Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 23/10/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-044124)
2 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés dès le stade embryonnaire à de l’éthinylestradiol et à des bisphénols ajoutés à leur eau, larves, juvéniles et adultes sont ensuite tués et fixés pour observer au microscope le développement de leur cerveau. Le porteur indique que ces perturbateurs endocriniens peuvent modifier le sex-ratio, le comportement locomoteur et provoquer de l’anxiété. Il affirme qu’aucun modèle in vitro ne reproduit le fonctionnement du cerveau et de sa barrière hémato-encéphalique sur le long terme.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
Le projet vise à comprendre les effets d’une exposition à des molécules polluantes de notre environnement : l’ethinyl estradiol (EE2), molécule très souvent utilisée en contraception et très largement retrouvée dans les milieux aquatiques, et certains bisphénols, molécules utilisées dans la fabrication de nombreux objets plastiques et emballages alimentaires. L’effet de ces expositions sera observé sur le développement et le fonctionnement du système nerveux central chez le modèle poisson zèbre (Zebrafish). Ces molécules sont déjà décrites pour être des perturbateurs endocriniens. Cette étude se fera sur des lignées transgéniques de poissons zèbres
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Cette étude permettra d’évaluer l’effet de ces molécules polluantes/pertubatrices endocriniennes à court (larve), moyen (juvénile) et long terme (adulte) sur le développement et le fonctionnement du cerveau de vertébrés. La mise en place notamment des vaisseaux dans le cerveau (voie d’entrée de toutes substances dans le cerveau) et des cellules souches neurales devraient être observés facilement par la création de la lignée doublement transgénique et le traitement des échantillons permettant ainsi de les rendre transparent (transparisation). La mise au point de cette nouvelle lignée et sa transparisation devrait aussi permettre à l’avenir d’analyser rapidement l’exposition à d’autres molécules polluantes de notre environnement et leur impacts sur la mise en place et le bon fonctionnement du cerveau.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Les animaux aux stades embryonnaires seront uniquement traités à des doses environnementales, ou légèrement supérieures, du 1er Jour au 4eme jour de développement embryonnaire. Le traitement des oeufs/embryons se fera par simple addition de la molécule dans le milieu aquatique d’incubation des oeufs/embryons. 2700 animaux (larves, juvéniles et adultes) traités dériveront de ces oeufs/embryons. L’analyse des animaux se fera après leur euthanasie. Pour rappel une seule ponte d’une femelle poisson zèbre correspond à environ 500 embryons.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
Les effets de perturbateurs endocriniens sont en général subtiles, surtout aux doses utilisées (proche des doses environnementales). Pour certains perturbateurs endocriniens, et en fonction de la concentration, les effets suivants ont été observés dans la litérature : comportements reproducteurs modifiés, changement du sex-ratio avec des possibilités de féminisation chez certaines espèces, modification du comportement locomoteurs et anxiété. Certains perturbateurs peuvent aussi avoir des effets obésogènes.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
La visualisation au microscope confocal (microscope à haute résolution) des cerveaux des animaux transgéniques traités ne peut se faire que sur des animaux fixés (non vivants)
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Le cerveau est un des organes les plus complexe de notre organisme. Il contient de nombreux types cellulaires (neurones, astrocytes, oligodendrocytes, cellules microgliales, ependymocytes). Son fonctionnement ne peut se faire que par sa vascularisation et les échanges de métabolites et de gaz qui se font avec le tissu neural passent par la barrière hémato-encéphalique, structures complexes présentes partout dans le cerveau. Il n’existe pas de modèles physiologiques in vitro qui mimerait le fonctionnement du cerveau et celui de la barrière hématoencéphalique. Par ailleurs les effets des perturbateurs endocriniens sont visibles très souvent à moyen et long terme : c’est ce qu’on appelle » le concept de l’origine développementale des maladies humaines ». Les effets à moyen/long terme ne sont pas compatibles avec des modèles de cultures de cellules (2 dimensions, sphéroides, organoides….) dont l’utilisation dans le temps est limité
2. Réduction
Les groupes d’animaux seront mis en place de façon suivante afin de pouvoir réaliser de solides statistiques. Nombre de molécules à tester : 4 (éthylniestradiol, Bisphenol A, Bisphenol S et Bisphenol AF) Nombre de concentrations des molécules à tester : 4 (Emax, EC50, EC20) et Condition contôle : DMSO (solvant pour les molécules à tester). Donc 5 conditions par expérience. Nombre d’animaux par condition : 15. Ce nombre de 15 est justifié par le fait qu’il peut y avoir une perte d’échantillon : l’individu ne survit pas jusqu’à la fin de l’expérience ou encore la qualité des coupes de cerveau obtenue à partir des échantillons biologiques est insuffisante pour permettre une quantification des marqueurs d’intérêt. 3 répétitions indépendantes : pour collecter et comparer des données avec un pouvoir statistique suffisant pour générer des conclusions. Les tests statistiques paramétriques de comparaison multiple one way ANOVA seront utilisés car ils sont les plus appropriés aux tests statistiques d’échantillons paramétrés ayant une distribution de type gaussienne. La répétition de 3 expériences permet aussi de stopper le projet si l’analyse des données des première et deuxième expériences se révèle être non encourageante. L’état de santé des animaux, la souffrance et l’angoisse seront évalués. La survenue répétitive d’épisodes de nage agitée, de diminution de la prise alimentaire, d’augmentation de comportement agressif nous indiquera un problème de bien-être chronique.
3. Raffinement
L’état de santé des animaux, la souffrance et l’angoisse seront évalués. La survenue répétitive d’épisodes de nage agitée, de diminution de la prise alimentaire, d’augmentation de comportement agressif nous indiquera un problème de bien-être chronique.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
Le poisson zèbre est utilisé car nous possédons déjà les deux lignées transgéniques à partir desquelles la lignée doublement transgénique sera réalisée par simple reproduction des geniteurs. Le modèle poisson zebre est largement utilisé en biologie du développement et toxicologie/perturbation endocrinienne. 675 larves (entre 5 et 10 jours), non sexé 675 juvéniles (entre 30 et 40 jours), non sexé 675 X 2 adultes (entre 90 et 120 jours) Males/femelles = 1350 adultes