Lapins

Non pour répondre à une question scientifique mais pour maîtriser les gestes d'anesthésie et de chirurgie, 6 lapines vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ovariectomie d'une à deux heures sous anesthésie, avec pose de cathéters et prélèvements de sang et d'urine. Le projet prépare un futur modèle de ménopause destiné à étudier les troubles cardiaques des femmes. Le porteur présente cette étape comme une mise en main du matériel et des bonnes pratiques avant une vraie étude.

Objectifs

De plus en plus d’études montrent que certains troubles du rythme cardiaque tels que la fibrillation auriculaire (FA) et l’insuffisance cardiaque (IC) diffèrent entre les femmes et les hommes. Les femmes sont plus âgées au moment de l'apparition de la FA (typiquement de 10 ans) et elles présentent des symptômes plus marqués et plus durables, avec un risque plus élevé et d'issues graves, notamment d'accident vasculaire cérébral. Peu d'attention scientifique a été accordée aux différences entre les femmes et les hommes, d'où un manque de connaissances et de sensibilisation dans la communauté des chercheurs et dans le public. Les mécanismes à l’origine des changements de la fonction cardiaque suite à la perte de signalisation des hormones sexuelles féminines sont encore peu connus. Un modèle animal chez le lapin nous présente l’opportunité d’étudier les mécanismes fondamentaux responsables de la sensibilité des femmes au développement de pathologies cardiovasculaires, en lien étroit avec la diminution des hormones sexuelles. Ce projet vise à encadrer la mise en place de ce nouveau modèle de ménopause, avec le but de maitriser les gestes et les bonnes pratiques d’anesthésie, de chirurgie et de suivi.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de maitriser les procédures et les bonnes pratiques sur un modèle de ménopause, pour, dans un deuxième temps, mieux comprendre le rôle des hormones sexuelles dans la survenue des maladies cardiaques, notamment de la fibrillation auriculaire et l’insuffisance cardiaque, pour permettre, à terme, une meilleure prise en charge des pathologies cardiaques chez les femmes et une meilleure prévention.

Procédures

Dans ce projet, 6 animaux seront traités. Chaque animal sera soumis à une opération chirurgicale. L’intervention sera réalisée en une seule fois (environ 1h-2h) sous anesthésie générale. Toute la procédure sera effectuée sous surveillance des paramètres vitaux. Au cours de la procédure expérimentale, des prélèvements sanguins (artère et veine) et urinaires seront réalisés sur chaque animal et sous anesthésie générale. Chaque prélèvement sera réalisé via la pose d’un cathéter adapté en fonction de l’abord artériel, urinaire et de l’abord veineux choisi, et ne durera que quelques minutes. Chaque animal fera ainsi l’objet d’un prélèvement urinaire, d’un prélèvement artériel ainsi que d’au moins un prélèvement veineux à trois reprises. Il s’agira donc de réaliser 1 prélèvement sanguin et urinaire en début de la phase 1, puis 1 prélèvement sanguin et urinaire en début et 1 prélèvement sanguin et urinaire en fin de la phase 2 de la procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels d’intensité modérée, peuvent apparaitre pendant la période intra-opératoire (1h- 2h), liés à l’anesthésie (hypoventilation, hypotension, hypothermie) et à la chirurgie (sensation de douleur, hémorragie; 1j-7j), ou pendant la période post-opératoire (désorientation, réactivité réduite, infection, réouverture de la plaie chirurgicale; 3j-15j). Les arrêts de transit peuvent être relativement fréquents en post-opératoire chez cette espèce, et seront pris en charge. De plus, des effets indésirables d’intensité modérée, peuvent survenir en post- opératoire, liés à l’implantation des équipements médicaux (réouverture de la plaie chirurgicale, infection; 3j-15j).

Devenir

Tous les animaux impliqués dans ce projet seront mis à mort afin de caractériser à l’échelle tissulaire, cellulaire, moléculaire et biochimique les effets du remodelage cardiaque obtenu par la ménopause et/ou l’induction de la fibrillation auriculaire et de l’insuffisance cardiaque.

Remplacement

Le projet prévoit dans un premier temps, la réalisation des procédures chirurgicales sur des cadavres de lapines, permettant aux expérimentateurs d’acquérir une première maîtrise technique sans recours à l’animal vivant. En revanche, les processus d’anesthésie et d’analgésie ne peuvent être reproduits de manière satisfaisante sur des tissus inertes ou modèles cellulaires in vitro, et nécessitent le recours à un modèle animal vivant. En effet, les mécanismes physiologiques sont complexes dans leur globalité et nécessitent d’avoir recours à un modèle animal pour cette étude. S’y ajoute qu’il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation numérique pour répondre aux objectifs souhaités.

Réduction

Nous avons estimé un effectif total de 6 animaux pour l’ensemble de cette étude. L’ensemble des animaux sera mobilisé pour permettre la prise en main du matériel et l’acquisition des gestes peropératoires indispensables, notamment pour les techniques d’anesthésie et de chirurgie. La mise en place de ce nombre a été fixée de manière à permettre des ajustements expérimentaux et des vérifications de faisabilité, tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Il s’agit du nombre minimal d’animaux requis à la fois pour maitriser, d’après notre expérience, les gestes chirurgicaux, ainsi que pour estimer, au bout de la procédure, la variabilité des paramètres physiologiques et cardiaques mesurés entre chaque animal. Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux et dans le cadre d’une DAP scientifique suivante, nous allons quantifier les changements de la fonction cardiaque et la concentration de molécules d’intérêts et les comparer par des tests statistiques.

Raffinement

Les animaux sont habitués au personnel animalier afin de limiter tout stress. L’ensemble des animaux est hébergé par deux, entre animaux socialement compatibles, ce qui leur permet d’exprimer des comportements naturels. Ils disposent d’enrichissements adaptés (bâtonnets à ronger et/ou foin ajoutés dans les cages, etc.). D’autre part, l’intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Des moyens pour éviter ou minimiser l’impact sur l’animal seront mis en place (protocole anesthésique et analgésique approprié, apport d’oxygène pendant toute la procédure, et contrôle de la voie aérienne, mise à disposition de tapis chauffants, maîtrise des saignements et vérification de ligatures et sutures et antibiotiques administrés pour prévenir l’infection). Pour faciliter le réveil, les animaux seront placés dans un environnement calme, chauffé et sous surveillance, afin de détecter rapidement toute complication éventuelle. Un suivi particulier sera porté à la bonne cicatrisation de la plaie pendant le post- opératoire (au moins 7 jours). Un examen clinique avec évaluation de l’état général, de la prise d’aliment, de l’activité et de la présence de la douleur sera réalisé pendant la période post-opératoire afin de détecter des possibles complications et de mettre en place les mesures thérapeutiques adaptées. Des critères d’alerte précis et des effets adverses seront évalués et surveillés. Si un point limite est atteint, des mesures adéquates seront mises en place dans le plus court délai (administration d’un traitement contre la douleur ou bien augmentation des doses si un traitement est déjà en cours). Parallèlement, le responsable du projet, le responsable du bien-être et le vétérinaire désigné seront contactés pour la prise de décisions dans le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proches de l’homme (brebis, porc, chèvre, chien, lapin), le lapin a été identifié comme le plus adéquat en tant que modèle animal bien connu et largement caractérisé dans des domaines variés de la recherche : •Cet animal présente également un fonctionnement cardiaque très proche de celui de l’être humain, notamment en termes de morphologies et de structures des cavités cardiaques et de réponse liée à l’activité électrique du cœur. Cette similarité en fait un modèle pertinent pour étudier les mécanismes d’action de différentes substances médicamenteuses sur le système cardiovasculaire. •Pour finir, notre étude inclut des femelles de 6 mois, car à cet âge elles permettent de reproduire de façon contrôlée une situation comparable à la ménopause chirurgicale chez la femme.

Faire valider par les autorités de santé le nouveau design d'un dispositif oculaire destiné à l'être humain : 48 lapins vont être utilisés pour cela, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vingt-huit d'entre eux reçoivent un prototype posé sur l'œil pendant cinq minutes sous anesthésie générale, les vingt autres le dispositif final, activé par des impulsions électriques qui percent transitoirement la membrane des cellules pour y faire entrer du matériel génétique. Le porteur ne retient comme effets indésirables qu'une sécheresse oculaire, une rougeur de la conjonctive et une réaction mortelle à l'anesthésie qu'il qualifie de très rare. Il justifie le choix du lapin par la taille de son œil, proche de celle de l'œil humain, et utilise les deux yeux de chaque animal pour réduire l'effectif.

Objectifs

Une technique de thérapie génique oculaire n’impliquant pas l’utilisation de virus, basée sur le transfert de gènes dans un tissu ciblé de l’œil en appliquant des impulsions électriques contrôlées a été développée. Ce procédé permet de générer, grâce à des impulsions de courte durée et de faible intensité, des « trous » transitoires dans la membrane des cellules favorisant ainsi l’entrée dans la cellule de matériel génétique permettant la synthèse de protéines thérapeutiques. Grâce à l’utilisation d’un dispositif oculaire dédié, il est possible de cibler spécifiquement l’injection du matériel génétique dans un tissu cible de l’œil et d’appliquer des impulsions électriques par le biais des électrodes du dispositif oculaire. Le tissu-cible assure ensuite la production des protéines thérapeutiques dans l’œil. Divers paramètres influencent l’étendue mais aussi l’efficacité d’entrée du matériel génétique dans les cellules cibles, dont notamment le positionnement des deux électrodes. En raison des similarités d’anatomie et de taille, l’œil du lapin est le mieux adapté pour ces travaux de conception et d’optimisation du dispositif oculaire. Un dispositif oculaire destiné à l’homme a donc été conçu sur la base d’un dispositif oculaire développé au préalable chez le lapin. Ce dispositif permet ainsi de standardiser les étapes d’injection et d’entrée du matériel génétique dans le tissu cible de l’œil et donc d’assurer ainsi une reproductibilité optimale. Les données d’utilisation et d’ergonomie du dispositif oculaire de première génération collectées lors de précédentes études cliniques ont conduit au développement d’un nouveau design du dispositif favorisant la stabilisation du globe oculaire lors de la procédure d’administration. Les objectifs du projet sont : (i) d’évaluer la sécurité des modifications du nouveau design du dispositif oculaire en testant différents prototypes chez le lapin et (ii) de démontrer l’efficacité de transfert du matériel génétique dans le tissu cible de l’œil en utilisant le dispositif de seconde génération.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de générer des données précliniques nécessaires pour démontrer aux autorités de santé la sécurité et l’efficacité du dispositif en développement et permettre ainsi la poursuite des essais cliniques chez l’homme en développant un dispositif adapté à l‘homme. Les bénéfices attendus du projet sont le développement d’un nouveau design de dispositif oculaire permettant une administration dans le tissu cible de l’œil sûre, efficace et reproductible. Ces différents éléments seront ensuite transposés chez l’homme pour la production d’un dispositif de seconde génération qui sera utilisé lors de prochaines études cliniques.

Procédures

28 lapins auront un prototype de dispositif placé sur l’œil une seule fois pendant 5 min sous anesthésie générale. 20 lapins auront le dispositif final mis en place et activé, sous anesthésie générale d’une durée de 5 minutes, une seule fois.

Impact sur les animaux

En plus du stress initial de la contention, les effets indésirables identifiés sont : -sécheresse oculaire, rougeur de la conjonctive : peu fréquents et de courte durée (1 à 2 jours maximum) -réaction/mort à l’anesthésie : très rare

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour collecte des tissus pour les études histologiques ou prélèvement des liquides oculaires pour le dosage du niveau d‘expression des protéines thérapeutiques.

Remplacement

Des études ex-vivo ont été réalisées sur explants (culture de cellules) d’œil de rat, de lapin ou de singe. Ces études ont permis de définir certains paramètres du transfert de gènes tels que la zone d’injection ou le seuil des impulsions électriques. L’utilisation de ce modèle ex-vivo reste limité car le niveau de production de la protéine diffusée dans le milieu de culture ainsi que sa durée d’expression ne sont pas représentatifs du fonctionnement du muscle cible de l'œil in vivo en raison de la dégradation rapide de ce tissu dans ces conditions de culture (2 jours de culture maximum). Par ailleurs, l’utilisation d’un œil isolé avant la mise en culture présente également des limites. La tonicité d’un œil isolé est différente de celle de l’œil d’un animal vivant et l’évaluation des inflammations oculaires liées à l’utilisation du dispositif ou à la production de la protéine thérapeutique au cours du temps est impossible. Le recours à un œil sur animal vivant, et plus particulièrement l’œil de lapin en raison de ses caractéristiques anatomiques et physiologiques est indispensable pour développer le dispositif oculaire et montrer que, via cette technologie, la protéine cible est efficacement produite et de façon sécurisée pour l’animal, et qu'elle diffuse depuis le muscle cible jusqu'aux tissus à traiter.

Réduction

Les procédures expérimentales standardisées ont été mises au point afin de pouvoir réduire le nombre d'animaux à utiliser et obtenir des résultats statistiquement exploitables. Nous avons également choisi d’utiliser les 2 yeux pour chaque animal et chaque animal sera utilisé pour tester un ou plusieurs prototypes (dans le respect des contraintes éthiques et de bien-être), lorsque cela est possible (par exemple, œil droit vs œil gauche), ce qui contribue à réduire le nombre total d’animaux requis. Le nombre d’animaux a été déterminé en fonction de la variabilité attendue sur la bases d’études précédentes et sur la nécessité d’avoir une représentativité suffisante. Le nombre d'animaux nécessaires a été déterminé grâce à un test statistique, tout en anticipant d’éventuelles pertes liées à l’expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les conditions standards (environnement contrôlé, présence systématique d’enrichissement du milieu) au minimum 1 semaine dans leur nouvel environnement avant toute manipulation afin d’éviter le stress. Sur toute la durée expérimentale, l’état de santé des animaux sera contrôlé deux fois par semaine par les expérimentateurs et une fois par jour par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront anesthésiés et recevront un traitement anti-douleur adéquat lors des procédures mises en œuvre afin de limiter le stress de la manipulation et une meilleure prise en charge de la douleur. Ils seront maintenus sur un matelas chauffant durant les anesthésies. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet ont été définis et seront appliqués.

Choix des espèces

Le lapin s'avère être le modèle animal le plus adapté pour le développement de notre système d’administration et plus particulièrement l’optimisation de notre dispositif oculaire : - La taille de l’œil de lapin est similaire à celle de l’œil humain, il est donc facile de transposer le design du dispositif oculaire du lapin à l’homme. - Il n’existe pas de modèle in vitro représentatif du transfert de matériel génétique par impulsion électrique contrôlée. - Les caractéristiques physiologiques du lapin sont bien connues et documentée dans la littérature scientifique. Les animaux utilisés seront des jeunes adultes âgés de 3 à 5 mois avec un poids moyen de 3,5 kg. La taille de l’œil du lapin varie en fonction de l’âge et du poids de l’animal et les données anatomiques de l’œil de lapin d’environ 3,5 kg sont les plus proches de celles de l’œil humain adulte. Les modélisations du dispositif oculaire adapté à l’œil du lapin ont été réalisées sur des données anatomiques de lapin de cet âge et cette fourchette de poids.

696 rats, 678 souris et 120 lapins reçoivent des injections, des perfusions et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine et par animal, gestes exécutés par des personnes en cours d'apprentissage qui ne les maîtrisent pas encore. Ces 1 494 animaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une session à l'autre pendant douze mois au plus avant d'être tués, parfois pour l'entraînement aux techniques de mise à mort. Le produit administré est une solution saline: rien n'est testé ici, il s'agit d'entretenir le geste technique d'une trentaine de techniciens. Le porteur mentionne des interventions invasives sous sédation ou anesthésie sans dire lesquelles, et prévoit la commande de femelles gestantes pour s'exercer aux mises bas.

Objectifs

Le but de ce projet est de permettre la formation du personnel technique (techniciens et animaliers) d’une ou plusieurs techniques sur le rat, la souris ou le lapin. On estime que l’on réalisera 8 sessions de formation par an, chacune ayant recours à l’utilisation d’un maximum de 15 rats, 15 souris ou 3 lapins, afin de maintenir les compétences techniques d’une trentaine de techniciens. Les animaux utilisés peuvent provenir : - d'animaux réutilisés provenant d’études précliniques (i.e. surnuméraires ou animaux non euthanasiés en fin de projet), ou peuvent être des animaux déjà inclus sur étude si cela n’impacte pas la qualité scientifique de l’étude en question. - dans de rare cas, d’une commande spécifique (ex : formation nécessitant des rongeurs gestants).

Bénéfices attendus

La formation du personnel est nécessaire et requise par la règlementation pour toute personne travaillant avec des animaux de laboratoire afin qu’elles disposent de compétences validées et régulièrement actualisées. En accord avec la Convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d’autres fins scientifiques (STE no. 123), nous mettons en œuvre toutes les mesures nécessaires pour affiner nos pratiques, maintenir les compétences de notre personnel et garantir un niveau élevé de qualité et de bien‑être animal. Toutes ces techniques sont décrites dans des procédures spécifiques internes revues et validées par la Structure pour le Bien-Etre Animal.

Procédures

En fonction des tâches de formation à réaliser, les animaux peuvent être traités par différentes voies (principalement orale mais aussi par injection intramusculaire, voies sous- cutanée ou intraveineuse, intra-oculaires, etc.) et soumis à des techniques de prélèvement (prélèvement sanguin, prélèvement de larmes, etc..). Le composé administré sera une solution saline. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure maximum chez le rongeur et 30 minutes chez le lapin, dans le cas de formation à la perfusion. Les prélèvements sanguins (sur animal vigile placé dans un tube de contention ou sous anesthésie) sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 3 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine en fonction des recommandations éthiques (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et un maximum de 12 prélèvements sanguins dans la semaine chez le lapin, 10 chez le rat et 6 chez la souris). Une mise à jeun pendant une durée maximale de 16h pour recueil d’urine/fécès est également possible (avec accès à l’eau). Le cumul de la douleur relative à la ré-utilisation des animaux sera pris en compte Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (de façon permanente en cas d’agressivité envers ses congénères, ou pendant quelques jours en cas de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus correspondent : - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures : prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (16h maximum), intervention invasive sous sédation/anesthésie. - à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés au geste expérimental compte tenu du fait qu’il sera réalisé par des personnes en formation, ne maitrisant pas encore totalement le geste. - à l’hébergement individuel lorsqu’il ne peut pas être évité (ex : souris mâle arrivée ne pouvant pas être remis en hébergement collectif sous peine de causer des agressions et blessures à ses congénères).

Devenir

Chaque fois que cela sera envisageable, les animaux seront réutilisés dans le cadre de ce même projet, avant mise à mort pour entrainement aux techniques d’euthanasie ou réalisation de bibliothèques de tissus dans un maximum de 12 mois après sa première réutilisation.

Remplacement

La formation du personnel à des techniques d’expérimentation animale ne peut pas être remplacé intégralement par des méthodes alternatives dans la mesure où le personnel doit pouvoir s’entrainer en conditions réelles avant de pouvoir intervenir sur étude réglementaire au risque de ne pas maitriser son geste au niveau requis et causer potentiellement douleur/stress une fois au contact de l’animal tout en compromettant la qualité des données d’étude. Afin de remplacer une partie des animaux utilisés pouvant être utilisés à des fins de formations, on pourra avoir recours au visionnage de vidéos, consultation d’articles, échanges avec scientifiques, utilisation de mannequins ou test sur animaux post-mortem.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera le plus petit possible tout en ayant la certitude que le personnel a obtenu un degré d'expertise suffisant (déterminée par le formateur). On aura recours en priorité à la réutilisation d’animaux provenant de surnuméraires de projets annexes. De même, l’utilisation préalable de vidéos, consultation d’articles, échanges avec scientifiques, utilisation de mannequins ou test sur animaux post-mortem pourra permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre le niveau de maitrise attendu. Les vidéos utilisées pourront provenir d’une bibliothèque de vidéos de formation déjà existantes, ou pourront être enregistrées au cours des formations pour utilisation lors de formations ultérieures du personnel.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants sont contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture, température corporelle, signes cliniques (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au vétérinaire. Il lui incombe la décision d'apporter des soins ou d’euthanasier les animaux au vu des signes observés. Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement (3 enrichissements minimum par hébergement). Pour les rats/souris, les enrichissements disponibles comprennent (liste non exhaustive) : tunnels (plastique ou carton), jouets en bois à ronger (buchettes, boules), accessoires de nidification (coton compressé, papier compressé). Pour les lapins, de la musique leur sera diffusée à faible volume pour masquer les bruits de fond de fonctionnement du laboratoire et ainsi réduire le stress lié au bruit. Ils disposent d’une plaque de repos, d’au moins un palet de foin compressé et d’un jouet. Les lapins sont également habitués à la manipulation et au contact humain par le biais de caresses quotidiennes dès leur arrivée au laboratoire. Si l’hébergement individuel est requis; comme par exemple lorsqu'il existe des incompatibilités connues (comme dans le cas des lapins mâles ou des souris mâles entre eux), ou bien pour raison sanitaire, ce choix devra être dûment argumenté et un enrichissement supplémentaire pourra être apporté. Des contacts visuels, auditifs et olfactifs seront maintenus avec les autres animaux.

Choix des espèces

Pour les rongeurs, les animaux peuvent avoir entre 6 semaines et 15 mois. Pour les lapins, les animaux peuvent être entre 3 mois d'âge et 16 mois. Après réception en étude à l’âge de 6-8 semaines (rats/souris) ou 10-14 semaines (lapins), les animaux non utilisés en étude sont réutilisés à des fins de formation pendant une durée maximale de 12 mois avant euthanasie. Dans de rares cas, il est également possible d'avoir recours à des femelles gestantes (rongeurs uniquement, commande spécifique en fonction du besoin), accouplés par l’éleveur et mettant bas au laboratoire afin de réaliser des phases d'entrainement sur les mises bas, la sélection et le traitement des portées, qui nécessitent une technicité différente de celle nécessaire aux expérimentations sur les animaux âgés de 6 semaines ou plus. Après utilisation, les nouveau-nés seront conservés dans la colonie de stock.

La production d'un médicament antirejet vendu dans plus de 80 pays repose sur 235 000 lapins, tous tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit deux injections immunisantes, subit deux prélèvements sanguins à l'artère de l'oreille en boîte de contention, puis un prélèvement intracardiaque sous anesthésie qui dure une dizaine de minutes et le tue. Le porteur reconnaît que ces ponctions répétées provoquent une anémie de deux à six jours. Il affirme qu'aucun modèle ne peut remplacer le lapin pour produire ces anticorps et rappelle que l'espèce est celle inscrite au dossier d'autorisation de mise sur le marché, ce qui verrouille le choix autant que la biologie.

Objectifs

Ce projet consiste en la production du principe actif d'un produit biologique à usage thérapeutique dit "life saving". Le médicament est un immunosuppresseur sélectif utilisé principalement pour prévenir ou traiter le rejet de greffe après une transplantation d’organe. Il s'inscrit dans un contexte de santé publique mondiale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet vise à produire le principe actif d’un médicament essentiel, distribué dans plus de 80 pays et reconnu comme un traitement vital pour de nombreux patients. Destiné à un usage hospitalier, ce médicament agit comme un immunosuppresseur sélectif, jouant un rôle clé dans la prévention et le traitement des rejets d’organes greffés, tant avant qu’après l’intervention chirurgicale. Le médicament est considéré comme un médicament « life saving », c’est-à-dire indispensable à la survie des patients greffés. Par ailleurs, ce médicament est également utilisé pour soigner l’aplasie médullaire. Classé parmi les médicaments critiques par l’Union européenne, il fait l’objet d’une obligation de stock minimal de quatre mois afin de garantir la continuité de l’approvisionnement et éviter toute rupture pour les patients.

Procédures

Il s'agit d’injections intra-veineuse et sous-cutanée, de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement. Les différentes étapes sont les suivantes : - Étapes d’immunisation : Chaque animal vigile va recevoir une injection d’une suspension immunisante en 2 fois. Une première injection en sous-cutanée pour une durée de 1 minute, puis une deuxième injection 14 jours plus tard en intra-veineuse sur une durée de 1 à 2 minutes. - Phase de prélèvements sanguins : Un premier prélèvement sanguin est réalisé au niveau de l’artère médiane de l’oreille sur animal vigile placé dans une boîte à contention pour une durée moyenne de 5 à 6 minutes. Une fois le prélèvement terminé, de la colle chirurgicale est appliquée au niveau du point de prélèvement pour assurer l’hémostase. Le deuxième prélèvement est à l’identique du premier (au niveau de l’artère médiane de l’oreille sur animal vigile pour une durée moyenne de 5 à 6 minutes avec application de colle chirurgicale pour assurer l’hémostase. - Prélèvement terminal : Après une injection sur animal vigile par voie intra-veineuse d’un produit anesthésique (la contention dure environ 1 minute pour effectuer cette opération), l’animal alors sous anesthésie générale est prélevé par voie intracardiaque jusqu’à la mort de l’animal. Cette étape de prélèvement terminal dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le protocole de production prévoit plusieurs étapes successives chez les animaux ; à savoir, 2 étapes d’immunisation, 2 étapes de prélèvements sanguins et 1 dernière étape de prélèvement intracardiaque : 1 - Étapes d’immunisation : Les animaux vont recevoir deux injections pour stimuler le système immunitaire. Une première injection en sous-cutanée d’une suspension cellulaire, puis une deuxième administrée 14 jours plus tard en intra-veineuse. Ces injections se font dans un délai court et peuvent provoquer une légère douleur au point d’injection (liée à la pénétration de l’aiguille et à la pression exercée lors de l’injection). La douleur est généralement immédiate et de courte durée. Elle est minimisée par l’utilisation d’aiguilles adaptées à la taille de l’animal et par la réalisation des injections par du personnel formé. 2 - Phase de prélèvements sanguins : deux ponctions sanguines sont réalisées au niveau de l’artère médiane de l’oreille. La ponction entraîne une douleur légère et brève, liée à la piqûre de l’aiguille. Les animaux peuvent manifester des signes de stress lors de la contention et de la ponction. Ces réactions sont généralement limitées et ne persistent pas après la fin de la procédure. Un petit hématome peut survenir au point de ponction, mais il est généralement minime et se résorbe spontanément en quelques heures. 3 - Prélèvement terminal : Il est effectué par voie intracardiaque sous anesthésie générale. L’induction du produit anesthésique par voie intraveineuse peut provoquer une douleur légère et brève. Ces prélèvements sanguins peuvent induire une anémie (avec une durée comprise entre 2 et 6 jours). Une étude menée en interne en 2023, basée sur la mesure et le suivi du taux d’hématocrite, a permis de démontrer que cette anémie reste légère à modérée.

Devenir

À l’issue de la procédure, l'ensemble des animaux seront mis à mort lors de la prise de sang terminale par voie intracardiaque sous anesthésie générale.

Remplacement

À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de remplacer le lapin pour la production d’anticorps polyclonaux destinés à la fabrication du principe actif du médicament en raison de la complexité et de la diversité épitopique requise. En effet, la diversité et la quantité d’anticorps générés par cet animal offrent une compatibilité optimale avec un large panel de patients greffés, et ce à l’échelle mondiale. Cette complexité immunologique ne peut être reproduite par les méthodes de production in vitro actuelles. Le médicament cible plus de 80 épitopes distincts des cellules immunitaires, induisant ainsi chez le patient une immunosuppression à la fois puissante et prolongée, essentielle pour prévenir les rejets de greffe.

Réduction

La procédure expérimentale mise en œuvre a été définie dans un objectif d’optimisation du rendement en sérum par animal utilisé, tout en assurant l’obtention d’un sérum présentant la concentration requise en anticorps polyclonaux. La réalisation de prélèvements sanguins répétés, effectués dans le respect des exigences réglementaires et sous contrôle du bien-être animal, permet d’accroître la quantité moyenne de sérum collectée par animal. Cette stratégie contribue ainsi à la production d’une quantité accrue de médicament à partir d’un nombre équivalent d’animaux utilisés. Enfin, le protocole prévoit l’utilisation de lapins mâles et femelles (lapins issus de l’élevage et lapins reproducteurs réformés), permettant l’inclusion de l’ensemble des animaux élevés au sein de l’établissement et participant à l’optimisation de l’utilisation des animaux conformément aux principes réglementaires en vigueur.

Raffinement

Les lapins sont hébergés dans des cages conformes aux exigences réglementaires, avec une densité adaptée et une stabilité des groupes sociaux. Un enrichissement environnemental adapté est en place : notamment avec des galets à ronger en cellulose, une stimulation sensorielle contrôlée (radio) ainsi que des plateformes de repos. Dans la mesure du possible, un maintien des groupes constitués précocement est assuré afin de limiter l’agressivité interindividuelle. Un suivi quotidien des animaux est assuré par du personnel qualifié, formé et régulièrement habilité. Des fiches de suivi individualisées permettent de consigner les soins apportés et de documenter l’évolution de l’état de santé de chaque animal. Un suivi renforcé est mis en place durant les phases de prélèvements prévues par le protocole expérimental. L’évaluation de la souffrance animale est réalisée quotidiennement à l’aide d’un poster mis à disposition en zone d’expérimentation. Toute manifestation de souffrance dépassant ces seuils entraîne l’arrêt immédiat de l’expérimentation pour l’animal concerné. Lors de la réalisation du prélèvement intracardiaque, une anesthésie générale est effectuée avec une solution de xylazine et de kétamine adaptée au poids. Enfin, lors des prélèvements sanguins au niveau de l’artère auriculaire, une application de colle chirurgicale est réalisée.

Choix des espèces

D'autres espèces animales pourraient être utilisées (exemples : cheval, chèvre...) mais le lapin est l'animal le plus approprié parce qu'il réunit à la fois faciliter d'élevage, facilité de maintien du statut sanitaire EOPS et facilité de prélèvement et d'atteinte du volume de sérum nécessaire. De plus, le lapin est l'espèce enregistrée par les Autorités de Santé Publique Internationales dans le dossier d'Autorisation de Mise sur le Marché du médicament à fabriquer. On utilise exclusivement des animaux en bon état physique et bonne santé apparente pesant au minimum 2,8 kg et âgés de 14 semaines minimum au moment de la première immunisation. Il s'agit d'un âge optimal pour avoir un lapin suffisamment mâture immunologiquement et suffisamment gros pour supporter les prélèvements de sang.

Proposés à l'adoption par une association après six mois d'utilisation, dix lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une fois par semaine, chacun est attaché pendant que plusieurs centaines de poux de corps humains d'élevage se nourrissent de son sang, la séance pouvant durer environ deux heures pour les cinq stades du parasite. Le porteur décrit une irritation passagère et un inconfort lié à la contention, et prévoit une mise à mort seulement en cas de maladie grave ou d'impossibilité de placement. Il affirme que le lapin est la seule espèce sur laquelle ces poux, sélectionnés il y a plusieurs décennies, peuvent survivre, et que ce nourrissage reste "nécessaire" le temps de mettre au point une alternative in vitro.

Objectifs

L'infestion de la peau et des cheveux par des poux touche des millions de personnes dans le monde et est toujours très fréquente en France, notamment chez les enfants scolarisés. Les poux représentent un problème de santé publique et un coût financier non négligeable pour les populations touchées. Afin de lutter contre ces parasites, il est important de tester l'efficacité des nouveaux produits antipoux avant leur mise sur le marché. Cependant, il est très difficile de se procurer des poux sur les humains. C'est la raison pour laquelle, des poux d’élevage sont utilisés avec l'avantage d'être disponibles en grande quantité à tout moment de l'année. Ce sont des poux de corps humains sélectionnés il y a plusieurs décennies, pour leur capacité à se nourrir du sang de lapin pour assurer leur survie. Le lapin est la seule espèce animale disponible pour l'élevage de poux. L'objectif du projet est de maintenir l'élévage de poux en les nourrissant sur des lapins puis de tester sur ces poux, l’efficacité de produits capables de tuer poux et lentes, ou de répulsifs développés par l'industrie pharmaceutique. De par cette expertise sur les poux et les antipoux, le deuxième objectif est de diffuser les connaissances nécessaires à la lutte contre la pédiculose auprès des étudiants, des services scolaires (interventions dans les écoles) et du grand public (conseils aux familles, expertise auprès des médias), confrontés à cette infestation.

Bénéfices attendus

Les résultats du projet permettront d'orienter le développement de produits antipoux et répulsifs efficaces et de conseiller leurs utilisateurs.

Procédures

Les animaux subiront la piqûre de poux une fois par semaine pendant 6 mois.

Impact sur les animaux

Les lapins seront hébergés individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères et non collectivement pour éviter les conflits. La contention du lapin nécessaire pendant le nourrissage des poux peut engendrer du stress. Les lapins pèsent plusieurs kilos et il est indispensable de les attacher pour assurer leur sécurité, ce qui peut provoquer un inconfort le temps de la procédure. Les liens sont en tissu et ne provoquent pas de blessures, irritations ou dépilation. Les poux des différents stades (adultes et 4 stades larvaires) ne doivent pas être mélangés. Les poux mettent environ 15-20 minutes à prendre un repas complet, ce qui fait une durée totale d’environ 2 heures pour le nourrissage des 5 stades en prenant en compte leur dépôt et leur ramassage. Si la quantité de poux est faible, deux stades peuvent être déposés côte à côte, ce qui diminue cette durée. Le nourrissage des poux (plusieurs centaines) peut entraîner une irritation passagère qui disparaît après quelques minutes.

Devenir

A l'issue de la procédure hebdomadaire, les animaux sont hébergés à l'animalerie. Après une période de 6 mois d'utilisation, tous les animaux seront proposés à l'adoption en famille d'accueil par l'intermédiaire d'une association. Les animaux ne seront mis à mort qu'en cas de pathologie grave indépendante de la procédure, de blessure grave accidentelle ou d'impossibilité de les placer en fin de projet. La décision de mise à mort sera préalablement soumise aux responsables du projet initial et au vétérinaire référent.

Remplacement

Le nourrissage des poux sur animal vivant est le seul moyen à ce jour de garantir la survie des poux, insectes hématophages stricts à tous les stades (adultes et larves), et le maintien du cycle (reproduction et pontes). Le lapin est le seul animal sur lequel les poux humains ont été adaptés il y a plusieurs décennies. Ces poux d’élevage meurent en cas d’ingestion de sang humain, puisqu’ils ne sont plus capables de le digérer. Le nourrissage sur lapin est nécessaire le temps de mettre en place un mode de nourrissage in vitro des poux sur sang de lapin permettant l'obtention d'une colonie conséquente et viable sur plusieurs générations.

Réduction

Le nourrissage des poux se fait par roulement sur 4 lapins. Afin de réduire les contraintes individuelles, la durée d’utilisation de ces lapins sera limitée à 6 mois, soit 8 lapins pour la durée du projet. Deux animaux supplémentaires sont prévus pour compenser l'éventuelle sortie prématurée d’animaux du projet.

Raffinement

Les lapins seront hébergés en accord avec les directives européennes, individuellement en box de 1,3 m x 0,5 m, avec contacts visuels et auditifs entre congénères, afin d’éviter les conflits en hébergement collectif. Le sol des box sera recouvert de copeaux de bois pour un plus grand confort et muni d'une tablette leur permettant de grimper ou de se cacher. De plus, leur environnement sera enrichi d’une balle en plastique pour jouer et régulièrement d'un bouchon de fibres pour se faire les dents. Des enrichissements seront ajoutés ponctuellement pour varier leur quotidien ("rabbit relaxer" par exemple). Une grille scorée basée sur l'échelle d’évaluation des expressions faciales éditée par le National Centre for the Replacement, Refinement & Reduction of Animals in Research (NC3Rs) sera utilisée pour évaluer l’état sanitaire des lapins. Les signes pris en compte seront la contraction orbitaire, l’aplatissement des joues, la position « tombante » du museau, des moustaches et des oreilles avec les scores absent (0), modéré (1) et évident (2). Une acclimatation d’une semaine est prévue à l’arrivée des lapins et une habituation à la procédure est mise en place sur plusieurs jours avant le tout premier nourrissage des poux. A chaque étape d'habituation et après chaque nourrissage des poux, le lapin recevra de la carotte de culture biologique en renforcement positif. A la fin du projet, les lapins seront proposés à l’adoption en famille d’accueil par l’intermédiaire d’une association.

Choix des espèces

Le lapin est la seule espèce sur laquelle les poux de corps humains d’élevage peuvent se nourrir et assurer leur survie sur plusieurs générations. Les adultes sont préférables pour avoir une surface de peau la plus grande possible et ainsi réduire la durée de nourrissage des poux.