Recherche fondamentale

Les souris utilisées appartiennent à une lignée qui développe spontanément une maladie auto-immune détruisant les glandes salivaires et lacrymales, et sont réparties par âge, à 4, 12 et 20 semaines, pour couvrir les stades de la maladie. 960 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse. Chacune subit une biopsie du bout de la queue, un tatouage d'identification, un prélèvement de sang à la veine faciale que le porteur décrit lui-même comme modérément douloureux, et jusqu'à six injections. La contrepartie annoncée tient en une phrase, de nouveaux outils thérapeutiques pour une maladie sans remède, et le dimensionnement des groupes en une autre, une "étude statistique adaptée" dont rien n'est précisé.

Objectifs

Nous étudions une maladie auto-immune chronique caractérisée par la destruction des glandes exocrines. Environ 0,5% de la population totale est atteinte et souffre de sécheresse buccale et oculaire et jusqu'à présent, il n'y a pas de remède pour celle maladie. Cela amène à la nécessité d'explorer d'autres domaines dans la compréhension de la maladie. Le rôle des molécules antimicrobiennes émerge dans le domaine de l'auto-immunité. Ces molécules constituent un groupe de petites molécules largement exprimés pour la défense contre les micro-organismes. Des études récentes révèlent que ces molécules régulent également les réponses immunitaires. Les molécules anti-microbiennes sont très exprimées dans les glandes salivaires. Notre objectif général est de déterminer le rôle de molécules anti-microbiennes dans les glandes exocrines lors du développement de l'auto-immunité dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Notre projet fournira de nouveaux outils thérapeutiques pour prévenir ou guérir un syndrome auto-immun.

Procédures

* Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. * Prélèvement de sang : une fois par animal,, 2-3 secondes. * Injection : entre 1 et 6 injections, 2-3 secondes.

Impact sur les animaux

- Biopsie pointe de la queue (douleur légère de quelques secondes), -Tatouage d'identification (douleur légère de quelques secondes), -Injections (douleur légère de quelques secondes), Prélèvement sang à la veine faciale (douleur modérée de quelques secondes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse.

Remplacement

Pour étudier la physiopathologie des maladies auto-immunes, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de ces maladies et notamment les interactions entre le microbiote intestinal, le système immunitaire et le tissu cible. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentation bien menée sur les plans scientifiques et méthodologiques.

Réduction

Les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée.

Raffinement

-nombre d’individus par cage : un nombre suffisant sera défini pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique.Tout animal qui aura une valeur totale comprise entre 1 et 3 dans les différents points limites recevra un analgésique (Ketoprofen, dose 5mg/kg, volume 0,012ml/g; SC).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. De plus il existe des modèles bien établis de maladies auto-immunes. Les souris NOR seront de 3 âges différents (4, 12, 20 semaines) correspondant aux différents stades de développement de la maladie. Les souris C57BL/6 Tcfcp2L1-Cre-ERT X Slpi-flox seront utilisées à l'âge adulte >8 semaines.

Toutes tuées pour des analyses tissulaires, 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un infarctus leur est provoqué par une chirurgie de trente minutes, qui détruit une partie du muscle du ventricule gauche. Suivent trois échographies cardiaques, une injection pendant l'opération, puis deux injections par jour pendant les 72 heures suivantes. Le porteur annonce un bénéfice au conditionnel, un traitement qui pourrait stabiliser la fonction cardiaque après un infarctus, et affirme que les méthodes sans animaux sont "insuffisantes" pour reproduire les interactions entre organes.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires constituent la principale cause de mortalité à l'échelle mondiale, représentant un enjeu majeur pour les systèmes de santé. La réparation cardiaque post-ischémique, un processus biologique complexe, est un facteur pronostique déterminant suite à une crise cardiaque. L'amélioration de ce processus est cruciale pour prévenir l'évolution vers l'insuffisance cardiaque et optimiser le pronostic des patients. Dans ce contexte, le projet vise à évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique. Celle-ci repose sur la libération contrôlée d'une petite molécule. Cette molécule présente des effets multiples, ciblant notamment les cellules contractiles et les cellules inflammatoires, et agit en réduisant l'accumulation délétère du fer dans le tissu cardiaque. Les objectifs de ce projet sont donc doublement définis :1/Caractériser les effets de cette nouvelle approche thérapeutique sur la réparation cardiaque post-infarctus chez la souris et 2/Élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ce contexte thérapeutique.

Bénéfices attendus

L’enjeu de ce projet est d'améliorer la récupération du cœur après un infarctus et de prévenir l'insuffisance cardiaque, maladie grave. La cible est l'accumulation de fer toxique qui endommage le tissu cardiaque après une crise. Le bénéfice principal attendu est la réduction des dommages et l'amélioration de la réparation cardiaque grâce à une nouvelle molécule qui piège le fer. Une nouvelle molécule encapsulée dans un système de micro-capsules pour une action plus longue et plus ciblée sera testée. Si cette approche est validée, elle pourrait offrir aux patients un traitement plus efficace pour stabiliser la fonction cardiaque et obtenir un meilleur pronostic après un infarctus.

Procédures

Chirurgie - durée 30 minutes // Une echocardiographie - Durée 15 minutes // 3 échographies cardiaques/souris // Une injection au moment de la chirurgie - durée 1 min// Une injection pré-opératoire et deux injections par jour pendant 72 heures post-opératoire - durée 1 min.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront les nuisances suivantes : 1/ Inconfort lié à la contention des animaux. 2/ Stress lié à l'anesthésie et mobilité transitoirement réduite. 3/ Les chirurgies peuvent causer des douleurs modérées post opératoires transitoires. Les infarctus du myocarde vont entraîner la mort d’une partie du tissu cardiaque ventriculaire gauche.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour analyses tissulaires de l'efficacité du traitement.

Remplacement

Le projet est axé sur l'étude de la réparation cardiaque post-infarctus. L'utilisation de modèles animaux est indispensable car ce processus implique une physiopathologie intégrée (changements structurels et fonctionnels du cœur entier), une réponse inflammatoire systémique et la pharmacocinétique complexe de l'agent thérapeutique dans différents organes. Les méthodes cellulaires ou alternatives sont insuffisantes pour reproduire ces interactions multi-organes, le flux sanguin, la distribution du médicament et l'évaluation globale et dynamique de la fonction cardiaque. De plus, l'utilisation de ces modèles pré-cliniques est un préalable nécessaire à la validation de toute stratégie thérapeutique future visant à améliorer la prise en charge des patients souffrant d'une crise cardiaque.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste par l'utilisation de calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par l’utilisation de protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptées et l’établissement de points limites stricts et adaptés.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle préclinique privilégié pour l'étude de l’efficacité d’une nouvelle approche thérapeutique, en particulier après un infarctus du myocarde. Ce modèle est idéal pour plusieurs raisons : 1.La souris est le modèle standard et le plus pertinent pour l'étude de la réparation cardiaque après un infarctus, permettant une comparabilité avec les données historiques et de la littérature. 2.Reproductibilité et Surveillance : L'utilisation de la souris garantit une homogénéité et une robustesse des résultats expérimentaux. De plus, elle offre la possibilité de surveiller l'évolution des complications cardiaques dans un délai de temps pertinent. 3.Complexité Biologique : Contrairement aux modèles cellulaires ou alternatifs, la souris permet d'étudier l'intégralité des interactions locales et systémiques impliquées dans la réparation cardiaque après un infarctus. 4. Stade de développement adulte. Cela rend le modèle hautement pertinent pour simuler les conditions physiopathologiques humaines et évaluer des thérapies visant la réparation ou l'amélioration du remodelage cardiaque dans un contexte clinique.

Pour tester des molécules censées protéger le cœur pendant une chimiothérapie anticancéreuse, 600 souris reçoivent une greffe de cellules tumorales puis de la doxorubicine, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin du protocole, le porteur jugeant "indispensables" les prélèvements de cœur, de tumeur, de foie et de reins. Aux injections quotidiennes pendant quatre semaines s'ajoute une échocardiographie sous anesthésie toutes les deux semaines, avec un risque de nécrose au site d'injection, d'intolérance à l'effort et d'hypothermie au réveil. Trois seuils déclenchent la mise à mort avant terme, la perte de poids, la taille de la tumeur et la détresse respiratoire.

Objectifs

La cardio-oncologie connait actuellement un essor grandissant au regard du problème de santé publique. En effet, ceci est dû au vieillissement de la population, l’augmentation de cas de cancer et la mise sur le marché de nouvelles molécules anticancéreuses. La doxorubicine (dox) fait partie des agents de chimiothérapies les plus utilisés dans le traitement des tumeurs solides comme le cancer du sein. Cependant son utilisation clinique est limitée due à sa cardiotoxicité qui peut conduire à l’insuffisance cardiaque (IC). Actuellement il existe une seule molécule cardioprotectrice dont l’utilisation reste limitée pour cause d’effets secondaires importants. L’objectif général scientifique de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à la cardiotoxicité afin de proposer une molécule à la fois cardioprotectrice, n’interférant pas avec le pouvoir antitumoral de la dox et idéalement l’amplifierait. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier de nouvelles molécules permettant de protéger le cœur lors d’une chimiothérapie anti-cancéreuse. L’effet de chaque molécule sera étudié à la fois sur le cœur et sur la tumeur, afin de s’assurer que l’efficacité antitumorale n’est pas altérée. L’ensemble du projet contribuera ainsi à proposer une nouvelle stratégie cardioprotectrice lors de l’utilisation de chimiothérapies couramment utilisées dans le traitement du cancer, améliorant ainsi la prise en charge du patient et ses chances de survie.

Procédures

Les animaux suivront plusieurs types d’interventions : une injection unique de cellules tumorales sous anesthésie (durée environ 1 minute) ; des injections journalières pendant 4 semaines (durée environ 10 secondes chacune, sur animal vigile). Une échocardiographie sous anesthésie sera réalisée une fois toute les deux semaines (10 minutes chacune). L'ensemble des interventions auront lieu dans l'établissement utilisateur 1. Seule l'isolation des cellules primaires en intervention terminale et la mise à mort réglementaire des animaux se fera dans l'établissement utilisateur 2.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront présenter une gêne transitoire liée à l’injection tumorale (apparition d’une masse localisée), une légère perte de poids ou une baisse d’activité liées aux traitements, ainsi qu’un stress ponctuel lors des manipulations répétées. De rares effets cardiovasculaires (intolérance à l’effort, respiration plus rapide) pourront survenir avec la doxorubicine ainsi qu’une nécrose localisée au niveau du site d’injection. Les anesthésies nécessaires aux échocardiographies peuvent entraîner une récupération lente ou une hypothermie passagère.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de protocole car les prélèvements d’organes (cœur, tumeur, foie, reins) sont indispensables à l’évaluation de la toxicité cardiaque et de l’efficacité antitumorale.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle murin est indispensable pour étudier l’interaction entre la chimiothérapie et la fonction cardiaque dans un organisme complet. Les modèles in vitro ou sur organoïdes ne permettent pas de reproduire la complexité des réponses métaboliques et circulatoires impliquées dans la cardiotoxicité et la croissance tumorale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables tout en respectant la variabilité biologique et sans compromettre les résultats scientifiques attendus. Les groupes expérimentaux ont été optimisés afin de partager les animaux pour plusieurs types d’analyses et d’éviter les répétitions inutiles.

Raffinement

Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé, afin de réduire la durée et le stress des interventions. Les injections de cellules tumorales sont effectuées sous anesthésie, les échocardiographies sous anesthésie légère avec maintien thermique, et les animaux font l’objet d’un suivi clinique quotidien. Les points limites (perte de poids, taille tumorale, détresse respiratoire) ont été clairement définis pour éviter toute souffrance prolongée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera effectué à pied (moins de 10 minutes), à l’écart du public, dans les cages de transport sécurisées. Les cages seront placées dans des sacs spécifiquement conçus pour garantir l’obscurité et l’isolement des stimuli extérieurs. Cette procédure vise à réduire au maximum le stress des animaux pendant le déplacement.

Choix des espèces

L’espèce souris a été choisie car elle représente le modèle mammifère le plus couramment utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude du cancer du sein et de la cardiotoxicité induite par la doxorubicine. Sa physiologie cardiovasculaire et ses réponses tumorales sont bien décrites et transposables à l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), correspondant à un stade physiologique stable et adapté aux procédures de greffe et de traitement.

Opérées une première fois pour recevoir une injection de virus dans le cerveau, puis une seconde pour une implantation d'une à deux heures, 4 330 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des coupes de cerveau. Pendant quatre semaines, elles subissent jusqu'à deux séances quotidiennes d'enregistrement électrophysiologique d'une heure, la tête maintenue immobile. Le projet porte sur la façon dont le cortex traite les informations tactiles captées par les vibrisses. Le porteur qualifie la tâche comportementale de "totalement non douloureuse et non stressante" tout en listant une douleur aiguë après la chirurgie d'implantation, un risque d'infection lié aux implants et un stress dû à la contention de la tête.

Objectifs

Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau perçoit le toucher et localise les objets dans l’espace. Pour cela, nous utilisons les vibrisses très sensibles des souris, qui leur servent à explorer leur environnement, comme nos mains. Nous pensons que certaines zones du cerveau intègrent différentes informations pour adapter la perception tactile selon la situation. Pour tester cette idée, nous observerons l’activité des neurones grâce à l’imagerie et à des enregistrements électriques chez des souris entraînées à effectuer des tâches tactiles. Nous utiliserons aussi des techniques pour activer ou désactiver certains neurones de manière ciblée. Ces recherches pourraient aider à mieux comprendre et traiter certains troubles sensoriels, comme ceux observés dans l’autisme ou chez les personnes amputées. Le projet se déroule dans deux EU.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une compréhension approfondie des mécanismes cellulaires et des circuits corticaux impliqués dans la perception tactile. Il visera à identifier les contributions spécifiques de différentes populations neuronales — excitatrices, inhibitrices et cholinergiques — ainsi que des systèmes neuromodulateurs dans le traitement de l’information sensorielle. L’étude mettra en évidence la manière dont le cortex somatosensoriel adapte ses calculs en fonction du contexte et des exigences de la tâche, tout en apportant de nouvelles connaissances sur la maturation des circuits corticaux durant les premiers jours de vie. Ceci représentera des nouvelles pistes pour comprendre les hallucinations tactiles : Par exemple, les sensations fantômes chez les amputés ou certains troubles de la perception dans la schizophrénie. Ciblage de circuits spécifiques pour la neuromodulation : À terme, cela pourrait appuyer le développement de traitements personnalisés par stimulation cérébrale ou thérapies ciblées

Procédures

EU1/2 Procédure chirurgicale pour injection de virus : Fréquence: 1 chirurgie par animal, durée: entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : Fréquence: 1 chirurgie par animal, durée: entre 1H et 2H EU2/2 Électrophysiologie in vivo sur animal 1H pendant 4 semaines (2 sessions maximum par jour par animal)

Impact sur les animaux

Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte

Devenir

Mise à mort pour prélèvement et réalisation de tranches aigues pour l'electrophysiologie ou pour la microscopie

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : l’attention tactile. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions les mécanismes neuronaux qui sont engagés au moment précis de l’attention. Le projet ne peut donc se faire que sur des animaux vivants éveillés. Cependant, la tâche comportementale est totalement non douloureuse et non stressante, et la chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées dont le niveau de souffrance est contrôlé pharmacologiquement. La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en oeuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique appropriée

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (matériel de nidification et tunnels) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires à l'échelle comportementale. Les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris largement transférables à l’homme. Les injections de virus seront réalisées sur des animaux de 0 semaine à 6 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux de de plus de 5 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.

392 souris vont être utilisées, chacune subissant une chirurgie du cerveau de vingt à trente minutes pour l'injection d'un vecteur viral, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles reçoit ensuite cinq injections de cocaïne en sept jours, puis passe des tests comportementaux que le RNT ne nomme pas. Toutes sont tuées pour des prélèvements post-mortem. Le bénéfice avancé se limite à une meilleure compréhension des bases moléculaires de l'addiction, quand la perte de poids, la douleur et l'hypothermie liées à la chirurgie du cerveau sont, elles, décrites comme attendues.

Objectifs

L’addiction à la cocaïne est un enjeu majeur de santé publique. A ce jour, il n’existe aucun traitement ayant reçu l’approbation des agences de santé. Un enjeu majeur de la recherche est l’identification de marqueurs biologiques spécifiques de l’addiction. Au moyen d’un modèle rongeur pertinent, nous avons identifié de tels des marqueurs au niveau moléculaire. Pour comprendre comment ces marqueurs contribuent à un comportement d'addiction, nous mettons en œuvre un projet qui vise à manipuler ces marqueurs et d’en étudier les conséquences moléculaires et comportementales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont une meilleure compréhension des bases moléculaires des mécanismes addictifs de la cocaïne. Ces travaux entrent dans le cadre de la recherche sur les mécanismes neurobiologiques de l’addiction à la cocaïne, une des rares addictions, à ce jour, à ne pas bénéficier de thérapies approuvées.

Procédures

Les animaux du projet seront soumis à une chirurgie pour l’injection d’un vecteur viral. La chirurgie cérébrale dure 20 à 30 minutes, sous anesthésie gazeuse, sous antalgique et sur couverture chauffante. La récupération post-opératoire prend environ 60 minutes. Une partie des animaux recevra également 5 injections de cocaïne de faible dose, une par jour au plus, sur une période de 7 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie cérébrale : une perte de poids modérée, un accroissement temporaire de la mobilité, une douleur modérée, une légère hypothermie, dans des conditions où toutes les mesures sont prises pour réduire douleur, hypothermie (couverture chauffante) et risque d’infections (asepsie, anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, suivi post-opératoires), ainsi que les nuisances associées à la piqûre d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale de cocaïne / saline qui entraine une douleur légère de courte durée. Enfin, de façon générale, les nuisances peuvent être celles associées aux manipulations réalisées lors des études comportementale qui ne génèrent pas de douleur mais peuvent initialement, par leur caractère nouveau, engendrer stress et inconfort rapidement éteints par la répétitivité, mais aussi prévenus par une habituation répétée à la manipulation et à l’expérimentateur.

Devenir

A l'issue des deux procédures, les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem d'échantillons biologiques pour analyse.

Remplacement

Le comportement d’addiction met en jeu des mécanismes psychopharmacologiques complexes qui ne peuvent pas être appréhendés par des modèles ex vivo. C’est par des modèles comportementaux complexes que nous avons pu identifier des marqueurs moléculaires spécifiques d’une prise mal-adaptée de drogue. Dans la continuité, seul le modèle animal permet d’étudier les bases moléculaires et cellulaires cérébrales sous-jacentes.

Réduction

L'utilisation d'un trop grand nombre d'animaux est contraire à l'éthique, mais si trop peu d'animaux sont utilisés, l'expérience peut manquer de puissance statistique et se révélée vaine donc non éthique. Nous procédons à des analyses de puissance statistique afin de déterminer le nombre adapté de sujets qui permettra d’affirmer que le résultat statistique obtenu est fiable.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cycle inversé. Le comportement des animaux est étudié alors qu’ils sont actifs (animaux nocturnes) et leur phase de sommeil est ainsi respectée. Ils sont hébergés collectivement dans des cages transparentes. L’environnement est enrichi par des carrés de cellulose favorisant la construction de nids. Les paramètres environnementaux sont contrôlés en permanence. Les animaux sont observés une fois par jour, week-ends compris. Les animaux sont pris en main de façon appropriée pour éviter la sensation stressante du vide. Les animaux sont habitués aux manipulations. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale et sur couverture chauffante. La douleur post-opératoire est gérée avec les molécules antalgiques et anti-inflammatoires les plus adaptées. Les périodes post-opératoires font l’objet d’un suivi spécifique et d’un traitement antalgique/anti-inflammatoire. Un vétérinaire est présent dans la structure et est sollicité quand la situation le requiert.

Choix des espèces

Compte tenu des questions que nous posons, il est nécessaire d’utiliser une espèce mammifère dont le développement des réseaux neuronaux permet l’expression d’un comportement aussi complexe que la prise de drogue. Or il a été montré un continuum entre les mécanismes psychologiques et biologiques des processus de récompense entre le rongeur et l’homme, et ces processus sont à la base des mécanismes étudiés dans ce projet. Nous utilisons ici des souris génétiquement modifiées adaptées aux questions posées.

Soumises à deux chirurgies à une semaine d'intervalle pour ligaturer une carotide et les artères rénales, puis à quatre à six mois d'eau salée destinée à faire monter leur pression artérielle, 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont toutes tuées par perfusion à la fin du traitement, pour des analyses histologiques des vaisseaux du cerveau. Pour 72 d'entre elles, un gène est invalidé par une injection pratiquée aux premier, deuxième et troisième jours de vie. Le porteur écrit n'avoir jamais constaté de souffrance liée à une hémorragie intracrânienne, son modèle ne provoquant pas la rupture des anévrismes qu'il fait apparaître.

Objectifs

L'anévrisme intracrânien (AIC) est une anomalie cérébrovasculaire fréquente et généralement asymptomatique affectant environ 3 % de la population générale. L'AIC se caractérise par une dilatation localisée et un amincissement de la paroi des artères intracrâniennes, le plus souvent au niveau des bifurcations artérielles du réseau sanguin artériel cérébral. La complication dévastatrice de l'AIC est sa rupture et l'hémorragie cérébrale qui en résulte, mortelle dans la moitié des cas ou laissant des séquelles neurologiques majeures. Il n'existe malheureusement aucun outil de diagnostic pour prédire la formation ou le devenir d'un AIC chez un individu donné. Les traitements actuels sont invasifs, chirurgical ou endovasculaire, avec un risque significatif de morbidité procédurale. A ce jour, la prise en charge des patients atteints d'AIC reste donc extrêmement difficile et controversée. Les facteurs de risque tels que l'hypertension, l'augmentation de l'âge, le tabagisme, la consommation excessive d'alcool, les antécédents familiaux d'AIC mais également le sexe féminin, prédisposent à la formation et à la rupture de l'AIC. De par son caractère multifactoriel, la mise en place de modèles expérimentaux in vivo mimant l’AIC est essentielle pour mieux comprendre sa formation, son développement et sa rupture.

Bénéfices attendus

La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie cérébrale dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Le projet pour lequel cette saisine est déposée nous permettra donc, (i)d'identifier le rôle potentiel de différentes mutations dans la formation des anévrismes (ii) de répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'AIC. En identifiant les mécanismes par lesquels certaines mutations favorisent la formation des anévrismes dans les artères cérébrales, ce projet devrait permettre de découvrir des cibles pharmacologiques potentielles pertinentes pour prévenir la progression de la maladie et diminuer le risque de rupture, mais également de découvrir de potentiels marqueurs biologiques pour suivre l'évolution des AIC et en prédire la rupture. (iii) de découvrir de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'AIC est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Faciliter le diagnostic et le pronostic et ainsi offrir une perspective de traitement pharmacologique sont de véritables enjeux pour une meilleure prise en charge de ces patients.

Procédures

Modèle d'anévrisme intracrânien effectué sur 136 souris : 2 chirurgies à 1 semaine d'intervalle pour ligature des artères carotide et rénales puis traitement en eau de boisson par ajout d'une solution saline pendant 4 à 6 mois. Chaque chirurgie dure entre 15 et 30 minutes. Perfusion de 136 souris (procédure terminale: la totalité du protocole de perfusion dure environ 20 minutes) Mesures de la pression artérielle pour un suivi longitudinal (basal, milieu de traitement et fin de traitement) sur 120 souris porteuses de mutation. Chaque cycle de mesures dure entre 20 et 30 minutes. Injections pour invalidation d'un gène (1 injection/jour pendant 3 jours: durée 30 secondes)

Impact sur les animaux

La présence d’un anévrisme intracrânien est, la plupart du temps, asymptomatique, ce qui en rend difficile sa détection, de surcroît chez la souris. La rupture d’un anévrisme, quant à elle, est imprévisible et brutale, suivie dans 50% des cas par un coma voire une mort subite. Les symptômes de la rupture sont consécutifs à l’hémorragie intracrânienne qu’elle occasionne. Leur intensité dépend de l’ampleur et de la localisation de l’hémorragie. Notre modèle d’AIC n’est pas un modèle de rupture. Par conséquent, nous n’avons jamais constaté de nuisances ou de souffrance en lien avec la survenue d’une hémorragie intracrânienne. Une perte de poids transitoire est observée les 2 jours suivant chacune des chirurgies. Le retour au poids initial se fait en 2 à 3 jours post-chirurgie. Les souris sont surveillées 2 à 3 fois/jour/3jours en post-opératoire avec injections d'anti-douleur et d’anti-inflammatoire. Ces injections nécessitent une contention pouvant potentiellement stresser l’animal. Pour chacune des chirurgies réalisées, des incisions des plans cutanés et musculaires sont nécessaires. La cicatrisation des points est donc à surveiller pour éviter toute infection. Enfin, le suivi de pression artérielle est réalisé sur souris vigile. Cette étape pouvant stresser l’animal, une période d’acclimatation d’1 semaine est nécessaire pour l’obtention de mesures fiables et reproductibles.

Devenir

Les animaux seront mis à mort après les 4 à 6 mois de traitement hypertenseur pour prélèvements en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

La pathologie anévrismale met en jeu différents compartiments cellulaires (cellules inflammatoires, endothéliales, musculaires lisses) et intègre plusieurs paramètres anatomiques (structure de la paroi et géométrie des vaisseaux) et systémiques (pression artérielle, vieillissement). Il n’existe malheureusement pas, à ce jour, d’approche expérimentale in vitro, ex vivo ou in silico apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques nécessaires pour statuer sur l’implication des différentes mutations étudiées dans cette pathologie. C’est pourquoi le recours au modèle animal est indispensable et ne peut se substituer à un autre modèle.

Réduction

Le modèle d’AIC est un modèle connu pour avoir environ 10% de mortalité, péri-opératoire essentiellement. De par notre expertise, nous avons pu améliorer ce protocole et dans nos mains, la mortalité péri-opératoire est quasi-nulle (moins de 1%). Quand ce sera possible, nous envisageons l’étude de 2 gènes en parallèle. Dans ce cas, le groupe contrôle servira pour les 2 gènes étudiés, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cette approche nous permettra également d’identifier « in vivo », dans la pathologie anévrismale, si oui ou non le gène étudié est pertinent. En fonction des résultats obtenus, nous saurons s’il est pertinent de poursuivre l’étude de cette mutation dans un nouveau projet ou non.

Raffinement

Les souris, stabulées en conditions normales d’hébergement, seront au nombre de 3 à 5 par cage, avec accès à volonté à la nourriture et à la boisson. Durant les 3 premières semaines du protocole, les souris seront surveillées plusieurs fois par jour pour pouvoir identifier, au plus tôt, une souffrance de l’animal et mettre en place les mesures nécessaires pour limiter ce stress ou cette douleur. De plus, toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale avec utilisation d'analgésiques adéquats dès que nécessaire.

Choix des espèces

Pour le système cérébro-vasculaire, il est fondamental d’étudier ces anomalies sur l’animal entier, soumis à l’ensemble des systèmes régulateurs, de façon parfaitement intégrée. A ce jour, il n’existe pas d’approche expérimentale apportant le même degré et la même qualité d’informations scientifiques ne faisant pas appel à l’expérimentation animale. De plus, la souris est un animal chez lequel les manipulations génétiques permettent la création de modèles de maladie humaine, en particulier de maladies des petits vaisseaux cérébraux. Nous choisissons donc de travailler sur la souris, cette dernière nous permettant plus facilement de mettre en œuvre l’étude des gènes identifiés en amont. Les souris seront toutes utilisées à l’âge adulte. Ces dernières étant traitées au maximum pendant 6 mois, le début des expérimentations commencera quand les souris seront âgées entre 10 et 12 semaines. Sur les 136 souris, si les modèles retenus sont des modèles conditionnels, 72 souris (soit 3 mutations maximum) devront alors être invalidées de façon précoce pour le gène candidat dans un territoire donné, par une injection à la naissance d'une solution aux jours 1, 2 et 3 de vie des animaux.

84 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour l'examen de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec jusqu'à deux chirurgies du cerveau d'une heure et trois IRM d'une heure sous anesthésie par animal. La première opération crée une lésion du cortex moteur, la seconde pose un implant de biomatériau censé favoriser la régénération des voies motrices, et les IRM ont lieu dans un second établissement, à 10 km de route. Le porteur décrit une douleur aiguë possible liée à l'incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du cerveau, puis des risques de saignements intracrâniens, d'œdèmes cérébraux et de crises d'épilepsie soudaines, face à des résultats qui "pourraient guider le développement futur" de thérapies contre les séquelles d'AVC. La méthode employée pour provoquer la lésion n'est pas décrite, et les tests moteurs, qui doivent mesurer l'amplitude des mouvements, la force et la sensibilité des membres antérieurs, ne sont pas nommés.

Objectifs

L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à favoriser la régénération des voies nerveuses motrices après une lésion du cortex moteur. Les effets de cette approche seront évalués à la fois sur le plan tissulaire, par imagerie IRM et analyses histologiques, et sur le plan fonctionnel, au moyen de tests moteurs spécifiquement adaptés. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU)

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’intégration d’un nouveau biomatériau dans le tissu cérébral et à évaluer son potentiel à favoriser la récupération structurelle et fonctionnelle de la composante motrice. Les principaux bénéfices attendus sont : - Restauration tissulaire ciblée : le biomatériau pourrait stabiliser la matrice extracellulaire et soutenir la reconstruction des circuits corticospinaux. - Amélioration fonctionnelle : en favorisant la régénération neuronale et la réorganisation synaptique, il pourrait améliorer la mobilité et la coordination motrice. - Réduction des interventions multiples : un implant efficace limite le recours à des traitements répétitifs ou invasifs, réduisant le stress et la souffrance des animaux. - Avancée méthodologique : le suivi longitudinal par IRM et tests comportementaux permet d’observer l’évolution de la récupération chez le même animal, augmentant la robustesse des données et réduisant le nombre d’animaux nécessaires.- - Impact translational potentiel : les résultats pourraient guider le développement futur de thérapies régénératives pour les AVC ou traumatismes cérébraux, combinant implants biomimétiques, facteurs de croissance et thérapie cellulaire. En résumé, le projet allie compréhension fondamentale de la régénération cérébrale et perspective thérapeutique.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion (EU 2/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la chirurgie: La procédure chirurgicale elle-même constitue une source importante de gêne pour l’animal. Elle peut provoquer une douleur aiguë immédiate liée à l’incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral. Malgré l’utilisation d’anesthésie générale et d’analgésiques adaptés, un risque résiduel d’inconfort ou de douleur persiste, notamment lors de la phase de réveil. La chirurgie comporte également des risques de complications, tels que : - Saignements intracrâniens - Infections post-opératoires - Réactions inflammatoires locales - Œdèmes cérébraux pouvant altérer le bien-être de l’animal et interférer avec la récupération attendue Conséquences post-opératoires et facteurs additionnels de stress Après l’intervention, les animaux peuvent présenter un inconfort prolongé lié à la cicatrisation et à l’adaptation physiologique post-lésion. Cela peut se traduire par : - Altération de la motricité - Diminution de l’appétit - Modification du comportement exploratoire - Apparition de crises d’épilepsie soudaines Les premiers tests comportementaux réalisés après récupération peuvent également induire un stress psychologique, en raison de la nouveauté des situations expérimentales et de la contrainte de manipulation.

Devenir

La procédure se termine par la mise à mort des animaux afin de pouvoir étudier leurs tissus cérébraux. Cette étape est nécessaire pour observer directement comment le biomatériau s’intègre dans le cerveau, et pour mesurer la reconstruction des zones touchées et la récupération des cellules et des circuits moteurs. Les informations obtenues permettent également de mettre en relation les changements observés dans le cerveau avec les performances motrices mesurées chez l’animal, donnant ainsi une vision complète de l’efficacité du traitement.

Remplacement

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une maladie grave causée par l’obstruction ou la rupture d’un vaisseau sanguin dans le cerveau, entraînant des séquelles neurologiques. Malgré les progrès de la recherche en laboratoire, les modèles actuels ne permettent pas encore de reproduire la complexité du cerveau humain, en particulier sa vascularisation et les réactions biologiques qui suivent un AVC. Pour mieux comprendre ces phénomènes et tester de nouvelles thérapies, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. Ce projet vise à évaluer une stratégie innovante basée sur l’implantation de biomatériaux dans la zone lésée du cerveau, afin de favoriser la régénération. Les effets seront suivis à la fois par des tests fonctionnels (motricité, force, comportement) et par imagerie cérébrale (IRM). Après avoir obtenu des résultats encourageants avec d’autres biomatériaux chez le rat, nous allons maintenant tester un nouveau biomatériau biodégradable, plus proche des conditions physiologiques humaines et offrant un meilleur potentiel régénératif.

Réduction

L’utilisation de méthodes non invasives comme l’IRM et les évaluations motrices permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires. Nous prévoyons d’utiliser 84 animaux adultes, mâles et femelles, sur une période de 5 ans, et nous réutiliserons, lorsque possible, les données d’animaux témoins provenant de protocoles antérieurs. Les animaux seront répartis en différentes catégories : animaux non lésés, animaux ayant subi une chirurgie factice (sham lésion), animaux avec implantation factice (sham-implant), et hémisphères sains des animaux lésés. Le suivi longitudinal de chaque animal permettra d’évaluer la récupération motrice ainsi que les changements observés à l’IRM et en histologie, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Le principe fondamental des 5 libertés est strictement respecté tout au long de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, par groupes de deux individus (espèce grégaire), dans une salle dédiée exclusivement à cette espèce. L’alimentation est disponible ad libitum, y compris pendant les phases d'entraînement et d’évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l’état de santé général est assuré par les expérimentateurs et le personnel de zootechnie : les animaux sont pesés chaque semaine et bénéficient de contrôles vétérinaires réguliers. Une attention renforcée est portée aux animaux opérés, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé. Cette surveillance comprend l’observation de l’appétit, du poids, de la mobilité, de l’état du pelage, du comportement général, et s’appuie sur un score clinique. Ce score guide les décisions à prendre : mise en place d’un traitement visant à diminuer la douleur, renforcement du suivi, retrait de l’étude ou mise à mort si nécessaire. La prise en charge de la douleur repose sur des protocoles stricts et validés, en cohérence avec les principes de nociception et leur impact potentiel sur le bien-être animal et la qualité scientifique des données (cf. paragraphe sur les chirurgies). Un enrichissement environnemental est systématiquement mis en place, incluant des éléments cognitivement stimulants (tunnels, boules de fouille, boules traversantes, odeurs naturelles variées…) ainsi qu’une stimulation sociale via une arène de rencontre intercage. les animaux sont conditionnés de manière progressive aux tâches motrices, à l’aide de renforcements positifs. Cette procédure est conçue pour être peu anxiogène et respectueuse du bien-être animal. Le transport des animaux de l’EU 1/2 à l’EU 2/2 (trajet routier de 10 km) est également encadré avec attention. Les cages sont sécurisées pour le transport, les biberons sont retirés afin d’éviter l’humidification de la litière, les animaux ont accès à des croquettes et à une coupelle de nourriture molle, les couvercles sont scotchés pour prévenir toute ouverture accidentelle, les cages sont placées dans des sacs isothermes afin de limiter les variations thermiques, les chocs et les nuisances sonores.

Choix des espèces

Le rat constitue un modèle privilégié pour l’étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion cérébrale et implantation de biomatériaux. En effet, la mobilité et la force du membre antérieur représentent des fonctions motrices essentielles, dont la récupération est déterminante pour l’autonomie des patients cérébrolésés dans les activités de la vie quotidienne. De plus, des tests comportementaux validés et adaptés chez le rat permettent d’évaluer l’amplitude des mouvements, la force musculaire ainsi que la sensibilité des membres supérieurs. Enfin, le suivi longitudinal de la progression tissulaire est réalisé grâce à des examens d’imagerie (IRM) non invasifs, indolores et pratiqués sous anesthésie, garantissant le bien-être de l’animal. Pour l'IRM, la taille du cerveau de rat est privilégiée par rapport à la souris. Les expériences sont conduites sur des animaux adultes âgés d’environ 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et se rapproche de la tranche d’âge à laquelle surviennent majoritairement les AVC ischémiques.