Procédures sévères

Une neurotoxine injectée par chirurgie stéréotaxique détruit des neurones chez une partie des 2 832 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit ce modèle comme très invalidant, avec un taux de mortalité important, et indique que les souris de la lignée Mito-Park atteignent vers 45 semaines une perte de poids et un mauvais état général qui déclenchent leur mise à mort. Toutes seront tuées, pour des contrôles anatomiques et histologiques à la fin de chaque procédure. Sept tests comportementaux sont annoncés, jusqu'à trois heures par jour, sans qu'aucun soit nommé, et l'un d'eux impose une restriction alimentaire pour motiver les animaux.

Objectifs

Ce projet cherche à mieux comprendre certaines manifestations de la maladie de Parkinson qui ne concernent pas directement le mouvement, comme l’anxiété, la perte de motivation ou la dépression. Ces symptômes apparaissent souvent avant les troubles moteurs et pourraient aider à diagnostiquer la maladie plus tôt. Aujourd’hui, une technique utilisée pour traiter Parkinson consiste à stimuler certaines zones du cerveau avec de l’électricité, mais on ne comprend pas encore bien comment elle fonctionne. De plus, elle peut parfois provoquer des effets secondaires importants. L’objectif de ce projet est donc d’identifier précisément quelles zones et quels circuits du cerveau sont responsables des effets positifs (amélioration des mouvements) et négatifs (troubles émotionnels) de cette stimulation. Les chercheurs vont étudier différentes populations de neurones dans des régions spécifiques du cerveau et tester leur rôle en les activant ou en les bloquant chez des souris. Le projet prendra aussi en compte les différences entre mâles et femelles, car le cerveau peut fonctionner différemment selon le sexe. À terme, ces travaux pourraient permettre de rendre les traitements plus efficaces et de limiter les effets secondaires.

Bénéfices attendus

Ce projet sera une caractérisation unique de structures clefs du cerveau dans le contrôle des troubles non-moteurs de la maladie de Parkinson (anxiété, dépression, etc.) en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération de ces zones cérébrales pourrait être à l’origine de troubles non-moteurs de la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes non-moteurs des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.

Procédures

Procédure chirurgicale pour injection de virus ou de neurotoxine : entre 30 minutes et 1 heure, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1h et 2h, Imagerie calcique in vivo sur animal vigile entre 1h et 2h. 7 tests comportementaux seront utilisés d'une durée comprise entre 15 et 45 minutes chacun, soit au total entre 1h30 et 3h par jour. Un des tests comportementaux nécessite la mise en place d’une restriction alimentaire pour motiver les animaux à faire la tâche comportementale demandée mais les animaux pourront être maintenus groupés car le test comportemental pourra être réalisé sur la même journée pour l’ensemble des animaux. Pour la lignée Mito-Park qui a un phénotype dommageable, les animaux font l’objet d’un suivi clinique et pondéral régulier, avec une attention particulière à leur mobilité, à leur état général et à leur poids. Les conditions d’hébergement sont adaptées : la nourriture et l’eau sont placées à une hauteur facilement accessible, des aliments enrichis ou ramollis sont proposés au sol, et la litière est rendue plus confortable pour faciliter le repos. Ces mesures visent à aider les animaux à s’alimenter et à se déplacer malgré leurs difficultés motrices, et à maintenir au mieux leur confort.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants, 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental, 4/ les modèles murins de maladie de Parkinson (voir détail ci-dessous) et 5/ un risque de stress à court terme induit par la restriction alimentaire et les tests comportementaux réalisés. Le modèle de souris Parkinsonienne unilatéral : Ce modèle est classiquement utilisé pour reproduire les phases tardives de la maladie de Parkinson. Il repose sur l’injection stéréotaxique d’une neurotoxine, et est très invalidant pour les animaux avec un taux de mortalité important. Chez le modèle progressif de la maladie de Parkinson, on observe, à partir de 6 semaines, une altération neuronale et à partir de 14 semaine une diminution de l’activité locomotrice. A 45 semaines, ces souris présentent une perte de poids et un mauvais état général nécessitant leur mise à mort. Les modèles unilatéraux et progressifs sont complémentaires, le premier mimant un stade avancé de la maladie de Parkinson avec une perte de certains neurones du cerveau, alors que le second présente l’avantage d’avoir une perte beaucoup plus modérée et progressive des neurones plus représentatif de la progression de la maladie de Parkinson et permet d’étudier les symptômes non-moteurs de la maladie qui apparaissent en amont des symptômes moteurs. Afin d’éviter une souffrance prolongée, des critères d’arrêt sont définis à l’avance. Un animal est retiré de l’étude et euthanasié de manière humanitaire dès qu’il présente une perte de poids importante ou continue, une incapacité à se déplacer suffisamment pour accéder à la nourriture ou à l’eau, ou un état de prostration marquée. Cette décision est prise pour chaque individu dès que les mesures de soutien ne suffisent plus à garantir un niveau de bien être jugé acceptable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. La mise à mort des animaux est justifiée par la nécessité de réaliser des contrôles anatomiques et histologiques à la fin de chaque procédure expérimentale.

Remplacement

Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du complexe noyau sous-thalamique/para-sous-thalamique et du reste de son circuit dans les troubles non-moteurs de la maladie de Parkinson. La meilleure façon d’atteindre cet objectif est d’utiliser plusieurs techniques complémentaires. D’abord, des injections précises dans le cerveau permettent de faire produire par certains neurones des protéines capables d’activer ou de bloquer leur activité. Ensuite, l’activité de ces neurones est mesurée soit sur des tranches de cerveau en laboratoire, soit directement chez la souris, qu’elle soit anesthésiée, maintenue immobile ou libre de ses mouvements et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits des noyaux sous-thalamique/para-sous-thalamique.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiabledes données biologiques collectées. Nous utiliserons ainsi 2832 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris mâles et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés. La taille des groupes a été déterminée à l'aide d'analyses statistiques basées sur des calculs de puissance.

Raffinement

Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des neurotoxines ou des animaux transgéniques. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété de l’interaction sociale et les phénomènes cellulaires et synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. La maladie de Parkinson étant une maladie neurodégénérative qui se développe chez l'homme à l'âge adulte, nous travaillerons sur des souris adultes.

Deux injections d'opioïdes de synthèse par jour pendant dix jours, des chirurgies de vingt à quarante-cinq minutes, des sondes portées une à trois semaines et jusqu'à quinze prises de sang en 24 heures : 1 138 rats vont être utilisés ainsi, 891 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 247 un niveau sévère, tous tués à l'issue. Une partie porte un cathéter pendant 48 heures, une autre un guide implanté dans le cerveau pour prélever du liquide cérébral pendant neuf heures, avec des isolements de six à vingt-quatre heures en enceinte de mesure. Le projet mesure la toxicité respiratoire de ces molécules et compare des traitements de l'overdose et du sevrage. Le porteur indique que ces administrations peuvent provoquer rigidité musculaire, hypothermie et dépression respiratoire allant jusqu'au coma et à la mort, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort.

Objectifs

Les nouveaux opioïdes de synthèse, très puissants, sont associés à un risque élevé d’intoxications graves, notamment en raison de leur toxicité respiratoire et de leur consommation fréquente avec d’autres substances. Nous étudierons leur toxicité, leurs interactions avec d’autres substances et la meilleure façon de traiter les overdoses ou le sevrage. Ainsi ce projet expérimental chez le rat vise à évaluer l’impact de ces substances sur la respiration et sur le diaphragme, principal muscle impliqué dans la ventilation, dans un contexte d’intoxication induite par injection unique, ou de tolérance après injection répétée d'opioïdes. Nous évaluerons l’efficacité de différentes molécules pour reverser ces effets respiratoires. Nous analyserons ensuite l’évolution des concentrations sanguines et cérébrales et étudierons d’éventuelles interactions en co-administration. De plus nous évaluerons l’efficacité de différentes stratégies de prise en charge du sevrage induit par ces opioïdes. Les résultats attendus permettront de mieux comprendre leur toxicité et de contribuer à l’amélioration de la prise en charge des intoxications associées à ces nouveaux opioïdes.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de mieux caractériser les mécanismes de toxicité mis en jeu par les opioïdes de synthèse seuls ou en association, d’explorer les mécanismes de ces interactions et de déterminer la meilleure stratégie de traitement des intoxications. Ce projet permettra d'optimiser la prise en charge de ces intoxications pouvant avoir des conséquences fatales mais aussi d’optimiser le traitement de la dépendance au-delà du simple traitement des symptômes.

Procédures

Les animaux soumis aux études de toxicité aiguë (administration unique) : subiront 1-2 injections (5-10sec). Indépendamment, les animaux soumis aux études de toxicité chronique: subiront 2 injections/j pendant 10j puis 1-3 injections supplémentaires correspondant à une molécule d’intérêt et/ou une molécule de réversion(5-10sec). Parmi eux, une 1ère partie sera soumise à : une procédure chirurgicale sous anesthésie générale (20min)+port d'une sonde de télémétrie (7 à 18j)+mise en boite de mesure isolée (6h). Une 2ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (30min)+port d'un cathéter (48h)+ prélèvements de sang sur animal vigile (11 prélèvements de 30 sec sur 5h). Une 3ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (45min)+port d'une sonde (7 à 18j) et isolement en cage individuelle (7j ou jusqu’à cicatrisation)+mise en cage de mesure isolé (6h). Une 4ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (45min)+port d'une sonde (10 à 18j) + mise en cage de mesure isolé (1 à 2 fois 24h). Une 5ème partie: procédure chirurgicale sous anesthésie générale (30min)+ port d'un cathéter (48h)+prélèvement de sang sur animaux vigiles (15 prélèvements de 30sec sur 24h). Une 6ème partie: procédure chirurgicale(45min)+ port d’un guide cérébral (7 à 18j)+ prélèvements de fluides extracellulaires (1h équilibration+8h prélèvements). Une dernière partie des animaux: mesures de l’activité locomotrice (sur 3 à 4j, pendant 30min+20min d'habituation) et mesure de l’anxiété (sur 1 à 3j, pendant 5min).

Impact sur les animaux

Stress léger de quelques secondes lors des injections. Stress léger lors de l'isolement du rat dans une enceinte fermée pendant 6 heures durant l’étude de mesures respiratoires. Stress léger lors de l’isolement du rat dans un tube pendant 8h pour réaliser les prélèvements sanguins. Stress léger lors de l'hébergement des rats en cage individuelle à la suite de la chirurgie, jusqu'à la fin de la cicatrisation, puis au cours de la procédure pour évaluer l’activité des muscles (6h). Isolement du rat dans une cage individuelle pour mesures de l’activité cérébrale (1 à 2 fois 24h). Isolement du rat dans un contenant de mesure inviduel pendant 9 heures pour prélèvement de liquide cérébral. Isolement des rats au cours des études comportementales de 50 minutes pour la mesure de l’activité locomotrice et de 5 min pour la mesure d'anxiété. Léger risque de formation de caillot dans les vaisseaux et de baisse d’activité locomotrice pour certains animaux lors de la mise en place de cathéters. Chirurgie légère à modérée de 10 min à 35 min après anesthésie générale précédée d’une analgésie. L’administration des différents opioïdes peut entrainer une réduction de l’activité locomotrice, une rigidité musculaire, une hypothermie et une dépression respiratoire pouvant aller jusqu’au coma et au décès. Variabilité de la durée et de l’intensité de ces effets en fonction des molécules administrées.

Devenir

​​La réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération post-mortem de l'appareillage implanté pour réaliser des mesures ou de l'atteinte d'un point limite qui requiert la mise à mort des animaux ou de la récupération de tissu post-mortem. ​

Remplacement

Les procédures réalisées sur animaux, ne sont pas remplaçables par des expériences alternatives. Le rat constitue un modèle nécessaire à cette étude en raison du fonctionnement de son système respiratoire proche de celui de l’être humain.

Réduction

​Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Cependant, si aucun effet ventilatoire significatif n’est perçu lors des mesures respiratoires, une partie des expériences ne sera pas réalisée dans le but de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. De la même manière, la procédure de prélèvements de liquide cérébral ne sera réalisée que si des effets sont observés soit au niveau des concentrations sanguines soit au niveau respiratoire. Cette procédure permet de réduire le nombre d’animaux utilisé, puisqu’elle permet la réalisation d’études longitudinales en effectuant plusieurs prélèvements successifs, à différents temps, sur un même individu.

Raffinement

​​Tous les rats du projet bénéficient des conditions d’hébergement contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période péri-opératoire. En cas de besoin, des procédures réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. De plus, une ouate en silicone sera déposée au fond de la cage après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement. Par ailleurs, concernant la procédure de mesure d’activité musculaire, les rats opérés seront ajoutés à ces cages pour enrichissement en vue de réduire le stress induit par l’isolement.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle nécessaire à cette étude en raison du fonctionnement de son système respiratoire proche de celui de l’être humain. En plus de sa taille adéquate qui permet une facilité et une répétition des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’Homme, ce qui facilitera la translation des données de concentrations sanguines à l’Homme. Pour les études mesurant la respiration ainsi que l’activité du cerveau et des muscles la pose des sondes est plus aisée sur le rat et donc les résultats seront plus reproductibles. La population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substance, des rats jeunes adultes Sprague Dawley âgés de 6 à 8 semaines seront utilisés. Ceci nous permettra de pouvoir faire l’analogie avec les résultats déjà obtenus et les articles publiés dans la littérature. La population jeune étant la plus affectée par les problèmes de mésusage de substance, des rats jeunes adultes Sprague Dawley âgés de 6 à 8 semaines seront utilisés.

Immobilisées à la main et injectées une fois par semaine pendant seize semaines, transportées chaque semaine entre trois établissements, 1 025 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, 767 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 258 dans des procédures d'un niveau sévère. Le porteur indique que le phénotype provoque des atteintes articulaires dès sept semaines, puis une mobilité réduite et une perte de poids à partir de dix semaines, et reconnaît le transport répété comme une source de stress. Les animaux dépourvus du génotype recherché sont tués, ceux qui le portent le sont pour prélever leur sang, leur rate, leurs ganglions et leurs pattes, à l'exception de quelques-uns conservés pour entretenir les lignées. Le projet tient en deux phrases sur les bénéfices attendus, et le porteur justifie l'effectif par une analyse de puissance statistique dont il ne donne aucun chiffre.

Objectifs

La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans un modèle de souris génétiquement modifiée.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.

Procédures

Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à une contention et à une injection réalisée une fois par semaine pendant 16 semaines, soit un total de 16 injections, chacune d’une durée approximative de 10 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à une imagerie (anesthésie générale) (au total 6 actes de 10 minutes).

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable va induire à partir de 7 semaines des potentielles atteintes articulaires, à partir de 10 semaines, une mobilité réduite et perte de poids. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les anesthésies gazeuses pour réaliser l’échographie sont des actes stressants. Le transport répété des animaux entre les sites utilisateurs, de manière hebdomadaire sera stressant pour les animaux.

Devenir

Des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. Certains animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques post-mortem : sang,rate et ganglions, pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte générale et articulaire par différentes techniques. Certains animaux avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.

Remplacement

Les cellules spécifiques du système immunitaire et les cellules de la membrane de l'articulation ont été traitées avec les différentes molécules étudiées et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.

Réduction

Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport avec bords opaques, sans visibilité de l’extérieur, dans un environnement enrichi.

Choix des espèces

La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires de la maladie sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées de 6 à 12 semaines pour l'étude menée sur cette maladie.

Deux critères déclenchent la mise à mort de l'animal quand ils atteignent leur valeur maximale, la respiration et la perte de poids. 512 souris mâles de neuf semaines vont être intoxiquées par un agent neurotoxique organophosphoré du type sarin ou VX, 248 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 264 dans des procédures d'un niveau sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la dose sous-létale la plus forte peut provoquer des crises convulsives dans l'heure suivant l'intoxication, et prévoit deux à trois séances d'imagerie cérébrale à un, trois et six mois, dont la durée cumulée peut dépasser deux heures. Le projet évalue un candidat thérapeutique, le Glunomab, associé au traitement actuel des intoxications par agents de guerre et par pesticides organophosphorés.

Objectifs

Les composés organophosphorés (OP) tels que les agents neurotoxiques de guerre (NOP) comme le sarin et le VX, ou certains pesticides organophosphorés (OPP), constituent une menace actuelle pour les populations militaire et civile. Si les intoxications à fortes doses représentent toujours un véritable danger (tentative d’assassinat), l’exposition de manière unique ou répétée à des NOP et des OPP à des doses asymptomatiques (attaque terroriste, terrains de guerre, épandage de pesticides…) est une réalité permanente. Les rapports d’intoxication passive, active ou accidentelle avec des pesticides (300 000 décès annuels dans le monde pour près de 3 millions de cas d’intoxication rapportés) ou lors d’utilisation de gaz neurotoxiques en Syrie témoignent du besoin de développer des traitements neuroprotecteurs plus efficaces. Ce projet multisite, mené sur deux établissements utilisateurs, vise à caractériser les altérations de l’UNV à moyen et long termes (jusqu’à 6 mois) après exposition aux OP et d'évaluer un nouvel acteur thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets d’une intoxication sur l’unité neurovasculaire (UNV). Une meilleure compréhension de ces atteintes nous permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d’améliorer la prise en charge clinique globale à la suite d’une intoxication aux NOPs. De plus un nouvel acteur thérapeutique sera testé : le Glunomab® en association avec le traitement actuel.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : •Intoxication à un agent neurotoxique organophosphoré suivi par une étude comportementale d’observation (durée 1 heure) pour déterminer les signes d’intoxication. L’intoxication et l’étude comportementale ne seront réalisées qu’une seule fois. (Etablissement utilisateur (EU) administration toxique) • Une injection de traitement thérapeutique • Réalisation de 2 à 3 sessions d’imagerie cérébrale à 1 mois, 3 mois et 6 mois après l’intoxication (EU imagerie). Chaque session pourra inclure : une imagerie IRM d’environ 20 minutes, une imagerie ultrasonore de type speckle, d’environ 1 heure, et une imagerie fonctionnelle par ultrasons (fUS) d’environ 1 heure. La durée totale d’examen pourra ainsi varier selon le protocole sélectionné pour l’animal, tout en restant compatible avec son confort et son suivi.

Impact sur les animaux

Lors des expériences d’intoxication : -Pour l’un des axes de ce projet de recherche, les animaux seront exposés à une dose sous-létale de toxique entrainant une intoxication de faible sévérité . En revanche, pour l’autre axe, qui implique l’utilisation d’une dose sous-létale plus importante de toxique, le développement de symptômes plus sévères peut survenir, notamment des crises convulsives périphériques. Ces effets post-intoxication apparaissent dans la première heure post-intoxication, et la surveillance des animaux sera prolongée jusqu’à 6 heures post-intoxication pour s’assurer de leur récupération.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever leurs organes et d’y étudier ex vivo certains paramètres et de les confronter aux données en imagerie.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier de manière intégrée la réponse du système nerveux central et périphérique à un neurotoxique. Par ailleurs, l’étude de l’unité neurovasculaire (UNV) et sa fonctionnalité suite à une intoxication aux organophosphorés ne peut être envisagée qu’«in vivo». Il n’existe actuellement aucune culture reproduisant l’ensemble des éléments de l’UNV : cellules endothéliales, pieds astrocytaires, microglie et macrophages péri-vasculaires.

Réduction

Afin de limiter au maximum l'utilisation des animaux tout en garantissant une qualité scientifique suffisante, deux plans expérimentaux distincts ont été établis. Le premier vise à étudier les effets de l’intoxication aux agents organophosphorés. Le second a pour objectif d’évaluer l’efficacité des traitements utilisés, seuls ou combinés. Dans ces deux volets, les chercheurs analyseront plusieurs paramètres liés au fonctionnement cérébral, notamment le flux sanguin cérébral, l’activité cérébrale et des marqueurs d’activation vasculaire. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées afin de comparer les groupes et de déterminer si les différences observées sont significatives. Les effectifs animaux ont été calculés de manière à utiliser le minimum d’individus tout en obtenant des résultats fiables. Les animaux seront hébergés par petits groupes afin de garantir leur bien-être, et le plan expérimental a été conçu pour limiter strictement le nombre total d’animaux nécessaires. Cette stratégie permet d’obtenir des conclusions solides tout en respectant la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en conditions standards d’animalerie, 4 individus par cage avec accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Ils bénéficieront d’un milieu enrichi (matériel de nidification, tunnel). L’isolement des animaux sera limité au maximum afin de minimiser leur angoisse. Pendant la 1ère heure suivant l’intoxication, les animaux seront placés seuls afin de suivre l’évaluation de l’intensité de l’intoxication, puis ils seront remis en cage avec leurs congénères. Une surveillance journalière des souris sera effectué pendant une semaine à la suite de l’intoxication, et un indice sera calculé suivant une grille d’évaluation pré-établie (ex : changements du rythme respiratoire, changement du comportement, réponses comportementales aux stimuli externes). L’indice cumulatif (addition des valeurs de chaque critère) indiquera une souffrance/détresse croissante. Deux critères « vitaux » atteignant la valeur maximum entraineront la mise à mort de l’animal : « respiration » et « perte de poids » : ils sont considérés comme des points limites. En fonction de l’indice cumulatif, différentes prises en charge seront réalisées : augmentation de la fréquence de surveillance (2-3 fois par jour), apport de complément alimentaire (gel hydratant…), injection de glucose et/ou injection de buprénorphine. Une attente de 15 jours entre l’intoxication et le transport ainsi qu’une période d’acclimatation de 15 jours à l’arrivée du site d’imagerie sont prévues avant toute expérience afin de réduire les nuisances aux animaux. Pendant le transport, les animaux seront maintenus dans leur groupe de cage (n=4), avec ajout de nourriture, hydrogel et matériel de nidification supplémentaires. Seuls les animaux en bonne santé seront envoyés. Le transport sera organisé par un transporteur agrée. Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. Une surveillance journalière des souris sera effectuée à la suite des examens d’imagerie afin de suivre l’évolution du poids et la cicatrisation des sutures.

Choix des espèces

Les expériences seront réalisées sur des souris Swiss mâles âgées de 9 semaines, pesant entre 38 et 43 g. Cette souche est largement utilisée dans les modèles d’intoxication aux agents neurotoxiques, notamment pour son profil comportemental stable et reproductible. Elle permet également d’explorer différents volets expérimentaux, dont l’analyse du comportement et l’activité cérébrale. Le choix d’animaux jeunes adultes assure une bonne comparabilité avec les travaux antérieurement menés sur des modèles similaires. Utiliser le même stade de développement permet une continuité scientifique et facilite l’évaluation de l’effet des traitements en conditions contrôlées. Cette souche est aussi reconnue pour sa sensibilité à l’altération du fonctionnement de l’unité neurovasculaire (interaction entre neurones, vaisseaux sanguins et cellules de soutien du cerveau), un aspect pertinent pour l’étude des conséquences cérébrales de l’exposition aux agents organophosphorés.

Privées de tout enrichissement dans leur cage pour ne pas gêner l'apparition du phénotype recherché, 735 souris subissent un suivi quotidien de 83 à 138 jours, avec des sessions comportementales de 5 à 45 minutes et des sons désagréables dont elles doivent apprendre à s'échapper. 390 sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 345 dans des procédures d'un niveau sévère, 615 d'entre elles passant par une chirurgie du crâne pour implanter une fibre optique, parfois accompagnée d'une manipulation du nerf vague. Le porteur revendique un "progrès éthique significatif" et présente ses procédures comme moins invasives que les équivalents existants, tout en annonçant une modélisation animale des conduites suicidaires, un stress chronique par corticostérone dans l'eau de boisson et des traitements au lithium, à la fluoxétine ou au diazépam. Toutes les souris sont tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau, leur foie et leur intestin.

Objectifs

Ce projet a pour but de développer de nouvelles approches d’étude des comportements aversifs par échappement Pavlovien (c’est à dire ne requérant que les réflexes d’approche ou d'évitement) ou opérant (requérant ici une action volontaire) de sons désagréables mais non douloureux dans le suivi des symptômes anxieux et dépressifs (avec ou sans conduites suicidaires) et enfin de caractériser la pertinence du suivi non invasif de l’activité autonomique dans l’évaluation des altérations émotionnelles.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront des avancées majeures sur les plans fondamental, éthique et appliqué. Grâce au développement d’épreuves comportementales adaptées, le projet approfondira la compréhension des mécanismes cérébraux de l’axe intestin-cerveau impliqués dans l’anxiété et la dépression, ainsi que les processus cognitifs en situation aversive. Un volet crucial concerne la modélisation animale des conduites suicidaires, un outil qui fait actuellement défaut pour l'étude des mécanismes biologiques sous-jacents. Sur le plan méthodologique, l'approche longitudinale proposée constitue un progrès éthique significatif : en suivant les mêmes individus (profils anxio-dépressifs et capacités cognitives), nous réduisons considérablement le nombre d'animaux requis tout en minimisant leur stress par rapport aux méthodes conventionnelles. Enfin, d’un point de vue translationnel, ce projet évalue le microbiote intestinal comme levier thérapeutique contre les troubles liés au sevrage alcoolique. À plus long terme, ces recherches ouvriront la voie à des stratégies innovantes pour traiter la dépression résistante et améliorer la prévention du risque suicidaire.

Procédures

L'ensemble des animaux de cette étude sera soumis à un suivi expérimental longitudinal s'étendant sur une période de 83 à 138 jours, incluant des épreuves comportementales ou physiologique quotidiennes et divers traitements pharmacologiques temporaire. Le suivi phénotypique repose sur des sessions comportementales journalières de 5 à 45 minutes, durée optimisée pour garantir la robustesse des données, complétées dans certains cas par une évaluation de l'activité du système nerveux autonome sur des périodes de 5 minutes. En fonction des objectifs expérimentaux, l'activité neuronale sera ponctuellement mesurée par photométrie de fibre lors de deux à trois sessions stratégiques réalisées avant et après les traitements. Une chirurgie stéréotaxique unique, avec ou sans manipulation du nerf vague, sera pratiquée sur 615 individus pour permettre l'implantation de dispositifs de neuro-ingénierie. Les protocoles d'administration incluent des traitements chroniques par voie orale via l'eau de boisson, tels qu'une antibiothérapie de 15 jours ou une supplémentation en corticostérone, lithium ou fluoxétine sur 28 jours. Des interventions plus aiguës seront également pratiquées, comprenant des injections intra-péritonéales répétées de diazépam sur 4 jours ou de PCPA sur 7 jours, ainsi que deux gavages du microbiote de patients alcooliques espacés d'une semaine.

Impact sur les animaux

Le projet, impliquant un total de 735 souris, présente des degrés de sévérité allant de léger à sévère selon la nature des interventions. Afin de ne pas interférer avec le développement des phénotypes anxio-dépressifs recherchés, tous les animaux ne bénéficieront d'aucun enrichissement environnemental. Une partie de la cohorte est dédiée à la modélisation des troubles affectifs. Les animaux témoins sont soumis à des injections intra-péritonéales et à des tests comportementaux dont le stress transitoire, lié à la manipulation est classé en sévérité légère. Les animaux expérimentaux subissent, en complément, un protocole de stress chronique par supplémentation de corticostérone dans l’eau de boisson. Ce traitement, visant l'induction d'un phénotype anxio-dépressif stable, porte le degré de nuisance à modéré. Pour l'étude des circuits neuronaux, des groupes d'animaux subissent une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale afin d'injecter des rapporteurs calciques et d'implanter des fibres optiques. Le suivi par photométrie de fibre impose un couplage physique à un câble optique lors des tests, pouvant induire une gêne motrice. En raison du caractère invasif de la chirurgie et des contraintes liées aux enregistrements longitudinaux, ces interventions sont classées en nuisances modérées. Dans certains protocoles, l'ajout d'une étape de punition par chocs électriques de faible intensité — bien qu'évitables par l'animal — renforce cet état de stress, maintenant la classification en sévérité modérée. Les procédures liées à la consommation volontaire d'alcool atteignent un degré de nuisances sévères en raison du cumul de plusieurs facteurs de stress chroniques. Aux stress des tests comportementaux, de la chirurgie stéréotaxique, des enregistrements de photométrie et gavage ; s’ajoute l’isolement social. Les animaux sont logés individuellement pendant cinq semaines. Ce mode d'hébergement individuel est choisi pour faciliter l'auto-administration d'éthanol et exacerber les phénotypes anxio-dépressifs au sevrage.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin d'expérience pour collecter et analyser ultérieurement leurs cerveaux et/ou organes périphériques (foie, intestin).

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. Le modèle animal reste le seul recours pour comprendre les mécanismes neuronaux intégrés tels que ceux sous tendant les altérations émotionnelles, cognitives et physiologiques dans l’anxiété, la dépression avec ou sans conduites suicidaires et le mésusage d’alcool et qui ne peuvent être modélisés in vitro ou in silico à ce jour.

Réduction

Le projet s’inscrit dans une approche de réduction et de raffinement des procédures d’évaluation des comportements de type anxieux et dépressif. Il se propose de vérifier la stabilité des comportements d’échappement Pavlovien ou opérant au cours de tests répétés. Une telle configuration permet l’utilisation des mêmes animaux pour l’évaluation de différentes stratégies thérapeutiques qui nécessiterait autrement l'utilisation d’un plus grand nombre d’animaux avec les outils actuels. Le nombre d’animaux pour chaque expérience a été choisi de manière à concilier la réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un pouvoir statistique suffisant pour une interprétation raisonnable des données. Les études de traitements pharmacologiques sur le comportement et les activités physiologiques au niveau central et autonomique sera fait entre groupes et au sein du même groupe ce qui ne peut se faire d’après nos propres expériences et de la littérature qu’avec des analyses statistiques sur des populations d’un minimum de 15 souris par groupe.

Raffinement

Les évaluations émotionnelles, autonomiques et cognitives dans ce projet sont beaucoup moins invasives que les procédures équivalentes qui existent à ce jour. La plupart des procédures présentées ici remplacent les stimulations aversives par choc électrique par des stimulations sonores désagréables mais non douloureuses. Les évaluations autonomiques sur animal éveillé utiliseront un système non invasif récemment mis au point, remplaçant les enregistrements par capteur à demeure implanté sous anesthésie par des enregistrements par contact des pattes sur une grille, permettant ainsi de se dispenser de chirurgie d’implantation. De plus, en comparant l'état général du bien-être des souris avec les enregistrements non invasifs de leur activité autonomique, ce projet permettra d'évaluer la pertinence de cette dernière comme indice précoce d'une détérioration du bien-être animal Pour évaluer le bien-être des animaux, le suivi clinique quotidien sera évalué par un score de 0 à 2 pour chacune des 5 composantes suivantes : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture et mobilité, comportement dans la cage d’hébergement et signes cliniques comme présenté dans l’annexe 1. Lorsque le total des différents scores sera supérieur à 8, il sera considéré que les animaux ont atteint un point limite et seront sacrifiés pour mettre fin à leur souffrance. La décision est prise par le responsable du projet en accord avec la structure chargée du bien-être de l'établissement utilisateur où sont hébergés les animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris adulte comme modèle biologique repose sur les fortes homologies anatomiques et fonctionnelles du système nerveux central entre les rongeurs et l'Humain. Ces similitudes, conservées au cours de l'évolution des mammifères, concernent tant la diversité des populations cellulaires cérébrales que les processus moléculaires sous-jacents aux fonctions supérieures. Le modèle murin constitue ainsi un outil translationnel de référence pour l'étude des mécanismes cellulaires et le développement de stratégies pharmacologiques ciblant les altérations émotionnelles, cognitives et décisionnelles. Le choix de la souris adulte est ici impératif, ce stade de maturité étant le seul à garantir l’expression complète et stable du répertoire comportemental complexe (anxiété, dépression, processus décisionnels). L’utilisation exclusive d’animaux adultes permet ainsi d’étudier des mécanismes physiopathologiques pleinement établis.

En moyenne trente-cinq mesures par souris sur douze semaines de croissance tumorale : 9 840 souris vont être utilisées dans cette plateforme préclinique, toutes tuées à l'issue, 9 780 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 60 en gravité sévère. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales, une puce implantée sous la peau sous anesthésie, des administrations de composés dont certaines par gavage, et des prélèvements sanguins. Une partie des souris sont immunodéficientes puis reconstituées avec un système immunitaire humain, une autre génétiquement modifiée pour exprimer des protéines humaines. Les études pilotes servent à écarter les lignées tumorales "trop agressives", et le porteur indique n'y appliquer aucun test statistique.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer de nouveaux modèles tumoraux chez la souris et d’utiliser ces modèles dans des études d’efficacité visant à tester de nouvelles thérapies anticancéreuses. Les modèles utilisés sont soit des souris génétiquement modifiées exprimant une ou plusieurs protéines humaines en remplacement de leurs équivalents murins, correspondant à des cibles pertinentes pour les traitements anticancéreux, soit des souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain fonctionnel. Ces derniers modèles permettent de reproduire les interactions entre des cellules tumorales humaines et un système immunitaire humain. Le projet comprend dans un premier temps des études pilotes, nécessaires avant toute étude d’efficacité. Ces études pilotes ont pour but d’évaluer de nouvelles lignées de cellules tumorales, de définir des conditions expérimentales adaptées permettant d’obtenir une croissance tumorale homogène et reproductible, et d’identifier et d’exclure les lignées trop agressives. Ces dernières pourraient en effet compromettre le bien‑être des animaux et rendre les études scientifiquement non exploitables. Le projet inclut également des études pilotes de tolérance, réalisées chez un nombre limité de souris, afin d’évaluer la toxicité de nouvelles molécules anticancéreuses n’ayant pas encore été utilisées chez l’animal. Les composés présentant une toxicité inacceptable sont exclus, ou bien les conditions expérimentales (dose, voie et/ou fréquence d’administration) sont ajustées afin d’assurer une utilisation sûre chez l’animal. Enfin, lorsque les conditions expérimentales sont validées, le projet comprend des études d’efficacité au cours desquelles les nouvelles molécules anticancéreuses sont évaluées dans les modèles tumoraux précédemment caractérisés.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à contribuer à la recherche anticancéreuse en développant, caractérisant et utilisant des modèles tumoraux chez la souris présentant une forte pertinence biologique. Les modèles employés reposent sur des souris génétiquement modifiées exprimant des protéines humaines du système immunitaire, ou sur des souris reconstituées avec un système immunitaire humain fonctionnel. Ces modèles permettent de reproduire de manière plus représentative certaines interactions entre les tumeurs et le système immunitaire humain. Les études réalisées à l’aide de ces modèles ont pour objectif d’améliorer l’évaluation préclinique de nouvelles molécules anticancéreuses, en fournissant des données plus pertinentes sur leur efficacité et leur tolérance avant toute utilisation chez l’Homme. En renforçant la valeur prédictive des études précliniques, ce projet contribue à améliorer la transposition des résultats vers la situation clinique, à réduire le risque d’échec lors du développement ultérieur des médicaments et à limiter l’exposition inutile des patients à des traitements inefficaces ou toxiques. À terme, ces travaux participent à l’optimisation du développement de stratégies thérapeutiques innovantes contre le cancer et visent à faciliter l’accès des patients à de nouveaux traitements mieux adaptés.

Procédures

Les interventions réalisées dans le cadre de ce projet comprennent la greffe de cellules tumorales, le suivi de la croissance tumorale, l’administration de composés et des prélèvements sanguins. La greffe de cellules tumorales consiste en une injection unique, réalisée le plus souvent par voie sous cutanée (SC) dans le flanc, et plus rarement par voie intraveineuse (IV). Les injections SC sont effectuées sous anesthésie (≤10 min) afin d’éviter les mouvements de l’animal, d’assurer une injection homogène et de limiter le stress. Les injections IV, très rapides (quelques secondes), sont réalisées sans anesthésie. Tous les souris reçoivent une puce électronique implantée par voie SC sous anesthésie, permettant l’identification individuelle et le suivi de la température corporelle, en remplacement de méthodes plus invasives, réduisant ainsi le stress lié aux manipulations répétées. La croissance tumorale est suivie par des mesures du volume tumoral, réalisées soit à l’aide d’un pied à coulisse chez un animal vigile, soit par imagerie in vivo sous anesthésie, selon le type de tumeur. La contention nécessaire à la mesure au pied à coulisse est brève (

Impact sur les animaux

Certaines souches de souris sont immunodéficientes et présentent une sensibilité accrue aux infections opportunistes ; elles sont donc maintenues sous des conditions sanitaires strictes. En l’absence d’infection, ces animaux restent en bon état général. Les manipulations peuvent être associées à un stress transitoire, limité par des contentions brèves et adaptées. Les injections réalisées chez des animaux vigiles sont de courte durée et peuvent entraîner une gêne légère et transitoire. Bien que très rares, des irritations locales ou des complications au site d’injection peuvent survenir. Dans des cas spécifiques et exceptionnels, des volumes plus importants peuvent être injectés, ce qui peut entraîner des effets physiologiques légers, aigus et transitoires durant quelques minutes (modifications respiratoires ou cardiaques, baisse temporaire de l’activité) (modifications respiratoires ou cardiaques, baisse temporaire d’activité). Les injections sous cutanées de cellules tumorales sont réalisées sous anesthésie afin d’éviter les mouvements de l’animal et d’assurer une injection homogène ; une douleur locale légère et transitoire peut être observée après le réveil. Le gavage peut occasionnellement provoquer un inconfort léger et transitoire et, plus rarement, des complications mécaniques. Les prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie, peuvent être associés à une douleur légère et transitoire, avec un risque très faible de complications locales. La croissance de tumeurs solides peut entraîner une gêne locomotrice ou des altérations cutanées, tandis que les tumeurs disséminées peuvent provoquer des signes généraux modérés. Enfin, certains composés ou pré traitements peuvent induire des réactions locales ou systémiques transitoires. Les composés dont le profil est encore inconnu peuvent présenter une toxicité. Des études pilotes permettent d’identifier et d’exclure précocement les lignées cellulaires tumorales ou les composés susceptibles d’entraîner des situations défavorables pour le bien‑être animal. Des signes cliniques non anticipés peuvent survenir ; les signes modérés sont pris en charge et intégrés aux points limites, tandis que les signes sévères entraînent l’arrêt de l’étude.

Devenir

Afin de recueillir un maximum d’informations scientifiques à l’issue des études, des prélèvements sont réalisés sur les tumeurs ainsi que, le cas échéant, sur d’autres organes et sur le sang. Ces prélèvements nécessitent la mise à mort des animaux à la fin de l’étude. Pour cette raison, l’ensemble des animaux inclus dans le projet est mis à mort à l’issue des procédures, afin de permettre la collecte des échantillons nécessaires à l’analyse

Remplacement

Les lignées tumorales et les composés étudiés font l’objet d’une phase préalable de caractérisation approfondie en laboratoire, notamment par des essais réalisés sur cellules en culture. Ces travaux permettent d’évaluer les caractéristiques biologiques pertinentes, telles que le comportement des cellules et la présence de cibles thérapeutiques, sans utiliser d’animaux. Les études décrites dans ce projet ne sont mises en œuvre chez l’animal qu’après l’achèvement de ces étapes préalables et lorsque les méthodes alternatives disponibles ont été exploitées. Le recours à un modèle animal intervient uniquement lorsque les données obtenues in vitro ne permettent plus de répondre aux questions scientifiques posées et que l’étude dans un organisme vivant constitue l’étape suivante nécessaire du développement préclinique.

Réduction

Le nombre de souris utilisées par lot est limité au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables et interprétables. Ce nombre est défini en tenant compte de la variabilité naturelle de la croissance tumorale, du risque de prise tumorale variable pour des lignées encore peu caractérisées, ainsi que de la variabilité biologique observée dans certains modèles, en particulier ceux reposant sur la reconstitution d’un système immunitaire humain. Des études pilotes sont mises en œuvre lorsque les données disponibles chez l’animal sont insuffisantes. Elles permettent de tester des lignées cellulaires ou des composés sur un nombre limité d’animaux, afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes et d’exclure précocement des lignées trop agressives ou des composés présentant une toxicité inacceptable, avant toute utilisation dans des études d’efficacité impliquant des effectifs plus importants. Ces études sont conçues à partir de l’ensemble des informations disponibles, incluant les données issues de la littérature scientifique et, le cas échéant, celles provenant de composés comparables, afin de limiter le nombre de conditions testées. En raison de leur caractère exploratoire et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, aucun test statistique n’y est réalisé et les effectifs sont maintenus au minimum nécessaire. Pour les études d’efficacité, le nombre d’animaux est calculé de manière à permettre la réalisation d’analyses statistiques adaptées, tout en restant aussi faible que possible. Les effectifs retenus permettent de prendre en compte l’hétérogénéité biologique tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats. Enfin, à l’issue de chaque étude, des prélèvements biologiques (tumeurs, sang et/ou des organes) peuvent être réalisés post mortem afin de maximiser les données obtenues et d’éviter des répétitions expérimentales inutiles, conformément au principe de réduction des 3R.

Raffinement

Les conditions d’hébergement, de manipulation et de suivi des souris sont mises en œuvre afin de limiter au maximum le stress, la douleur et l’inconfort. Les animaux sont hébergés sous statut sanitaire contrôlé, en groupes sociaux stables, dans des cages enrichies comportant du matériel favorisant les comportements naturels, avec un accès libre à l’eau et à l’alimentation. Une période d’acclimatation est respectée avant le début des études. Les souris sont équipées de puces implantables permettant leur identification individuelle et le suivi de la température corporelle. L’utilisation de ces puces remplace des méthodes d’identification et de mesure plus invasives et permet de simplifier les manipulations, tout en réduisant le stress lié aux interventions répétées. Les manipulations sont réduites au strict nécessaire et réalisées sous anesthésie lorsque cela est recommandé. Les injections sont effectuées à l’aide de matériel adapté et dans le respect des volumes autorisés. Les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie, limités au nécessaire, et espacés afin de permettre une récupération adéquate. Les sites de prélèvement peuvent être alternés pour éviter toute irritation ou lésion liée à des ponctions répétées. Un suivi clinique régulier est assuré tout au long des études, avec une fréquence adaptée à la procédure. Des dispositifs de suivi peu invasifs sont privilégiés afin de réduire le stress, notamment pour la mesure de la température corporelle. Des points limites spécifiques, classés en modérés ou sévères, sont définis pour chaque procédure afin de permettre une prise en charge rapide des animaux présentant des signes cliniques. Une souris présentant trois signes modérés ou un signe sévère est mise à mort. En cas de signes modérés, un suivi renforcé et des mesures de soutien adaptées peuvent être mis en place. Tout signe clinique inattendu est évalué avec le vétérinaire et la structure en charge du bien‑être animal, puis intégré aux points limites pour les études ultérieures.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car elle constitue l’espèce de référence pour les études précliniques en oncologie et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques anticancéreuses. Les modèles murins, y compris les modèles génétiquement modifiés ou humanisés, permettent de reproduire des processus biologiques complexes impliqués dans la croissance des tumeurs et la réponse aux traitements, notamment les interactions entre la tumeur, son environnement et le système immunitaire. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives réalisées uniquement sur cellules ou tissus isolés. La souris présente également des avantages scientifiques et pratiques importants, tels qu’une taille adaptée aux procédures expérimentales, une manipulation facilitée, une cinétique de développement tumoral compatible avec les objectifs des études, ainsi qu’une large base de connaissances scientifiques permettant une interprétation fiable des résultats. Le recours à cette espèce permet ainsi d’obtenir des données pertinentes pour la recherche sur le cancer. Les souris immunocompétentes génétiquement modifiées sont utilisées à l’âge de jeune adulte, période à laquelle leur développement physiologique et immunitaire est stabilisé. Ce stade permet une croissance tumorale reproductible et une bonne tolérance aux procédures expérimentales. Les souris immunodéficientes reconstituées avec un système immunitaire humain sont utilisées à un âge plus avancé, nécessaire à la mise en place et à la stabilisation fonctionnelle du système immunitaire humain.

Deux chirurgies sous anesthésie générale, la seconde onze jours après la première, puis des séances d'observation comportementale : 376 rats vont être utilisés pour tester douze molécules antidépressives de synthèse, tous tués à l'issue pour que leurs cerveaux soient prélevés. 328 d'entre eux sont déclarés en gravité sévère, 48 en gravité modérée. Le porteur écrit pourtant qu'"aucune nuisance n'a été rapportée" avec la technique d'administration continue, et que les rats opérés "ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d'un stress, d'une souffrance ou d'un inconfort particulier". Les deux tests comportementaux sur lesquels repose tout le projet ne sont jamais nommés.

Objectifs

Les molécules actuellement disponibles pour le traitement de la dépression et des troubles de l'humeur sont loin d'être optimales. En effet, seuls 1/3 des patients répondent pleinement aux médicaments, et même dans ce cas, on n'observe une amélioration thérapeutique qu'après plusieurs semaines d'administration continue, un problème qui peut s'avérer crucial, notamment dans les cas de crise suicidaire. Sur la base de travaux menés durant les 20 dernières années, nous avons récemment proposé la création d’une nouvelle classe de molécules antidépressives, susceptibles de présenter à la fois un meilleur taux de réponse et une rapidité d’action 5 à 10 fois plus importante que les molécules classiques. Grâce à une collaboration avec un laboratoire de chimie organique nous avons mis en place un processus de synthèse chimique et obtenu un petit nombre de molécules correspondant au design théorique que nous avions proposé. Les tests de validation in vitro ont montré que ces composés correspondaient au profil ciblé. Suite à ces travaux préliminaires, nous avons lancé un programme de synthèse de molécules plus ambitieux en termes de nombre (12 composés sont planifiés), et plus précis encore dans le ciblage des profils pharmacologiques. Le présent projet vise à valider le potentiel d’antidépresseur rapides de ces nouvelles molécules chez le rongeur. Pour cela, nous confirmerons la non-toxicité de ces médicaments potentiels en suivant en détail l’état de santé d’une petite cohorte d’animaux, puis nous procèderons à deux tests comportementaux. Le premier de ces tests permet de détecter si un composé donné a un potentiel d’antidépresseur, mais il ne donne pas de renseignement sur la vitesse d’apparition d’un éventuel effet. Le second est précisément connu et validé pour permettre de mesurer cette vitesse.

Bénéfices attendus

Le programme auquel se rattachent ces expériences permet d’espérer qu’au moins l’une des molécules obtenues satisfasse aux conditions requises pour entrer dans un programme de développement en phase d’essais cliniques. En cas de réussite, il deviendrait alors possible à terme de proposer la mise sur le marché d’une nouvelle classe de médicaments antidépresseurs, capables d’agir plus rapidement que les molécules actuelles.

Procédures

Pour l’étude-pilote de validation, les animaux seront soumis à une chirurgie de très courte durée (3-5 min), permettant d’administrer le composé en continu. Le premier test comportemental se fait sur deux sessions séparées de 24 h. La première session dure 15 min, il s’agit d’une phase d’habituation. Le lendemain, le composé test est administré en aigu, puis l’animal est replacé dans le même test comportemental pour 5 min. Dans le second test comportemental, les animaux seront soumis à deux chirurgies, sous anesthésie générale: la première nécessaire au test comportemental en lui-même (environ 30 min par animal), la seconde 11 jours plus tard pour permettre d’administrer nos composés en continu, comme décrit ci-dessus. Puis, 3 et 14 jours après cette seconde chirurgie, les animaux seront soumis à deux séances d’observation comportementale, d’une durée de 10 min chacune. Cela revient donc à 4 interventions sur la durée de vie à la mort de l'animal pour ce test.

Impact sur les animaux

Nous surveillerons tout particulièrement les risques d’apparition d’effets secondaires indésirables dus à l’utilisation de nos nouvelles molécules sur les animaux lors de l’étude-pilote. Même si, sur la base de leurs profils pharmacologiques, il semble peu probable que de tels phénomènes se produisent, les fonctions vitales (respiration, rythme cardiaque, réflexes entre autres) seront surveillées de près durant tout le temps d’administration. Cette administration en continu des composés nécessite une chirurgie. Il s’agit d’un geste extrêmement minime effectué sous la peau du dos, qui ne nécessite d’anesthésier l’animal que durant quelques minutes : aucune nuisance n’a été rapportée suite à l’utilisation de cette technique. Le second test repose sur un autre type de chirurgie avant de passer aux expériences comportementales proprement dites. Cette dernière chirurgie provoque des douleurs modérées ; cependant, il a été montré que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d’un stress, d’une souffrance ou d’un inconfort particulier. La surveillance des animaux sera donc celle qui est classiquement mise en œuvre après une chirurgie, les risques de nuisance étant de type post-opératoire : infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie.

Devenir

A l'issue de l'étude-pilote et des deux tests, tous les animaux seront mis à mort : il sera nécessaire de prélever les cerveaux pour analyser le tissu cérébral en post-mortem.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons valider, à l'aide de deux tests comportementaux, le potentiel de nos molécules comme nouveaux antidépresseurs, à action rapide. Par définition, un modèle comportemental ne peut pas s'effectuer autrement que sur le système intégré que représente un animal entier, et vivant.

Réduction

Les expériences de pharmacologie in vitro que nous avons menées en amont de ce projet nos ont permis d’éliminer 15 molécules, qui ne correspondaient pas au profil visé. Ces composés ne seront donc évidemment pas testés in vivo. Seules 12 molécules ont répondu à nos critères, elles seront synthétisées dans les quantités nécessaires pour le présent programme in vivo durant les 5 années prévues pour sa réalisation. Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Pour cela, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque lot expérimental, en nous basant sur les acquis de travaux précédents, et sur des calculs statistiques. L’étude-pilote de validation nécessitera d’utiliser 4 animaux par cohorte ; pour ce qui concerne les tests comportementaux, nous avons déterminé qu'il sera nécessaire d'utiliser un effectif compris entre 8 et 10 animaux par lot en fonction de la variabilité propre à l’expérimentation. Nous avons ainsi établi un grand total de 376 rats nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximum leur bien être durant la totalité de l’étude. Un minimum de 14 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal dès leur arrivée à l‘animalerie, où ils seront placés en cages collectives par groupe de 2 individus. Lors de l’étude-pilote, leur état de santé sera examiné en profondeur de manière quotidienne. Si un effet toxique est suspecté suite à l’administration d’une des molécules prévues dans le programme, les expériences seront immédiatement arrêtées, et le produit définitivement écarté de la suite du projet. De même, une pesée et une observation quotidienne seront réalisées durant les périodes post- opératoires afin de s’assurer du bon état des plaies chirurgicales, des sutures et du bien-être général. Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux recevront un anti inflammatoire afin de lutter contre l’apparition de toute douleur éventuelle. En outre, nous utiliserons des anesthésiants locaux autour des zones opérées. Des points limites définis préalablement permettront de s’assurer que tous les animaux maintenus dans les procédures expérimentales sont dans les conditions optimales pour limiter stress, souffrance et inconfort. Si l’un ou plusieurs de ces points limites est atteint, des procédures de soin seront mises en place suivant un arbre décisionnel prédéfini, impliquant les expérimentateurs et le vétérinaire de la structure.

Choix des espèces

Le second test, qui nous permet d'évaluer la cinétique d'effet d'un traitement antidépresseur potentiel, a été validé chez le rat et n’est pas transposable à la souris. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte (entre 7 et 9 semaines), qui correspond à ce qui est classiquement choisi pour le type d’expériences que nous réalisons.