Procédures sévères

Greffées de cellules de cancer du pancréas sous la peau ou directement dans le pancréas, au cours d'une opération d'environ 25 minutes, 725 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Pendant quatre semaines, elles reçoivent chaque jour une injection de médicament et passent une fois par semaine sous anesthésie pour une imagerie optique, une partie d'entre elles étant des souris NSG que le porteur décrit comme "sévèrement immunodéficientes". Le projet vise à rendre ces tumeurs plus sensibles à une molécule ciblant le métabolisme du fer, avec des retombées énoncées au conditionnel. Tout le projet est déclaré en souffrance sévère, alors que le porteur décrit la croissance tumorale comme source d'un "léger inconfort lors de la locomotion" et mentionne une "résection des tumeurs" absente de la liste des procédures.

Objectifs

Le cancer du pancréas est l’un des cancers les plus agressifs et les plus difficiles à traiter. L’une des raisons est que les cellules cancéreuses peuvent résister aux mécanismes naturels qui conduisent normalement à leur mort. Ces tumeurs ont également un besoin important de certains nutriments, en particulier le fer, qui favorisent leur croissance et leur production d’énergie. Cependant, cette dépendance au fer peut aussi les rendre vulnérables à des traitements spécifiques qui ciblent l’équilibre du fer dans les cellules. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les cellules du cancer du pancréas survivent et de déterminer si la modification de certains processus internes peut rendre ces traitements plus efficaces pour provoquer leur mort. Nous utiliserons deux types de modèles murins de cancer du pancréas : 1. Dans le premier modèle, les tumeurs seront développées sous la peau des souris. Cette méthode permet de mesurer facilement la croissance tumorale et d’évaluer l’efficacité du traitement. 2. Dans le second modèle, les tumeurs seront implantées directement dans le pancréas. Ce modèle se rapproche davantage du cancer du pancréas humain et permet de mieux comprendre le comportement des tumeurs dans un environnement naturel. Dans les deux cas, nous comparerons la croissance des tumeurs et leur réponse au traitement dans différentes conditions. Dans l’ensemble, ce projet vise à améliorer notre compréhension du cancer du pancréas et à contribuer au développement de traitements plus efficaces à l’avenir.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre certains mécanismes impliqués dans la mort des cellules cancéreuses dans le cancer du pancréas. En confirmant ces mécanismes chez l’animal, cette étude pourrait permettre d’identifier de nouveaux indicateurs ou approches pour améliorer les traitements. Ces résultats pourraient contribuer à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques combinées, afin de rendre les traitements plus efficaces. Plus largement, ce projet vise à améliorer la prise en charge du cancer du pancréas en contribuant au développement de traitements plus adaptés aux patients.

Procédures

Dans cette étude, les souris subiront deux types de procédures pour étudier le cancer du pancréas. Dans la première, des cellules tumorales seront injectées sous la peau une seule fois par souris. Cette procédure est très courte, environ une minute, et les souris seront endormies sous anesthésie. Dans la seconde, les cellules tumorales seront transplantées directement dans le pancréas. Cette opération se fera une seule fois et durera environ 25 minutes, incluant l’anesthésie, l’intervention chirurgicale et le réveil des souris. Pendant quatre semaines, les souris recevront chaque jour une injection d’un médicament qui agit sur les cellules tumorales pour les tuer. Chaque injection dure environ une à deux minutes. Pour suivre l’évolution de la maladie, les souris seront examinées une fois par semaine à l’aide d’une technique d’imagerie optique. Cette méthode est non invasive, mais nécessite une anesthésie légère. Une substance spéciale est administrée avant l’examen pour rendre les tumeurs visibles, et chaque séance dure environ six à dix minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les atteintes subies par les animaux comprennent : • Pendant la chirurgie : Procédures chirurgicales pour l’implantation et la résection des tumeurs ; chirurgie comportant un risque d’infection au niveau du site d’incision ; effets indésirables de l’anesthésie gazeuse (diminution de la température corporelle, dépression respiratoire) ; douleur associée à l’injection de cellules tumorales dans le pancréas. • Après la chirurgie : Injection pour administration de médicaments; complications postopératoires potentielles (rupture de suture, infection de la plaie). • Pendant le développement tumoral et métastatique : Développement tumoral pouvant s’accompagner d’un léger inconfort lors de la locomotion en raison du volume tumoral et, plus rarement, d’une perte de poids ; développement métastatique pouvant affecter le bon fonctionnement des organes envahis ; procédures régulières telles que la mesure du poids corporel, la manipulation lors des mesures du volume tumoral et l’anesthésie associée à l’imagerie optique (hebdomadaire), constituant une source potentielle de stress à court terme ; injections IP répétées du traitement pendant une durée maximale de 4 semaines et les effets indésirables associés, constituant une nuisance modérée ; souris NSG, sévèrement immunodéficientes et sensibles aux infections par un large éventail de pathogènes normaux, opportunistes et commensaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex vivo le développement tumoral et métastatique selon les conditions expérimentales.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est essentielle pour ce projet, qui vise à améliorer l’efficacité des médicaments ciblant la ferroptose (IKE) par la manipulation génétique de régulateurs clés du métabolisme cellulaire. Afin de réduire l’utilisation d’animaux, toutes les expériences feront d’abord l’objet d’une caractérisation approfondie in vitro à l’aide de lignées cellulaires cultivées et de systèmes protéiques purifiés. Toutefois, des aspects critiques de nos résultats doivent être validés in vivo afin de prendre en compte l’influence du métabolisme de l’organisme entier, du microenvironnement tumoral et de la pharmacodynamique des médicaments, des facteurs qui ne peuvent pas être reproduits avec précision in vitro. Ces paramètres ne peuvent être évalués de manière fiable que dans des modèles animaux de cancer du pancréas.

Réduction

Ce projet de 5 ans implique un maximum de 725 souris; toutefois, les études seront menées par étapes successives avec des critères précis permettant de décider de la poursuite ou de l’arrêt des expériences. Une phase initiale évaluera l’intérêt de cibler certains mécanismes biologiques impliqués dans le développement et la résistance aux traitements du cancer du pancréas dans un modèle de souris dépourvues de système immunitaire fonctionnel. Seules les approches ayant démontré un intérêt lors de cette première phase seront poursuivies afin d’étudier, de manière séquentielle, l’influence du système immunitaire et des tissus sains entourant la tumeur sur le développement de la maladie, tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaire. Pour toutes les études, une planification rigoureuse sera réalisée et des mesures seront prises pour minimiser à la fois le nombre d’animaux utilisés et la sévérité des procédures. Le nombre de souris nécessaires a été déterminé à l’aide de méthodes statistiques permettant d’obtenir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux. Enfin, afin de réduire davantage le nombre de souris utilisées, nous emploierons une technique d’imagerie permettant de suivre l’évolution des tumeurs chez les animaux vivants de manière non invasive et répétée, réduisant ainsi le recours à des procédures supplémentaires.

Raffinement

L’hébergement est effectué conformément à la réglementation en vigueur, sous le contrôle d’un vétérinaire et avec l’aide d’un personnel technique qualifié. Les animaux feront donc l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou de souffrance éventuelle conduira à la mise en œuvre de l’action appropriée (par exemple l’administration d’un analgésique) en fonction d’une grille d’évaluation du bien-être. Les greffes, les prélèvements et l’imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse et sur tapis chauffant afin de réduire au strict minimum le stress et la souffrance des animaux. Une analgésie peropératoire sera appliquée lors des interventions chirurgicales. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué par des mesures cinétiques utilisant des méthodes non invasives: des mesures au pied à coulisse, ou des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris, modèle de référence dans la recherche sur le cancer du pancréas. Les caractéristiques morphologiques et génétiques des tumeurs reproduisent étroitement la maladie humaine. Les souris offrent également plusieurs avantages : développement rapide, portées nombreuses, et facilité de soins et d’élevage. Conformément à la littérature, pour les expériences de transplantation, les cellules seront implantées chez des souris «jeunes adultes » âgées de 5 à 8 semaines.

34 marmousets, des ouistitis communs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacun subit deux ou trois chirurgies de deux à sept heures pour poser une chambre d'imagerie sur le cerveau, puis des anesthésies pouvant durer six heures chaque semaine pendant des mois, avec des complications possibles allant des infections aux abcès et à l'œdème cérébral. Le porteur estime que 36 mois entre l'implantation et la mise à mort devraient suffire pour étudier comment le cortex représente la scène visuelle. Il présente ce maintien prolongé comme une réduction du nombre de marmousets, obtenue "tout en gardant des animaux en très bonne santé".

Objectifs

Cette demande d'autorisation de projet fait suite à un projet déjà mis en place dans notre laboratoire et présente deux objectifs principaux. Il vise dans un premier temps à comprendre comment les neurones corticaux encodent différents attributs de la scène visuelle et interagissent ensemble pour générer une représentation globale de l'information, par exemple un simple objet en déplacement dans l'espace visuel. Ceci implique plusieurs sous-objectifs tels que le développement d'un protocole d'entraînement des animaux afin de pouvoir enregistrer l'activité neuronale pendant qu'ils réalisent une tâche visuelle simple, ainsi que le raffinement des procédures d'imagerie déjà mises en place dans notre laboratoire pour enregistrer cette même activité neuronale sous anesthésie. Ces deux modalités d'acquisition de données (éveillé et anesthésié) testées sur les mêmes animaux nous permettront ainsi d'obtenir des informations sur le fonctionnement des réseaux neuronaux qui sous-tendent la vision. Le second objectif de ce projet est de développer des outils et méthodes permettant l'acquisition de données d'électrophysiologie (activité électrique) des neurones du cortex visuel chez le marmouset couplées aux données d'imagerie optique.

Bénéfices attendus

En premier lieu, la réalisation de ce projet nous permettra d'accroitre nos connaissances fondamentales sur le système visuel et de mieux comprendre la manière dont le cerveau intègre et représente l'information visuelle et le rôle joué par certaines régions spécifiques du cerveau dans les comportements moteurs d'orientation des yeux. Par ailleurs, les informations collectées pourraient permettre d'améliorer les solutions mises en place chez certains patients. Elles pourront par exemple contribuer à améliorer les techniques d'appareillage prothétique et la performance en réhabilitation visuelle.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 ou 3 interventions chirurgicales pouvant durer de 2 à 7h. Ils pourront être par la suite anesthésiés une fois par semaine maximum, chaque anesthésie durant 6h au maximum (4h en moyenne). Ces sessions sous anesthésies seront conduites pendant plusieurs mois, mais la durée de l'expérience ne peut être prédéterminée à l'avance car elle dépendra de l'état de santé des animaux. C'est pourquoi la santé de chaque animal inclus dans ce projet sera suivie quotidiennement par du personnel formé, et leur état de santé réévalué tous les 6 mois. Nous estimons toutefois qu'une période de 36 mois entre la chirurgie d'implantation et la mise à mort de l'animal devrait suffire pour l'entraîner et acquérir toutes les données nécessaires. Aussi, les animaux qui passeront les mêmes expériences mais en étant éveillés devront être habitués et entraînés à passer ces exépriences. Cela implique qu'ils soient manipulés et capturés plusieurs fois par semaine.

Impact sur les animaux

Ces expérimentations impliquent plusieurs chirurgies, des anesthésies répétées dans le temps et une manipulation hebdomadaire voire quotidienne des animaux (entraînements vigiles, contention pour induction d'anesthésie, contention pendant les entraînements vigiles, enregistrements éveillés...) qui pourront induire du stress pendant les mois d'expérimentation. Du stress et des complications faisant suite aux chirurgies et anesthésies peuvent également survenir dans les jours qui suivent l'intervention (mise à jeun la veille de chaque anesthésie, isolement quelques heures en retour de chirurgie, douleurs, inflammation, infections, difficultés respiratoires, perte d'appétit, tremblements, abcès, oedème cérébral...).

Devenir

Pour avoir des données complètes sur le système visuel que nous étudions, le projet nécessite le prélèvement du cerveau à la fin de la procédure, et donc la mise à mort des animaux utilisés.

Remplacement

Ce projet requiert l'enregistrement de l'activité cérébrale à différentes échelles, c'est à dire à l’echelle d'une aire cérébrale mais avec une grande résolution spatiale (neurone) et temporelle (potentiel d’action). Les méthodes non-invasives ne permettent pas cet accès, et l'utilisation d'animaux ne peut donc être remplacée.

Réduction

Afin de minimiser le nombre d'animaux prévus pour réaliser cette étude, nous voulons faire passer les animaux par toutes les techniques d'imagerie optique dont nous disposons une fois qu'ils seront implantés de la chambre d'imagerie. Nous avons conscience que cela implique que les animaux restent plus longtemps dans le protocole (plusieurs mois entre l'entraînement aux tâches comportementales, les chirurgies, l'acquisition des données et la mise à mort) mais cela nous permettra de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires pour répondre à toutes les questions scientifiques posées. De plus, les séances d'entrainement permettront d'habituer les animaux à leurs expérimentateurs, ce qui permettra de diminuer le stress de leur manipulation. L'expérience acquise sur les animaux associés au projet précédent nous a également permis d'améliorer nos techniques de chirurgie et notre matériel expérimental, ce qui permettrait pour ce projet de conserver une chambre d'imagerie sans tissus de repousse pendant plus de 200 jours (contre 100 jours estimés a priori sur la base des articles trouvés dans la littérature) chez la plupart des animaux, tout en gardant des animaux en très bonne santé, et par conséquent de réduire le nombre d'animaux sur la durée du projet.

Raffinement

La chambre d'enregistrement a déjà été raffinée, nous essayons de l'améliorer au fur et à mesure de l'expérience acquise. Cette chambre est composée d'un piston réglable en hauteur équipé d'une vitre courbe qui épouse la forme du cerveau sans le comprimer. Grâce à cette nouvelle chambre, nous espérons limiter la repousse de tissus généralement observée, et par conséquent réduire le nombre d'interventions pour retirer ces tissus, ce qui minimisera les risques d'infection et le nombre d'interventions nécessaires à leur réalisation. De plus, d'après nos observations, nous nous attendons à pouvoir garder cette chambre hermétiquement fermée pendant plusieurs mois, sans que cela n'impacte la santé ni les comportements des animaux. Nous nous attendons aussi à ce que l'expérience acquise au cours du projet permette le raffinement de nos techniques de chirurgie et donc une meilleure récupération post-opératoire, ainsi qu'un raffinement du bien-être tout au long de la période d'imagerie de ces animaux. Le nombre réduit d'anesthésies nécessaires à l'acquisition de données (1 fois 3h/semaine VS. 2 fois 6h/semaine prévu au commencement du projet) permettra aussi de limiter l'impact sur l'état de santé des animaux et de minimiser une potentielle habituation aux agents anesthésiants. Dans ces conditions, nous nous attendons à ce que les animaux ne montrent aucun signe clinique de mal-être lié aux anesthésies répétées. Les sessions d'imagerie sous anesthésie nous permettront aussi de continuer d'acquérir des données, tout en évitant le stress induit par la manipulation des animaux éveillés. L'état de santé des animaux inclus dans les protocoles sous anesthésie sera suivi de près et quotidiennement par du personnel formé et qualifié, et une évaluation du vétérinaire référent et de la SBEA sera réalisée tous les 6 mois afin de s'assurer qu'aucun signe clinique lié aux anesthésies répétées ne survient. En ce qui concerne les entraînements pour les séances éveillées d'acquisition de données, les animaux seront tous entraînés par renforcement positif avec de la gomme arabique (aliment présent dans le régime alimentaire des marmousets), ce qui permettra d'éviter toute restriction alimentaire ou hydrique. Enfin, les animaux seront hébergés en paires dans des volières adaptées et enrichies de plusieurs éléments (hamac, tunnels, nids suspendus, perchoirs...).

Choix des espèces

L'utilisation de primates ne peut être remplacée puisque le système visuel est un système complexe et nécessite d'être étudié chez une espèce au plus proche de l'espèce humaine pour les besoins de ce projet (le système visuel des rongeurs étant très différent de celui des primates). Le modèle marmouset nous permettra de travailler sur une espèce de primate non humain qui possède plusieurs avantages significatifs pour notre projet. C'est une espèce dont le système visuel est très proche de celui de l'humain, avec une hiérarchie des aires corticales supérieures identique. De plus, c'est une espèce lissencéphale ce qui permet d'utiliser l'ensemble de nos techniques d'imagerie sur tout le système visuel. Enfin, sa petite taille nous permet de l'utiliser pour des expériences d'imagerie biphotonique. Age : à partir de 12 mois (animaux matures), nous n'avons pas de contrainte d'âge pour ce projet. Poids : 0.3 à 0.5 kg

Des cellules cancéreuses injectées dans la peau, les muscles, les os, les articulations, la prostate, les glandes mammaires, le cerveau ou le cœur, puis jusqu'à quatorze semaines de traitements expérimentaux : 1 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées puis autopsiées à l'issue. Le projet teste des candidats anticancéreux au fil de dix études, dont les effets indésirables sont discutés "avec les clients" avant chaque protocole. Certaines souris ont un système immunitaire inactif. Pour l'ostéosarcome, un cancer des os, le porteur prévoit d'injecter des souris âgées de 4 à 5 semaines.

Objectifs

Ce projet vise à tester de nouveaux traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de tumeurs créés par injection de cellules cancéreuses chez la souris. Pour 5 ans de projet, le nombre maximal d’animaux utilisés sera de 1800 souris. Le nombre d’études/protocoles prévisionnel sur les 5 ans de projet est de 10 études/protocoles. Certain(e)s études/protocoles pourront nécessiter environ 10 à 20 animaux, tandis que d’autres pourront nécessiter jusqu’à 360 animaux maximum. L’effectif de chaque étude sera adapté aux besoins scientifiques et expérimentaux. Le nombre de 10 études/protocoles constitue alors une estimation prévisionnelle et pourra évoluer en fonction des besoins scientifiques, sans que le nombre total de souris utilisées puisse dépasser 1 800 sur la durée du projet. Les modèles de tumeurs créés chez la souris ont de nombreux avantages en recherche préclinique, notamment : (i) mimer et pouvoir étudier les mécanismes biologiques impliqués dans le développement et la récidive des cancers; (ii) permettre l’étude des interactions entre les cellules cancéreuses et ce qui les entourent ; (iii) permettre d’analyser la/les réponse(s) des cellules cancéreuses aux traitements en cours de développement ; (iv) permettre d’étudier les voies d’administration et le devenir des molécules à l’étude dans l’organisme, tout en analysant leurs toxicités ; et (v) pouvoir prédire les applications de ces potentiels traitements chez l’homme. Suivant le type de cellules cancéreuses utilisées et le site d’implantation choisi pour celles-ci, il est possible de créer différents modèles tumoraux chez la souris, tels que le cancer du sein ou encore de la prostate.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont principalement de nature scientifique et translationnelle (la recherche translationnelle vise à transformer les découvertes scientifiques en applications concrètes pour les patients). À court terme, ce projet permettra d’évaluer, dans des systèmes vivants intégratifs pertinents, l’efficacité et la tolérance d’anticancéreux potentiels. Il fournira des données sur la biodisponibilité (portion et vitesse de passage dans la circulation sanguine) et le métabolisme (transformation chimique) des molécules, leurs capacités à inhiber le développement des tumeurs et leurs éventuels effets toxiques. L’ensemble des résultats pourra être extrapolé à ce qui pourrait être observé chez l’homme, ce qui permettra d’identifier les traitements les plus prometteurs et d’orienter les décisions de poursuite ou d’arrêt de leur développement. À moyen terme, les données générées contribueront à améliorer la compréhension des mécanismes liés au développement des cancers. Elles permettront également d’approfondir les connaissances sur les mécanismes d’action des familles chimiques des molécules étudiées. De plus, les résultats obtenus permettront d’affiner la méthodologie de développement des modèles précliniques tumoraux. Grâce aux retours d’expériences, le développement des futurs candidats médicaments en oncologie sera mieux orienté. À plus long terme, ce projet vise à contribuer à la sélection rationnelle de candidats médicaments destinés aux essais cliniques. Les résultats obtenus permettront ainsi de réduire les incertitudes liées à l’extrapolation des données expérimentales à l’humain, tout en améliorant la pertinence des choix faits lors de la phase de développement préclinique des futurs médicaments anti-cancéreux.

Procédures

Les études prévoient une injection unique de cellules cancéreuses par différentes voies d'administration (au niveau de la peau, des muscles, du tissu osseux, des articulations, de la prostate, des glandes mammaires, du cerveau, du cœur ou par voie intraveineuse). La voie d’administration dépendra du cancer à modéliser. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur. La durée de l’injection variera de 1 à 30 minutes selon la voie d'administration utilisée, et une radiographie pourra être réalisée pendant la procédure (5 à 10 minutes). Le volume injecté dépend de la voie d'administration et est défini à partir de critères physiologiques propres à la souris, dans le respect du bien-être animal et conformément aux recommandations des guides de bonnes pratiques. Les traitements expérimentaux pourront être administrés avant et/ou après l'injection des cellules cancéreuses, jusqu'à 14 semaines après celle-ci, par différentes voies (orale, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou intra-articulaire). Les administrations dureront de 1 à 8 minutes et pourront être répétées selon le protocole expérimental. Les volumes administrés dépendront de la voie d'administration, et ils sont définis à partir de plusieurs critères physiologiques propres à la souris, en tenant compte du respect du bien-être animal, et des conseils rassemblés dans les guides de bonnes pratiques. Les fréquences des administrations dépendront de la voie d'administration et de la nature des traitements expérimentaux. Les fréquences d’administration sont définies à partir de plusieurs critères physiologiques propres à la souris, en tenant compte du respect du bien-être animal, et des conseils rassemblés dans les guides de bonnes pratiques. Au cours des études, des prélèvements sanguins, des collectes d'urine et, en fin d'étude, des prélèvements de liquide synovial (liquide présent dans les articulations) pourront être réalisés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur des animaux vigiles, en moins de 5 minutes, dans le respect des limites réglementaires en termes de volume et de fréquence des prélèvements. Les prélèvements de liquide synovial seront réalisés sous anesthésie générale avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Une observation quotidienne de l’état général des animaux, ainsi qu’une évaluation clinique détaillée à minima 2 fois par semaine du comportement, du poids, et des volumes tumoraux seront réalisées tout au long de l’étude afin d’identifier et circonscrire ou éliminer le plus rapidement et efficacement possible toute nuisance ou effet indésirables éventuels sur les animaux. Des nuisances ou effets indésirables liés à l’induction du/des modèles oncologiques murins (injection des cellules cancéreuses sur les souris) et au développement tumoral sont attendus dans ce projet. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour déceler tout éventuel traumatisme et inflammation au niveau des sites d’injections des cellules cancéreuses, ainsi que tout mal-être en lien avec le développement de la/des tumeur(s). Des nuisances ou effets indésirables liés aux traitements à tester peuvent être observés lors de leurs administrations ou plus tardivement (exemple : perte de poids). Les nuisances et effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avec les clients avant toute mise en œuvre de l’étude / du protocole. Ils seront également anticipés grâce aux informations obtenues au cours d’études / de protocoles préalablement réalisés et à une veille bibliographique inhérente au(x) traitement(s) à administrer.

Devenir

À l’issue de chaque étude/protocole, les animaux seront anesthésiés, mis à mort puis autopsiés, et les organes d’intérêt seront prélevés. Les échantillons sanguins, urinaires et de liquide synovial (liquide présent dans les articulations) seront analysés afin de déterminer les concentrations des molécules testées dans ces compartiments, d’évaluer leurs toxicités et la réponse biologique aux traitements. Les organes prélevés pourront également faire l’objet d’analyses diverses afin d’évaluer la distribution des molécules dans l’organisme, d’étudier leurs éventuelles toxicités et d’analyser les éventuelles modifications tissulaires suite aux traitements (tissus sains et tissus cancéreux).

Remplacement

De manière générale, les traitements que nous évaluons sur des modèles animaux ont fait l’objet de tests préliminaires mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’identifier et analyser les interactions des molécules à l’étude avec l’organisme. En effet, les tests préliminaires actuels permettent d’anticiper les comportements des molécules testées, mais ne fournissent pas d’informations fiables sur leurs effets généraux sur l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, dans le cadre des études en cancérologie, il est pour le moment impossible de reproduire artificiellement les mécanismes et la complexité de la pathologie.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera réduit au minimum tout en s’assurant de pouvoir obtenir des résultats fiables et ainsi permettre une interprétation robuste des données et éviter toutes répétitions du protocole/de l’étude. Le nombre d’animaux par groupe sera de 10 maximum. Ce nombre a été déterminé grâce à nos données historiques et à des calculs. Cet effectif pourra être revu à la baisse après analyse de résultats préliminaires et dans le cas où le(s) traitement évalué(s) est/sont connu(s) (exemple : traitement(s) de référence). Le nombre de groupe sera de 10 maximum, par temps d’analyse expérimental (3 temps expérimentaux d’analyse maximum par étude / protocole). De plus, les groupes seront optimisés pour éviter toute redondance. En cas de risque d’exclusion d’animaux identifié (exemple : animaux de nature agressive), il sera possible d’ajouter des animaux de réserve. Le nombre d’animaux de réserve ne dépassera pas 20% de l’effectif total ou 1 animal par groupe par temps expérimental d’analyse.

Raffinement

Une phase d’acclimatation, de minimum 7 jours, sera respectée. Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés (pièces sous atmosphère contrôlée, cages ventilées, accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, enrichissement (tunnel) permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de mal être. Un hébergement individuel temporaire pourra-être mise en place par exemple en cas de complications post-opératoires nécessitant un isolement (réouverture d’un site opératoire, etc.) ou encore en cas d’agressivité. Dans ce cas, l’enrichissement sera augmenté. Un suivi quotidien et un suivi clinique plus approfondi, à minima 2 fois par semaine, seront réalisés, avec prise de poids, mesure du volume des tumeurs et observations des caractéristiques spécifiques aux modèles tumoraux (exemple : observation des signes de boiterie pour le modèle ostéosarcome (cancer des os)). Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation (ex : au moment de leur pesée et de la mesure du volume de la tumeur, ou au moment des prélèvements sanguins). Nous mettrons en place des mesures adaptées et spécifiques pour réduire au maximum/éliminer le mal être éventuel occasionné par les manipulations, le développement tumoral et les différents traitements : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation/ à l’eau et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons des traitements antalgiques dès l’apparition de signes cliniques de douleur ou pour éviter l’apparition de ceux-ci. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites, repérés le plus précocement possible grâce à un suivi clinique précis, sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal largement utilisé dans les études précliniques en raison de la proximité de nombreuses caractéristiques biologiques et physiopathologiques avec celles observées chez l’homme. Il s’agit d’un modèle très bien caractérisé, pour lequel il existe un important recul scientifique ainsi que de nombreuses données de référence. De plus, sa taille et ses caractéristiques physiologiques permettent le prélèvement de volumes suffisants de liquides biologiques (sang, liquide synovial, etc.) afin de réaliser l’ensemble des analyses requises dans le cadre des projets scientifiques. Ainsi, la souris constitue un modèle pertinent pour étudier les mécanismes pathologiques, évaluer l’efficacité et la tolérance des médicaments en développement, et générer des données utiles à la préparation des essais cliniques chez l’homme. Selon les questions scientifiques initialement posées dans les études/protocoles, des souris ayant une système immunitaire inactif ou actif pourront être utilisées. Le choix du sexe et de l’âge au démarrage des études/protocoles des souris sera également défini en fonction des questions scientifiques auxquelles souhaitent répondre les études/protocoles. Les cancers peuvent toucher les patients à n’importe quel âge, mais il est recommandé d’effectuer les injections de cellules cancéreuses sur des souris âgées de 4 à 10 semaines. Pour modéliser des cancers pédiatriques, tel que l’ostéosarcome, il est recommandé, par exemple, d’injecter les cellules cancéreuses sur des souris jeunes âgées de 4 à 5 semaines, pour que le modèle soit pertinent. Les modèles de cancer peuvent être induits sur des souris femelles ou mâles. Cependant, suivant le cancer à modéliser, le choix du sexe des souris doit être pertinent. Par exemple, la modélisation du cancer du sein se fait majoritairement sur des souris femelles.

5 740 rongeurs, 2 870 souris et 2 870 rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et le porteur prévoit une espérance de vie de 60 à 70 % seulement à huit ou douze semaines. Chacun subit une ligature de l'artère coronaire ou de l'aorte pour provoquer une insuffisance cardiaque, avec un arrêt cardiaque dont le résumé écrit qu'il "ne peut pas être totalement exclu". Certains restent seuls jusqu'à huit semaines pour la télémétrie, et le test de course sur tapis roulant passe par une stimulation électrique. Tous sont tués à la fin pour prélever organes et sang, au fil de 70 projets destinés à tester des médicaments "développés par nos clients".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité mondiale, il est primordial de poursuivre la recherche dans ce domaine pour mieux caractériser les mécanismes impliqués, développer des modèles prédictifs et robustes et ainsi permettre l’évaluation pré-clinique de nouveaux candidats médicaments. Les atteintes cardiaques peuvent se manifester sous différentes formes telle que l’insuffisance cardiaque dont la conséquence principale est que le cœur n'assure plus son rôle de pompe cardiaque essentiel à l’apport de nutriments et d’oxygène à l’ensemble de l’organisme. Les mécanismes mis en jeu sont très complexes et nécessitent encore une meilleure compréhension afin d’avoir des médicaments adaptés. Nous réaliserons 70 projets sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Les médicaments existants permettent d’améliorer la condition de vie des patients et de prolonger leur espérance de vie en ralentissant l’évolution de la maladie. Cependant, aucun ne répare complètement ou n’empêche l’évolution inéluctable de cette défaillance cardiaque. Afin d’améliorer la prise en charge de cette maladie il est donc nécessaire de développer des modèles précliniques au plus proche de la physiopathologie humaine afin d’évaluer des nouveaux médicaments potentiels. L’ensemble des expériences effectuées ont pour but de valider ou non l’efficacité de nouveaux médicaments développés par nos clients sur des modèles précliniques, étape indispensable et préalable à l’administration chez l’homme.

Procédures

L’insuffisance cardiaque sera induite chez le rongeur par le biais d’intervention chirurgicale afin de ligaturer complétement l’artère coronaire ou partiellement l’aorte ascendante. Si le projet requiert l’implantation d’implants, cela se fera en même temps que la chirurgie cardiaque. Ces interventions sont réalisées sur des animaux anesthésiés et ventilés mécaniquement ayant préalablement reçu des antalgiques locaux et centraux. Le contrôle et maintien de la température sera assuré par des tapis chauffants et une injection de soluté d'hydratation à 37°C permettra une réhydratation en cas de perte de sang. Un suivi postopératoire est mis en place pour assurer une bonne récupération avec un accès facilité à la nourriture et à l’eau. Ces interventions chirurgicales durent en moyenne 20 à 30 minutes et ne seront réalisées qu’une fois par animal. Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour sur animal vigile ou anesthésié. L'administration dure 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Des pompes permettant une diffusion du composé en continu pourront être implantées sous la peau des animaux (chirurgie de 10 minutes sous anesthésie avec couverture analgésique). Les animaux seront soumis à des suivis longitudinaux non invasifs à maximum 4 reprises pendant le projet : - épilation, imagerie et capteurs (examens réalisés sous anesthésie gazeuse, 20 minutes maximum par examen). - Pour la mesure de pression artérielle en télémétrie, les animaux seront hébergés seuls avec un sur-enrichissement approprié le temps de la mesure (quelques heures à 8 semaines en continu) avec contact visuel, olfactif et auditif des congénères. - La mesure de la composition corporelle se fera sur animal vigile contenu dans un tube teinté et dure moins de 2 minutes. - La mesure de la dépense énergétique se fera sur animaux vigiles hébergés en cage individuelle sans enrichissement sur une période de 40h avec contact uniquement visuel des congénères. En fin de procédure, les animaux pourront être soumis à un test d’effort réalisé sur un tapis de course (60 minutes max) ou à un test de force musculaire (moins de 10 minutes). Les mesures terminales nécessiteront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et sans réveil. Des prélèvements de sang (uniques ou répétés) seront réalisés maximum 4 fois pendant le projet. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal et sera réalisé selon la voie choisie sur animal vigile ou anesthésié.

Impact sur les animaux

La chirurgie cardiaque induit progressivement une dysfonction cardiaque qui va engendrer des nuisances. Chez le rongeur, les effets indésirables se manifesteront sous différentes formes : comportementale (hyper ou hypoactivité, isolement, agressivité, hygiène), modification des prises hydriques et alimentaires (poids et hydratation), aspect général (aspect du pelage, manque d’hygiène) ... Ces altérations du comportement seront détectées lors des visites quotidiennes. Cependant, le risque d’un arrêt cardiaque est possible et ne peut pas être totalement exclu. Par ailleurs, la chirurgie en soi peut également induire des nuisances comme l’hypothermie ou la perte de sang. Certaines techniques, bien que non invasives, nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Les prélèvements sanguins et administrations de composés peuvent engendrer un stress et une douleur légère (piqûre). Durant les mesures de dépenses énergétiques ou de télémétrie, les animaux seront isolés sur une période de 40h (mesure de dépense énergétique) à 8 semaines (mesures télémétriques) ce qui est source de stress. Lors des tests de course sur tapis roulant, les animaux seront soumis à un stress et une douleur légère à modérée (stimulation électrique pour le tapis). L’induction du modèle et l’implantation d’émetteur de télémétrie nécessitent une intervention chirurgicale qui pourra engendrer une douleur.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin des procédures afin de procéder à la collecte des organes et du sang pour l'évaluation de critères d’efficacité des composés .

Remplacement

Les nouveaux médicaments doivent avoir validé leur efficacité pré-clinique (chez l’animal) avant de passer en phase clinique (chez l’homme). L’utilisation des animaux permet de réaliser ces tests dans un système intégré et donc d’augmenter la prédictibilité des effets chez l’homme. Les interventions chirurgicales décrites dans ce projet permettent de reproduire les différentes phases de la pathologie qui mettent en jeu des phénomènes locaux (au niveau du tissu) et des phénomènes intégrés (par exemple la participation du système immunitaire, du système nerveux autonome et des reins). Seul l'ensemble de ces mécanismes permet de rendre compte de la physiopathologie et ne peuvent donc être mis en jeu autrement que chez l’animal. Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme.

Réduction

Le projet a été organisé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux tout en prenant en compte une espérance de vie à 8-12 semaines de 60-70% et la variabilité interindividuelle lors du développement de la dysfonction (15% des animaux exclus après répartition avant le début des traitements si applicable). Ces estimations sont basées sur notre expérience, au sein de la société, des modèles induits par chirurgie, des données bibliographiques et d’échanges avec d’autres chercheurs. La possibilité de réaliser des mesures non invasives permettra un suivi longitudinal de plusieurs paramètres pour chaque animal, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans le projet.

Raffinement

Lors des chirurgies, l’utilisation de tapis et/ou lampes chauffantes pendant la chirurgie et la phase de réveil/post-opératoire et l’injection de lactate Ringer à 37°C permettront de prévenir une hypothermie ou de compenser une perte de sang éventuelle. Sur la phase aigüe post-opératoire (7 jours), une surveillance renforcée sera mise en place pour suivre la récupération post-opératoire des animaux avec des visites 2 fois par jour et des pesées quotidiennes sur les 3 premiers jours. Pendant les 4 jours suivant la chirurgie, une surveillance standard quotidienne sera remise en place sauf en cas d’observation de signes de douleurs. Au-delà de 7 jours, le suivi quotidien des animaux sera poursuivi. Pendant toute la durée de nos études, les animaux sont suivis quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine afin d’identifier une potentielle souffrance. Si les animaux présentent des signes de souffrances (tels que perte de poids, défaut de toilettage, agressivité, …), nous scorerons son état. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture ou d’hydrogel dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une blessure cutanée un protocole de soin sera effectué (désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas, l’animal concerné sera mis à mort. Des mesures non invasives de la fonction cardiaque, vasculaire et métabolique sont réalisées sur un même animal. Les examens réalisés sous anesthésie ne le seront que si l'état de l'animal le permet (pas de perte de poids, température corporelle normale). Pour les techniques réalisées sur animal vigile, une habituation au dispositif sera réalisée : - aux tétines spécifiques dans les cages d'hébergement pendant 7 jours sur quelques heures par jour et habituation à la cage pendant 16h avant la mesure. - au tapis de course pendant 1 minute à l'arrêt et 4 minutes à faible vitesse, réalisée une semaine avant la mesure. - à la contention du grip test, 2 ou 3 fois les jours précédant la mesure. Pour les procédures qui peuvent induire une douleur, une couverture analgésique adaptée est mise en place et sera adaptée au besoin de chaque animal.

Choix des espèces

Les rongeurs (rats et les souris) sont largement utilisés et caractérisées par la communauté scientifique pour des études pharmacologiques précliniques afin d’évaluer les effets de molécules sur les fonctions cardiovasculaires dans des modèles pathologiques. Il est possible d’induire chez le rongeur des atteintes similaires à celles observées chez l’Homme et d’en suivre l’évolution avec les mêmes outils qu’en médecine humaine (échographe, doppler, mesure de pression artérielle…). Le choix de l'espèce se fera en fonction des physiopathologies développées dans chacune des 2 espèces, des caractéristiques connues (publications, projets ultérieurs), des cibles thérapeutiques et des validations pharmacocinétiques, de la nature du traitement testé. L’ensemble des procédures décrites dans le projet concerne des animaux sevrés (minimum 3 semaines). Si l’étude le requiert, les expérimentations pourront être réalisées sur des animaux plus âgés afin de considérer le vieillissement (comorbidité connue) comme les facteurs aggravants de la pathologie (jusqu'à 18 mois)

Opérés au cou pour qu'un caillot de sang injecté dans leur carotide interne provoque un accident vasculaire cérébral, 413 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après l'AVC, ils peuvent perdre l'équilibre, présenter une faiblesse des membres et avoir du mal à manger et à boire les premiers jours, puis passent deux IRM sous anesthésie ainsi que le neuroscore et le corner test à J1, J3 et J7. Les molécules testées sont fournies par un partenaire industriel, en vue d'essais cliniques et d'une "mise sur le marché dans les années à venir". Pour justifier le choix du rat, le porteur cite notamment "le coût relativement bas, et la logistique aisée".

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est pathologie cérébrale causée par un caillot sanguin qui bloque une artère dans le cerveau. Actuellement, le traitement principal consiste à administrer un médicament appelé activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour dissoudre le caillot, parfois associé à une intervention chirurgicale appelée thrombectomie. Cependant, ces traitements ne sont pas toujours efficaces et peuvent avoir des effets secondaires graves, limitant leur utilisation à moins de 10% des patients. De plus, l'efficacité du tPA peut varier en fonction de la nature du caillot et de l’origine de la maladie. Pour améliorer la prise en charge des patients à long terme, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Notre projet vise à étudier chez le rongeur différentes façons d'administrer des médicaments pour voir comment ils affectent les dommages cérébraux, les saignements dans le cerveau et la récupération après un AVC. Nous utiliserons un modèle d'AVC chez le rat, largement utilisé en recherche. Cela nous permettra d'étudier comment différents traitements pourraient aider les rats à se remettre après un AVC, ce qui pourrait avoir des implications importantes pour le traitement des patients victimes d'AVC. Ce projet sera réalisé sur deux sites, avec un site pour la réalisation des chirurgies et l’évaluation comportementale et un site pour l’imagerie.

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Se déroulera à J-1 un prélèvement de sanguin sur tous les animaux vigiles au niveau de la veine caudale. Ce prélèvement ne prendra pas plus de 5 minutes. Tous les animaux de cette DAP seront soumis à une chirurgie au niveau du cou afin de pouvoir injecter un caillot de sang dans la carotide interne provoquant ainsi un AVC. Une fibre doppler sera positionnée sur la tête afin de valider l’AVC. Cet acte chirugical durera 30 minutes, AVC + pose de la fibre. A J+1 et J+7, ces mêmes animaux seront passés à l'IRM sous anesthésie générale pour une durée totale de 20 minutes. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux, jusque 3 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J3 et J7. Nous comptons un total de 15 minutes pour la prise du neuroscore et moins de 10 minutes pour le corner test. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une anesthésie léthale. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes, comprenant la récupération de tissu post-mortem.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC à savoir des déficits sensorimoteurs dus aux lésions cérébrales de certaines parties du cerveau. Ces déficits sont visibles chez l'animal à court et moyen terme, ce qui nous permet d'effectuer des tests comportementaux et de tirer des conclusions pertinentes. Après un AVC, les animaux peuvent présenter des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres du côté opposé à la lésion cérébrale. Dasn les premiers jours suivant l'AVC, ils peuvent également rencontrer des difficultés à manger, à boire et à intéragir avec leur environnement, nécessitant une surveillance particulière.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font des rats le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, rattus norvegicus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Pour l’étape de mise au point, nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction tout en aquérant un certain niveau d'expertise technique. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon l'expertise nécessaire à la bonne réalisation des gestes techniques. Ainsi, le nombre d'animaux nécessaire pour cette étape de mise au point, a été calculé selon l’expérience de l’expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes) désigné pour réaliser ces gestes chirurgicaux. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (IRM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 15 par groupe dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux, l’augmentation de l’effectif à 20 par groupe expérimentaux est prévu mais non obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 15 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages conformes à la Directive, isolées des nuisances sonores, avec enrichissements, nourriture et eau ad libitum. Les rats sont maintenus à 2 par cage. Le bien-être est suivi deux fois par jour en semaine et quotidiennement les week-ends et jours fériés par du personnel qualifié. Lors des chirurgies, les animaux sont anesthésiés avec analgésie pour soulager la douleur. La température corporelle des rats sera maintenue stable pendant la chirurgie. Le site opératoire est tondu, désinfecté et reçoit une application d'anesthésiant local. Les sutures seront faites par points séparés afin de limiter le risque de déhiscence. Au réveil, les animaux sont placés en cage individuelle chauffée, puis remis en cage avec alimentation facilitée et gel nutritif. La surveillance est continue et renforcée en post-opératoire immédiat. Les points limites sont définis ; en cas de dépassement, ils seront mis à mort. Un suivi strict est assuré les jours suivants (pesée, état général). Le transport entre établissements s’effectue dans les cages d’origine, sur chariot, via un passage souterrain sans exposition extérieure, avec maîtrise des vibrations. À l’arrivée, une période de repos d’1 h est respectée avant toute manipulation.

Choix des espèces

Le rat (Rattus norvegicus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs, notamment les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et le rat, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font des rats un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation des rats devient incontournable. En effet, elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats obtenus avec ceux de la littérature, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés de 6 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids allant de 250 à 275 g. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles dèjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.

Opérés une première fois trente minutes sous anesthésie générale pour qu'un défaut osseux soit creusé dans leur palais et qu'une plaque de silicone y soit posée, 48 rats attendent un mois avant une seconde opération qui retire la plaque et comble le trou. S'y ajoutent trois séances d'imagerie aux rayons X de dix minutes, sous anesthésie gazeuse, dans un second établissement, avec le transport que cela suppose. Ces procédures sont classées en niveau de souffrance sévère, et le porteur indique que la création du défaut osseux peut entraîner une douleur post-opératoire, un changement du comportement alimentaire et une perte de poids, les rats étant séparés de leurs congénères pendant les 24 heures qui suivent l'opération. Tous sont mis à mort à la fin pour analyser au microscanner et en histologie l'os néoformé et les tissus qui l'entourent.

Objectifs

Les fentes labio-alvéolo-palatines (ou plus communément appelées « becs-de-lièvre ») sont les malformations congénitales les plus fréquentes en France (1 cas sur 700 naissances en 2023). Leur prise en charge chirurgicale commence dès les premiers mois de la vie avec, dans le cas des fentes alvéolaires, une étape d’autogreffe osseuse généralement prélevée sur l’os du bassin, à l’âge de 4 ou 5 ans. L’ingénierie tissulaire, utilisant des biomatériaux avec ou sans cellules, a connu d’importants développements au cours des dernières années dans le cadre de la réparation des pertes osseuses et ouvre désormais le champ à la médecine dite régénérative. À l’avenir, elle pourrait donc remplacer les autogreffes osseuses, ce qui permettrait d’épargner aux enfants opérés toute douleur ou inflammation au niveau de la zone de prélèvement osseux. Des substituts naturels ou synthétiques ont déjà été développés pour tenter de combler les pertes osseuses, et leur fonctionnalisation par des cellules souches du tissu osseux a prouvé une amélioration de leur efficacité en réparation osseuse. Cependant, malgré des résultats favorables, l’ingénierie tissulaire ne permet pas encore la régénération d’un tissu fonctionnel comparable au tissu sain. Le projet, qui se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2), vise ainsi à proposer une solution implantable pour la reconstruction osseuse, dépassant les performances jusqu’ici obtenues grâce à l’utilisation inédite d’organoïdes de moelle osseuse.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les fentes labio-alvéolo-palatines (ou « becs-de-lièvre ») sont l’une des malformations congénitales les plus fréquentes au monde (1 cas pour 700 naissances en France en 2023 selon l’Organisation mondiale de la santé), ce qui en fait un véritable problème national et international de santé publique. Ces malformations sont perçues comme graves et affectent le visage, l’audition, la parole, voire le développement cognitif des patients, engendrant ainsi un handicap social conséquent. La prise en charge hospitalière actuelle de ces malades s’effectue d’abord par une chirurgie de fermeture du défaut, réalisée rapidement après la naissance, puis via une greffe osseuse prélevée au niveau du bassin du patient âgé de 4 ou 5 ans. Cette succession d’opérations génère plusieurs points problématiques : chirurgie lourde (particulièrement au vu de l’âge du patient), délai long de prise en charge, nombreuses visites hospitalières obligatoires, lésions vasculaires, infections ou autres complications post-opératoires. Afin de pallier cette prise en charge fortement incommodante pour le patient, ce projet propose de valider le concept d’un biomatériau implantable innovant à l’issue d’une unique chirurgie précoce, améliorant significativement la réparation osseuse sur le long terme. Au niveau clinique, cela conduira à une prise en charge plus supportable pour le patient et moins complexe pour le personnel hospitalier.

Procédures

Au début de la période expérimentale, une chirurgie visant à créer un défaut osseux au niveau du palais et l’insertion d’une plaque de silicone seront réalisées chez les animaux. L’opération dure environ 30 minutes et est réalisée sous anesthésie générale. Un mois après, le retrait de la plaque de silicone et le comblement du défaut seront effectués. L’opération dure environ 10 minutes et est réalisée sous anesthésie générale. Les interventions chirurgicales seront réalisées au sein de l'EU1. Des acquisitions d’imagerie par rayons X seront réalisées au sein de l'EU2 : trois imageries au total par animal, d’environ 10 minutes par acquisition, réalisées sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux engendrera un stress léger potentiel chez ces derniers, notamment lors de la phase d’acclimatation. Si l’harmonie sociale à l’intérieur des cages est compromise, les animaux seront séparés de leur congénères. De la même façon, la séparation post-opératoire, d’une durée de 24 heures, pourrait produire une angoisse légère et transitoire chez les animaux concernés. Une légère douleur passagère pourra être ressentie lors des traitements par injection abdominale (analgésique, anesthésiques, antibiotique, produit de réhydratation, produit d’aide au réveil). De plus, les anesthésies prévues dans l’étude (gazeuse en pré-opératoire et pendant toutes les phases d’acquisition d’imagerie aux rayons X) engendreront un stress léger chez les rats. La création du défaut osseux est une intervention sévère susceptible d'entrainer une douleur post-opératoire qui fera l'objet d'une prise en charge analgésique. Les deux phases chirurgicales de l’étude pourront provoquer des douleurs et/ou un changement du comportement alimentaire chez les animaux opérés, pouvant notamment amener à une perte de poids transitoire. Le transport entre les 2 établissements utilisateurs conduira à un stress léger des animaux. Un contrôle rigoureux de ces nuisances et effets indésirables attendus sera effectué et des actions spécifiques mises en place s’ils dépassent les points limites fixés par la procédure.

Devenir

Les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la fin de la procédure par une méthode réglementaire, afin de pouvoir réaliser des analyses post mortem sur le défaut osseux, le tissu osseux néoformé et les tissus adjacents au défaut (acquisitions et analyses au microscanner, histologie et immunohistologie).

Remplacement

Le projet vise à proposer une solution implantable pour la reconstruction osseuse dépassant les performances jusqu'ici obtenues en chirurgie conventionnelle. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité cellulaire et moléculaire, les interactions entre les cellules ainsi que le système vasculaire intervenant dans le processus de réparation osseuse. Par ailleurs, cette étude ne peut être réalisée sur des modèles invertébrés car ils ne présentent pas de squelette interne. Le recours à un modèle in vivo est dû au fait que les alternatives actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse.

Réduction

Grâce à une analyse statistique basée sur la littérature, le nombre de rats utilisés a été réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le recours à une technologie d'imagerie non invasive in vivo, réduit de manière significative le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, une phase d'acclimatation de 1 semaine sera observée. Durant cette période, un rapprochement positif homme-animal par des chatouilles sera mis en place. Les animaux seront hébergés par 2 dans des cages. Un enrichissement social, tactile et environnemental sera mis en place. La température et l’hygrométrie du local climatisé seront adaptées aux conditions optimales des rats. Les rythmes circadiens seront scrupuleusement respectés, l’eau et la nourriture seront fournies à volonté. Pendant les 3 jours précèdent les chirurgies, les animaux seront chatouillés (tickling). L'ensemble des procédures chirurgicales est réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie adaptée à l'espèce et à la nature de l'intervention. Un suivi post-opératoire est mis en place, incluant l'application de points limites définis pour ce projet. Le transport des animaux sera effectué par un transporteur agrée garantissant des conditions optimales de bien-être animal (ventilation, lumière, hydrométrie, température) et la conformité aux exigences réglementaires en vigueur. L’utilisation d’une technologie d’imagerie in vivo permettra le suivi de la régénération osseuse des animaux dans le temps par une technique non invasive. Le bien-être des animaux ne sera donc pas impacté lors des acquisitions. Une fois l’induction gazeuse réalisée et l’animal transféré à l’intérieur du microscanner sous masque ventilé, cette anesthésie sera contrôlée tout au long de l’acquisition des scans grâce à une caméra interne à l’appareil, permettant le suivi de la respiration. Enfin, à la fin de chaque phase de chirurgie et d'imagerie, les animaux recevront des friandises appétentes.

Choix des espèces

Le modèle de fente palatine chez le rat est bien caractérisé dans la littérature scientifique. De plus, le rat présente un processus de réparation osseuse comparable à celui de l'homme, ainsi qu'une taille suffisante permettant d'effectuer des gestes chirurgicaux. Les animaux utilisés dans cette procédure seront adolescents au moment de la chirurgie et seront suivis jusqu’à l’âge adulte. La taille des animaux à l'adolescence est suffisante pour la chirurgie et leur croissance osseuse restera encore forte pendant plusieurs semaines, permettant le suivi dans le temps par l’observation par une technique d’imagerie non douloureuse de la régénération osseuse.

Un défaut osseux est creusé dans le palais de 48 rats sous anesthésie générale, avec insertion d'une plaque de silicone retirée un mois plus tard lors d'une seconde opération qui comble le trou. Ces procédures d'un niveau de souffrance sévère se terminent par la mise à mort de tous les rats, pour analyser au microscanner et en histologie l'os néoformé. L'objectif déclaré est de valider un biomatériau à base d'organoïdes de moelle osseuse qui remplacerait, à terme, la greffe osseuse prélevée sur le bassin des enfants opérés d'une fente labio-alvéolo-palatine vers 4 ou 5 ans. Le porteur écrit que les anesthésies gazeuses des trois séances d'imagerie engendreront un stress léger chez les rats, puis, quelques lignes plus loin, que leur "bien-être" ne sera pas impacté lors de ces acquisitions.

Objectifs

Les fentes labio-alvéolo-palatines (ou plus communément appelées « becs-de-lièvre ») sont les malformations congénitales les plus fréquentes en France (1 cas sur 700 naissances en 2023). Leur prise en charge chirurgicale commence dès les premiers mois de la vie avec, dans le cas des fentes alvéolaires, une étape d’autogreffe osseuse généralement prélevée sur l’os du bassin, à l’âge de 4 ou 5 ans. L’ingénierie tissulaire, utilisant des biomatériaux avec ou sans cellules, a connu d’importants développements au cours des dernières années dans le cadre de la réparation des pertes osseuses et ouvre désormais le champ à la médecine dite régénérative. À l’avenir, elle pourrait donc remplacer les autogreffes osseuses, ce qui permettrait d’épargner aux enfants opérés toute douleur ou inflammation au niveau de la zone de prélèvement osseux. Des substituts naturels ou synthétiques ont déjà été développés pour tenter de combler les pertes osseuses, et leur fonctionnalisation par des cellules souches du tissu osseux a prouvé une amélioration de leur efficacité en réparation osseuse. Cependant, malgré des résultats favorables, l’ingénierie tissulaire ne permet pas encore la régénération d’un tissu fonctionnel comparable au tissu sain. Le projet, qui se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2), vise ainsi à proposer une solution implantable pour la reconstruction osseuse, dépassant les performances jusqu’ici obtenues grâce à l’utilisation inédite d’organoïdes de moelle osseuse.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, les fentes labio-alvéolo-palatines (ou « becs-de-lièvre ») sont l’une des malformations congénitales les plus fréquentes au monde (1 cas pour 700 naissances en France en 2023 selon l’Organisation mondiale de la santé), ce qui en fait un véritable problème national et international de santé publique. Ces malformations sont perçues comme graves et affectent le visage, l’audition, la parole, voire le développement cognitif des patients, engendrant ainsi un handicap social conséquent. La prise en charge hospitalière actuelle de ces malades s’effectue d’abord par une chirurgie de fermeture du défaut, réalisée rapidement après la naissance, puis via une greffe osseuse prélevée au niveau du bassin du patient âgé de 4 ou 5 ans. Cette succession d’opérations génère plusieurs points problématiques : chirurgie lourde (particulièrement au vu de l’âge du patient), délai long de prise en charge, nombreuses visites hospitalières obligatoires, lésions vasculaires, infections ou autres complications post-opératoires. Afin de pallier cette prise en charge fortement incommodante pour le patient, ce projet propose de valider le concept d’un biomatériau implantable innovant à l’issue d’une unique chirurgie précoce, améliorant significativement la réparation osseuse sur le long terme. Au niveau clinique, cela conduira à une prise en charge plus supportable pour le patient et moins complexe pour le personnel hospitalier.

Procédures

Au début de la période expérimentale, une chirurgie visant à créer un défaut osseux au niveau du palais et l’insertion d’une plaque de silicone seront réalisées chez les animaux. L’opération dure environ 30 minutes et est réalisée sous anesthésie générale. Un mois après, le retrait de la plaque de silicone et le comblement du défaut seront effectués. L’opération dure environ 10 minutes et est réalisée sous anesthésie générale. Les interventions chirurgicales seront réalisées au sein de l'EU1. Des acquisitions d’imagerie par rayons X seront réalisées au sein de l'EU2 : trois imageries au total par animal, d’environ 10 minutes par acquisition, réalisées sous anesthésie gazeuse.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux engendrera un stress léger potentiel chez ces derniers, notamment lors de la phase d’acclimatation. Si l’harmonie sociale à l’intérieur des cages est compromise, les animaux seront séparés de leur congénères. De la même façon, la séparation post-opératoire, d’une durée de 24 heures, pourrait produire une angoisse légère et transitoire chez les animaux concernés. Une légère douleur passagère pourra être ressentie lors des traitements par injection abdominale (analgésique, anesthésiques, antibiotique, produit de réhydratation, produit d’aide au réveil). De plus, les anesthésies prévues dans l’étude (gazeuse en pré-opératoire et pendant toutes les phases d’acquisition d’imagerie aux rayons X) engendreront un stress léger chez les rats. La création du défaut osseux est une intervention sévère susceptible d'entrainer une douleur post-opératoire qui fera l'objet d'une prise en charge analgésique. Les deux phases chirurgicales de l’étude pourront provoquer des douleurs et/ou un changement du comportement alimentaire chez les animaux opérés, pouvant notamment amener à une perte de poids transitoire. Le transport entre les 2 établissements utilisateurs conduira à un stress léger des animaux. Un contrôle rigoureux de ces nuisances et effets indésirables attendus sera effectué et des actions spécifiques mises en place s’ils dépassent les points limites fixés par la procédure.

Devenir

Les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort à la fin de la procédure par une méthode réglementaire, afin de pouvoir réaliser des analyses post mortem sur le défaut osseux, le tissu osseux néoformé et les tissus adjacents au défaut (acquisitions et analyses au microscanner, histologie et immunohistologie).

Remplacement

Le projet vise à proposer une solution implantable pour la reconstruction osseuse dépassant les performances jusqu'ici obtenues en chirurgie conventionnelle. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire la complexité cellulaire et moléculaire, les interactions entre les cellules ainsi que le système vasculaire intervenant dans le processus de réparation osseuse. Par ailleurs, cette étude ne peut être réalisée sur des modèles invertébrés car ils ne présentent pas de squelette interne. Le recours à un modèle in vivo est dû au fait que les alternatives actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la réparation osseuse.

Réduction

Grâce à une analyse statistique basée sur la littérature, le nombre de rats utilisés a été réduit au minimum permettant d'obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le recours à une technologie d'imagerie non invasive in vivo, réduit de manière significative le nombre d'animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, une phase d'acclimatation de 1 semaine sera observée. Durant cette période, un rapprochement positif homme-animal par des chatouilles sera mis en place. Les animaux seront hébergés par 2 dans des cages. Un enrichissement social, tactile et environnemental sera mis en place. La température et l’hygrométrie du local climatisé seront adaptées aux conditions optimales des rats. Les rythmes circadiens seront scrupuleusement respectés, l’eau et la nourriture seront fournies à volonté. Pendant les 3 jours précèdent les chirurgies, les animaux seront chatouillés (tickling). L'ensemble des procédures chirurgicales est réalisé sous anesthésie générale associé à une analgésie adaptée à l'espèce et à la nature de l'intervention. Un suivi post-opératoire est mis en place, incluant l'application de points limites définis pour ce projet. Le transport des animaux sera effectué par un transporteur agrée garantissant des conditions optimales de bien-être animal (ventilation, lumière, hydrométrie, température) et la conformité aux exigences réglementaires en vigueur. L’utilisation d’une technologie d’imagerie in vivo permettra le suivi de la régénération osseuse des animaux dans le temps par une technique non invasive. Le bien-être des animaux ne sera donc pas impacté lors des acquisitions. Une fois l’induction gazeuse réalisée et l’animal transféré à l’intérieur du microscanner sous masque ventilé, cette anesthésie sera contrôlée tout au long de l’acquisition des scans grâce à une caméra interne à l’appareil, permettant le suivi de la respiration. Enfin, à la fin de chaque phase de chirurgie et d'imagerie, les animaux recevront des friandises appétentes.

Choix des espèces

Le modèle de fente palatine chez le rat est bien caractérisé dans la littérature scientifique. De plus, le rat présente un processus de réparation osseuse comparable à celui de l'homme, ainsi qu'une taille suffisante permettant d'effectuer des gestes chirurgicaux. Les animaux utilisés dans cette procédure seront adolescents au moment de la chirurgie et seront suivis jusqu’à l’âge adulte. La taille des animaux à l'adolescence est suffisante pour la chirurgie et leur croissance osseuse restera encore forte pendant plusieurs semaines, permettant le suivi dans le temps par l’observation par une technique d’imagerie non douloureuse de la régénération osseuse.