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Evaluation de sondes radiomarquées d’intérêt dans le cancer de l’ovaire chez la souris EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
2 181 souris vont être utilisées, chacune greffée de cellules tumorales ovariennes humaines chimiorésistantes puis transportée entre deux sites distants de trois kilomètres pour environ 45 minutes d'imagerie TEP sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur écrivant qu'elles le seront "pour récupération et valorisation des tissus". Les procédures d'un niveau de souffrance modéré comprennent l'injection de radiotraceurs, des prélèvements sanguins à la veine saphène sous contention, et une irradiation localisée possible des organes où les traceurs s'accumulent, le seul suivi comportemental décrit étant une inspection quotidienne notant la prostration, la rupture du lien social et une grimace scale. Les retombées annoncées pour les patientes atteintes de cancer de l'ovaire séreux de haut grade sont formulées dans "l'espoir d'augmenter leurs perspectives de survie", quand le projet en est encore à vérifier où se distribuent quatre familles de molécules.
Objectifs
Dans le domaine de la médecine nucléaire, la thérapie par radioligand (TRL) représente une avancée majeure pour le traitement des cancers. Cette approche théranostique repose sur l’utilisation d’agents biologiques, tels que des peptides ou des anticorps, ciblant spécifiquement des protéines exprimées à la surface des cellules tumorales, couplés soit à un radioisotope d’imagerie pour le diagnostic, soit à un radioisotope thérapeutique. Cependant, aucun agent théranostique n’existe encore pour des cancers agressifs tels que le cancer de l’ovaire séreux de haut grade dont le sombre pronostic est généralement associé à des résistances à la chimiothérapie. Ce projet vise à évaluer l’efficacité de nouveaux radioligands, développés pour cibler de façon spécifique différentes protéines membranaires surexprimées à la surface des cellules tumorales ovariennes. À ce jour, quatre cibles dont les ligands naturels sont déjà bien caractérisés ont été identifiées. Le premier objectif de ce projet consistera à évaluer la biodistribution de différentes molécules dirigées contre ces quatre cibles d’intérêt, après couplage à un radioisotope d’imagerie, afin de vérifier leur spécificité. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité thérapeutique de ces molécules en les couplant avec un radioisotope thérapeutique émettant des rayonnements ionisants afin de créer des dommages à l’ADN des cellules tumorales ciblées et de provoquer leur mort. Des souris porteuses de tumeurs ovariennes humaines (chimiorésistantes) seront ainsi utilisées soit pour réaliser des imageries par Tomographie à Emission de Positron (TEP) après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope d’imagerie ; soit pour étudier le suivi de la croissance tumorale après injection d’un radioligand couplé à un radioisotope thérapeutique. Cette étude a pour but d’évaluer la spécificité et l’efficacité thérapeutique de radioligands ciblant des protéines surexprimées dans les cancers de l’ovaire. Cela permettra de sélectionner les candidats les plus prometteurs qui pourraient avoir un intérêt dans le traitement de ces cancers.
Bénéfices attendus
Ces travaux permettront de déterminer la faisabilité d’une approche théranostique, chez les patientes atteintes de cancer de l’ovaire, en fournissant de précieuses informations sur la distribution des radioligands au sein de l’organisme, son excrétion et stabilité dans le sang, connaissances indispensables pour le choix des radioligands possédant la meilleure efficacité thérapeutique, tout en minimisant les effets sur les tissus sains. Ainsi, cela permettrait d’envisager de nouvelles méthodes de prise en charge des patientes atteintes de cancer de l’ovaire grâce à la théranostique, dans l’espoir d’augmenter leurs perspectives de survie et d’améliorer leur qualité de vie pendant et après le traitement, par la diminution des effets secondaires. De plus, les 4 récepteurs d’intérêt étant également surexprimés dans d’autres types de cancers, cela pourrait étendre les bénéfices de ces composés innovants à d’autres patients.
Procédures
Injection de cellules tumorale (5minutes sous anesthésie gazeuse). Transfert entre les deux sites : moins de 3 km (environ 10 minutes). Injection de radiotraceurs (2 minutes) sous anesthésie gazeuse suivi d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse : environ 45 minutes. Prélèvements sanguin (veine saphèene) sous contention : 1 minute.
Impact sur les animaux
Une inspection détaillée et quotidienne dans les périodes critiques, i.e. après implantation et après traitement, de chaque animal est effectuée afin d’observer le comportement et les symptômes cliniques de l’animal : rupture du lien social, prostration, grimace scale. De plus, de l’aliment gélifié leur sera proposé Les animaux ressentiront de l’inconfort, voire de la douleur, en raison de la nécessité de procéder à des injections de cellules tumorales ou de radiotraceurs : - stress de la préhension des souris pour l'implantation des tumeurs : environ 2 minutes - inconfort associé au développement tumoral : légère gêne au niveau moteur : maximum 2 semaines - au moment du tranfert des animaux : stress du au changement d'environnement : environ 3 jours - injection des radiotraceurs sous anesthésie : pas de stress en dehors de celui de la préhension pour sédation - imagerie TEP : pas de stress ni douleur prévu, car non invasif et réalisé sous anesthésie. Les signes de toxicité possibles des radio ligands sont principalement liés à l’accumulation des radiotraceurs dans certains organes qui peut entrainer une irradiation localisée. Ces toxicités seront évaluées via les études de bio distribution (et comptage gamma après prélèvements d’organes). Nous serons tout de même attentifs aux pertes d’appétit, de diarrhée et de perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupération et valorisation des tissus.
Remplacement
Bien que de nombreux modèles in vitro, de plus en plus poussés, existent et qu’il s’agisse d’un champ de la biologie en essor, il n’est à l’heure actuelle pas possible de remplacer un organisme vivant par une puce microfluidique ou un organoïde. En effet, dans le cadre de l’étude présentée ici, il est nécessaire d’évaluer des paramètres tels que la distribution au sein d’un organisme entier ainsi que l’excrétion des radioligands. Tout ceci nécessite des systèmes circulatoires et excrétoires, dont toute la complexité ne saurait encore être retranscrite artificiellement. C’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à un modèle murin. Les étapes de recherche de récepteurs cibles ont été menées in silico. Par ailleurs, les étapes de validation des cibles ainsi qu’une première sélection des ligands présentant les meilleures caractéristiques (liaison spécifique au récepteur cible et capacité d’internalisation) ont été réalisées in vitro, sur des lignées cellulaires de cancer ovarien. Cela permet ainsi de réduire l’utilisation d’animaux et leur utilisation n’arrive qu’à la fin d’un processus réfléchi et optimisé, de sorte à en minimiser l’usage.
Réduction
Les différents tests in vitro permettent de sélectionner uniquement les composés ayant montré les meilleures caractéristiques pharmacologiques avant l’utilisation d’animaux. La quantité d’animaux utilisée a été réduite au minimum nécessaire, en limitant la quantité de ligands testés grâce à une analyse « en entonnoir ». Ainsi, le nombre d’animaux annoncé est un nombre maximum est pourra être réduit si un des radioligands testés répond à tous les paramètres étudiés. De plus, le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.
Raffinement
Concernant l'hébergement les cages sont insérées dans un portoir ventilé, permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et leurs yeux lubrifiés afin d’éviter toute sècheresse ou irritation oculaire. Les conditions d’anesthésie sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Afin de diminuer l'effort en convalescence, de aliment gélifié est placé dans les cages après chaque anesthésie (il aura été présenté en amont aux souris pour les habituer et passer l’étape de néophobie alimentaire). En fin de protocole, les souris seront placées dans une salle isolée du reste des souris pour la mise à mort et les manipulations post-euthanasies seront également réalisées dans une autre pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements (3 km) suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris utilisées sera assurée. Les greffes sont réalisées sous anesthésie gazeuse afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal. Les antalgiques ou anti-inflammatoires non stéroïdiens sont prévus et pourront être utilisés si nécessaire. Les tumeurs seront mesurées 2 fois par semaine afin de suivre leur progression et/ou l'apparition de zones de nécrose. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués.
Choix des espèces
La souris demeure un modèle de choix pour les études précliniques en oncologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme permet d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre deux et six mois. Les expériences sur adultes permettent de garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser.
Traitement de la thrombose dans l’AVC ischémique et l’embolie pulmonaire amplifié par hyperthermie locale par application de photoacoustique et l’hyperthermie magnétique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un accident vasculaire cérébral ischémique est provoqué par chirurgie en 45 minutes, puis une embolie pulmonaire est induite par cathétérisme, avant vingt minutes d'hyperthermie magnétique ou photoacoustique. 1 816 souris sont utilisées dans ces procédures, d'un niveau de souffrance sévère ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue pour prélèvements. Les effets annoncés vont de l'hémorragie aux difficultés respiratoires jusqu'à la mortalité, et la récupération est mesurée par deux tests nommés, le couloir test et le corner test. Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids sont mises à mort avant la fin du protocole, pour comparer des agents dont le porteur écrit que les performances en hyperthermie "restent encore non vérifiés".
Objectifs
Les agents thrombolytiques sont utilisés pour traiter plusieurs pathologies majeures directement liées à la formation de caillots sanguins (thrombi) tel que l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique ainsi que l’embolie pulmonaire. Il a été démontré qu’une élévation de la température fragilise la structure de ces thrombi en augmentant leur porosité, facilitant ainsi la diffusion et l’action des agents thrombolytiques. Pour induire cette hyperthermie localisée, deux approches innovantes font actuellement l’objet d’un fort intérêt : l’hyperthermie magnétique et la photoacoustique. Ces techniques reposent sur l’utilisation de particules ferreuses capables de générer une chaleur localisée grâce à leurs propriétés magnétiques. Dans ce projet des agents théranostiques optimisées pour l’hyperthermie grâce à leur excellente capacité de conversion de l’énergie en chaleur, seront comparées à un agent théranostique déjà développé au laboratoire et dont les effets théranostiques dans la thrombose sont établis, mais dont les performances en hyperthermie restent encore non vérifiés. L’objectif est d’évaluer dans quelle mesure l’hyperthermie peut potentialiser les capacités thrombolytiques de ces agents théranostiques ainsi que leur effet antioxydant. Ces approches, combinant ciblage théranostique et hyperthermie localisée, visent à améliorer l’efficacité de la thrombolyse, à réduire les effets secondaires systémiques et à diminuer la dose de thrombolytique nécessaire, offrant ainsi un potentiel thérapeutique optimisé pour la prise en charge de l’embolie pulmonaire et de l’AVC ischémique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de valider les effets de l’hyperthermie sur l’efficacité thrombolytique et antioxydant des agent théranostiques pour deux pathologies liées à la thrombose : l’AVC ischémique et l’embolie pulmonaire chez la souris SWISS, en exploitant les propriétés magnétiques des particules auxquelles les agents thrombolytiques sont fonctionnalisés. Il est attendu a ce que ces agents thérapeutiques réduisent la dose nécessaire tout en améliorant leur efficacité thérapeutique.
Procédures
Procédure chirurgicale : Induction de l'AVC ischémique (45 minutes) Cathétérisation pour l'administration des traitements et induction de l'embolie pulmonaire (quelques minutes). Tests comportementaux : couloirs test (quelques secondes a quelques minutes) corner test (2 - 10 minutes) Imagerie : 3 minutes pour les acquisitions du MPI, 15 minutes pour les acquisitions de l'IRM Hyperthermie : 20 minutes pour l'hyperthermie magnétique et 20 minutes pour le photoacoustique.
Impact sur les animaux
•Nuisances associées aux procédures chirurgicales pouvant entraîner des douleurs temporaires ou des inconforts post-opératoires : Hémorragies, douleurs post-opératoires, perte de poids de plus de 15% •Possibilité d'effets indésirables liés aux propriétés pharmacologiques des substances, tels que des hémorragies •Symptômes provoqués par l’induction des pathologies : - Embolie pulmonaire : Gasps (difficulté de respirer), mortalité - Accident vasculaire ischémique : Perte de poids de plus de 15 %, mise à mort par atteinte du point limite , troubles sensorimoteurs •Pour les procédures nécessitants une manipulation de l’animal : Stress
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures conformément aux objectifs scientifiques du projet, notamment afin de permettre la réalisation des prélèvements et des analyses nécessaires à l’étude des effets des traitements.
Remplacement
À ce jour, il n’existe pas d’autres modèles complexe permettant d’étudier de manière complète la complexité du traitement de l’embolie pulmonaire et l’AVC ischémique, tout en prenant en compte l’inflammation réelle dans ces organes, car de nombreux facteurs y sont impliqués.
Réduction
-Un test de puissance est réalisé pour limiter le nombre d’animaux utilisé tout en assurant la robustesse des résultats en se reposant sur des articles antérieurs du laboratoire utilisant ces mêmes modèles pathologiques. -Une variété de données par animal sont collectées : •Modalités IRM pour le calcul du nombre de transformation hémorragique et tailles des lésions des souris présentant un AVC ischémique •Modalités MPI pour calculer la quantité de fer proportionnel au nombre de caillots dans le modèle d’embolie pulmonaire •Organes récupérés pour marquer l’inflammation, les caillots, les particules de fer •Les études comportementales pour évaluer la récupération fonctionnelle - Les animaux sont placés sous 5% d’isoflurane 02/nO2 30/70 dans l’IRM, le MPI, les dispositifs d’hyperthermie pour faciliter la contention et ainsi réduire le stress. L’injection des différentes conditions sont réalisés à ce moment pour réduire le nombre de manipulation. - Des tests in vitro ont été réalisés pour valider l’hyperthermie des molécules utilisées ainsi que leur effet thrombolytiques
Raffinement
-Le suivi du bien être des animaux s'effectue quotidiennement par un personnel qualifié -Les animaux sont placés dans un environnement enrichi : 5 animaux par cage, matériels de nidification (cotons, paillettes) et bâtonnets de ronge. -Lors de la réception des animaux, les animaux sont habitués pendant 1 semaine pour s’imprégner de leur nouvel environnement. Du Handling sera exercé pour les habituer a la manipulation. -Lors des procédures chirurgicales, les souris seront placées sous analgésie (Buprénorphine 0.03mg/kg injecté en sous cutané 20min avant la chirurgie) et anesthésie générale (Isoflurane 2 % O2/nO2 30/70). Pour prévenir le dessèchement cornéen induit par l’anesthésie et la lampe de la loupe binoculaire, une pommade ophtalmique à base de vitamine A (Dulcis – 311 344-3) sera déposée sur les yeux. Pour le modèle d’AVC Ischémique, une anesthésie locale sera appliquée sur les barres auriculaires à l’aide de lidocaïne (EMLA 5 % : 556 936-0) afin de limiter l’inconfort lié à la fixation céphalique. De la lidocaïne en spray sera appliqué avant ouverture de la peau de la souris et avant fermeture. -Pour améliorer la récupération post-chirurgie, les souris seront réveillées sur couverture chauffante avec eau et croquette humide pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation. Les points limites définis seront pris en compte et appliqués tout au long des procédures, dans le cadre du raffinement et du suivi des animaux.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce de référence utilisée dans la littérature pour l’étude des patholo-gies cardiovasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine chez la souris sont également bien connues et, dans leurs grandes lignes, similaires à celles de l’être humain. De plus, les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont comparables chez l’homme et chez la souris. L’ensemble des connaissances disponibles au laboratoire ainsi que les données de la littérature font de cette espèce un modèle particulièrement pertinent pour l’étude de la microthrombose dans l’AVC et l’embolie pulmonaire. Le stade de développement des animaux est de 8 semaines pour un poids compris entre 35g et 40g. Nous effectuerons donc notre modèle sur des jeunes adultes. Le choix de ce stade de développement est basé sur les données de la littérature et les précédentes études réalisées au laboratoire.
Restauration de l’homéostasie énergétique centrale en cachexie cancéreuse
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Vingt et un jours d'hébergement individuel, cinq injections en cinq jours consécutifs puis une greffe de cellules tumorales : 280 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue par exsanguination sous anesthésie profonde. L'objectif est de comprendre comment des protéines des cellules immunitaires du cerveau éteignent la sensation de faim au cours d'un cancer, la perte de poids et la fonte musculaire attendues étant décrites comme les paramètres mêmes de l'étude. Le porteur justifie la souris par des interactions que ni culture cellulaire ni simulation informatique ne reproduiraient, et conclut que le recours à la souris vivante est, selon ses mots, "indispensable". Seuls des mâles entrent dans le protocole, les femelles issues des croisements étant affectées au maintien des lignées et conservées pour une seconde phase annoncée.
Objectifs
Le cancer s'accompagne fréquemment d'une perte d'appétit sévère et d'une perte de poids importante, un syndrome appelé cachexie cancéreuse. Ce syndrome touche plus de la moitié des personnes atteintes de cancer et est directement responsable de 20% des décès liés au cancer. Malgré son impact considérable sur la qualité de vie et la survie, aucun traitement efficace n'existe à ce jour. On sait que la tumeur produit des substances chimiques qui circulent dans le sang et agissent sur le cerveau pour éteindre la sensation de faim. Ces substances agissent sur une région du cerveau qui joue le rôle de chef d'orchestre de la faim et de la satiété. Dans cette région, des cellules immunitaires du cerveau semblent jouer un rôle clé en relayant les signaux de la tumeur vers les neurones qui déclenchent la sensation de faim. Quand ces cellules immunitaires sont activées par la tumeur, elles produisent des substances nocives qui inhibent les neurones de la faim. Mais le mécanisme précis par lequel cela se produit reste inconnu. Nos recherches ont identifié des protéines présentes dans ces cellules immunitaires du cerveau qui semblent contrôler leur réponse aux signaux tumoraux. En l'absence de ces protéines, les cellules immunitaires du cerveau deviennent moins agressives et produisent moins de substances nocives pour les neurones de la faim. Ce projet vise à comprendre comment ces protéines contrôlent la perte d'appétit associée au cancer, et à évaluer si agir sur elles pourrait constituer une nouvelle piste thérapeutique pour aider les personnes atteintes de cancer à maintenir leur appétit et améliorer leur qualité de vie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment les substances produites par une tumeur agissent sur les cellules immunitaires du cerveau pour éteindre la sensation de faim chez les personnes atteintes de cancer. Ces connaissances combleront une lacune majeure dans la compréhension de la perte d'appétit associée au cancer, pour laquelle aucun traitement efficace n'existe à ce jour. À plus long terme, comprendre ce mécanisme ouvrira la voie au développement de nouveaux traitements capables de restaurer l'appétit chez les personnes atteintes de cancer. Cela représente un enjeu majeur car maintenir un bon état nutritionnel améliore la tolérance aux traitements anticancéreux, réduit les complications liées à la dénutrition et améliore significativement la qualité de vie. Les découvertes réalisées dans ce projet pourraient également s'appliquer à d'autres maladies provoquant une perte d'appétit et une fonte musculaire, comme certaines maladies inflammatoires chroniques, l'insuffisance cardiaque ou le vieillissement, élargissant ainsi considérablement leur impact potentiel sur la santé humaine.
Procédures
- Injections d'une molécule permettant d'activer la modification génétique (5 fois, sur 5 jours consécutifs, durée < 30 secondes par injection) - Injection de cellules tumorales ou de solution physiologique pour les contrôles (1 fois, durée < 30 secondes) - Prélèvements sanguins (2 fois, espacés de minimum 3 semaines, durée < 2 minutes) - Évaluation de la composition corporelle et de la force musculaire (3 fois, aux jours 0, 14 et 21, durée < 2 minutes) - Pesée et mesure de la prise alimentaire quotidienne (durée < 1 minute) - Chirurgie finale sans réveil sous anesthésie et analgésie
Impact sur les animaux
Les effets attendus sur les animaux utilisés dans ce projet sont principalement liés au développement tumoral et à ses conséquences sur l'organisme, qui constituent précisément le phénomène étudié. Les souris porteuses de tumeurs pourront présenter une perte de poids progressive, une réduction de la prise alimentaire, une diminution de l'activité et une fonte musculaire au cours des 21 jours de suivi. Ces manifestations sont caractéristiques du modèle de cachexie cancéreuse et représentent les paramètres scientifiques étudiés. Le développement tumoral peut entraîner une gêne locale au site d'injection ainsi qu'un stress modéré lié à la présence de la masse tumorale. Une surveillance quotidienne de l'intégrité de la peau au site d'implantation sera assurée. Les injections répétées sur cinq jours consécutifs peuvent induire un stress modéré lié aux manipulations répétées, sans entraîner de souffrance. Les prélèvements sanguins sont des procédures brèves pouvant induire une douleur ponctuelle lors de l'introduction de l'aiguille. L'hébergement individuel pendant 21 jours peut engendrer un stress lié à l'absence de contact physique avec les autres animaux, atténué par le maintien d'un contact visuel et auditif entre les animaux grâce à des cages transparentes disposées côte à côte. Globalement les effets indésirables attendus sont modérés et feront l'objet d'un suivi clinique rigoureux. À l'issue du protocole, tous les animaux sont mis à mort sous anesthésie et analgésie pour permettre les analyses tissulaires.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin de protocole expérimental pour prélèvement et analyse des tissus, ou lors de l'atteinte des points limites afin de limiter la souffrance. La mise à mort est réalisée par exsanguination sous anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque d'une solution de fixation.
Remplacement
Les questions posées dans ce projet nécessitent d'étudier comment les cellules immunitaires du cerveau communiquent avec les neurones de la faim dans un contexte de cancer, et quelles en sont les conséquences sur le comportement alimentaire et le métabolisme de l'organisme entier. Ces phénomènes font intervenir des interactions complexes entre le système immunitaire, le cerveau et les organes périphériques qu'aucun modèle informatique ou culture cellulaire ne peut reproduire. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont de ce projet pour valider les mécanismes impliqués. Ces expériences permettent de réduire le recours à l'animal en limitant les expériences chez la souris aux seules questions qui ne peuvent pas être résolues autrement. Cependant le recours à l'animal vivant est indispensable pour plusieurs raisons. La communication entre les substances produites par la tumeur, les cellules immunitaires du cerveau et les neurones de la faim implique des interactions avec la circulation sanguine et les barrières naturelles du cerveau qui ne peuvent pas être reconstituées en dehors d'un organisme vivant. De même la mesure de la prise alimentaire, du poids et de la composition corporelle nécessite un organisme intègre. Enfin l'utilisation de souris génétiquement modifiées est la seule approche permettant de démontrer le rôle causal des protéines étudiées dans ce contexte. L'utilisation d'animaux vivants est donc indispensable et ne peut pas être remplacée par des alternatives non animales pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux prévu pour ce projet a été déterminé sur la base d'un calcul statistique rigoureux réalisé à partir de données préliminaires disponibles au laboratoire sur la prise alimentaire et le poids corporel de souris porteuses de tumeurs. Ce calcul garantit que le nombre d'animaux utilisés est suffisant pour obtenir des résultats fiables, sans être supérieur au strict nécessaire. Il indique un effectif de 15 animaux par groupe auquel un coefficient de 25% est ajouté pour tenir compte des pertes éventuelles, portant l'effectif à 20 animaux par groupe. Le projet est organisé en trois groupes d'animaux indépendants correspondant aux trois lignées de souris génétiquement modifiées étudiées, chacune avec ses propres animaux contrôles issus de la même portée. Chaque groupe comprend des animaux avec et sans tumeur, soit un total de 280 animaux sur l'ensemble du projet. Plusieurs mesures sont prises pour limiter le nombre total d'animaux utilisés. Des expériences sur cellules sont réalisées en amont pour valider les hypothèses scientifiques et limiter le recours à l'animal aux seules questions ne pouvant pas être résolues autrement. Les tissus prélevés au sacrifice sont partagés entre toutes les analyses prévues afin qu'un même animal contribue simultanément à l'ensemble des mesures sans nécessiter d'animaux supplémentaires. L'utilisation d'animaux issus de la même portée comme contrôles permet de réduire la variabilité entre les individus et donc le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Des analyses statistiques sont prévues pour comparer les résultats entre les groupes.
Raffinement
Plusieurs mesures concrètes sont mises en place pour réduire au minimum le stress et la souffrance des animaux tout au long de ce projet. Chaque animal est observé quotidiennement par du personnel formé, ce qui permet de détecter rapidement tout signe de mal-être et d'intervenir immédiatement. Des points limites stricts sont définis et appliqués sans délai dès qu'un animal présente des signes de souffrance, afin de ne pas prolonger inutilement son inconfort. Les cages sont aménagées avec des matériaux de nidification, des abris et des tubes qui permettent aux souris de se réfugier et servent également à les manipuler sans contact direct avec la main, réduisant considérablement leur stress lors des manipulations. Si des signes de perte d'appétit apparaissent, une alimentation adaptée et facilement accessible est proposée pour faciliter l'accès à la nourriture des animaux à mobilité réduite. Dans ce cas, la mesure quotidienne de la prise alimentaire n'est plus interprétable, mais l'animal reste inclus dans le suivi clinique et les analyses tissulaires terminales.. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé à la manipulation des rongeurs. Une anesthésie et une analgésie adaptées sont administrées pour la mise à mort, garantissant l'absence de souffrance. Tout au long du projet, une veille scientifique est assurée afin d'intégrer les nouvelles méthodes de raffinement disponibles et toute évolution des recommandations en matière de bien-être animal.
Choix des espèces
La cachexie cancéreuse implique des interactions complexes entre le système immunitaire, le cerveau et les organes du corps qui ne peuvent être étudiées que dans un organisme vivant entier. Les organismes plus simples comme la mouche du vinaigre ou le ver de terre ne possèdent pas de région cérébrale comparable à celle étudiée dans ce projet, ni de cellules immunitaires du cerveau équivalentes à celles de la souris et de l'homme. Ils ne permettent donc pas d'étudier la communication entre les cellules immunitaires du cerveau et les neurones de la faim dans un contexte de cancer. De plus les outils génétiques utilisés dans ce projet sont spécifiquement développés et validés chez la souris. Le recours à la souris est donc indispensable et constitue le modèle le plus pertinent scientifiquement tout en représentant le niveau de complexité biologique minimal requis pour répondre aux questions posées. L'induction de la modification génétique est réalisée à l'âge de 6 semaines, suivie d'une période de repos de 4 semaines. Les souris ont donc 10 semaines au moment de l'implantation tumorale. À cet âge leur système immunitaire et leur cerveau sont pleinement matures, ce qui garantit une réponse représentative de la situation adulte et comparable à ce qui est observé chez les personnes atteintes de cancer. Ce projet utilise initialement des souris mâles, en cohérence avec nos données préliminaires et avec les modèles de référence en cachexie cancéreuse, garantissant la comparabilité des résultats. Le cycle hormonal féminin module la prise alimentaire, le métabolisme et les réponses inflammatoires de façon cyclique, ce qui augmente la variabilité entre individus et les effectifs nécessaires. Conformément aux recommandations actuelles, cette stratégie sera étendue aux femelles dans une seconde phase du projet, après validation du mécanisme chez les mâles. Les femelles issues des croisements sont affectées au maintien des lignées (reproduction) et conservées en vue de l'extension de l'étude aux femelles prévue en seconde phase du projet.
Administration intravaginale d’une bactérie pathogène chez des souris gestantes
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Une bactérie pathogène est administrée dans le vagin de souris gestantes maintenues éveillées, au quatorzième jour et demi de gestation. 358 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, que le porteur qualifie de "Légère, non invasive". Il écrit dans le même résumé que ces femelles infectées "sont susceptibles de faire des mises-bas prématurées" et que les bactéries "ne semblent pas avoir d'incidence sur le bien être des souris". Les gestantes sont tuées vingt-quatre heures après l'infection, ne pouvant plus, selon lui, "retourner dans les zones d'élevage conventionnelles". Les 80 souris comptées comme réutilisées sont des mâles reproducteurs, que le résumé dit pouvoir servir à d'autres projets, et dit aussi tués en fin de procédure.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle d’une famille de gènes conservée entre l’Homme et la souris dans la protection de la barrière cervico-vaginale contre les infections bactériennes. Plus précisément, il s’agit de déterminer si des souris déficientes pour ces gènes ont une susceptibilité accrue à l’ascension de bactéries vaginales vers l’utérus au cours de la gestation. Le projet vise également à tester si le renforcement de la barrière cervico-vaginale permet de limiter l’ascension bactérienne et les conséquences associées.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle d’une famille de gènes dans la protection des muqueuses génitales contre les infections bactériennes, en particulier dans le contexte de la grossesse. Les résultats devraient améliorer la compréhension des liens entre la variabilité de ces gènes et les anomalies des mécanismes de défense de la muqueuse cervico-vaginale. À plus long terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à renforcer la barrière cervico-vaginale et à prévenir les infections ascendantes et leurs complications pendant la grossesse.
Procédures
Intervention / procédure : Administration intravaginale d’une bactérie pathogène (E. coli O55) sur souris gestantes vigiles. Type de manipulation : Légère, non invasive, contention temporaire pour administration intravaginale. Nombre de souris : Maximum 358 souris sur l’ensemble du projet, réparties en 17 lots expérimentaux ou moins. Durée de la procédure : Quelques minutes par souris pour la contention et l’administration intravaginale. Âge et stade : Souris sexuellement matures (>2 mois), souris gestantes au jour de gestation 14,5. Sexe : Femelles pour l’étude expérimentale ; mâles et femelles pour l'obtention des souris gestantes. Fréquence / répétition : Selon plan Go/No Go pour limiter le nombre de souris, reproduction et lots selon besoins expérimentaux. Vigilance / suivi : Surveillance quotidienne des souris pour détection de tout signe de mal-être ou phénotype dommageable. Points limites appliqués et euthanasie si nécessaire. Destin des animaux : souris gestantes euthanasiées 24 heures après l’infection expérimentale ou à la fin de l’expérience. Reproducteurs réutilisés pour l'obtention de plusieurs portées pour la procédure d'infection puis euthanasiés en fin de procédure.
Impact sur les animaux
La procédure d’infection intra-vaginale à 14,5 jours de gestation nécessite une contention (stress). Les pathogènes utilisés ont un tropisme humain. Ils sont rapidement éliminés chez la souris de type sauvage (WT) et ne semblent pas avoir d’incidence sur le bien être des souris. Les souris gestantes infectées intra-vaginalement sont susceptibles de faire des mises-bas prématurées, c’est-à-dire entre 16,5 et 18,5 jours de gestation.
Devenir
Les souris gestantes ayant reçu l’administration d’un pathogène sont euthanasiées, car elles ne peuvent plus retourner dans les zones d’élevage conventionnelles et/ou pour permettre les analyses post-mortem nécessaires (prélèvements de tissus, études inflammatoires). Les souris mâles reproducteurs peuvent être réutitlisé dans d'autres projets selon leur âge.
Remplacement
À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses sécrétoires, en particulier les interactions complexes entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles alternatifs actuellement disponibles (cultures cellulaires, organoïdes ou systèmes in vitro) ne permettent pas encore de reproduire l’ensemble des interactions physiologiques se déroulant à l’échelle de l’organisme entier, notamment les interactions entre les différents tissus, le système immunitaire et le microbiote. Par ailleurs, des considérations éthiques et réglementaires limitent naturellement les investigations mécanistiques chez l’Homme, qui reposent essentiellement sur des observations cliniques ou des analyses ex vivo. Le développement de stratégies thérapeutiques dans les pathologies associées à une altération de la barrière des muqueuses nécessite une compréhension approfondie des mécanismes biologiques impliqués et de leurs mécanismes de régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent pour l’étude de ces processus. Elle présente plusieurs avantages pour la recherche biomédicale : un système immunitaire bien caractérisé, un génome entièrement séquencé et la disponibilité de nombreuses lignées transgéniques permettant d’étudier la fonction de gènes spécifiques impliqués dans la défense des épithéliums.
Réduction
La production de souris gestantes est planifiée en fonction des besoins expérimentaux, estimés à de l’expérience acquise dans les projets précédents. Le nombre de lots et de souris/lot à utiliser ont été déterminés selon les données de la littérature et notre expérience antérieure pour garantir une analyse statistique adéquate et dresser des conclusions convaincantes.
Raffinement
Les souris sont utilisées dans des locaux agréés disposant d’un statut sanitaire « exempt de pathogènes spécifiques » (EOPS) ou A2. Les souris sont hébergées dans des cages enrichies, par groupes de 2 à 5 individus, sauf lorsque les femelles sont gestantes (souris unique), avec un accès ad libitum à une alimentation stérile de composition standardisée et à de l’eau de boisson stérile. Le personnel en charge des manipulations est formé et habilité conformément à la réglementation en vigueur. Les souris font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Les procédures réalisées dans le cadre de ce projet sont peu invasives et associées à une douleur légère. Les cages hébergeant des souris susceptibles de développer un phénotype dommageable sont clairement identifiées afin de permettre une vigilance accrue de la part des zootechniciens et du personnel scientifique. En cas d’apparition de signes cliniques évocateurs d’un phénotype dommageable, les souris sont euthanasiées.
Choix des espèces
À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale permettant d’étudier de manière intégrée les anomalies de la barrière des muqueuses et les interactions entre l’hôte et les agents pathogènes. Les modèles in vitro ou organoïdes ne reproduisent pas l’ensemble des interactions entre tissus, système immunitaire et microbiote. Les investigations chez l’Homme sont limitées pour des raisons éthiques et réglementaires. Le développement de stratégies thérapeutiques nécessite une connaissance détaillée des mécanismes biologiques et de leur régulation. Dans ce contexte, la souris constitue un modèle pertinent, grâce à son génome séquencé, son système immunitaire bien caractérisé et la conservation de nombreux gènes avec l’Homme. Les lignées transgéniques disponibles permettent d’étudier spécifiquement le rôle de gènes impliqués dans la défense des épithéliums. L’utilisation de la souris permet également de contrôler l’environnement et la variabilité génétique, assurant l’analyse reproductible des mécanismes physiopathologiques. Souris sexuellement mâtures (>2 mois) et sans phénotype dommageable (
Modèles précliniques en cancérologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées sous la peau ou injectées dans le sang avec des cellules tumorales humaines, opérées dans certains cas pour retirer la tumeur, soumises jusqu'à cinq prélèvements sanguins et à une imagerie hebdomadaire sous anesthésie, 2 875 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées pour que soient prélevés les tumeurs et les tissus d'autres organes. Une partie d'entre elles est immunodéficiente, donc exposée, écrit le porteur, à "l'infection par un large éventail d'agents pathogènes". Le laboratoire agit comme "prestataire de services" pour des laboratoires publics ou privés, et prévoit trente études précliniques en cinq ans. Il concède que ces protocoles "demandent à être améliorés", tout en disant espérer "le développement dans un futur proche de thérapies innovantes".
Objectifs
Malgré les progrès de la médecine, le cancer reste actuellement la première cause de décès en France. Dans ce contexte, nous avons pour objectif de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments innovants. La réalisation complète de ce projet permettrait sur 5 ans de mener 30 études précliniques en cancérologie.
Bénéfices attendus
En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats médicaments à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.
Procédures
Les souris devront être transplantés soit au niveau sous-cutané sous anesthésie gazeuse (1x5min), soit par injection dans la voie sanguine à l’aide d’un tube de contention adapté à ce type de procédure de manière à la rendre rapide et limiter le stress de l’animal (1x2min). Une partie des animaux recevra l’administration de candidats médicaments (douleur d’une aiguille/1-2min). Une partie des animaux subira jusqu’à 5 prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie gazeuse (5 min/souris). En fonction des conditions expérimentales, une intervention chirurgicale sous anesthésie sera nécessaire afin d’effectuer la résection de la tumeur. Enfin, le suivi du développement tumoral sera effectué soit bihebdomadairement par une mesure au pied à coulisse (contention de 2min), soit hebdomadairement par imagerie, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris). Les actes de pesée des animaux seront réalisés à minima bihebdomadaires et dureront quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont relatives : 1) aux interventions chirurgicales et aux risques d’infection liés; 2) au développement d’une tumeur sous-cutanée qui pourrait s’accompagner d’une faible gêne lors de la locomotion et plus rarement d’une perte de poids ; 3) au développement de nouvelles tumeurs secondaires (métastases), éloignées de la tumeur primaire d’origine), qui pourrait affecter le bon fonctionnement des organes envahis ; 4) aux manipulations et anesthésies (prélèvements sanguins ou imagerie) qui seront une source potentielle d’un stress de courte durée ; 5) à l’administration du traitement à évaluer (au maximum durant 4 semaines) et aux effets indésirables associés qui constitueront potentiellement jusqu’à une nuisance modérée et 6) aux souris immunodéficientes (ayant un système immunitaire non fonctionnel) qui sont sensibles à l’infection par un large éventail d’agents pathogènes.
Devenir
Afin de caractériser l'effet de nos traitements ; notamment l'effet biologique, nous devons récupérer en fin d'expérience les tumeurs des animaux traités et non traités. Nous devons pour cela procéder à l’euthanasie de l'ensemble des animaux du projet. L'étude moléculaire des tumeurs, ainsi que celles des tissus des autres organes est indispensable pour évaluer les effets anti tumoraux mais également la toxicité des traitements testés
Remplacement
Notre projet avant d’impliquer des souris, fait appel à différents modèles expérimentaux développés in vitro à partir de prélèvements tumoraux, de cultures de cellules ou d’organoides/tumoroides (modèle de mini organes simplifiés). Ces expériences permettent de sélectionner les traitements les plus prometteurs. Une telle approche permettra de réduire significativement le nombre d’animaux que nous utiliserons. Cependant, le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance tumorale. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la distribution dans l'organisme du candidat thérapeutique évalué, ni le role du système immunitaire dans la réponse anti-tumorale ou les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et qui permet en plus de faire un suivi de l’évolution du développement tumoral par des mesures cinétiques non invasives par imagerie.
Réduction
Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux tout en permettant d'obtenir un effet statistique robuste et significatif, nous avons réalisé un calcul d’effectif en utilisant d'anciennes données afin de déterminer le nombre d'animaux nécessaires. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles et la transplantation sera réalisée au niveau des 2 flancs des animaux afin de diviser par 2 le nombre d’animaux. Le projet comprend 3 étapes séquentielles et chaque étape ne sera réalisée que si la précédente aura été validée
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et une pesée à minima bihebdomadaire, par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être et de points limites prédictifs et spécifiques au projet. Les greffes, les prélèvements et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie gazeuse et sur tapis chauffant, afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance des animaux. Une analgésie per-opératoire sera appliquée lors de la chirurgie. En cas d’administration orale de traitement, lorsque possible, mise en place de protocoles d'administrations orales volontaires après apprentissage. Enfin, le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant un procédé non invasif à savoir soit des mesures au pied à coulisse, soit des acquisitions de bioluminescence par imagerie optique sous anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type d’études chez l’homme sans données précliniques solides. Le modèle murin a été choisi car certaines souches de souris possèdent un système immunitaire déficient permettant ainsi la transplantation de cellules tumorales humaines tout en maitrisant les risques de rejet de greffe. Conformément à la littérature et à nos expériences précédentes, nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 6 à 12 semaines au moment de l’injection des cellules tumorales humaines
Évaluation d’une thérapie innovante visant à corriger un déficit constitutionnel en une protéine essentielle à la régulation de la microcirculation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées sont génétiquement modifiées, le porteur indiquant qu'elles reproduisent "certaines pathologies humaines". 904 d'entre elles vont être utilisées, une partie tuée sous anesthésie sans reprendre conscience, les autres dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune reçoit une ou deux injections puis un ou deux prélèvements de sang, geste dont le porteur dit qu'il peut causer une douleur moyenne et une légère hémorragie. L'objectif annoncé est un nanocorps qui "pourrait permettre" de faire passer les perfusions des patients d'une par semaine à une toutes les deux semaines. Toutes les souris sont tuées en fin de procédure, en raison du "volume sanguin prélevé ou perdu".
Objectifs
La coagulation sanguine regroupe un ensemble de mécanismes qui permettent d’arrêter un saignement en cas de blessure, grâce à la formation d’un caillot qui colmate la brèche du vaisseau. Ce processus fait intervenir les plaquettes sanguines et de nombreuses protéines. Tout défaut dans l’un des éléments de la coagulation peut entraîner des saignements anormaux ou au contraire provoquer la formation de caillots dans les vaisseaux sanguins. La formation de tels caillots conduit à la thrombose et à l'impossibilité au sang de circuler dans le vaisseau qui est colmaté. Si les organes ne peuvent plus recevoir suffisamment de sang pour les oxygéner, ils meurent progressivement. Parmi toutes les pathologies qui peuvent conduire à ces évènements thrombotiques, l'une d'elle est provoquée par l'absence d'une protéine très importante dont le rôle est de fluidifier le sang. Les patients chez qui cette protéine est manquante sont traités par un médicament qui leur apporte cette protéine. Mais ce traitement est lourd car il doit être administré toutes les semaines par voie intra-veineuse. L’objectif de ce projet est d'administrer en même temps que la protéine manquante, un deuxième traitement par nanocorps qui va prolonger la durée d'action de cette protéine. Ce double traitement pourrait permettre d’espacer les administrations de médicaments toutes les deux semaines plutôt qu'une fois par semaine.
Bénéfices attendus
Ce projet a vocation à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'une pathologie thrombotique caractérisée par l'absence d'une protéine qui permet de fluidifier le sang. Le but est de rendre le traitement moins contraignant, facilitant ainsi l'adhésion des patients à leur traitement et améliorant leur qualité de vie.
Procédures
Les souris seront soumises sous anesthésie générale à : 1) une ou deux injections. Le nombre maximal est de 2 injections réparties sur 2 jours. Chaque injection va durer 1-2 secondes. 2) 1 ou 2 prélèvements sanguins répartis sur 14 jours au maximum. Ces prélèvements durent entre 5 et 45 secondes.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent être associées à une légère douleur transitoire, de courte durée. Le prélèvement sanguin peut être associé à une douleur moyenne et une légère hémorragie, nécessitant d'exercer un point de compression.
Devenir
En fin de procédure et en raison du volume sanguin prélevé ou perdu, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires et le constat de mort sera établi par des signes évidents de mort.
Remplacement
L’étude in vivo est nécessaire en préclinique pour évaluer un traitement. En effet, le système de la coagulation est complexe et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être étudié de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de techniques qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Les tests préalables seront faits sur du sang prélevé chez les souris d'intérêt permettant que seules 3 associations de molécules soient testées in vivo. Une dizaine de combinaisons sera produite et caractérisée in vitro et seules les combinaisons avec les profils biochimiques les plus prometteurs seront injectés aux animaux. Cela permet de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur les animaux. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne montrent pas de signes de souffrance auquel cas un calcul de score permettra de mettre en place les mesures adaptées.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d'ordre scientifique, pratique et éthique. La génétique de cette espèce est bien connue et facilite la création de modèles transgéniques. La souris est l'animal de laboratoire le plus utilisé en hémostase par la communauté scientifique internationale, ce qui permet de comparer les résultats obtenus. La méthodologie envisagée dans ce projet est adaptée au modèle murin et nous avons acquis au cours des années une expertise notable et de bonnes pratiques expérimentales avec cette espèce. Ce projet s’appuie sur des modèles murins déjà développés et dont la pertinence a été démontrée dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés permettant de reproduire certaines pathologies humaines. Des souris âgées entre 8 et 25 semaines seront utilisées pour le projet. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine, susceptible de souffrir de ces pathologies.
Rôle de la bactérie Akkermansia municiphila dans l’immunité et l’inflammation intestinale dans un modèle murin de prédisposition à la maladie de Crohn
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Tuées à l'issue pour des analyses post-mortem, 352 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles appartiennent à une lignée mise au point par une autre équipe pour reproduire certains aspects de la maladie de Crohn, et reçoivent par voie orale une bactérie intestinale cinq fois par semaine pendant trois mois, plus une injection et un prélèvement de sang. Le porteur indique que ces administrations répétées peuvent causer une douleur modérée, une gêne ou une irritation courant sur les trois mois, et une perte de poids passagère. Sur le remplacement, il décrit des organoïdes intestinaux "intéressants et prometteurs" qui ne permettent pas d'observer "l'impact du reste de l'organisme", et conclut au "besoin de travailler sur l'animal".
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’étudier l’impact d’une bactérie habituellement présente dans l’intestin, appelée Akkermansia muciniphila (ou AKK), sur l’inflammation intestinale qui caractérise la maladie de Crohn. AKK est connue pour avoir des effets bénéfiques pour l’organisme et est considérée un probiotique prometteur, son abondance est fortement diminuée lors de la maladie. Dans un 1er objectif, nous administrerons cette bactérie AKK à des souris présentant des symptômes de la maladie de Crohn et analyserons les effets sur l’immunité et l’inflammation intestinales. Dans un 2ème objectif, nous nous intéresserons aux interactions entre la bactérie AKK et certaines cellules de la membrane intestinale. Cette membrane est une barrière essentielle pour notre organisme qui permet l'absorption des nutriments et de l'eau, et assure une protection contre les agents pathogènes. De plus, certaines cellules qui la constituent jouent un rôle dans l’inflammation présente dans la maladie de Crohn. Ces deux objectifs nous permettront de mieux comprendre comment la maladie de Crohn se développe et les mécanismes mis en jeu. Ces mécanismes restent encore peu connus mais impliquent une mauvaise régulation de l’équilibre entre le malade et son microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet en santé humaine seront à court terme une meilleure connaissance des effets de la bactérie AKK sur l’intestin, l’identification de ses bienfaits dans des conditions où l’intestin est très inflammé, et la compréhension de ses interactions avec l’organisme. Ces bénéfices pourront s’appliquer à large échelle puisque le nombre de patients atteints de maladie inflammatoire de l’intestin comme la maladie de Crohn ne cesse d’augmenter dans le monde et aucun traitement efficace n’existe à ce jour. A moyen terme, ce projet permettra de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour la prise en charge de cette maladie.
Procédures
Chaque animal sera soumis aux gestes suivants : - Administration orale (5 fois/semaine pendant 3 mois, 3 minutes par geste) - 1 injection (1 fois, 3 minutes) - Prélèvement de sang (1 fois, 5 minutes)
Impact sur les animaux
L’administration des antibiotiques peut conduire à un inconfort intestinal. L'injection pourra entraîner une douleur et un stress légers de courte durée. Les administrations orales pourront entraîner un stress de manipulation, une douleur modérée et une gêne ou irritation courant sur les trois mois de durée du projet. Une perte de poids passagère peut se produire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Il existe des modèles intéressants et prometteurs en 3 dimensions (que l’on appelle organoïdes intestinaux) qui reproduisent les structures de la membrane de l’intestin, qui constitue une barrière cruciale entre l’environnement et le corps, et qui permettent d’étudier les interactions entre l’intestin d’un hôte et sa flore bactérienne. A ce jour, ces modèles peuvent donner des informations préliminaires mais ils ne permettent pas d’observer l’impact du reste de l’organisme : la circulation sanguine, le système immunitaire, les autres organes de la digestion. Or ces différents éléments jouent un rôle très important dans la physiologie de l’organisme mais aussi dans les maladies, et ne peuvent être reproduites totalement in vitro pour le moment. Nous avons donc besoin de travailler sur l’animal pour mieux comprendre les mécanismes responsables du développement des pathologies intestinales et les causes à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Les effectifs ont été estimés à l’aide d’un test statistique pour obtenir un nombre minimum d’individus tout en permettant d’obtenir des résultats statistiques significatifs. Afin de limiter le nombre d’animaux, les prélèvements de tissus seront utilisés dans différents types d’expériences prévues pour ce projet.
Raffinement
Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie. Afin de réduire au maximum la douleur et l’angoisse que certaines procédures pourraient engendrer chez les animaux, des étapes d’entraînement des animaux ont été prévues, une surveillance accrue sera mise en place, des protocoles d’anesthésie et analgésie ont été définis. Pour traiter les impacts indésirables, une surveillance intensive sera réalisée, des points limites précoces ont été spécifiés, un suivi de poids quotidien et la mise en place d’une grille d’évaluation de l’animal seront réalisés et un régime alimentaire adapté sera fourni. Des critères d’arrêt de souffrance ont été définis.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. Afin de tester la capacité de la bactérie AKK présente dans le microbiote intestinal à réduire ou prévenir l’inflammation intestinale (son abondance est fortement réduite chez les patients atteints de la maladie de Crohn qui développent une inflammation chronique de l’intestin), nous utiliserons un modèle préalablement développé dans cette espèce par une autre équipe récapitulant certains aspects de la pathologie humaine. De plus, nous combinerons ce modèle avec un autre modèle de souris afin d’analyser les communications entre cette bactérie et les cellules de la membrane de l’intestin et de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu. Nos travaux précédents ont montré que l’inflammation modérée dans le modèle de prédisposition génétique à la maladie de Crohn que nous utilisons se produit à l’âge adulte, progressivement, entre 3 et 6 mois. Dans le but de tester si la bactérie peut prévenir le développement de cette inflammation, des animaux âgés de 3 à 6 mois seront utilisés. De plus, les expériences visant à tester si l’exposition à la bactérie peut améliorer l’inflammation lorsque qu’elle est présente, des animaux âgés de 6 à 9 mois seront utilisés. Nous utiliserons les animaux des 2 sexes pour ce projet.
Bioélectronique pour la neurocardiologie dans un modèle porcin : diagnostique et thérapeutique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Un infarctus du myocarde est provoqué chez 48 cochons sous guidage par rayons X, pendant deux heures, une fois par individu. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère ou menées sous anesthésie sans réveil, tous tués à l'issue, et le porteur chiffre entre 10 et 20 % le risque de décès pendant la chirurgie par fibrillation ventriculaire. Deux IRM de deux heures, trois cartographies de contact, des stimulations nerveuses qui peuvent provoquer des spasmes musculaires involontaires et jusqu'à huit prélèvements sanguins s'ajoutent pour les individus du groupe chronique, portés de 25 à 60 kg entre le début et la fin du protocole. La cicatrice cardiaque est annoncée "non douloureuse", quand l'ouverture du thorax pour prélever le cœur est classée en "douleur intense (palier 3)", geste par lequel le projet se termine.
Objectifs
4 à 5 millions de décès seraient attribuables chaque année à la mort subite cardiaque, qui est principalement la conséquence des infarctus du myocarde (70%). Dans ces pathologies, l’action du système nerveux favoriserait la survenue des troubles du rythme cardiaque (arythmies). Bien que ces affections représentent un problème majeur de santé publique, les traitements actuels restent à ce jour insuffisants, et/ou associés à des effets secondaires. Aussi, le blocage de l’activité nerveuse (ou neuromodulation) qui a déjà fait ses preuves dans le traitement des douleurs chroniques semble être une piste thérapeutique prometteuse. Le projet vise ici à 1) mieux comprendre le rôle du système nerveux (autonome) dans l’émergence et le maintien des troubles du rythme, et à 2) valider les nouveaux dispositifs implantables et nouvelles approches de neuromodulation à visée thérapeutique, dans un modèle de gros mammifère.
Bénéfices attendus
A long terme, ce projet contribuera à la mise au point et à la validation des capteurs et des modulateurs implantables chez le patient, capables de détecter les anomalies qui précèdent la survenue des troubles du rythme, et d’agir en conséquence sur le système nerveux, pour prévenir la mort subite cardiaque.
Procédures
Un infarctus du myocarde sera induit chez les animaux (2h, une fois par animal), de manière guidée par rayon X (fluoroscopie), qui génèrera une cicatrice non douloureuse dans le muscle. Les animaux du modèle chronique seront aussi concernés par la pose d’un boitier de suivi ECG (1h, 1 fois par animal) pour monitorer l’activité cardiaque chez l’animal éveillé, après la création de l’infarctus. Avant, pendant et après l’induction de l’infarctus, les activités cardiaques et nerveuses seront étudiées par des procédures non invasives et mini-invasives utilisées en clinique, sous anesthésie générale, avec l’administration d’une procédure antidouleur adaptée. Les animaux seront concernés par : - un IRM 1.5T (2h par examen, 2 fois par animal du modèle chronique), - de la cartographie de contact (1h30 par examen, 3 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu) - un monitoring de la pression cardiaque (toute la durée de l’expérience sous anesthésie, 3 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu), - une stimulation cardiaque programmée (environ 1h, 2 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu), - une stimulation bloquant l’activité nerveuse (1h, 2 fois par animal des modèles chroniques, 1 fois par animal du modèle aigu), - un prélèvement de sang dans le sinus coronaire (environ 10 min, 4 fois par animal des modèles chroniques, et 2 fois pour le modèle aigu) - un prélèvement de sang systémique (environ 5 min, 4 fois pour chaque animal des modèles chroniques et 2 fois par modèle aigu) - une coronarographie 3D (30-45 min, 2 fois par animal des modèles chroniques et 1 fois par animal du modèle aigüe). - des prélèvements tissulaires (30 min par prélèvement, 1 fois par animal)
Impact sur les animaux
Les animaux seront mis à jeûn à minima 12h avant l’opération. La création du modèle d’infarctus provoquera la mise en place d’une cicatrice cardiaque non douloureuse. La chirurgie nécessitera l’introduction de cathéters dans les veines/artères, ce qui pourra provoquer une douleur légère et des saignements au moment de leur pose et de leur retrait. Les anesthésies générales peuvent impacter légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou un état léthargique transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasive (IRM) ou mini-invasive (cartographie de l’activité électrique cardiaque : cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters (douleur légère et saignement) : au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments), au niveau de la veine fémorale et de l’introduction sous le sternum (guide pour la cartographie). La création d’infarctus et les procédures de cartographie de contact peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire. La stimulation des ganglions nerveux peut provoquer des spasmes musculaires involontaires. Le positionnement du stimulateur sur les ganglions sera rectifié jusqu’à la disparition des spasmes. Le prélèvement du cœur après la mise à mort requiert une ouverture du thorax préalable chez l’animal endormi, soit un acte chirurgical provoquant une douleur intense (palier 3). Une analgésie proportionnelle à l’intensité de la douleur (légère versus intense) sera mise en place.
Devenir
Dans le but de mieux comprendre et caractériser le rôle du système nerveux dans le déclenchement et le maintien des troubles du rythme associés aux infarctus, les cœurs seront prélevés pour cartographier l’activité électrique et ainsi obtenir des données complémentaires à celles enregistrées chez l’animal vivant.
Remplacement
Compte tenu de la visée thérapeutique du projet, les données récoltées nécessitent un modèle proche du patient, et donc l’utilisation de gros mammifère. D’autre part, agir sur la relation système nerveux-cœur implique de l’étudier dans son contexte naturel car cette relation fait appel à des réflexes qui s’établissent de manière complexes à l’intérieur du corps, et passe aussi par la sécrétion de molécules dans la circulation sanguine qui seront dosées. Aujourd’hui, il n’existe pas d’alternative non animale qui permette de reproduire ce degré de complexité et cette ressemblance, ce qui exclue la possibilité de remplacer les animaux. Les résultats obtenus dans ce projet permettront cependant d’enrichir la base de données pour créer des modèles informatiques de cœurs pathologiques grâce à la modélisation, et ainsi à terme de limiter l’utilisation de l’expérimentation animale.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux, plusieurs méthodes d’analyses seront mises en œuvre afin d’obtenir le maximum de données expérimentales dans ce projet tels que l’IRM, les mesures de l’activité cardiaque (électrique, capacité de contraction, etc…). Les animaux ont été répartis en 4 groupes de 12 individus, soient les animaux contrôles reproduisant la procédure mais sans obstruction des vaisseaux, commun pour les 3 modèles d’infarctus (les infarctus dits reperfusés pour lesquelles l’obstruction du vaisseau est transitoire, les infarctus reperfusés pendant que l’activité neuronale liée au cœur est abolie, et les infarctus dits non reperfusés pour lesquels le blocage d’un vaisseau est définitif). L’utilisation de protocoles expérimentaux identiques permettra également de comparer les groupes entre eux, et ainsi de réduire le nombre d’animaux. L’étude sera pratiquée selon un suivi longitudinal (c’est-à-dire au cours du temps, en plusieurs étapes successives) chez chaque animal, de manière à faire correspondre les paramètres obtenus de leur vivant avant et après l’infarctus, et après avoir prélevé le cœur chez tous les individus. La taille des groupes envisagée est aussi le résultat de précédentes expérimentations menées au laboratoire sur le même modèle animal, pour lesquelles il a été constaté que ce nombre était suffisant pour faire valoir des différences statistiques, lorsque les effets observés ne sont pas dus au hasard. La taille de cette cohorte prend également en compte un risque de perte (10-20%) lié à la procédure chirurgicale, pour laquelle des fibrillations ventriculaires peuvent survenir, induisant le décès de l’animal. Les paramètres mathématiques des données (moyennes, percentiles, écarts standards à la moyenne) seront analysés afin de déterminer le test statistique adéquat à appliquer en suivant.
Raffinement
La prise en compte du bien-être animal s’effectue à plusieurs niveaux. La création des modèles et les expérimentations seront réalisées sous anesthésie générale selon des protocoles approuvés, et avec des procédures analgésiques adaptées à la douleur générée par les gestes chirurgicaux pratiqués. Les constantes de l’animal (fréquence cardiaque, pression artérielle, fréquence respiratoire, etc…) seront suivies par du personnel compétent tout au long de la procédure expérimentale, et les doses d’anesthésiques/analgésiques seront adaptées si des signes de réveil/souffrance étaient observés. Quand les anesthésies générales sont suivies d’un réveil, les animaux recevront un traitement médicamenteux de telle sorte que la douleur post-opératoire soit prise en charge, et leur état de santé général sera surveillé. Si le comportement de l’animal suggère un état de souffrance, un examen vétérinaire sera pratiqué, et sera suivi d’une prise de médicament si nécessaire, ou dans les cas les plus sévères et non traitables, de l’euthanasie. Les animaux bénéficieront de soins quotidiens pratiqués par une équipe de spécialistes compétents. L’hébergement est agréé, les locaux sont entretenus, et les cochons seront regroupés de telle sorte qu’ils pourront exprimer des comportements sociaux naturels, tout en disposant de distractions (Kong, balles, jouets en caoutchouc durs mastiquables …).
Choix des espèces
Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le porc a été retenu car (i) une très grande expérience des équipes de recherche sur la création du modèle d’infarctus avec cette espèce (ii) ce modèle animal est bien décrit et caractérisé et constitue donc une référence dans la communauté scientifique ; (iii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle animal ; (iv) il est déjà utilisé par les autres équipes que regroupe le projet, et permettra la mutualisation des données obtenues. Les animaux seront inclus de telle sort qu’ils disposeront à la fois de caractéristiques fonctionnelles proches de celles de l’Homme, et que leur prise de poids (environ 1 kg / jour) soit cohérente avec une prise en charge adaptée lors de l’expérimentation terminale du modèle chronique. Les cochons des groupes chroniques (infarctus définitifs, infarctus reperfusés, cochons contrôles : groupes 1, 2a et 3 respectivement) seront donc inclus en phase (1) – acquisition des données de base- à 25 kg (1-2 mois), pour peser 25 kg (2-3 mois) lors de la phase (2) – création du modèle- et 60 kg (3-4 mois) lors de la phase (3) – remodelage dû à la lésion-. Pour correspondre aux poids de la phase (2), les animaux prévus pour le groupe d’ischémie reperfusion sous inhibition des ganglions rachidiens (groupe 2b) utilisés uniquement en protocole terminal (c’est-à-dire anesthésie sans réveil) seront inclus à 25 kg, d’âge 2-3 mois.
Etude de l’élimination de cellules immunitaires résidentes du muscle strié squelettique en conditions physiologiques et pathologiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Le plafond annoncé est d'une anesthésie gazeuse par jour pendant deux semaines. 744 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour les prélèvements de tissus. Elles reçoivent jusqu'à douze injections intrapéritonéales ou sous-cutanées, et selon les groupes douze séances d'exercice musculaire en trois semaines, une lésion musculaire provoquée, ou douze microlésions intramusculaires par jour pendant deux semaines, l'objectif étant de supprimer les macrophages du muscle et d'observer ce qui suit. Sur l'effectif, le porteur écrit que "l'analyse statistique permet de définir le nombre d'animaux nécessaires minimum pour chaque expérience", sans donner ni ce calcul ni ce nombre, et résume les atteintes en une ligne sur le stress de la contention.
Objectifs
Les tissus renferment des cellules immunitaires résidentes dont les macrophages. Leur rôle n'est pas connu dans le muscle strié squelettique. Pour identifier ce ou ces rôles, l'approche utilisée dans le projet est d'éliminer ces cellules dans le tissu musculaire à l'aide d'un modèle de souris transgénique adapté, et d'évaluer les conséquences sur la stabilité physiologique et la fonction musculaires. Trois types de conditions seront étudiées : l'état basal, une condition physiologique d'exercice, une condition de lésion musculaire et une condition pathologique de maladie musculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de définir le rôle des macrophages résidents du muscle strié squelettique dans toutes les conditions physiologiques et pathologiques. Cela pourra permettre ultérieurement d'identifier de potentielles voies d'action pour améliorer l'état du muscle, normal ou malade.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales ou sous-cutanées (12 injections maximum). Certains seront soumis soit à un protocole d'exercice musculaire pendant 5 min, maximum 12 séances en 3 semaines, soit à un protocole de dommage musculaire (5 min en une fois), soit à des microlésions intramusculaires pendant 2 semaines (12 microlésions par jour). Tous protocoles utilisent l'anesthésie générale. Les nuisances attendues de ce projet incluent : un stress lors de la contention pour les injections vigiles et un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie. Le maximum d'anesthésies est une anesthésie gazeuse quotidienne pendant 2 semaines.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont un stress lors de la contention lors des injections ou le déplacement dans la boite d'anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en vue des prélèvements tissulaires pour les analyses biologiques.
Remplacement
Les cellules étudiées (macrophages) sont incrustées au sein du muscle. Si on veut étudier leur rôle sur l'équilibre du tissu (homéostasie), on doit rester au niveau de l'organe et de l'organisme entier. Le projet apportera la preuve de concept de l'utilité des macrophages dans la régulation de l'équilibre du muscle dans les différentes conditions physiologiques et pathologiques, qu'il est impossible de mimer in vitro.
Réduction
La réduction est réalisée selon plusieurs principes : 1) l'analyse statistique permet de définir le nombre d'animaux nécessaires minimum pour chaque expérience; 2) nous utilisons un système de banque de tissu permettant leur réutilisation évitant le recours à de nouveaux animaux; 3) trois Go/Nogo sont établis dans le protocole.
Raffinement
Le raffinement se fait sur le site d'injection, et l'appareil pour mesurer la force musculaire, induire la lésion musculaire et l'exercice est complètement non-invasif. Les souris sont anesthésiées lors de procédures durant plus de 20 secondes. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
La souris présente un système musculaire proche de celui de l'homme. Les animaux sont des animaux adultes, dont le développement est terminé, des deux sexes.
Effets des rayonnements sur l’ovaire : stabilité génétique des ovocytes, altérations du tissu ovarien et infertilité
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Un groupe reçoit vingt-cinq séances d'irradiation en cinq semaines, un autre une irradiation unique suivie de deux injections hormonales puis d'un prélèvement d'ovocytes, un troisième une irradiation puis une mise en accouplement. 528 souris vont être utilisées dans ce projet sur la fertilité après radiothérapie, toutes tuées pour l'analyse des ovaires et des ovocytes, y compris des souriceaux de moins de huit jours. Le projet est déclaré en souffrance légère, alors que le porteur écrit lui-même que les procédures "peuvent entraîner des nuisances légères à modérées" et qu'une altération de l'état général peut survenir sous irradiations répétées. Il écrit aussi qu'"Aucun analgésie systématique n'est prévue", au motif que les expériences antérieures n'avaient pas montré de signes de douleur.
Objectifs
La fertilité féminine peut être altérée par des expositions aux rayonnements, en particulier lors de traitements médicaux comme la radiothérapie. Les cellules des ovaires, indispensables à la reproduction, sont très sensibles à ces expositions. Des dommages à l’ADN des ovocytes, cellules reproductrices féminines, peuvent compromettre leur survie, leur qualité et, à plus long terme, la fertilité ainsi que la santé de la descendance. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre comment les irradiations affectent l’ovaire, en s’intéressant à deux aspects complémentaires. Le premier concerne la stabilité génétique des ovocytes : le projet cherche à déterminer si les ovocytes exposés aux rayonnements peuvent survivre avec des anomalies génétiques susceptibles d’être transmises. Il s’agit notamment de comprendre si la sensibilité aux rayonnements dépend du stade de développement des ovocytes. Le second aspect concerne les effets à long terme des irradiations répétées sur le tissu des ovaires dans son ensemble, en particulier l’apparition de phénomènes chroniques tels que l’inflammation locale, les altérations du tissu de soutien et la perte progressive de la fonction des ovaires. Enfin, le projet vise à explorer si certaines approches peuvent limiter ces effets délétères et contribuer à préserver la fonction des ovaires après exposition aux rayonnements.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur la manière dont l’ovaire et les ovocytes réagissent aux rayonnements. Il apportera des informations nouvelles sur les mécanismes pouvant conduire à une infertilité après exposition aux rayonnements, ainsi que sur les risques potentiels de modifications génétiques associées. À plus long terme, les résultats obtenus pourront contribuer à une meilleure évaluation des risques liés aux irradiations chez les femmes exposées dans un contexte médical. Ces connaissances pourront aider à améliorer les stratégies de préservation de la fertilité féminine, mieux informer sur les conséquences à long terme de traitements visant les ovaires, et à orienter le développement d’approches visant à protéger ou restaurer la fonction des ovaires.
Procédures
Certaines souris recevront une irradiation unique à faible dose d’une durée d’environ une minute, suivie d’une période de récupération, puis d’une mise en accouplement. D’autres animaux recevront une irradiation unique suivie de deux injections hormonales effectuées en 30 secondes chacune, sur une courte période afin de stimuler l’ovulation, avant un prélèvement des ovocytes en fin de procédure. Enfin, un troisième groupe sera exposé à des irradiations répétées (25 sessions d’environ 20 secondes) à faible dose sur cinq semaines afin d’étudier les effets chroniques sur l’ovaire, avec ou sans traitement destiné à limiter ces effets. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière tout au long de la durée des études. La durée d’implication des animaux varie selon les groupes, allant de quelques jours à plusieurs semaines.
Impact sur les animaux
Les procédures prévues peuvent entraîner des nuisances légères à modérées. Les principales nuisances attendues sont liées au stress des manipulations et de la contention, notamment lors des irradiations, des injections ou des mises en accouplement. Après irradiation, certains animaux peuvent présenter une fatigue transitoire, une baisse d’activité ou une légère perte de poids, généralement de courte durée. Les injections répétées peuvent être associées à un stress ponctuel et à un inconfort léger. Dans le cadre des irradiations répétées à faible dose, une altération de l’état général peut survenir chez certains animaux, nécessitant une surveillance renforcée pendant la procédure. Ces effets sont suivis attentivement afin de détecter toute souffrance et de mettre en place rapidement des mesures adaptées, pouvant aller jusqu’à une interruption anticipée de l’étude si nécessaire.
Devenir
Dans ce projet, les animaux sont euthanasiés au cours ou à la fin des études, car les objectifs scientifiques nécessitent l’analyse directe des ovaires, des ovocytes ou des tissus associés. Ces analyses permettent d’évaluer la stabilité génétique des cellules reproductrices, les anomalies génétiques, ainsi que les altérations chroniques du tissu des ovaires induites par les irradiations.
Remplacement
Avant le recours à l’expérimentation animale, des études in vitro et ex vivo ont été menées afin de mieux comprendre les effets des rayonnements sur les ovocytes et le tissu des ovaires. Ces approches ont permis d’identifier les paramètres clés à étudier, de tester des hypothèses initiales et d’exclure certaines conditions expérimentales. Ceci, contribue ainsi à réduire le nombre d’expériences in vivo aux seules situations ne pouvant pas être évaluées hors de l’organisme : l’étude des effets à long terme des irradiations sur la fertilité et la transmission génétique. L’utilisation d’un modèle animal est indispensable pour répondre aux objectifs spécifiques de ce projet, tout en étant limitée aux paramètres qui ne peuvent être étudiés par des approches alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base d’expériences préliminaires et de données issues de la littérature, afin d’obtenir des résultats interprétables tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Chaque animal est utilisé de manière optimale, notamment par l’exploitation des deux ovaires pour plusieurs analyses.
Raffinement
Le projet intègre des mesures visant à limiter le stress et l’inconfort des animaux tout au long de leur vie. Les procédures sont réalisées avec des manipulations courtes et adaptées. Une surveillance régulière est mise en place, associée à des points limites précoces et à une prise en charge adaptée en cas de signes d’altération du bien-être. Aucun analgésie systématique n’est prévue car les procédures d’irradiation à ces doses ainsi que les injections intrapéritonéales n’ont pas montré, lors d’expériences antérieures, l’induction de signes évocateurs de douleur chez les animaux. Les procédures sont interrompues si une souffrance excessive est observée.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle expérimental car son fonctionnement ovarien et les mécanismes de réparation de l’ADN des ovocytes sont bien caractérisés et comparables à ceux de l’être humain. Ce modèle permet d’étudier la fertilité, la transmission génétique et les effets à long terme des irradiations dans un cadre expérimental contrôlé. Deux stades seront utilisés. Des jeunes adultes femelles (8 à 10 semaines) : À cet âge, les souris ont atteint leur maturité sexuelle et présentent une fonction de reproduction stable. Elles constituent donc le modèle de référence pour évaluer l'effet des rayonnements sur la fertilité. Des souriceaux de moins de 8 jours après la naissance : Les analyses sont réalisées durant les premiers jours de vie, car les paramètres étudiés (information génétique) sont présents dès ce stade du développement.
PFAS dans les écosystèmes terrestres : exposition, bioaccumulation et transfert trophique, un focus sur les petits mammifères et leurs prédateurs
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Capturés au piège sur des sols contaminés, maintenus quelques heures dans le dispositif, identifiés, sexés et pesés éveillés, 120 mulots et campagnols sont ensuite anesthésiés pour une prise de sang, dans une procédure menée sous anesthésie générale, et tués avant tout réveil. Le résumé annonce par ailleurs 60 musaraignes tuées sous anesthésie sans prise de sang, alors qu'il les décrit ailleurs comme "non inclues dans la procédure" et que l'effectif déclaré s'arrête à 120 rongeurs. Un quart de cet effectif est constitué de femelles gestantes et un quart de juvéniles sevrés, ce que le porteur justifie par le manque de données sur le transfert placentaire de ces polluants. Il retient ces espèces parce qu'elles sont "communes, abondantes, relativement ubiquistes", qu'elles "ne sont pas protégées ni menacées" et qu'elles figurent en préoccupation mineure sur les listes rouges.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de mieux comprendre comment les composés per- et polyfluoroalkylés aussi appelés sous leur abréviation « PFAS » ou nommés « polluants éternels », contaminent et impactent les milieux terrestres. Il s’agit d’une une famille de polluants chimiques dont certaines molécules sont très persistantes, peuvent s’accumuler dans l’organisme, et sont toxiques. Leur présence dans l’environnement entraîne des contaminations qui soulèvent des préoccupations grandissantes pour la santé humaine et la biodiversité. Le projet vise à apporter un éclairage scientifique pour mieux comprendre et évaluer le risque de ces pollutions à travers l’étude de la faune sauvage. L’étude permettra d’apporter des connaissances sur l’écodynamique (étude des processus de transfert, de transformation, de dégradation et de rémanence des composés chimiques) et l’écotoxicité (étude des mécanismes d’exposition des organismes, de toxicité pour le vivant et des conséquences écologiques) des polluants per- et polyfluoroalkylés dans les écosystèmes terrestres. Il s’agira notamment de mieux caractériser le devenir des polluants dans l’environnement et leurs transferts dans les chaînes alimentaires ainsi que l’exposition des prédateurs. Des petits mammifères sauvages (rongeurs : mulots, campagnols, et insectivores : musaraignes) seront étudiées comme espèces sentinelles. Le projet s’appuie sur des travaux sur le terrain, il sera mené dans des zones où des études antérieures ont mis en évidence des contaminations des sols. La contamination des animaux sera mesurée pour renseigner quels facteurs déterminent leur exposition aux polluants et apporter des connaissances sur la manière dont les polluants s’accumulent dans leur organisme. Des mesures seront réalisées pour évaluer l’état de santé des animaux, en étudiant leurs réponses physiologiques et le fonctionnement de leur système immunitaire. Les données alimenteront une évaluation du risque pour les écosystèmes en s’appuyant sur des valeurs de référence disponibles pour les sols et sur des seuils connus de toxicité des polluants étudiés. Ces différentes analyses permettront de documenter les niveaux de contamination de la faune sauvage, d’affiner les seuils de toxicité, et d’identifier quels prélèvements sont les plus pertinents pour mettre en place des suivis de surveillance de la pollution et des outils de bioindication pour la gestion des sites et sols pollués.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur l’exposition de la faune sauvage, l’accumulation au sein des organismes et les transferts des polluants per- et polyfluoroalkylés dans les chaines alimentaires dans les écosystèmes terrestres. Les données permettront de documenter la toxicité des polluants per- et polyfluoroalkylés et d’apporter des informations pour le développement de valeurs toxicologiques de référence. Le projet participera à alimenter l’évaluation du risque environnemental lié aux polluants per- et polyfluoroalkylés. Le projet est innovant par le fait d’étudier les polluants per- et polyfluoroalkylés dans les écosystèmes terrestres, en région urbaine et péri-urbaine, sur des sites où les sols présentent un gradient de contamination. Les écosystèmes aquatiques ont majoritairement été étudiés jusqu’à présent. Le projet vise à étudie des cocktails polluants per- et polyfluoroalkylés, en analysant plusieurs dizaines de composés, alors que les connaissances sont actuellement focalisées sur 3 molécules principalement. Ce projet permettra un nouvel apport de connaissances pour développer des méthodes de surveillance et de suivi de la pollution dans l’environnement.
Procédures
Les animaux seront capturés in natura et maintenus en captivité quelques heures dans les dispositifs de piégeage. Chacun des individus est identifié à l’espèce, sexé et pesé avant d’être inclus dans les procédures expérimentales ou relâché in situ sur son site de capture. Cette étape est menée sur animaux vigiles, elle dure 3 à 5 minutes à partir de la sortie du piège. Le nombre exact d’individus concernés ne peut être affirmé car il dépend des succès de piégeage, il devrait concerner a minima les 120 individus prévus dans la procédure expérimentale, mais pourrait être inférieur selon l’abondances des espèces sauvages sur les sites étudiés et le succès de capture. Une prise de sang sera menée sous anesthésie générale chez les rongeurs le jour de la capture. Ceci sera réalisé par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé pour une prise de sang est de l’ordre de 1 à 2 minutes. À l’issue des prises de sang et toujours sous anesthésie générale, les rongeurs seront mis à mort sous anesthésie générale par un personnel qualifié. Les musaraignes (60 individus) seront mises à mort par un personnel qualifié sous anesthésie générale sans prise de sang préalable.
Impact sur les animaux
Au cours des expérimentations, les animaux peuvent ressentir un stress transitoire lié à la capture, à la contention et à la manipulation. La manipulation est potentiellement cause de douleur en cas d’incident pendant la contention (lorsque l’animal tente de s’échapper, de mordre, etc). La durée est transitoire sur les quelques minutes de manipulation. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie. Dans de rares cas, la prise de sang peut entraîner un écoulement sanguin anormal. Cet écoulement dure quelques secondes à quelques minutes et il est enrayé très rapidement. Les protocoles et méthodes employés dans les procédures permettent d’empêcher ou limiter les nuisances et effets indésirables, tel que décrit dans les procédures et les mesures de raffinement.
Devenir
Dans le cadre de cette expérience, aucune mesure de remplacement ne permet d’éviter la mise à mort des animaux pour atteindre les objectifs scientifiques des programmes de recherche, programmes dont les objectifs ont été validés par des comités scientifiques. La mise à mort des animaux est nécessaire dans cette procédure car le prélèvement des organes internes est incontournable et justifié scientifiquement.
Remplacement
Le projet vise spécifiquement la faune sauvage dans son milieu naturel et s’emploie à étudier son exposition aux polluants dans des conditions environnementales réalistes et représentatives. Le remplacement total n’est donc pas envisageable. Les objectifs du projet reposent sur l’étude de l’accumulation des polluants dans les organismes et des réponses physiologiques des animaux associées à cette exposition. Les besoins de connaissances sur la faune sauvage nécessitent d’étudier directement les espèces concernées, et les méthodes non animales ou ex vivo ne permettent pas, en tout cas actuellement, de reproduire ou prédire les niveaux d’exposition observés dans des contextes écologiques réalistes, ni les variations interindividuelles liées aux caractéristiques biologiques et au régime alimentaire des animaux. L’emploi de méthodes alternatives non-invasives uniquement n’est pas envisageable dans le présent projet pour atteindre les objectifs scientifiques recherchés. En revanche, une partie du projet vise également à évaluer la pertinence de prélèvements peu invasifs comme le sang et les poils pour le suivi de l’exposition aux polluants chez les mammifères. Cette approche pourra contribuer au développement de méthodes de suivi de la pollution et de ses impacts dans l’environnement de façon moins invasives et réduire le recours à des prélèvements internes dans de futurs travaux.
Réduction
Des études existantes ont été analysées en amont afin de faire l’état des lieux des connaissances actuelles et pour guider la stratégie d’échantillonnage et affiner les hypothèses. Les effectifs souhaités pour ce projet sont définis pour viser un effectif le plus faible possible en termes d’individus étudiés par groupe d’espèces, par site de capture, par classe d’âge et sexe, au regard des besoins de puissance statistique pour des données valider la robustesse des données, la qualité des résultats et détecter des effets biologiquement pertinents. La procédure est prévue sur 120 individus. Les animaux étudiés dans ce projet permettront de regrouper les prélèvements et d’alimenter des bases de données dans la perspective de futurs programmes de recherche. Cette étude alimentera nos banques d’échantillons.
Raffinement
Les captures sont menées à l’aide de pièges non-vulnérants équipés de compartiments dortoirs contenant litière et nourriture. Les pièges sont relevés quotidiennement. En cas de conditions météorologiques extrêmes, les captures sont suspendues. Les manipulations et la contention sont réduites au minimum et conduites dans le respect des bonnes pratiques par du personnel expérimenté. La majeure partie de la manipulation et l’ensemble de la procédure est réalisée sous anesthésie générale sans réveil de bout en bout, leur durée s’élève à seulement quelques minutes. La prise de sang chez les rongeurs est réalisée en mettant en œuvre des mesures de raffinement : le prélèvement est mené sous anesthésie, le geste est réalisé par des personnels compétents. Les animaux sont mis à mort sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les espèces sont Apodemus sylvaticus (Mulot sylvestre), Apodemus flavicollis (Mulot à collier), Myodes glareolus (Campagnol roussâtre), Microtus arvalis (Campagnol des champs), Microtus agrestis (Campagnol agreste). Des musaraignes Crocidura russula (Crocidure musette) et Sorex araneus (Musaraigne carrelet), non inclues dans la procédure, seront aussi étudiées. Elles sont largement répandues dans les écosystèmes européens et ces espèces sont communes, abondantes, relativement ubiquistes. Ces espèces ne sont pas protégées ni menacées. Elles présentent un statut de conservation « préoccupation mineure » sur les listes rouges mondiale, européenne, nationale et régionale (région Auvergne Rhône-Alpes). Leur aire de répartition couvre une bonne partie du continent et du territoire métropolitain français. Les micromammifères jouent un rôle écologique considérable dans les écosystèmes terrestres et constituent des hôtes et vecteurs majeurs de contaminants chimiques et biologiques. Fréquemment utilisés comme espèces modèles en écologie et écotoxicologie, ce sont des espèces sentinelles et ils permettent de relier les résultats obtenus aux connaissances sur les espèces de rongeurs de laboratoire. Pour cette étude, les individus adultes constituent l’essentiel de l’effectif. Des juvéniles sevrés ayant atteint l’autonomie seront inclus, à hauteur de 25% de l’effectif. Des femelles en gestation seront inclues, à hauteur de 25% de l’effectif. Ce choix est guidé par des raisons scientifiques mais également en visant à réduire au maximum l’effectif de juvéniles et de femelles gestantes inclus dans la procédure. Les connaissances sont lacunaires sur l’accumulation et les effets sexe- et âge-spécifiques des polluants per- et polyfluoroalkylés, ce qui nécessite d’étudier l’influence de ces variables biologiques. Le transfert embryonnaire et placentaire des polluants per- et polyfluoroalkylés a été avérée dans des études récentes mais il reste encore un manque de connaissance important car ce phénomène est documenté pour peu de composés per- et polyfluoroalkylés (principalement deux parmi les centaines existant) et avec peu d’informations sur l’embryon précoce.
Étude du développement du cancer colorectal chez la souris à partir de tissus tumoraux murins et humains
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Toutes tuées pour que leurs organes soient récupérés et analysés, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des polypes colorectaux, murins ou humains, leur sont implantés par chirurgie sous anesthésie gazeuse au niveau du rein ou dans l'abdomen, suivis de cinq prélèvements sanguins hebdomadaires. Le porteur écrit que le rein porteur de l'implant "n'assurera plus son rôle habituel, mais l'autre rein prendra le relais pour maintenir le bon fonctionnement de l'organisme", et décrit deux à quatre semaines plus tard des douleurs au rein ou à l'abdomen, une perte de poids, des tremblements et des difficultés à se déplacer dues au volume de la tumeur. Une partie des souris a le système immunitaire affaibli pour accepter les tumeurs humaines, l'autre le garde intact.
Objectifs
Le cancer colorectal est la deuxième cause de mortalité liée au cancer en France, avec environ 17 000 décès par an. Il se développe souvent à partir de polypes bénins (une petite excroissance dans le côlon), mais seuls certains évoluent en cancer, en raison d’une grande variabilité biologique encore mal comprise. Pour mieux comprendre l’évolution de ce cancer et tester de nouvelles thérapies, des modèles expérimentaux chez la souris sont indispensables. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre pourquoi certains polypes deviennent cancéreux. Pour cela, des polypes colorectaux seront implantés chez la souris afin d’observer leur capacité à former des tumeurs et d’étudier le rôle de leur environnement. Deux méthodes d’implantation seront utilisées (au niveau du rein ou dans l’abdomen), reconnues pour leur reproductibilité et leur fiabilité. Les expériences seront menées sur différents types de souris afin de reproduire diverses situations. Cette approche permettra de mieux comprendre les mécanismes précoces du cancer colorectal et d’améliorer, à terme, l’évaluation du risque. Ce projet contribuera au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques
Bénéfices attendus
Nous souhaitons comprendre le rôle de tout ce qui entoure la tumeur, appelé microenvironnement : ce sont les cellules, les tissus et les molécules autour du polype, qui peuvent aider ou freiner son développement. Grâce à cette étude, nous espérons découvrir ce qui se passe au tout début de la maladie et peut-être trouver des indicateurs biologiques qui permettraient de mieux diagnostiquer ou de suivre le cancer du côlon chez l’homme.
Procédures
Les animaux subiront une intervention chirurgicale pour la transplantation de polypes au niveau du rein ou dans l’abdomen. Les actes s’effectueront sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésie (moins de 25 minutes). Au total, 5 prélèvements sanguins seront réalisés une fois par semaine pendant toute la durée de la procédure. Les différents gestes seront compris entre 20 et 90 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir un stress temporaire lors de leur manipulation et de l’anesthésie. Après l’intervention chirurgicale, une douleur passagère peut apparaître, comme après toute opération, avec un faible risque de complications locales (irritation ou infection de la zone opérée). Les effets sur les animaux peuvent évoluer avec le temps : 1 à 2 semaines après la chirurgie : Les animaux peuvent présenter de petits changements liés à la croissance de la tumeur, comme une légère baisse d’activité, un pelage un peu moins entretenu ou une gêne très discrète dans leurs déplacements. Dans le cas d’une implantation réalisée au niveau du rein, ce dernier n’assurera plus son rôle habituel, mais l’autre rein prendra le relais pour maintenir le bon fonctionnement de l’organisme. 2 à 4 semaines après l’implantation : Lorsque la tumeur est plus volumineuse, les effets peuvent devenir plus visibles : douleurs au niveau du rein ou de l’abdomen, perte de poids, diminution importante de l’activité. Les animaux peuvent aussi présenter des tremblements, un pelage négligé et des difficultés à se déplacer en raison du volume de la tumeur.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et les organes d’intérêts seront récupérés pour pouvoir les analyser.
Remplacement
Ce projet vise à évaluer la capacité des polypes (une petite excroissance dans le côlon) à former des tumeurs, afin de mieux comprendre comment débute le cancer colorectal. Pour étudier ces mécanismes, il est nécessaire que l’on s’appuie sur des animaux, qui nous permettent d’étudier toutes les interactions des tumeurs avec le reste de l’organisme. Les souris utilisées dans ce projet reproduisent de manière fidèle les premières étapes de la formation des tumeurs intestinales. À ce jour, aucun modèle en laboratoire, comme les cultures de cellules, ne permet de reconstituer toutes les composantes d’un tissu vivant dans son intégralité. C’est pourquoi l’utilisation de ces animaux reste indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées dans ce projet.
Réduction
Nous avons choisi le nombre minimum de souris nécessaire pour obtenir des résultats fiables, en nous appuyant sur des données scientifiques et des méthodes statistiques. Nous mettrons en œuvre en priorité la première méthode, dont la mise au point est plus simple. Si celle-ci permet d’atteindre les objectifs du projet, la seconde méthode ne sera pas réalisée, ce qui permettra de réduire le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous avons mis en place toutes les mesures nécessaires pour assurer le bien-être des animaux. Leur état sera vérifié chaque jour, et les procédures seront réalisées sous anesthésie et analgésie pour éviter la douleur et réduire le stress. Les animaux seront maintenus au chaud jusqu’à leur réveil après la chirurgie. Nous surveillerons attentivement tout signe de malaise. En cas de problème, des actions rapides seront mises en place pour soulager l’animal, comme une alimentation plus facile à consommer, des améliorations de l’environnement ou l’administration d’antidouleurs en complément si besoin.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l’utilisation de la souris qui est proche de l’humain sur le plan physiologique. Pour mener ces recherches, deux types de souris sont utilisés de façon complémentaire. Des souris au système immunitaire intact sont nécessaires pour comprendre comment les défenses naturelles de l’organisme influencent le développement des tumeurs. En parallèle, des souris dont le système immunitaire est affaibli sont indispensables pour pouvoir étudier des tumeurs humaines implantées chez l’animal. L’association de ces deux approches permet de mieux comparer les situations et d’obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe chez l’être humain. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 2 à 3 mois, lorsqu'ils auront atteint leur maturité physiologique et immunitaire, ainsi qu'un poids minimal de 20 g.