Recherche fondamentale

Un régime riche en graisses pendant huit ou seize semaines, appliqué pour installer une inflammation puis une fibrose du foie : 60 souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer une protéine dans cet organe vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur ne décrit comme atteintes que le stress de deux pesées par semaine et une perte de poids d'environ 5 % la première semaine, alors que la maladie qu'il provoque évolue chez l'humain vers la cirrhose et le cancer du foie. Il revendique un "besoin urgent" d'optimiser le traitement de cette maladie et écrit qu'il serait "intéressant d'affirmer" que sa protéine y joue un rôle. Toutes sont tuées après un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour qu'on collecte leurs tissus.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’implication de l’expression d’une cible thérapeutique sur le développement de la Maladie Hépatique Associée au Syndrome Métabolique (MASH). La MASH est caractérisée par une inflammation et une dégradation des cellules hépatiques dues à une accumulation de graisse dans le foie. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, évoluant vers un cancer du foie dans les cas les plus graves. Le Resmetirom, 1er médicament approuvé par la FDA (mars 2024) pour la MASH, permet seulement de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez 24% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser le traitement de la MASH. Au sein de notre laboratoire nous étudions une protéine localisée sur la membrane cellulaire, qui joue un rôle dans le développement de différents cancers, notamment celui du foie. Il serait maintenant intéressant d’affirmer que cette dernière joue un rôle important dans le développement de la MASH. Pour cela, un nouveau modèle de souris a été développé avec une suppression ciblée de cette cible au niveau du foie uniquement. Cela nous permettra d’affirmer l’implication de cette dernière sur le développement de la MASH. Afin d’induire un modèle pertinent de MASH avec fibrose hépatique in vivo, un régime spécifique riche en graisses sera appliqué.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre en profondeur le rôle de notre cible thérapeutique dans le développement de la MASH. Par exemple l’étude de son rôle fonctionnelle dans le foie et le métabolisme (réponse au stress oxydatif, inflammation, impact sur la signalisation immunitaire et métabolique) dans le cas de la MASH. Ce modèle avec une suppression ciblées de notre cible permettra de comprendre comment notre protéine d’intérêt participe à l’évolution de la maladie et d’identifier de nouveau biomarqueur ainsi que des signatures moléculaires spécifique.

Procédures

Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation (pendant 8 semaine dans un groupe et 16 semaines dans un autre). Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permettra de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement d’une maladie hépatique liée au syndrome métabolique (MASH). Un stress de la souris peut être observé dû à la pesé des animaux 2 fois par semaine. Une légère perte de poids la première semaine du régime est observée (environ -5%).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier pour une meilleure compréhension du mécanisme et avant une transposition chez l’Homme.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Le prélèvement terminal sera réalisé sous anesthésie. Les animaux sont observés quotidiennement. A l’arrivé des souris dans l’animalerie, une période d’acclimatations de 7 jours sera appliquée avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une MASH. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).

Deux heures d'anesthésie d'affilée, dont un quart d'heure avec une aiguille-capteur enfoncée au centre de la tumeur : 110 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales du sein ou du pancréas leur sont injectées dans le flanc, la tumeur pousse deux à trois semaines, puis vient l'examen complet, une heure quinze d'IRM, trente minutes d'échographie et la mesure directe de la pression interne. Toutes sont tuées ensuite pour que la tumeur soit découpée et comparée aux images. Le porteur retient la souris parce que les appareils d'imagerie ont été conçus pour elle et qu'il est plus aisé de trouver des points de comparaison dans la littérature.

Objectifs

Les tumeurs solides sont principalement composées de cellules et d'autres éléments comme les fibres de collagène, qui affectent leurs caractéristiques physiques. Certaines caractéristiques sont connues pour rendre la tumeur plus sévère et plus résistante aux traitements médicaux. Parmi ces propriétés, seule la dureté de la tumeur peut actuellement être mesurée de manière précise et non invasive en imagerie. Il est alors intéressant de développer des techniques pouvant mesurer les autres caractéristiques tumorales, pour évaluer la sévérité tumorale de manière plus précise. La technique envisagée dans ce projet est l’élastographie par imagerie par résonance magnétique (IRM) sous compression. L’élastographie est la mesure des propriétés mécaniques du tissu comme l’élasticité, la dureté, etc… On utilise un dispositif vibrant pour générer des ondes à travers le tissu d’intérêt. Pour acquérir l’image de ces ondes qui se déplacent, on peut utiliser l’IRM (dont les images sont créées grâce à des champs magnétiques) ou l’échographie (dont les images sont créées grâce à des ultrasons). On peut également mesurer des propriétés plus complexes en réalisant un examen d’élastographie sous compression, c’est-à-dire en appuyant de manière continue sur le tissu pendant l’examen d’imagerie. Des études utilisant l’élastographie échographique sous compression ont été menées sur le foie en dehors du corps et ont montré que ces propriétés étaient liées à la manière dont sont organisées les fibres à l’intérieur du cancer, ce qui affecte sa sévérité. Le but de ce projet est de transposer cette méthode développée avec les ultrasons vers l’IRM. Ce type d’imagerie informe sur un volume entier, ce que ne fait pas l’échographie. Il y aura ainsi une information complémentaire et une meilleure précision dans les mesures. Cette nouvelle technique sera appliquée sur des tumeurs implantées chez la souris, avec deux modèles différents : des tumeurs du sein et des tumeurs du pancréas. Les valeurs obtenues seront ensuite comparées à des données provenant de la microscopie pour valider l’utilisation de cette méthode pour déterminer l’organisation des tissus et la sévérité de la tumeur. La validation de la méthode sera d’autant plus assurée que ces deux modèles possèdent des compositions et des propriétés physiques différentes. Cela permettra d’offrir une méthode sans douleur qui pourrait prédire la sévérité d’un cancer et adapter ensuite le traitement donné au patient. MODIF: Prolongation.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’approfondir les connaissances fondamentales relatives aux propriétés mécaniques du cancer. En particulier, l’objectif est d’obtenir des marqueurs non-invasifs d’imagerie pouvant indiquer la sévérité tumorale qui est liée à la fois à la composition de la tumeur et à sa pression. Cette étude pourra notamment permettre de définir de nouvelles méthodes d’imagerie afin d’aider le clinicien dans le diagnostic du cancer et, également, adapter le traitement aux caractéristiques de la tumeur.

Procédures

Dans un premier temps, les animaux seront anesthésiés pour une injection unique des cellules tumorales en sous-cutané dans le flanc. Cet acte aura une durée totale de 10 min par animal. Les animaux seront observés de manière bihebdomadaire pendant la croissance tumorale. Une fois que la tumeur aura atteint une taille suffisante (environ 2 à 3 semaines après l’injection des cellules), un examen complet sera effectué. Il comprendra un examen d’imagerie IRM, un examen d’imagerie échographie et une mesure de la pression tumorale, tous réalisés au sein d’une même anesthésie gazeuse. Pour la mesure de la pression tumorale, un capteur de pression ressemblant à une aiguille sera introduit au centre de la tumeur pour obtenir des mesures de pression qui seront comparées avec les mesures d’imagerie. Cette comparaison permettra de valider l’intérêt de l’imagerie IRM et échographie comme méthode de mesure de pression non-invasive. Au total, cette intervention aura une durée de 2h pour chaque animal, avec environ 1h15 d’acquisition d’images IRM, 30 min d’acquisition échographique et 15 min de mesures de pression.

Impact sur les animaux

Des cellules tumorales seront injectées dans le flanc droit de l’animal, ce qui peut occasionner un stress ou une légère douleur au point d’injection. La croissance tumorale peut engendrer une gêne, voire une perte de poids pour l’animal. Cette perte de poids sera en revanche limitée, car surveillée deux fois par semaine. De plus, la taille de la tumeur ne devrait pas excéder les 1000 mm3, ce qui limite de potentiels effets indésirables sur la mobilité de l’animal. Le fait d’être maintenu immobile pour l’imagerie et passer à l’intérieur d’un tunnel d’IRM avec un diamètre réduit peut être une source de stress pour l’animal. Cependant, les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress que l’examen peut engendrer. L’animal est surveillé et maintenu au chaud quand il est sous anesthésie, et la durée est limitée le plus possible, pour éviter d’éventuels effets indésirables de l’anesthésie tels que l’hypothermie (refroidissement de l'animal) et la diminution du rythme respiratoire.

Devenir

A la suite de l’examen complet (imageries et mesure de pression), les animaux seront euthanasiés et la lésion tumorale sera disséquée. Des analyses d’histologie seront réalisées pour obtenir des informations sur la composition tumorale. Ces analyses consistent en des coupes fines de la tumeur qui seront passées au microscope pour quantifier les éléments (cellules, fibres de collagène) qui composent la tumeur. Ces données seront corrélées avec les mesures obtenues en imagerie.

Remplacement

A notre connaissance, il n’y a pas d’alternatives en dehors d'un système vivant (construction de cellules ou morceaux de tumeurs) ou de modélisation numérique qui ont été validées et qui peuvent être utilisées comme solution de remplacement. Afin de valider l’imagerie comme solution non-invasive de mesure de la pression tumorale, les mesures doivent être effectuées sur des modèles animaux afin de reproduire l’environnement hétérogène et les propriétés tumorales qui pourront être retrouvés en clinique chez les patients atteints de lésions tumorales.

Réduction

Les dispositifs d’imagerie utilisés dans ce projet ont déjà été validés en amont, ce qui évite d’avoir une phase de test et de validation sur petit animal. Le nombre d’animaux par groupe a été défini selon des données obtenues précédemment et les données de la littérature.

Raffinement

En plus du suivi quotidien standard, un suivi clinique aura lieu deux fois par semaine : l’état de l’animal sera noté à l'aide d'une grille de score, avec surveillance du poids, de son apparence, de son comportement et de la taille de la tumeur. En cas d’atteinte des points-limites, l’animal sera euthanasié. En cas de score intermédiaire, une injection d’antidouleur sera réalisée et le suivi clinique sera réalisé quotidiennement. Tous les examens seront effectués sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress provoqués par les examens. La durée des examens sera réduite au maximum (temps total prévu de 2 heures au maximum) et tous les examens seront réalisés au cours de la même anesthésie pour éviter plusieurs anesthésies successives. Les animaux seront maintenus dans des cages de cinq maximum afin qu’ils aient suffisamment d’espace et qu’ils maintiennent un comportement social. Du matériau favorisant la nidification leur sera fourni. Les animaux seront hébergés en animalerie avec un statut adapté et manipulés sous hotte.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies pour cette étude, car elles permettent de greffer en sous-cutané des modèles de tumeurs humaines. Les dispositifs d’imagerie ont été développés pour les souris. De plus, la plupart des études d’imagerie sur tumeurs greffées en sous-cutané ont été réalisées sur des souris et il est donc plus aisé de trouver des informations dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés au stade adulte (au moins 8 semaines) afin de bénéficier d’animaux plus grands et plus à même de supporter les lésions tumorales étudiées. De plus, les cancers du sein et du pancréas sont généralement observés chez des patients adultes.

Capturés en rivière, anesthésiés puis marqués par une injection de colorant sous la peau, 120 gobies à tache noire mâles sont chauffés dans un bac de terrain jusqu'à perdre l'équilibre, en séances de deux heures trente. Suivent un mois en animalerie, jusqu'à trente-six heures de jeûne, des passages isolés en tunnel de nage et en chambre de respirométrie sous oxygène réduit, et un second échauffement mené jusqu'à l'arrêt de la nage. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour prélever leur cœur, leur cerveau et leur muscle et relier ces défaillances à l'état de leurs mitochondries.

Objectifs

Dans un contexte de changement climatique global, les milieux aquatiques continentaux sont de plus en plus soumis à des stress environnementaux (chaleur, hypoxie, etc.) sévères, affectant la physiologie, le comportement et la survie des espèces qui y vivent. Les poissons, ectothermes, sont particulièrement exposés à ces changements. Ainsi, les espèces les plus résilientes pourraient être avantagées et coloniser de nouvelles niches écologiques. Ces espèces invasives entraînent un déséquilibre des réseaux trophiques impactant l’ensemble du milieu. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent leur plasticité est donc essentiel pour anticiper les conséquences des contraintes naturelles sur la biodiversité aquatique et orienter les politiques de conservation. Ce projet vise à caractériser les limites de tolérance thermique chez le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus), une espèce benthique invasive en forte expansion dans les rivières européennes, notamment en France. Cette espèce semble capable d’occuper des habitats plus contraignants que ceux d’espèces endémiques, notamment des zones de fond à faible teneur en oxygène. Cette tolérance à l’hypoxie contribuerait à son succès invasif en lui permettant d'exploiter une niche écologique plus large. Le projet repose sur une approche expérimentale comparative combinant plusieurs indices de tolérance thermique basés sur les performances de nage qui seront mesurés dans des dispositifs dédiés à la fois sur le terrain et en laboratoire. La comparaison de ces deux situations n’a jamais été effectuée auparavant et sera complétée par des mesures en condition d’oxygène réduite, caractéristique importante des milieux dégradés. En combinant mesures de performances/tolérances thermiques (CTmax terrain et laboratoire, CTswim) et analyses mitochondriales sur cœur, cerveau et muscle, ce projet vise à fournir une compréhension multi-échelle de la tolérance thermique chez une espèce envahissante, et à identifier les traits qui favoriseraient sa progression dans les milieux aquatiques soumis au changement global. Ce projet implique la capture de gobies sauvages dans la Saône et des expérimentations en conditions de terrain et en animalerie agréée.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à affiner notre compréhension des limites de tolérance thermique chez le gobie à tache noire, une espèce invasive largement répandue dans les grands cours d’eau d’Europe. Il s’agit notamment de comparer différents indicateurs de tolérance thermique : la CTmax, mesurée soit en conditions naturelles, soit en conditions contrôlées, et la CTswim correspondant à une perte fonctionnelle locomotrice sous contrainte thermique. (1) Sur le plan fondamental, cette étude permettra d’identifier les mécanismes écophysiologiques impliqués dans la défaillance thermique, en reliant les seuils critiques comportementaux (perte d’équilibre, arrêt de nage) au fonctionnement des mitochondries de plusieurs organes (cerveau, cœur, muscle). L’approche multi-échelle utilisée (de l’organisme à la cellule) contribuera à clarifier les processus qui limitent les performances thermiques des poissons dans leur environnement. (2) Sur le plan méthodologique, le projet interroge la robustesse d’un indicateur largement utilisé (la CTmax) selon le contexte expérimental (terrain vs laboratoire), et propose une alternative potentiellement plus pertinente d’un point de vue écologique : la CTswim, qui intègre la composante locomotrice, essentielle à la survie (fuite, alimentation, reproduction). (3) Sur le plan appliqué, les résultats aideront à reconsidérer les indicateurs utilisés pour la gestion thermique des milieux aquatiques. Si la CTswim se révèle plus sensible que la CTmax, notamment en conditions hypoxiques, elle pourrait constituer un nouveau seuil critique pertinent à intégrer dans les modèles de niche thermique, la planification de la restauration écologique ou l’évaluation des risques liés aux canicules aquatiques. Enfin, l’étude du gobie comme modèle invasif permettra d’identifier des traits fonctionnels susceptibles de favoriser la résilience thermique et l’occupation de niches écologiquement stressantes, offrant ainsi des clés pour mieux comprendre les dynamiques d’invasion dans un contexte de changement global.

Procédures

Les poissons seront soumis à plusieurs interventions expérimentales réparties en séquences, selon les deux procédures décrites dans le projet. - Capture et marquage individuel Après la capture en milieu naturel (temps d’émersion

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement liés au stress physiologique induit par : - La capture en milieu naturel, - Le changement d’environnement (transition rivière → laboratoire), - Les manipulations expérimentales (chambre de nage, respirométrie, échauffement thermique). Ce stress peut favoriser des troubles immunitaires et l’apparition d’infections opportunistes, notamment chez des individus déjà fragilisés. Ce risque sera réduit par des phases de récupération post-manipulation, une surveillance rigoureuse de l’état des animaux et une stabulation adaptée (eau filtrée, oxygénée, cachettes, densité contrôlée). Les autres effets indésirables incluent : - Le jeûne alimentaire imposé avant les mesures métaboliques (36h max), potentiellement inconfortable mais nécessaire pour éviter les biais liés à la digestion ; - L’isolement temporaire (

Devenir

À la fin de l’expérience, il est prévu de procéder à des échantillonnages pour analyses mitochondriales (cœur, cerveau, muscle squelettique) sur l’ensemble des individus utilisés. Ces analyses nécessitent l’euthanasie de tous les individus restants, conformément au plan expérimental, afin de relier directement les performances thermiques et locomotrices aux mécanismes cellulaires.

Remplacement

A ce jour, seule l’expérimentation sur animaux permet de réaliser une étude intégrative qui prend en compte l’ensemble de l’organisme et ses réponses physiologiques, surtout lorsqu’il s’agit d’animaux sauvages. Cela permet notamment de caractériser les interactions complexes entre les tissus et leurs fonctions cellulaires. Cette vision globale est indispensable pour étudier de façon complète, les réponses métaboliques de l’animal face à son environnement

Réduction

Compte tenu de la variabilité interindividuelle attendue (taille, masse, capture en milieu naturel), le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire tout en garantissant la pertinence scientifique et statistique. Le marquage individuel permet d’appliquer des tests à mesures répétées, prenant l’individu comme facteur aléatoire, ce qui réduit fortement le besoin d’effectifs supplémentaires. Notre plan expérimental inclut : • Deux conditions d’oxygénation (100 % vs 20-50 % de saturation en O₂), • Deux statuts expérimentaux (poissons testés en CTmax terrain vs individus naïfs). Nous travaillons uniquement sur des mâles pour limiter la variabilité liée au sexe et réduire le nombre d’animaux nécessaires. L’effectif final (120 individus) est équilibré entre conditions et prend en compte une faible marge pour compenser la mortalité possible (transport, acclimatation, manipulations), inévitable avec des individus sauvages. Cet effectif se base sur la taille d’échantillons décrite dans les articles publiés sur le sujet.

Raffinement

Lors des protocoles in vivo, un des principaux objectifs est de limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Chaque geste contraignant (mesures et changement de milieu – tunnel, chambre ou nouvel aquarium) sera réalisé sous anesthésie légère, suivi par un temps d’acclimatation de 12h dans le tunnel de nage avant les protocoles de respirométrie. Après chaque expérience, les poissons seront replacés dans leur aquarium de stabulation et toutes les précautions seront prises pour leur éviter toutes nuisances visuelles et sonores. Les gobies seront maintenus dans des aquariums en densité adaptée à leur espèce, agrémentés de plantes artificielles et de gravier. Des cachettes adaptées des constitués de tubes PVC seront disposées dans les aquariums. Les poissons seront nourris une fois par jour, avec des cubes de moules hachées avec du mix (différentes larves de moustiques, daphnies et de la verdure (épinards, spiruline)) et lors du nourrissage, leur comportement sera particulièrement observé. En effet, si un poisson ne se nourrit pas, des mesures seront prises à son égard. Une observation biquotidienne sera réalisée par le personnel animalier et les expérimentateurs afin de veiller au bien-être des animaux depuis leur arrivée à l’animalerie jusqu’à l’euthanasie. Les états de santé et de bien-être des animaux seront ainsi évalués en prenant en compte les signes cliniques et comportementaux selon des grilles d’évaluation afin de définir des points limites adaptés et précoces pour mettre fin à toute douleur incompatible avec les objectifs du projet. Dès l’apparition de signes cliniques de mal-être, les animaux seront sortis du protocole et remis en conditions standard d’élevage. Dans le cas où des signes de douleur ou de mal-être devaient persister au-delà de 24 heures après la mise en stabulation, les animaux seront euthanasiés selon la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

Le gobie à tache noire (Neogobius melanostomus) a été choisi comme modèle en raison de son fort intérêt de la communauté scientifique quant à son impact écologique. Espèce benthique exotique envahissante, elle colonise rapidement les cours d’eau français (Moselle, Saône, Doubs) et entre potentiellement en compétition avec des espèces autochtones en occupant des habitats hypoxiques peu accessibles à ces dernières. Son comportement locomoteur particulier (nage par bursts, maintien au substrat) et sa tolérance apparente à l’hypoxie en font un modèle idéal pour explorer les limites physiologiques et bioénergétiques de la tolérance thermique. Par ailleurs, le gobie est classé en préoccupation mineure (LC) sur la liste rouge UICN. Sa capture en milieu naturel, dans le cadre d’autorisations préfectorales spécifiques, n’entraînera aucun impact significatif sur les populations locales, d’autant plus qu’il s’agit d’une espèce prolifique, suivie dans plusieurs programmes de gestion piscicole régionaux. Tous les individus utilisés sont des adultes mesurant entre 8 et 14 cm, ce qui correspond aux tailles adultes couramment observées dans les populations naturelles. Le choix de ce stade de développement est justifié pour deux raisons principales : - Il garantit une compatibilité optimale avec les dispositifs expérimentaux utilisés (tunnel de nage de 5 L, chambres métaboliques, système CTmax). - Il assure une représentativité écologique : les individus adultes sont les plus exposés aux contraintes environnementales (température, hypoxie) et jouent un rôle clé dans les dynamiques de population (reproduction, territorialité, compétition interspécifique).

672 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir dix injections, subir quatre heures de piqûres de filaments sur la face ou la patte les jours d'injection, boire pendant une semaine une eau qui irrite son intestin, et passer six séries de trente minutes de bruit au cours d'une même nuit. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour le prélèvement d'organes. Le projet cherche un mécanisme commun entre migraine, fibromyalgie et douleurs viscérales, du côté des cellules satellites gliales qui entourent les neurones. Le porteur situe le bénéfice possible au-delà de ce projet, tester un jour de nouvelles molécules, quand les stimulations douloureuses, elles, sont datées et comptées.

Objectifs

Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs du viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones dans les ganglions, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, de fibromyalgie, douleur viscérale et migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraines chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.

Procédures

Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après douze à quatorze heures de jeûne, un produit irritant leur est administré directement dans le côlon pour provoquer une inflammation de trois jours, avec une perte de poids attendue pouvant approcher 20 %, puis ils passent une IRM sous anesthésie avant d'être tués par injection létale. L'objet est de savoir si l'IRM permet de mesurer l'épaississement de la paroi du côlon, en vue d'études ultérieures sur l'effet des polluants. Le porteur qualifie les six animaux par groupe d'"indispensables" pour compenser les différences individuelles, sans autre calcul, cette étude préliminaire devant précisément servir à dimensionner les suivantes.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont caractérisées par des poussées inflammatoires entrecoupées de périodes de rémission de durée variable et impactant très lourdement la qualité de vie des patients. Le registre EPIMAD nord de France a montré que l’incidence de la maladie de Crohn (MC) est croissante depuis de nombreuses années et que l’incidence des MICI chez les jeunes et adolescents (10-16 ans) explose. Des études prédisent une prévalence des MICI entre 0.5% à 1% à partir de 2030 et l’incidence grandissante gagne peu à peu les pays en cours d’industrialisation. L’étiologie de ces pathologies reste encore très mal connue et les facteurs de risque environnementaux identifiés jusqu’alors ne peuvent expliquer toute la pathogenèse des MICI et l’explosion de leur incidence. Pour comprendre l’effet de certains polluants sur l’inflammation de l’intestin, notre projet recherche de nouveaux outils permettant de suivre l’évolution et l’étendue de l’inflammation en utilisant des outils capables de mesurer précisément l’ampleur de cette inflammation, notamment en observant l’épaississement de la paroi du côlon. D'autres segments du tube digestif pourront également être explorés. Nous n'avons jusqu'à présent pas une notion suffisante de la capacité de résolution et de la précision de l'outil IRM pour réaliser une mesure précise de l'épaisseur de la paroi intestinale. Ce projet a ainsi pour ambition de lever cette incertitude.

Bénéfices attendus

Afin de répondre à un certain nombre de questionnements sur l'implication de ces polluants environnementaux dans le développement et la modulation de l'inflammation, nous cherchons des outils matériels pertinents qui permettraient de mesurer l'étendue de l'inflammation notamment de l'infiltration inflammatoire par la mesure de l'épaisseur des couches de la paroi colique. Nous savons qu'au cours du développement de la phase inflammatoire, l'infiltrat de cellules inflammatoires va épaissir progressivement la paroi du tissu d'intérêt. Grâce à l’imagerie par résonance magnétique, il est possible d’obtenir des informations très utiles pour mesurer ces changements sans avoir besoin de sacrifier l’animal à chaque étape. Cela permet de suivre l’évolution de l’inflammation chez le même animal à plusieurs moments, selon le traitement reçu. Cette approche aide à mieux comprendre le phénomène tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires pour les expériences futures.

Procédures

Dans ce projet, une inflammation contrôlée du colon est provoquée chez les rats en administrant un produit irritant directement dans le côlon, après une période de jeûne de 12 à 14 heures. Cette inflammation, modérée et de courte durée (3 jours), est conçue pour limiter au maximum les effets négatifs sur les animaux. Une perte de poids modérée, inférieure à 20%, peut survenir au cours des deux premiers jours. À la fin des trois jours, les animaux sont placés sous anesthésie gazeuse pour passer par l’imagerie par résonance magnétique, puis endormis avant mise à mort afin de permettre des prélèvements et analyses de tissus.

Impact sur les animaux

Le modèle utilisé dans cette étude provoque une inflammation très modérée du côlon chez les rats. De notre expérience du modèle, on attend une perte de poids modérée au cours des deux premiers jours, sans autres changements détectables de comportement. L’injection du produit qui déclenche l’inflammation dure environ deux minutes et se fait sous anesthésie générale. Pour éviter que les animaux ne prennent froid pendant l’anesthésie, ils sont installés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil. Ensuite, chaque rat retourne dans sa cage, où il est régulièrement surveillé pendant 6 heures après la procédure pour s’assurer de son bon état de santé.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par administration létale d'anesthésique après la session de passage à l'IRM, afin de réaliser les prélèvements tissulaires et analyses ultérieures.

Remplacement

L’utilisation de rats dans ce projet se justifie parce qu’il n’existe pas d’autres modèles capables de mimer fidèlement les phénomènes étudiés, comme l’inflammation de l’intestin ou le comportement des animaux. Les modèles utilisant uniquement des cellules, des simulations informatiques ou des petits organismes comme les vers ou les insectes ne sont pas adaptés pour reproduire les interactions complexes entre les différents organes comme l’intestin, le microbiote, le cerveau ou le foie. De plus, certains effets de l’inflammation, par exemple l’augmentation de la température corporelle, ne peuvent être étudiés que chez un organisme vivant qui peut s’adapter, notamment par des changements dans le sommeil ou l’alimentation. Les jeunes rats offrent aussi un modèle pertinent, reproductible et validé dans la communauté scientifique.

Réduction

Cette étude est une étude préliminaire. Nous prévoyons d’utiliser 12 rats, répartis en deux groupes de 6. Ce faible nombre nous permet d’obtenir les premiers résultats qui serviront de base s’ils sont positifs pour calculer au plus juste le nombre de rats nécessaires pour une étude plus importante. C’est pourquoi dans cet esprit de réduction nous choisissons uniquement de jeunes mâles adultes pour limiter le nombre total d’animaux nécessaires. Avoir 6 animaux par groupe est indispensable pour compenser les différences individuelles et obtenir des résultats fiables sur le plan statistique.

Raffinement

Afin de limiter l’inconfort des animaux, toutes les manipulations pouvant causer un stress ou une douleur, comme l’injection dans le côlon ou l’imagerie par résonance magnétique, seront réalisées sous anesthésie générale. Les rats seront hébergés dans des cages spacieuses au sein d’un environnement adapté (endroit calme et climatisé) où ils pourront bouger librement, se redresser et s’allonger, afin de préserver leur comportement habituel. Plusieurs éléments favorisant leur bien-être seront ajoutés : les rats seront hébergés en petits groupes stables pour maintenir une vie sociale, des objets qu’ils peuvent manipuler seront mis à leur disposition (comme des tubes en carton ou des frisettes), et un fond musical varié sera diffusé. Enfin, les cages transparentes permettront une bonne visibilité et un environnement visuel stimulant.

Choix des espèces

Pour cette étude, nous émettons l’hypothèse que l’exposition aux polluants pendant les phases sensibles du développement, comme l’enfance et l’adolescence, pourrait favoriser la survenue de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. C’est pourquoi nous utilisons des rats jeunes adultes car ils réagissent physiologiquement et comportementalement de manière proche des humains face à différents polluants environnementaux. Ce modèle est reconnu scientifiquement pour l’étude de l’inflammation intestinale et les installations nécessaires à leur hébergement sont bien adaptées depuis plusieurs années.

12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. Huit reçoivent des traceurs injectés dans le cerveau au cours d'opérations de quatre à six heures, suivies de trois jours de traitement antidouleur, quatre portent un implant crânien et une barre de tête, et quatre vivent sous restriction d'eau pendant sept à seize mois. Le but est fondamental, comprendre comment les voies descendantes du cortex fabriquent des prédictions, question posée en parallèle chez des humains par IRM fonctionnelle. Sur le remplacement, le porteur écarte l'informatique en affirmant qu'il n'existera pas de modèle assez précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

Tués à l'issue pour que leur cerveau soit découpé et analysé, 12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des IRM de trois à cinq heures, des injections de traceurs directement dans le cerveau lors d'opérations de quatre à six heures, la pose d'un implant crânien et d'une barre de tête, puis l'insertion d'électrodes. Quatre d'entre eux vivent sous contrôle hydrique pendant vingt-huit à soixante-quatre semaines, avec un risque de déshydratation dont le porteur détaille les signes, muqueuses sèches, peau qui perd son élasticité, urine concentrée. Le choix du macaque tient à ce que le rongeur ne convient pas pour l'IRM des fibres cérébrales et que l'homologie du carnivore avec l'humain est jugée trop pauvre.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.