Procédures modérées

Des injections cinq jours sur sept pendant quarante-cinq jours, plus trois gavages par semaine pour une partie des animaux : 620 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses après leur mort. Des cellules cancéreuses humaines, de pancréas, de poumon, de côlon, de vessie ou de la sphère ORL, leur sont greffées sous la peau du flanc, où les tumeurs se développent jusqu'à devenir palpables. L'immunodéficience est recherchée pour éviter le rejet de ces cellules et pour que le système immunitaire des souris ne vienne pas moduler l'effet du peptide testé. Le porteur détaille une grille de douleur qui va du rétrécissement de l'aire orbitale aux vibrisses orientées vers l'arrière, et prévoit la mise à mort par dislocation cervicale des animaux dont l'état ne s'améliore pas en vingt-quatre heures.

Objectifs

Nous travaillons sur est une protéine (ci-après nommée K1) qui joue un rôle central dans le contrôle de divers fonctions cellulaires (adhésion, migration, croissance et différenciation). La surexpression de K1 dans différents types de cancers est un facteur de mauvais pronostic qui prédit une diminution de la survie des patients. En particulier, K1 est impliquée dans les cancers du pancréas, du côlon, du poumon, de la vessie et de la sphère ORL, cancers présentant souvent des options thérapeutiques limitées. Nous avons récemment montré que la déplétion de K1 réduit spécifiquement la viabilité des cellules cancéreuses dépendantes de voies oncogéniques particulières. Nos résultats montrent, par ailleurs, qu’un mutant de K1, qui ne peut plus se lier à ces partenaires moléculaires inhibe totalement les propriétés prolifératives et invasives des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que le ciblage de K1 à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques sélectifs pourrait être une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des cancers dépendants de voies de signalisation particulières. Nous avons donc conçu un peptide-médicament qui interfère avec la capacité de liaison de K1 à d’autres protéines. L’utilisation de notre inhibiteur pharmacologique sur un grand nombre de lignées immortalisées de cancers du pancréas, du poumon, du colon, de la vessie et de la sphère ORL a montré une réduction importante de la prolifération tumorale in vitro. L’objectif de ce projet est de déterminer si notre inhibiteur pharmacologique peut inhiber la croissance de tumeurs dépendantes de voies de signalisation particulières in vivo et de mettre en évidence de potentiels effets synergiques de notre inhibiteur pharmacologique en combinaisons avec des agents thérapeutiques classiquement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de l'étude proposée est de déterminer les groupes de patients atteints de cancer susceptibles de répondre favorablement à notre peptide inhibiteur et qui pourront donc bénéficier de notre inhibiteur pharmacologique en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules déjà utilisées en clinique. De plus, notre inhibiteur pourrait permettre de surmonter la résistance à certains traitements, utilisés actuellement en clinique, et ainsi améliorer la prise en charge de patients dont les options thérapeutiques sont limitées.

Procédures

Afin d’évaluer l’effet anti-tumoral de notre inhibiteur pharmacologique, les souris seront greffées avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée (J1 de l’expérience) sur le flanc de l’animal afin de minimiser la gêne liée à la croissance tumorale. Les souris vigiles recevront une seule injection Les souris seront ensuite suivies quotidiennement afin de contrôler l’apparition de tumeurs et l’état général des animaux. De plus, une mesure du poids sera effectuée 2 fois par semaine. Dès lors que les tumeurs deviendront palpables les souris vigiles recevront une injection d’un produit non irritant, 5 jours sur 7, sur une durée de 45 jours maximum. Certains animaux recevront également un second traitement anticancéreux par voie orale à raison de 3 gavages par semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée) ou à l’administration des traitements par voie orale (stress lié au gavage)

Devenir

Tous les animaux du protocole seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nous avons d’ores et déjà accumulé de nombreuses données in vitro sur les différentes lignées correspondant au projet proposé, et avons constaté l’effet anti-tumoral spécifique de notre inhibiteur pharmacologique sur les lignées dépendantes d’une voie de signalisation particulière. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité des tumeurs in vivo. Ces dernières ne sont pas simplement constituées de cellules tumorales, elles sont également colonisées par des cellules de l’hôte (macrophages, cellules du système immunitaire, fibroblastes) et des vaisseaux sanguins qui viennent vasculariser les tumeurs et permettent leur croissance. De plus, il est également impossible de mimer in vitro la dissémination métastatique à partir d’une tumeur primaire vers d’autres organes à distance. C’est pour ces raisons que nous avons besoin d’utiliser ce modèle murin.

Réduction

La taille des groupes d’animaux nécessaires à la réalisation de l’étude a été calculée à l’aide d’une analyse de puissance qui nous a permis de déterminer l’effectif minimal garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, ce projet sera réalisé par étape. La première partie du projet, permettra de déterminer le nombre de souris nécessaires pour la deuxième partie du projet. Cette analyse ne sera lancée que dans un deuxième temps, sur les modèles les plus pertinents obtenus en première partie de projet.

Raffinement

Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de 2 semaines est observée suite à leur réception. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress. Un examen clinique approfondi (avec pesées des animaux) sera réalisé deux fois par semaine pour évaluer les anomalies comportementales naturelles, qui incluent (1) l’apparition de morsures ou de lésions indiquant des comportements agressifs de souris entre elles, (2) une hyperactivité locomotrice et la modification de la structure du nid, (3) un isolement de l’animal (4) une prostration de l’animal dans un coin de la cage, mais également aux anomalies comportementales provoquées en touchant l’animal (l’animal bouge lentement ou refuse de bouger, prostration transitoire, hyperactivité, agressivité). Les signes de douleur comprennent également (1) l’apparition de plaies par grattage, (2) une expression faciale modifiée (rétrécissement de l'aire orbitale, gonflements du museau et joues, oreilles écartées vers l'arrière, vibrisses orientées vers l'arrière), (3) un écoulement naso-oculaire, et (4) une perte de poids supérieure à 10 % sur une semaine. En cas de petites plaies causées par les souris, une solution aqueuse de chlorhexidine sera appliquée afin de les désinfecter, suivie de l’application d’une crème cicatrisante afin d’aider à la régénération des tissus endommagés. Suivant le type de dommage et afin de garantir le bien-être animal, les souris pourront être (1) isolées dans une nouvelle cage en vue de leur apporter les soins adaptés, (2) observées plusieurs fois par jour, (3) recevoir des antalgiques en cas de signe de douleur, et (4) mises à mort si aucune amélioration n’est observée au bout des premières 24h. L’observation de signes de douleur ou de mal être entraînera automatiquement la sortie de l’animal du protocole. L’identification d’un point limite entraînera la mise à mort de l’animal par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Nous avons obtenu de nombreuses données in vitro à partir de lignées tumorales. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité des tumeurs in vivo qui ne sont pas simplement constituées de cellules tumorales mais également de cellules de l’hôte (macrophages, cellules immunitaire, fibroblastes, vaisseaux). De plus, il est également impossible de mimer in vitro la dissémination métastatique à partir d’une tumeur primaire vers d’autres organes à distance. Le recours à un organisme-modèle est indispensable. Les souris sont des mammifères couramment utilisés en recherche cancérologique. Les souris immunodéficientes, permettent de réaliser des greffes de cellules humaines dans le modèle murin sans rejet par son système immunitaire. De plus, l’activité biologique de notre inhibiteur pharmacologique pourra être évalué sans que le système immunitaire des souris puisse moduler son effet. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.

Nourries d'un régime gras pendant vingt semaines à partir de l'âge de 4 semaines, des souris peuvent grossir au point de ne plus atteindre leur nourriture ni leur eau, et développer un état dépressif et de l'anxiété. 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, afin de tester l'association de deux traitements contre la fibrose du foie liée à l'obésité et au diabète. Elles reçoivent ces traitements par gavage et subissent 14 incisions de la veine de la queue sous anesthésique local, chaque test de glycémie étant précédé de six heures d'isolement à jeun. Pour décrire les actes, le porteur compte en secondes : 30 secondes de pesée par semaine, "soit un total de 12 minutes par souris", 10 secondes de contention par gavage, 3 à 4 secondes par incision, sans y faire figurer le régime.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Actuellement, aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutique sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type II et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont déjà chacune démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 24 semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 12 minutes par souris sur l’ensemble du projet. L’administration des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes à chaque administration. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour les tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un isolement de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même durent 2h.

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécule, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (5 animaux par cages) avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle pour les tests de tolérance au glucose et de sensibilité à l’insuline (total de 8h par expérimentation). Pour chaque cas, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 4 semaines. L’utilisation d’animaux jeunes se justifie par le fait qu’à cet âge, l’efficacité du régime est optimale car ils sont en pleine croissance. Ceci permet donc de limiter le temps de régime et donc le stress et les nuisances engendrées. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 24 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 28 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

Tuées à la fin des expérimentations pour que leurs tissus soient prélevés, 96 rates Lewis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suspendues par un harnais qui décharge leurs pattes arrière pour reproduire un alitement, ce qui peut provoquer sur les premières quarante-huit heures une perte de poids et des bouchons d'urine. S'y ajoutent trois prélèvements de sang à la veine de la queue et, trois fois au cours du protocole, un test de vitesse maximale aérobie sur tapis roulant d'une vingtaine de minutes, un test d'endurance de trente à soixante minutes et un test de force d'agrippement. Le porteur écrit que ces procédures "n'entraînent pas de douleurs spécifiques" et qualifie le recours aux rates d'"étape obligatoire" mais aussi d'"extrêmement enrichissante du point de vue scientifique", pour évaluer un extrait de romarin contre la fonte musculaire.

Objectifs

Le romarin est connu depuis quelques décennies pour avoir des effets antioxydants et anti-inflammatoires pouvant être bénéfiques pour l’être humain dans certaines circonstances. Le projet vise à tester les effets d’une substance naturelle extraite du romarin et de ces dérivés afin de prévenir la perte de masse musculaire et d’endurance lors d’une immobilisation prolongée ou bien résultante d’une maladie musculaire. Ce projet présente plusieurs objectifs. Dans un premier temps, il s’agira de tester l’efficacité des composés contre la perte de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le modèle de suspension par harnais chez le rat. Il s’agira aussi de compléter la connaissance des mécanismes de fonctionnement du composé principal. Dans un second temps, l’objectif de ce programme est de développer des substances dérivées mais avec des propriétés sur la masse musculaire et sur l’endurance plus importantes. Ces substances seront développées et d’abord testées sur des cultures de cellules musculaires humaines. La ou les molécules les plus efficaces seront ensuite testées pour lutter contre la diminution de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le même modèle de suspension). L’ensemble de ce projet vise donc à la fois des aspects fondamentaux mais aussi appliqués avec le développement d’une nouvelle stratégie de prévention de la perte de masse musculaire et d’endurance. Les effets du modèle de suspension par harnais qui sera utilisé se rapprochent énormément de ceux retrouvés lors d’un alitement clinique chez l’humain et par conséquent la réussite de ce projet pourrait avoir un impact important chez les patients alités et par extension dans les diverses situations entrainant une diminution de l’activité physique (plâtrage, sédentarité) ou dans diverses maladies musculaires impliquant les cibles du composé et de ses dérivés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et l’inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est un réel problème en matière de santé publique. Ces expérimentations portent donc sur un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine.

Procédures

Tous les animaux subiront 3 prélèvements de sang sur animal vigile en respectant les recommandations en termes de volume, de fréquence et de site de prélèvement. Les animaux réaliseront ensuite des tests non invasifs. Pour les qualités d'endurance, 2 tests seront réalisés sur tapis roulant à savoir le test de VMA (vitesse maximale aérobie) qui dure une vingtaine de minutes et le test de temps limite qui dure entre 30 et 60 minutes en général. L’étude de la composition corporelle dure 2 min. Le test de force d’agrippement dure une quinzaine de minutes (3 séries de 5 essais de 2-3 secondes entrecoupées de 5 minutes de récupération). L'ensemble des tests seront réalisés 3 fois au cours de la procédure à raison d'une fois par semaine sur 3 semaine distinctes (avant le début du traitement, après le traitement et après la suspension). L'ordre des tests au cours des 3 périodes de test sera la suivant. Le test de composition corporelle sera réalisé 3 fois au cours de la procédure. Il sera réalisé une fois le premier jour de chacune des 3 semaines de test. Le test d’agrippement est réalisé au jour 2. Le test de vitesse maximale aérobie est réalisé à 3 jours et le test d’endurance est réalisé à 5 jours pour permettre un repos complet de l’animal.

Impact sur les animaux

La principale nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera le stress lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension des pattes arrières qui peut entrainer sur les premières 48h une perte de poids ainsi que des bouchons d’urine. Les animaux seront aussi stressés lors des tests fonctionnels sur tapis roulant (3 tests de 20-30 minutes espacés de 2-3 semaines) et ou pendant l’évaluation de la force d’agrippement (3 tests de 5 répétitions d’agrippement durant 2-3 secondes chacune espacés de 2-3 semaines) ainsi que lors des 3 prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue. De plus, lors des 3 prélèvements sanguins, les animaux pourrait ressentir une légère douleur au moment de l'introduction de l'aiguille dans la veine caudale.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats pré-cliniques très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés aux moyens de trois axes de réductions. Le premier axe consiste à regrouper les procédures de 2 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 2 le nombre de rats qui aurait été classiquement employé. Le deuxième axe consiste à utiliser les mêmes animaux pour obtenir des données fonctionnelles et des données cellulaires et moléculaires permettant là encore de réduire le nombre de rats par 2 sans affecter la qualité des résultats. Enfin, le troisième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement avec un logiciel.

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour les tests physiques réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir. Les différents composés sont intégrés dans la nourriture pour éviter toute injection ou gavage. Les procédures de suspensions par harnais sont validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toutes complications. De plus, les rats seront hébergés par deux dans une même cage pour éviter l’isolement social. Pour éviter le refroidissement, la température de la pièce d'élevage sera de 24-25° et les animaux auront à disposition de la ouate pour réaliser leur nid. Chaque phase de l’étude possède également des points limites et critères d’arrêts strictes en cas d’évènements potentiellement néfaste du point de vue des animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être etc. Les suivis quotidiens des animaux, des poids corporels et la consommation de nourriture sera un paramètre intégré à nos protocoles. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt, les animaux sont anesthésiés avant d’être mis à mort pour éviter toute douleur.

Choix des espèces

Le rat Lewis est privilégié pour de plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculaire. Cette espèce est de même plus petite et moins lourde que les rats Wistar nous permettant d’utiliser le modèle de suspension par harnais en toute sécurité. Enfin, ces expérimentations se feront sur des rats femelles, afin de combler le manque de résultats sur ce sexe. Les animaux seront utilisés entre 11 et 22 semaines d’âge. L’expérimentation commencera à 12 semaines car à partir de cet âge la croissance musculaire des rats Lewis devient très lente.

Gavées chaque jour de leur gestation, jusqu'à vingt et une fois, 255 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles porteuses sont mises à mort au sevrage de leurs petits, qui subissent ensuite trois tests de mémoire, une imagerie de la rétine sous anesthésie injectable de trente à quarante-cinq minutes, une IRM et un prélèvement de sang avant la fixation de leur cerveau. Il s'agit de tester in utero une molécule contre les déficits cognitifs liés à la trisomie 21, dont le porteur espère qu'elle déplacera "de quelques dizaines de points" le quotient intellectuel des patients. Le RNT décrit une douleur de gavage "accentuée à cause de la répétition" et un stress lié aux tests, tout en affirmant ailleurs que "les tests comportementaux sont sans contraintes".

Objectifs

La trisomie 21 (T21), est due à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental qui touche environ 1 nouveau-né pour 2000 naissances. Elle représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. Plusieurs traitements visant à améliorer le retard mental ont déjà été investigués. Parmi ceux-ci, on trouve une molécule qui a montré des effets bénéfiques dans des modèles animaux mais aussi chez l’Homme à l’âge adulte. Pour autant, peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications importantes se mettent en place très tôt au cours du développement dans la T21. Pour palier a ce manque, une molécule sera administré aux souris femelles gestantes. Suite à ce traitement au cours de la gestation, 4 domaines seront évalués. 1) Le domaine de la mémoire à l’origine du retard mental. 2) Le domaine ophtalmologique qui servira à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces défauts chez les patients. 3) Le domaine de du cerveau pour évaluer par Imagerie par Résonance Magnétique son fonctionnement avec ou sans le traitement. 4) Le domaine de fonctionnement du foie qui comporte des défauts chez les porteurs de T21. Ici nous voulons tester l’hypothèse que ces problèmes commence au cours de la gestation. Ce projet sera réalisé sur 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer, de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée. Cela constituerait un progrès très important pour leur qualité de vie et celle de leur entourage. Peu d’études portant sur l’impact d’une action au cours de la gestation ont été réalisées chez le modèle animal, alors que des modifications structurales de l’hippocampe et du cervelet se mettent en place très tôt au cours du développement embryonnaire dans la T21 et donc au cours de la période gestationnelle. Dans 2 études précédentes, nous avons montré que le traitement in utero chez la souris avec des inhibiteurs ciblant l’activité d'une proteine cible, améliore les déficits observés en lien avec la T21 chez plusieurs modèles murins. Ceci montre que le traitement au cours de la gestation entraîne des modifications qui perdurent sur le long terme. Nous attendons pour cette étude, les mêmes effets bénéfiques mais en utilisant une molécule de dernière génération, soluble, permettant une administration per os, indispensable pour une transposition chez l’Homme. Nous espérons que ce traitement sera suffisant pour permettre de ne plus avoir besoin de traitement chronique chez l’adulte. Une amélioration significative des performances cognitives est attendue, notamment pour la mémoire de travail et la mémoire explicite dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ce test. L’imagerie rétinienne révélera si le traitement a un impact sur les phénotypes rétiniens, ça n’a jamais été investigué. De plus, les potentielles améliorations seront également caractérisées par de l’imagerie fonctionnelle. L’étude des marqueurs sanguins permettra de savoir si le défaut du métabolisme hépatique à une origine développementale. D’une façon plus générale, pour une recherche fondamentale, les résultats obtenus devraient également permettre d’approfondir les connaissances sur le rôle de cette protéine cible au cours du développement et son impact sur les défauts cognitifs des patients.

Procédures

Les femelles gestantes seront traitées avec la molécule par gavage tous les jours pendant la durée de la gestation. Le traitement sera administré 1 fois par jour, tous les jours durant la gestation (21 jours maximum) per os par gavage. Les animaux seront soumis à 3 tests de comportement qui permettent d'évaluer leur mémoire. Ces tests se déroulerons sur 4 jours, avec 1 session unique par jour. Chaque session dure de 8 à 15min suivant le test. Les souris recevront 4 anesthesies, -1 gazeuse pendant toute la durée de l’imagerie ophtalmique, 15 minutes maximum. -1 anesthésie gaseuse complementée par une analgesie pour l'imagerie par resonnance magnétique (IRM) - 1 anesthesie pour effectuer une fixation du cerveau ou une anesthésie de quelques minutes par inhalation pour un prelevement sanguin. La production des animaux traités in utero ainsi que les tests de comportement et les analyses ophtalmologiques seront fait dans l'EU235. L'IRM, les prelevements de sang et les fixations des cerveaux au PFA seront fait dans l'EU466.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules par voie orale. Cette douleur sera accentuée à cause de la répétition des gavages, au maximum 21 fois, soit 1 gavage par jour de gestation. L’électrorétinographie implique une anesthésie longue (30-45 minutes) obtenue par injection d'anesthesique. L'IRM se fait sous une anesthésie gazeuse avec analgésie, necessitant une injection. Le prélèvement de sang se fait sous anesthésie gazeuse, pouvant induire une angoisse chez l'animal. Les test de comportement nécessite de placer les souris dans des sytèmes quelles ne connaissent pas, ce qui peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux sont mis a mort. Des organes seront prelevés pour études.

Remplacement

La compréhension des mécanismes ainsi que les origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines.

Réduction

Le taux de transmission de la trisomie dans ce modèles souris et d’à peine 30%. 1 portée compte en moyenne 6 petits dont 2 trisomiques. Pour assurer la production des animaux, il faut accoupler 40 animaux femelles au total pour le traitement au cours de la gestation. Il faut multiplier ce chiffre par 2 pour avoir des mâles et des femelles, car l’analyse IRM montre des différences significatives en fonction du sexe. En effet, il nous intéresse de connaître la différence d’action que peut avoir la molécule inhibitrice sur des souris de sexes différents. Les effets du genre sur l’action de la molécule pourront ainsi être étudiés. La taille des groupes a été déterminée grâce aux résultats de nos précédentes études qui nous ont permises de déterminer le nombre minimum d’animaux à utiliser. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testeront 4 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Dans notre étude précédente, l’administration répétée pendant 19J par gavage chez l’adulte de cette molécule n’a pas montré d’effets délétères chez les animaux traités. Un suivi des femelles sera cependant réalisé sur la totalité de l’expérience, notamment durant la période gestationnelle où aura lieu le traitement. Un arbre décisionnel basé sur le reflet de la douleur chez la souris sera utilisé pour ne pas prolonger des souffrances éventuellement constatées. Les conditions d’élevage seront améliorées pour les femelles gestantes pour leur permettant de faire un nid plus complexe et ainsi de mieux gérer leur exposition à la lumière et aux menaces perçues. De plus, un tube de transfert sera placé dans les cages pour manipuler les animaux sans les toucher et servira également comme enrichissement du milieu durant toute l’expérience. Les animaux seront ensuite sevrés de leur mère à 4 semaines et hébergés par groupe de 4 ou 5 pour leur assurer une vie sociale. Lors des tests ophtalmiques, du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout dessèchement cornéen. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil. Durant l’examen d’IRM une anesthésie est utilisée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. La température et la respiration des animaux sont en permanence surveillées par un système de monitorage et les animaux sont maintenus à une température optimale grâce au système de chauffe berceau de l’IRM. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l’acquisition en cours est immédiatement interrompue et l’animal est sorti de l’IRM. Il est alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu’à son réveil, sous surveillance. Le transport se fera dans des cages sécurisées dédiées au transport avec nourriture et eau gélifiées et sera pris en charge par un transporteur. Une habituation de deux semaines avant les acquisition IRM sera mise en place.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d’utiliser des transgéniques est liée à l’absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Les femelles qui seront traitées durant leur gestation, utilisées pour générer les groupes d’animaux, seront accouplées à partir de 8 semaines, dès la maturation sexuelle atteinte. Les animaux issus de ces croisements, seront utilisés dès le début de la gestation. Le but de l’expérience étant de réduire les deficits qui ont lieu in utero, pendant la gestation chez les souris trisomiques. Après la naissance, les animaux sont sevrés à 4 semaines. Les femelles porteuses seront mises à mort à ce stade. Les nouveaux nés seront gardés jusqu’à 3 mois, âge adulte, auquel ils seront évalués dans différents paradigmes. C’est aussi l’âge où le développement cérébral est complet et où le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présentes.

45 rates adolescentes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées et pesées chaque jour, trente d'entre elles subissent trois semaines de restriction alimentaire pour reproduire une anorexie mentale, toutes passent deux examens d'imagerie de soixante minutes sous anesthésie après injection d'un produit radioactif, et quinze reçoivent en plus une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois semaines. Le porteur reconnaît que la restriction peut provoquer une constipation et que l'isolement peut stresser les rates, et fixe la sortie de l'étude à une perte de poids supérieure à 25 %. L'avancée espérée sur un sous-type de récepteur à la sérotonine "pourrait ouvrir la porte" à de nouveaux traitements, et le porteur affirme qu'un modèle animal est "nécessaire" parce qu'il veut suivre l'installation d'une maladie chronique.

Objectifs

L’anorexie mentale fait partie des troubles alimentaires dont l'origine est multifactorielle. Ce trouble se caractérise par une restriction des apports alimentaires durant plusieurs mois, voire plusieurs années, conduisant à une perte importante de poids associée à un certain "plaisir de maigrir" et une peur intense de prendre du poids. La prise en charge de cette pathologie passe par différentes stratégies (soutien psychologique, renutrition, traitement antidépresseur) mais il n’existe pour le moment pas de traitement médicamenteux spécifique de l’anorexie mentale. Une étude a montré l’implication de la sérotonine (un neurotransmetteur impliqué dans de nombreuses fonctions physiologiques) à diminuer la prise alimentaire chez le rat entraînant une perte de poids significative. Ces résultats préliminaires laissent entrevoir un potentiel rôle du récepteur à la sérotonine dans la prise alimentaire et plus largement dans l’anorexie mentale. Nous proposons donc d’explorer l’évolution de la densité d’un sous type de récepteurs à la sérotonine chez des rats dont l’anorexie mentale aura été induite par un régime alimentaire et une activité physique adaptés à l’aide de la Tomographie par Emission de Positons (TEP).

Bénéfices attendus

L'anorexie mentale a été longtemps considérée comme un trouble principalement influencé par des facteurs socioculturels ; cependant, des études ont montré qu’elle est plus fréquente dans certaines familles ce qui suggère une influence génétique dans ce trouble. Le rôle de la sérotonine dans l'anorexie mentale découle en grande partie des données pharmacologiques établissant un lien entre le système sérotoninergique et la régulation de l'appétit. Le système sérotoninergique peut en effet médier la sensation de satiété et la motivation de la consommation de nourriture. L’avancée des connaissances sur les récepteurs impliqués dans l’anorexie mentale pourrait alors ouvrir la porte à la conception de nouveaux traitements.

Procédures

Tous les rats (n=45) seront isolés et pesé quotidiennement. Deux groupes (n=30) seront soumis à un régime alimentaire restreint pendant trois semaines. Deux examens TEP sous anesthésie générale de 60 minutes, par injection intraveineuse, d’un radiopharmaceutique seront réalisés au début et en fin de procédure pour tous les rats (n=45). Un groupe (n=15) sera traité pendant trois semaines par injection intra péritonéale quotidienne d’un médicament.

Impact sur les animaux

Le régime hypocalorique pourrait induire une modification du transit intestinale avec apparition de constipation chez les rats. L'isolement des rats envers ses congénères pendant la période de l’étude pourrait provoquer des symptômes de stress chez les rats.

Devenir

Les rats seront mis à mort par utilisation d’un agent euthanasiant. En cas d’atteinte des points limites, la mise à mort d’un sujet sera envisagée. Les cerveaux pourront être extraits pour des analyses sur tissu frais congelé. D’autres organes pourront être prélevés si l’étude le nécessite.

Remplacement

Un modèle animal est nécessaire car nous souhaitons explorer l’évolution de certains récepteurs suite à l’apparition d’une maladie chronique. Une fois la preuve de concept obtenue chez l’animal, ce projet d’imagerie sera rapidement transférable chez l’Homme en utilisant le même radiotraceur.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi correspond au minimum acceptable afin d’analyser les données de façon pertinente d’un point de vue statistique. Ce nombre est fonction du nombre d’examens techniquement réalisables par notre équipe. Le suivi longitudinal des rats en imagerie permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le choix de rats comme modèle repose sur le fait qu’ils sont un modèle robuste et connu pour la maladie étudiée. Un monitorage rapproché sera appliqué chez les rats du groupe ABA chronique. Les points limites justifiant la sortie d’un sujet de l’étude seront l’observation d’un comportement de souffrance (selon l’apparence, les comportements naturel et provoqué, l’hydratation et les selles) et une perte de poids supérieure à 25%. Lors des examens d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale profonde permettant à l’animal de ne ressentir aucune douleur.

Choix des espèces

Dans cette étude potentiellement translationnelle chez l’Homme, le rat apparaît comme étant le plus adapté en termes de faisabilité, modélisation et translation. L’anorexie induite chez le rat est physiologiquement proche de celle retrouvée chez l’Homme : hyperactivité malgré la baisse de prise alimentaire, perturbation du cycle oestral. Le choix du rat est préféré à la souris pour la plus grande taille du cerveau, au regard de la résolution limitée de la TEP. Selon le modèle d’anorexie mentale chronique, des rats femelles de 8 semaines seront utilisées. Ainsi, nous pourrons suivre l’impact de la nourriture sur leur développement et influencer leur perte de poids permettant de créer un modèle d’anorexie mentale chronique se rapprochant de ce qui est observé chez l’humain. Le choix de rates adolescentes est motivé par le fait que l’anorexie mentale est fréquemment observée chez la femme entre 15 et 17 ans.

Jusqu'à seize prélèvements de sang par semaine, et douze en vingt-quatre heures pour un même individu : 150 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants et réutilisés d'un protocole à l'autre pendant cinq ans. Ils reçoivent des substances par voie intraveineuse, orale, intramusculaire, sous-cutanée ou cutanée, subissent des ponctions de vessie à l'aiguille et des cathétérismes urétraux, le tout sous contention manuelle. L'objet déclaré est de suivre le devenir de principes actifs dans l'organisme pour de futurs médicaments vétérinaires, le chat étant l'espèce visée par ces produits. L'avenant qui porte l'effectif à 150 est justifié par "une demande accrue d'études", et le porteur indique qu'il n'y a "pas d'approche statistique prévue".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration est étudié chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espece cible). AVENANT: Suite à une demande accrue d'études, le nombre d'animaux doit être augmenté

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests. Et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est necessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations (intraveineuse, orale, intramusculaire, souscutannée ou topique) . Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 12 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire.Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ou par cystocentèse ( contention manuelle légère). Durée de l'ordre de la minute. Deux cystocentèses au maximum sur 24h, espacées d'au moins 6h. Une seule cathétérisation maximum pour les chats males sur une semaine.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Toute contention peut engendrer un stress, un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entrainer un stress pour la contention , un inconfort mais également de la douleur (cas d'un prélèvement d'urine par cystocentèse par exemple).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.

Réduction

150 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. Cela représente en moyenne 30 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe entre 2 et 4 animaux par groupe. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Jeune adulte. Stade avec un système immunitaire, métabolique mature

Rendues malades par un agent chimique qui enflamme leur côlon pendant sept jours, 32 souris de dix semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'inflammation peut provoquer des selles molles ou des diarrhées et une perte de poids. Après un gavage unique destiné à mesurer la perméabilité de leur intestin, elles sont anesthésiées, saignées, puis mises à mort quatre heures plus tard. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de prélever leur côlon et le contenu de leur cæcum, pour vérifier si une supplémentation en tryptophane et en butyrate atténue l'inflammation intestinale.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des maladies chroniques très invalidantes dont l’origine implique des facteurs environnementaux, en particulier le microbiote intestinal et l’alimentation. Certains produits du microbiote connus pour leur rôle bénéfique dans la santé de la muqueuse intestinale, sont diminués chez les patients atteints de MICI. Plusieurs études ont démontré les propriétés anti-inflammatoires de ces produits du microbiote et confortent l’intérêt de rechercher les effets d’une supplémentation nutritionnelle en produits bactériens bénéfiques pour la muqueuse intestinale dans les MICI. L’objectif du projet de recherche est d’évaluer l’efficacité d’une supplémentation nutritionnelle en produits du microbiote sur l’inflammation intestinale et la cicatrisation de la muqueuse intestinale chez la souris.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de confirmer ou d’infirmer l'effet bénéfique d'une supplémentation nutritionnelle en produits du microbiote sur l’inflammation et la réparation de la muqueuse intestinale et d’apporter des éléments sur le mécanisme d’action. Le projet devrait ainsi fournir des bases rationnelles à des essais cliniques de supplémentation nutritionnelle pour la prévention ou le traitement des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

Procédures

Tous les animaux du projet seront soumis à des manipulations lors de la constitution des groupes et des pesées. Un gavage oral unique d’une durée de 5 secondes, avec une solution permettant d’évaluer la perméabilité intestinale, se fera sur tous les animaux à l’état vigil. Quatre heures après ce gavage, les animaux auront une anesthésie générale pour un prélèvement sanguin (d’une durée d’environ 10-15 secondes), puis seront immédiatement mis à mort.

Impact sur les animaux

Les animaux auront une inflammation modérée du côlon distal qui durera 7 jours. Cette inflammation peut être associée à des selles molles ou des diarrhées et une perte modérée de poids. L’arrêt du traitement inflammatoire au bout des 7 jours entraine l’arrêt progressif de ces symptômes et une récupération de l’état physiologique normal au bout de 4 jours. Le gavage unique des souris avec une solution pour évaluer la perméabilité intestinale est une procédure de classe légère qui devrait se limiter à un stress au moment du gavage, les animaux étant mis à mort 4 heures après.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour rechercher des différences statistiques de l’impact des différents régimes sur l’inflammation intestinale et sur le microbiote intestinal sur des critères histologiques et moléculaires. Il est indispensable de prélever des tissus coliques pour des analyses histologiques et de marqueurs moléculaires à partir d’ARN et de protéines extraits de ces tissus. L’analyse de la composition et de l’activité métabolique du microbiote intestinale nécessite de recueillir le contenu luminal au niveau du cæcum.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est indispensable dans les études évaluant l’impact de la nutrition sur un écosystème physiologique aussi complexe que le microbiote intestinal et la muqueuse intestinale, impliquant des interactions très complexes. Il n’existe pas de modèles cellulaires in vitro pouvant reproduire la complexité de ces interactions.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est de N=8, ce qui représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement l'effet des régimes alimentaires sur l’inflammation intestinale et la cicatrisation de la muqueuse intestinale. Ce nombre est basé sur des études similaires issues de notre laboratoire ou de la littérature et tient compte d'une variabilité interindividuelle importante dans la sensibilité à l'inflammation des animaux qui impacte les analyses effectuées.

Raffinement

L’environnement des souris sera enrichi (tunnel, bâton à ronger, frisottis) tout au long de la procédure. Les souris seront hébergées à 4 par cage dès leur arrivée jusqu’à l’induction d’une inflammation intestinale. Les animaux seront suivis par un personnel animalier compétent et observés quotidiennement pour détecter d’éventuels signes de souffrance. L’évaluation de l’état des animaux sera effectuée selon des critères définis (poids, apparence physique (pelage, posture), activité, comportement, fréquence respiratoire). Leur prise alimentaire et leur prise de poids seront mesurées 3 fois par semaine, puis quotidiennement durant la période de 7 jours d'inflammation afin de détecter une éventuelle sous-alimentation ou perte de poids anormale. Si une douleur était constatée chez un animal durant cette période, un analgésique sera administré. Les points limites définis conduiront, s’ils sont observés, à la mise à mort des animaux le cas échéant.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans les études nutritionnelles, mais également dans les études sur l’inflammation intestinale. Les souris commandées auprès de l’établissement éleveur seront âgées de 10 semaines. Après une phase d’acclimatation de 10 jours et une période expérimentale de 18 jours, les souris seront âgées de 14 semaines à la fin l’expérimentation (soit 3,5 mois) ce qui correspond à un stade de jeune adulte fréquemment observé chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin.

80 souris transgéniques vont être utilisées, chacune portant un mélanome injecté sous la peau qui peut atteindre 1 000 mm3, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection dure cinq secondes sous anesthésie à l'isoflurane, et toutes sont tuées ensuite pour prélever les tumeurs et les organes lymphoïdes. Le porteur affirme que ces tumeurs ne provoquent ni nécrose, ni métastase, ni gêne à la mobilité, et ramène les nuisances au stress de la manipulation et de la contention. Le bénéfice annoncé tient en une phrase : montrer qu'une protéine détectrice de danger pourrait servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Objectifs

Nos résultats précédents ont montré in vitro et in vivo qu’une protéine détectrice de danger donnait des fonctions pro tumorales à certaines cellules immunitaires. Pour mieux comprendre ces observations et, pourquoi pas, à terme développer une stratégie thérapeutique, nous avons mis en place une collaboration avec une équipe ayant développé des souris transgéniques portant des mutations sur cette protéine. Une des mutations induit un profile antitumorale de nos cellules d’intérêt in vitro. Toujours in vitro, notre collaborateur a pu identifier une molécule agissant sur cette mutation. Pour valider que ces observations sont bien associées à un ralentissement de la croissance des tumeurs, nous utiliserons des souris transgéniques et évaluerons la croissance du mélanome dans ces souris. A la fin de l’expérience, les tumeurs et organes lymphoïdes secondaires des souris seront prélevés pour analyse

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pensons pouvoir montrer que la protéine détectrice de danger peut servir de cible thérapeutique en cancérologie.

Procédures

Dans le cas des tumeurs sous cutanées les souris recevront une injection de cellules tumorales (durée de l’injection +/- 5 sec). Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie à l’isoflurane.

Impact sur les animaux

Les tumeurs sous cutanées seront injectées sous anesthésie. Sur la durée de l’expérience (les plus grosses tumeurs atteignant un volume de 1000mm3), ces modèles de tumeurs ne provoquent pas de nécrose, pas de métastase et pas d’impact sur la mobilité des souris. Les souris subiront le stress de la manipulation et de la contention.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs

Remplacement

Une grande partie de nos démonstrations a été réalisées in vitro. La réponse immunitaire anti-tumorale étant un phénomène complexe faisant intervenir beaucoup de cellules, de molécules et leurs interactions, il est impossible d’en modéliser l’entièreté en dehors d’un organisme vivant.

Réduction

Dans un souci de réduction, les expériences ne seront répétées que deux fois et les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. De plus, nous avons fait appel à une méthodologiste afin de déterminer au mieux le nombre minimal de souris requis pour que nos tests statistiques soient suffisamment puissants.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Chaque animal sera examiné quotidiennement tout au long de l’expérimentation. En cas de signes de douleur ou de souffrance les souris seront mises à mort.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte à partir de 8 semaines, c’est-à-dire possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour sous forme génétiquement modifiée.

Greffées de cellules d'adénocarcinome colorectal humain sous anesthésie, 80 souris mâles portent une tumeur pendant deux à trois semaines, traitées tous les trois jours et passées deux à trois fois en microtomographie à rayons X. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni douleur n'est prévisible puisque les animaux sont anesthésiés pendant les manipulations puis tués en fin de protocole, tout en listant la perte de poids, le stress et la perte de mobilité parmi les effets à surveiller. Le projet transpose au cancer colorectal des peptides déjà testés sur un modèle de mélanome, jugé moins utile parce que ce cancer est plus rare et de meilleur pronostic.

Objectifs

Avec plus de 43000 personnes touchées par an en France, le cancer colorectal se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme et au deuxième rang chez la femme. Il constitue la deuxième cause de décès par cancer et représente près de 12 % de l’ensemble des décès par cancer, en particulier chez les 65 ans et plus. Le choix du traitement du cancer colorectal dépend du stade, de sa localisation et de l'état général du patient. Bien que la  chirurgie  soit utilisée en première ligne, la chimiothérapie peut être prescrite à tous les stades de la maladie, et plus récemment, des thérapies ciblées sont utilisées en association avec la chimiothérapie . Malheureusement tous les patients ne répondent pas à ces thérapies et des phénomènes de résistance se développent très souvent. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du cancer colorectal demeure donc un défi majeur.

Bénéfices attendus

Historiquement, nos premiers résultats sur les effets anti-cancéreux de nos peptides ont été obtenus sur un modèle de mélanome, en association avec un laboratoire de dermatologie. Toutefois, en France, le mélanome cutané se situe au 9ème rang des cancers tous sexes confondus et ne représente que 2 à 3 % de l’ensemble des cancers. C’est également un cancer de bon pronostic avec une survie à 5 ans supérieure à 80% dans le cas du mélanome de stade I, représentant lui-même 84% des cancers diagnostiqués. A l’heure actuelle, les traitements sont souvent efficaces depuis les progrès de l’immunothérapie. Le cancer colorectal est, quant à lui, le troisième cancer le plus fréquent, tous sexes confondus, en France où il représente la deuxième cause de décès par cancer. Les traitements peuvent être très lourds avec de nombreux effets secondaires. Il apparaît donc important de cibler de nouvelles approches thérapeutiques, c’est pourquoi nous souhaitons vérifier que l’activité anti-tumorale de notre molécule et de ses analogues, observée in vivo dans un modèle de mélanome murin, est transposable au cancer colorectal. En effet, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle in vitro de tumeur 3D sont très prometteurs.

Procédures

Pour nos expériences, les animaux seront sous anesthésie générale (quelques minutes) pour l'injection des cellules de cancer colorectal. 7 jours après, les animaux seront traités tous les 3 jours (quelques secondes par animal) pendant 2 à 3 semaines. Le suivi longitudinal (imagerie 3D par microtomographie rayons X) des animaux se fera sous anesthésie (10 à 15 minutes) à raison de 2 à 3 fois au cours des 2 dernières semaines du projet.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances ou critère prévisible de douleur dans la mesure ou les animaux seront sous anesthésie générale durant les manipulations puis euthanasiés en fin de protocole. Douleur potentielle modérée et passagère (piqure) à l'injection des molécules. Une surveillance quotidienne du développement des tumeurs permettra de s'assurer du bien-être des animaux (absence de gêne à la locomotion ou de signes visibles de souffrance). Les effets indésirables surveillés pourraient être : perte de poids, stress, perte mobilité.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations, afin de prélever et d'analyser les tumeurs.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisées in silico, in vitro et ex vivo. Les peptides testés ont fait l’objet d’une étude in silico afin de sélectionner les meilleurs candidats potentiels. Ces candidats ont ensuite été validés par des études in vitro (migration et invasion cellulaire, modèles 3D multicellulaires) et ex vivo (anneaux aortiques) et nous testerons dans ce projet les peptides ayant donnés les meilleures réponses. Ce projet vise donc à valider in vivo les effets observés. Aucune méthode de substitution n’existe actuellement pour mesurer les effets sur la croissance tumorale.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les peptides candidats ont été sélectionnés sur des modèles de sphéroïdes 3D. Ainsi seuls les peptides à fort potentiel seront testés. Ainsi l’étude considérée dans sa globalité est susceptible de concerner un nombre maximal de 80 souris mâles, réparties en 4 groupes et 2 procédures : 1 groupe contrôle, 3 groupes de test. Afin d’obtenir des résultats significativement robustes, un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé. L’analyse statistique se fera avec le test U de Mann-Whitney bidirectionnel.

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 7 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés lors des procédures pouvant apporter un stress (jusqu'à l'euthanasie), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris. Il s’agit du modèle de référence pour l’étude de la croissance tumorale.