimentaux intradermique en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en maximum 10 minutes (anesthésie comprise) Des examens scanners seront réalisées sous anesthésie générale. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens scanners sera de maximum 3 acquisitions par jour le premier jour, puis maximum 1 acquisition par jour pendant les 15 jours suivants, puis maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les manipulations bien que réalisées avec le plus grand soin par du personnel formé seront susceptibles d’induire un stress chez le lapin. De plus, l’injection de produits par voie intradermique peut induire une douleur potentielle causée par une potentielle inflammation (rongeur et/ou gonflement) au site d’injection.

Devenir

Si des prélèvements du site d’injection ou d’organe doivent être réalisés afin de réaliser des analyses histologiques, les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Si aucun prélèvement n’est nécessaire à la fin de l’étude , dans la mesure du possible, un replacement ou une adoption des animaux sera envisagé.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu’à des exigences réglementaires, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant de manière fiable. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnant et l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi du comportement des produits injectés réalisé par imagerie médicale permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux par projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et pouvoir utiliser des tests statistiques permettant d’étudier la performance du produit au cours du temps, des groupes de minimum 6 sites d’injection par éléments d’essai seront constitués (plusieurs sites d’injection pourront être réalisés sur un même animal réduisant le nombre d’animaux à utiliser).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée pour les lapins. Les lapins seront hébergés en parc de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure où ils seront hébergés en individuel, en parc ou cage) avec des enrichissements appropriés. Pour que l’hébergement collectif des mâles soit une réussite, une demande auprès du fournisseur pourra être faite pour que les animaux de l’étude soient hébergés de manière collective jusqu’à réception dans nos locaux. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires : mesure de soutien ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera contrôlé régulièrement tout au long de l’étude. Une pesée ainsi qu’un suivi clinique approfondi sera réalisé dans les 24h à 72h après l’injection des produits afin de détecter les signes suivants : Signes cliniques généraux : comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle baisse d’activité, une prostration une apathie, une non réponse à la stimulation ou des oreilles basses avec un rythme respiratoire accéléré voire la présence d’écoulement nasaux et/ou oculaires. Signe cliniques en lien avec l’administration du produit : inflammation, lésion ou nécrose du site d’injection. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi et des examens cliniques approfondis pourront être réalisés. Les signes cliniques observés seront pris en charge si les actions n’interfèrent pas avec les produits administrés et l’objectif de l’étude. S’il n’est pas possible de le soigner sans interférer avec les objectifs de l’étude alors il sera euthanasié. Des fluides pourront être injecté. Du gel oculaire sera également appliqué à chaque examen d’imagerie pour éviter le dessèchement cornéen pendant les anesthésies.Des analgésiques pourront être administrés par voie sous-cutanée pour diminuer toute douleur éventuelle ; la fréquence sera décidée par un vétérinaire. Des antibiotiques pourront également être administrés sur avis du vétérinaire (la voie et la posologie seront précisées par le vétérinaire). La fréquence des administrations sera adaptée en fonction des besoins et des conseils apportés par le vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin permet de tester des volumes importants et ainsi mimer les volumes d’injections les plus importants réalisés chez l’humain. Les lapins pourront être utilisés à partir de 10 semaines. Le stade de développement jeune adulte est celui habituellement utilisé (pas de contrainte spécifique lié à l’âge pour cette procédure).