Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
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Modulation du système sérotoninergique pour le traitement des douleurs neuropathiques traumatiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 984 rats vont être utilisés, 1 780 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun passant jusqu'à trois heures dans un compartiment de test avec une mesure du seuil de douleur toutes les trente minutes. Un nerf est lésé chirurgicalement pour reproduire une neuropathie traumatique, la douleur post-opératoire est déclarée sévère et traitée pendant vingt-quatre heures, puis la patte est stimulée au toucher ou plongée dans l'eau froide, gestes que le porteur classe eux aussi comme sévèrement douloureux. La veille du test de reconnaissance sociale, chaque rat passe moins de vingt-quatre heures isolé. Les rats qui ne deviennent pas douloureux après la chirurgie, environ un sur cinq, sont écartés de l'étude, et 96 rats juvéniles sans traitement partent vers d'autres expériences de l'animalerie, tous les autres étant tués pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les douleurs neuropathiques touchent en France 5.6–7.3% de la population générale adulte. Ce sont des douleurs chroniques car persistantes ou récurrentes qui ne sont généralement pas améliorées par le traitement de la maladie sous-jacente ou même par sa guérison. Elles se caractérisent par une perception aberrante de douleur et sont souvent associées à des troubles cognitifs. Le traitement de ces douleurs est difficile, par manque d’efficacité des médicaments de référence et par leurs nombreux effets indésirables.. La sérotonine est un neurotransmetteur impliqué dans la modulation de la douleur et dans de nombreuses autres fonctions, comme le contrôle de l’appétit, du sommeil, de l’humeur…. L'objectif principal de ce projet, qui mettra en œuvre des approches comportementales chez le rat présentant une neuropathie traumatique similaire à celle causée par un accident de la voie publique ou par la lésion d’un nerf au cours d’une chirurgie, est d'étudier le rôle de la sérotonine dans ce contexte douloureux afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques améliorant les symptômes douloureux et les comorbidités cognitives.
Bénéfices attendus
Si les agents pharmacologiques testés permettent de soulager la douleur et les comorbidités associées, alors on peut espérer i) soit leur utilisation dans de nouvelles indications (la douleur neuropathique), ii) soit le développement de nouveaux agents. Au vu de la sévérité des douleurs neuropathiques, de leur impact sur la qualité de vie des patients et du manque d’efficacité des traitements existants, le développement de thérapeutiques médicamenteuses efficaces est fortement attendu.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à un test de détection de seuil de douleur (14 jours après la chirurgie) et à un test de cognition (21 jours après l'induction de la neuropathie). Les rats ne sont soumis qu'à un seul test de détection de seuil de douleur (stimulation tactile ou froide). Les tests détection de seuil de douleur sont réalisés chez l'animal vigile à raison d'une mesure avant la chirugie puis une mesure 2 semaines après, puis, après l'administration de l'agent pharmacologique ou du véhicule, 1 fois toutes les 30 min pendant 3 h maximum (au total entre 5 et 7 mesures). Le test de cognition est réalisé chez l'animal vigile, une seule fois, il dure 10 minutes. Entre leur arrivée et leur mise à mort, les animaux ont subi: 2 injections intrapéritonéales d'agent pharmacologique (rat vigile) OU: 1 injection intrapéritonéale d'agent pharmacologique (rat vigile) et 1 injection intrathécale (rat anesthésié).
Impact sur les animaux
Stress (modéré) lié à l’immobilisation du rat dans la main de l’opérateur pour l'injection. Douleur (légère) de l’injection intrapéritonéale . La durée totale de la nuisance (immobilisation + injection) est de 10 secondes. Stress (modéré) dû au changement de salle. Stress (modéré) lors de l’immersion de la patte dû à l’immobilisation du rat entre les mains de l’expérimentateur (durée: 20 sec). Stress (modéré) lors de la mise du rats dans un compartiment pour la stimulation tactile (durée: 180 min). Stress (modéré) dû à l’isolement de l’animal la veille (pendant moins de 24 h) du test de reconnaissance sociale. Douleur post-opératoire (sévère) traitée avec un anti-inflammatoire (pendant 24 h). Douleur (sévère) à la stimulation tactile (durée 6 sec) et à la stimulation thermique (durée 14 sec maxi). Difficultés à se mouvoir (modérées) et à atteindre la mangeoire pendant 24 h après la chirurgie.
Devenir
A l'exception des 96 rats juvéniles issus de la procédure 3, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure pour prélèvement d'organes ou fixation de tissus.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal vigile, sont nécessaires pour appréhender les mécanismes intégrés de la douleur et pour évaluer la pertinence de traitements antalgiques potentiels sur la douleur et les comorbidités associées. Le modèle de neuropathie traumatique fait référence dans la communauté scientifique. Sa répétition est nécessaire afin d’évaluer l’effet de nouveaux agents pharmacologiques sur les symptômes douloureux de la neuropathie et les comorbidités cognitives associées. Les mécanismes moléculaires sous-jacents aux processus douloureux et cognitifs ne peuvent être entièrement élucidés par des études cliniques.
Réduction
n= 8 rats/condition (traitement), taille de l’échantillon définie selon la variabilité (10%) des paramètres étudiés et par la puissance des tests statistiques; une analyse de variance à une ou deux voies est réalisée,suivie d'un test post-hoc. Une partie des rats neuropathiques ayant subi la stimulation tactile ou l'immersion de la patte seront réutilisés pour le test de cognition. Ainsi, 288 rats pourront être réutilisés pour le test de cognition. Les rats non douloureux après la chirurgie seront écartés de l'étude pharmacologique. Ceux-ci représentent environ 20% de la proportion des rats opérés. Pour écarter les biais méthodologiques les traitements sont randomisés, les expériences réalisées en « aveugle » et selon la méthode des blocs. 96 rats juvéniles n'ayant subi aucun traitement pourront être intégrés dans d'autres expérimentations autorisées se déroulant au sein de l'animalerie.
Raffinement
Les rats sont stabulés à raison de 4 par cage. Le protocole mettant en jeu un modèle de douleur chronique, une attention particulière est portée aux animaux, aux conditions de stabulation et aux soins pré et post-opératoires : enrichissemnt du milieu avec des tunnels en plastique, du coton, d'un bloc de bois; change avec soin, utilisation d’un tapis chauffant, protection de la cornée par du gel oculaire, traitement antalgique en fin de chirurgie et 24 h après. En raison de la réduction de leur mobilité pendant les 24 h suivant la chirurgie, les granulés d’aliments sont placés sur le sol de la cage pendant 24 h. Les rats sont observés tous les jours et évalués à l’aide de la grille de score spécifique au modèle.
Choix des espèces
Des rats jeunes adultes (âgés de 6-7 semaines) et juvéniles (âgés de 4-5 semaines), mâles et femelles sont utilisés. Le choix du rat est justifié par: i) sa pertinence physiologique (nombreuses similarités structurelles et fonctionnelles de son système nerveux avec l’humain) pour permettre des extrapolations pertinentes ; ii) la richesse de ses comportements facilement observables et mesurables, reproductibles, pour l’étude des fonctions cognitives et de la douleur ; iii) sa facilité de manipulation, iv) son cycle de vie court (permettant d’étudier en quelques semaines les effets d’une pathologie qui peut perdurer plusieurs mois chez l’homme) ; v) la possibilité dedévelopper des modèles de maladies humaines, permettant de tester de nouvelles thérapies potentielles avant de passer aux essais cliniques chez l’humain.
Maintien de l’élevage de souris obèses – souche Ob/Ob
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Nées de croisements entre porteurs hétérozygotes organisés pour entretenir la lignée, 1 000 souris ob/ob vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. La mutation qu'elles portent dérègle le contrôle de l'appétit et provoque dès quatre semaines une obésité sévère accompagnée de troubles métaboliques, phénotype que le porteur qualifie lui-même de dommageable. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet, dont l'objet se limite à fournir aux autres protocoles un stock d'animaux obèses disponible en continu. L'obésité y est décrite comme n'induisant ni traumatisme ni douleur, quelques lignes avant l'énoncé des aménagements qu'impose la mobilité réduite de ces souris, deux par cage et tétines de biberon rallongées.
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique causée par un excès de graisse dans le corps, entraînant des problèmes de santé, notamment au niveau du métabolisme, du système vasculaire et du cœur, et réduisant l’espérance de vie. Son développement est influencé par plusieurs facteurs, tels que l’alimentation, la génétique et l’environnement. Dans ce contexte, la souris Ob/Ob, porteuse d’une mutation génétique affectant un gène important pour le contrôle de l'appétit, est un modèle essentiel pour étudier les maladies liées à l’obésité. Cette mutation provoque une obésité sévère et des troubles métaboliques similaires à ceux observés chez l'Homme. Maintenir cette lignée de souris permet de mieux comprendre les causes de l’obésité et ses complications, et d’évaluer de nouvelles solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le maintien de cette lignée à mutation spontanée permet de fournir un modèle stable et reproductible pour de nombreux projets de recherche, facilitant ainsi les études comparatives et assurant une disponibilité continue d’animaux adaptés aux besoins expérimentaux.
Procédures
Les souris ob/ob présentent une obésité due à une mutation génétique spontanée qui altère le fonctionnement d'un récepteur à une hormone contrôlant l'appétit, cette mutation induit un phénotype dommageable visible dès l'âge de 4 semaines.
Impact sur les animaux
L’obésité, qu’elle soit induite par un régime riche en graisses ou par une mutation spontanée (Ob) n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. Avec l’installation de l’obésité, les souris pourraient présenter une mobilité réduite.
Devenir
Les animaux seront garder en vie et utilisés dans des projets nécessitant des souris Ob/Ob.
Remplacement
En l’absence de modèles alternatifs permettant de développer une obésité à l’échelle de l’organisme, nous utilisons des modèles murins bien caractérisés comme les souris Ob/Ob. Ces modèles ont l’avantage de reproduire des altérations biologiques similaires à celles observées chez l’Homme..
Réduction
Ce projet vise à limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant un maintien efficace de la lignée. Les souris Ob/Ob sont obtenues par croisement d’hétérozygotes (Ob/+ × Ob/+), et toutes les souris issues de ces accouplements seront utilisées pour éviter toute mise à mort inutile. Les souris hétérozygotes excédentaires seront intégrées au programme d’élevage pour assurer la pérennité de la colonie ou utilisées comme contrôles. De plus, une planification rigoureuse des accouplements sera mise en place pour ajuster la production aux besoins réels des projets, évitant ainsi un surnombre d’animaux. L’utilisation de méthodes standardisées pour le suivi et la gestion des lignées contribuera à optimiser les effectifs et à limiter les manipulations superflues.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à leur espèce, avec un enrichissement du milieu comprenant des cabanes, du papier, des tubes en carton et des morceaux de bois. Un suivi quotidien des animaux sera assuré, incluant l’évaluation de critères comportementaux et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé), ainsi qu’un suivi du poids de façon hebdomadaire. Ces observations permettront d’identifier d’éventuels signes de détresse et de déterminer les points limites de l’expérience pouvant conduire à la mise à mort de l’animal, conformément à la grille d’évaluation des points limites. Les souris obèses, qu’elles soient mâles ou femelles, seront hébergées par deux par cage pour tenir compte de leur poids et de la taille de leur environnement. Leur mobilité réduite nécessitera une attention particulière lors des manipulations et des transferts, des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l’étude des maladies cardiaques et métaboliques. Elle est utilisée depuis longtemps pour caractériser les différentes complications associées à l’obésité et est largement reconnue pour sa pertinence dans la recherche biomédicale en raison de sa similitude génétique avec l'humain. Facile à manipuler et à reproduire, elle offre une bonne reproductibilité des résultats, ce qui en fait un choix privilégié pour les études précliniques. Son utilisation permet ainsi d’obtenir des données fiables. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines pour les protocoles expérimentaux, un âge couramment choisi dans la plupart des études car il correspond à un stade de développement suffisamment mature. Toutefois, cette fenêtre peut varier en fonction des objectifs spécifiques de chaque projet, certaines études nécessitant des animaux plus jeunes ou plus âgés. En ce qui concerne la reproduction, les femelles seront mises à la reproduction entre 8 et 10 semaines, un stade où elles sont physiquement prêtes et capables de donner des descendants viables.
Rôle de CD44 sur les fonctions des cellules stellaires hépatiques dans les maladies chroniques du foie dont les maladies stéatosiques du foie associées à un dysfonctionnement métabolique (MASLD)
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 200 souris, dont des souris génétiquement modifiées pour ne plus produire la protéine CD44, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et chacune passe jusqu'à 32 semaines sous régime gras ou reçoit jusqu'à 16 injections intrapéritonéales d'un agent qui provoque une fibrose du foie. Sous régime riche en graisses, glucides et cholestérol, les premières sont mises à jeun quatre heures puis gavées à la sonde rigide, avec un risque de passage du liquide dans les poumons et de détresse respiratoire, et reçoivent jusqu'à trois injections intrapéritonéales et plusieurs prises de sang à la queue. Le porteur annonce la validation d'une protéine qui "pourrait être une cible thérapeutique potentielle" dans les maladies du foie liées à l'obésité. Pour justifier le choix de la souris, il avance sa "natalité importante" et le fait qu'elle permet d'obtenir assez de "matériel" pour les analyses, puis conclut : "Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée".
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’à la fibrose/cirrhose puis au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, les traitements pharmacologiques restent très limités et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine clef que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, et également à la surface des cellules stellaires hépatiques qui jouent un rôle clé dans la mise en place de la fibrose, en produisant de façon excessive du collagène. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de cette protéine est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n'exprimant pas cette protéine, et soumis à des régimes alimentaires ou des agents chimiques favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer son rôle et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la validation in vivo du rôle d’une protéine à la surface des cellules qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle dans un contexte de maladie stéatosique du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.
Procédures
Dans la procédure 1 : Pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris seront mises à jeun pendant 4h puis recevront des solutions aqueuses par gavage à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge suivi de 2 prélèvements sanguins à la veine de la queue. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées et le sang sera alors prélevé au niveau de la veine de la queue. Enfin à la fin du régime, un dernier prélèvement sanguin sera effectué. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Un à deux prélèvements sanguins à la veine de la queue seront effectués (en milieu et en fin de traitement avec l’agent chimique).
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1 : pendant la période d’alimentation riche en graisse, carbohydrate et cholestérol (durée de 32 semaines au maximum), les souris prendront du poids pouvant occasionner une gêne pour se déplacer. Lors des gavages des solutions aqueuses à l’aide d’une sonde rigide droite de 22 gauge, l’introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. En milieu de période de régime, 3 injections intra-péritonéales maximum, espacées de 1 semaine, seront réalisées. À la suite de ces injections une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Dans la procédure 2 : 16 injections intra-péritonéales au maximum à raison de 2 par semaine seront effectuées pouvant entraîner une inflammation au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes. Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront réalisées 3 fois au maximum pour atteindre la significativité statistique.
Raffinement
La mise en place de points limites précoces, prédictifs, adaptés (perte de poids, état général de la souris) pour chacune nos procédures et basés sur une observation détaillée des animaux au cours de chaque procédure, permettra de limiter leur sévérité. Les souris seront hébergées selon les mesures réglementaires pour le raffinement : en groupe (6 souris par cage, ou 5 souris par cage si une des souris fait 30g ou plus) dans des cages enrichies (igloos, ouate, baguettes de bois à ronger). La surveillance quotidienne des animaux par les zootechniciens et nos surveillances lors des pesées et/ou injections bi-hebdomadaires nous permettront de repérer précocement l’apparition de points limites qui imposent une action pour soulager l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles et femelles), la mise sous régime riche en graisse sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles et femelles), le traitement chimique induisant de la fibrose hépatique débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.
Effets directs de la lumière sur le métabolisme énergétique, la prise alimentaire et le glucose circulant chez la souris nocturne et le rat roussard diurne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Autres rongeurs : 64
Le rat roussard, un rongeur diurne, vit en cage individuelle dès le sevrage, les mâles de cette espèce étant agressifs entre eux. 64 rats roussards et 64 souris, soit 128 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer l'effet de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme d'une espèce diurne et d'une espèce nocturne. Chacun subit une chirurgie d'une heure trente sous anesthésie générale pour l'implantation d'un capteur de télémétrie, puis jusqu'à quatre semaines en cage individuelle, ce que le porteur décrit comme un "stress d'isolement social". Tous sont tués pour des analyses post-mortem, après un prélèvement de sang terminal que le porteur situe "après arrêt respiratoire de l'animal".
Objectifs
La lumière joue un rôle majeur sur la physiologie et la santé. Ce projet de recherche vise à étudier les effets de la lumière ambiante sur la prise alimentaire et le métabolisme au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne, la souris et chez un modèle animal diurne, le rat roussard. Dans ce projet de recherche, nous proposons de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise les comportements de prise alimentaire chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur le comportement. Nous proposons que les effets directs de la lumière favorisent la prise alimentaire de jour chez les espèces diurnes et inhibent la prise alimentaire de nuit chez les animaux nocturnes.
Bénéfices attendus
L’identification des effets directs de la lumière sur la prise alimentaire et le métabolisme pourrait permettre de participer à la prévention et le traitement des troubles liés à la prise de nourriture et des maladies métaboliques, comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter.
Procédures
Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et à un prélèvement sanguin terminal réalisé également sous anesthésie générale et après arrêt respiratoire de l'animal. Pour toutes les procédures les animaux devront être placés en cage inviduelle pour une durée maximal de 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux seront hébergés en cages individuelles pour enregistrer des variables rythmiques individuelles, ce qui pourra créer un stress d'isolement social d'une durée maximale de 4 semaines. La chirurgie d'implantation du capteur de télémétrie pourrait induire de l'inflammation, une perte de poids transitoire, une infection au site des sutures.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour analyse post-mortem.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme et la détection de la lumière impliquant plusieurs organes à la fois (notamment, rétine, cerveau, foie, pancréas, surrénales, muscles) et des relais nerveux et hormonaux, l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-organes.
Réduction
Pour les tests in vivo circadiens et métaboliques, le nombre d’animaux proposé (n=12 par condition) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales recueillies dans des études antérieures. Pour l'étude des réponses hormonales et neuronales à la lumière (post-mortem), le nombre d’animaux proposés (n=6 par point-horaire et par condition lumineuse) est basé sur une évaluation de la puissance statistique qui prend en compte les moyennes et la dispersion des données comportementales des études antérieures . Notre suivi systématiquement longitudinal des animaux réduit significativement le nombre d’individus utilisés.
Raffinement
Les souris issues d'un fournisseur agréé seront soumies à deux semaines d'acclimatation aux nouvelles conditions d'animalerie avant le début des procédures. Le rongeur diurne est quant à lui hébergé dès le sevrage en cage individuel car les mâles de cette espèce sont très territoriaux et donc agressifs entre eux. Les souris seront ensuite placées en cages individuelles pour la durée des procédures ce qui genèrera un stress d'isolement social que nous limiterons par ajout de frisure en plus de l'enrichissement classique des cages à savoir bâton à ronger et coton pour faire un nid. La frisure permettra de soutenir la thermorégulation de la souris individualisée notamment tout en apportant un enrihcissement supplémentaire pour la construction du nid. La procédure invasive de chirurgie est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie adaptée et la température corporelle des animaux est maintenues grâce à un tapis thermostaté relié à une sonde rectale durant toute la procédure. Dès l'anestéhsie et ensuite jusqu'au réveil les animaux sont maintenus sous lampe chauffante. L'état de santé des animaux est évalué une fois par semaine avant la procédure de chirurgie puis au minimum quotidiennement à l'aide d'une grille de score adapatée après. Des points limites spécifiques ont été établis pour limiter la souffrance animal en arrêtant la procédure dès que nécessaire. En post-chirurgie pour aider la récupération de l'animal de la nourriture gélifiée sera ajoutée au fond de la cage pour faciliter la prise de nourriture et hydrique.
Choix des espèces
Pour mieux comprendre les mécanismes mis en jeu, notre projet repose sur l’analyse comparative des réponses comportementales, physiologiques et neuronales entre un modèle animal nocturne et un modèle animal diurne. La souris est une espèce nocturne devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable en recherche animale par l’existence de nombreuses lignées transgéniques (y compris celles porteuses de mutations, celles avec gènes invalidés, ou avec gènes-rapporteurs). Une fois ce projet achevé, nous envisageons de rechercher les mécanismes moléculaires mis en jeu, en étudiant des souris transgéniques exposées aux mêmes procédures expérimentales. Le modèle rongeurs diurnes sont des modèles expérimentaux appropriés pour la recherche biomédicale. Leur utilisation dans le projet présent est pertinente pour comprendre les différences de réponses entre espèces nocturnes et diurnes. C’est pourquoi les mêmes expériences seront faites en parallèle chez un rat diurne, et la souris nocturne. Jeunes adultes (2-4 mois) pour étudier un système circadien et un métabolisme matures et non-sénescents.
Etude de la fonction des structures cérébrales de poissons osseux doués de capacités cognitives élaborées pour mieux comprendre l’évolution du cerveau (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les poissons retenus pour ce projet le sont pour leurs capacités cognitives, utilisation d'outils, reconnaissance de soi dans un miroir, reconnaissance individuelle, et pour un cerveau assez volumineux pour supporter une chirurgie. 450 cichlidés de trois espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour que leur cerveau soit prélevé et le site de la lésion localisé. Chacun subit une lésion du lobe inférieur par ultrasons, environ une heure sous anesthésie, avec un risque de troubles moteurs et de brûlure superficielle de la peau au point de contact de la sonde, puis vit seul dans son aquarium le temps des tests. Le porteur annonce cinq tests de comportement avant et après la lésion, jusqu'à deux séances d'une heure par jour pendant vingt jours, sans dire lesquels.
Objectifs
Certains poissons présentent des comportements comme l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau de ces poissons, qui présentent des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez ces poissons, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables citées précédemment. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des poissons ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment des cerveaux dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires. Notre étude implique deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2) dont la demande d’autorisation de projet est soumise au CEEA pour chacun.
Bénéfices attendus
Certains poissons présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les structures cérébrales impliquées demeurent méconnues. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons produisent ces comportements, des études lésionnelles sont nécessaires. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau des poissons téléostéens est très différente de celle des mammifères, et que le lobe inférieur, une structure unique à ces poissons, pourrait être impliquée dans ces comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment des cerveaux dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Les poissons seront soumis à 5 tests de comportement avant et après une lésion cérébrale pendant une durée maximale totale de 3 mois (durée des tests après la lésion : 3 à 20 jours, avec une à deux sessions d’une heure par jour). Les tests de comportement seront évalués sur animal vigile au sein de l’EU1. Les poissons seront soumis à la procédure de lésion cérébrale par ultrasons durant environ une heure sous anesthésie dans l’EU2.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à: - La lésion par ultrasons, qui pourrait créer des problèmes moteurs, et provoquer une brûlure superficielle de la peau au point de contact avec la sonde ultrasons. - L’hébergement individuel et les tests comportementaux, qui nécessitent cet hébergement individuel des individus, et peuvent provoquer un stress pour l’animal. - La manipulation des animaux pour l’anesthésie (stress potentiel).
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau, et qui possèdent un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisé que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les poissons nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de l’eau est surveillée. Après la lésion cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à la fin de l’expérimentation (20 jours maximum après la lésion). Aussi, une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie dans l’eau de nage, ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par bain en post opératoire a été choisie pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson (sortie de son aquarium, anesthésie avec le MS222, puis injection), ce qui produirait un stress trop important. En cas de brûlure légère liée à la température de la sonde, un pansement antiseptique sera appliqué que la plaie jusqu’à cicatrisation. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’intervention puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Lors du transport des animaux, la température de l’eau sera maintenue par l’utilisation de chaufferettes dans la boîte de transport.
Choix des espèces
Les poissons ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez certaines espèces, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de poissons traditionnellement utilisées en recherche ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de poissons de plus grande taille, dont la taille du cerveau permet une approche lésionnelle, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Isolement cellulaire à partir de tissus de souris dans le but de développer des modèles expérimentaux alternatifs
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une chirurgie unique de quinze à vingt minutes, jamais suivie d'un réveil : 115 souris vont être opérées sous anesthésie générale et tuées avant tout retour à la conscience, pour que leur foie soit perfusé ou prélevé. Les cellules ainsi isolées doivent servir à monter des cultures en trois dimensions, organoïdes et sphéroïdes, présentées comme des modèles substitutifs destinés à réduire l'usage d'animaux dans l'étude du cancer des voies biliaires. Le porteur affirme qu'un système vivant reste "indispensable" pour isoler les sous-populations cellulaires du foie, les lignées commerciales n'en étant pas représentatives. Sur la réduction, il indique que 115 individus suffisent d'après des expériences préliminaires et précise qu'aucune approche statistique n'a été conduite.
Objectifs
Nos études sont centrées sur le cholangiocarcinome (CCA), une tumeur des voies biliaires, qui est un cancer rare, très résistant aux thérapies. Par conséquent, afin d'élucider les mécanismes physiopathologique de cette résistance, des modèles expérimentaux alternatifs ou substitutifs doivent être mis en œuvre au laboratoire pour réduire le nombre d’animaux. Nous avons donc pour objectif de développer notamment des modèles de culture cellulaire en 3 dimensions (3D) comme des organoïdes ou des sphéroïdes comportant plusieurs types cellulaires dans le but de récapituler la structure d’un tissu biliaire sain in vitro afin de le comparer à des modèles in vitro de tumeurs biliaires. Ainsi avec le développement de tels modèles expérimentaux, nous souhaitons réduire substantiellement le nombre d’animaux. Ces modèles alternatifs nous permettrons de progresser sur les mécanismes physiopathologiques du cancer des voies biliaires. Les objectifs sont de développer des modèles expérimentaux in vitro en culture en 3 dimensions (exemple : organoïdes) afin de recourir à des méthodes substitutives à l’utilisation d’animaux (R=remplacer), limiter le nombre d’animaux utilisés pour atteindre un même objectif scientifique (R=réduire) et assurer et renforcer le bien-être des animaux (R=raffiner).
Bénéfices attendus
Dans son ensemble, ce projet doit permettre de développer des nouveaux modèles expérimentaux in vitro de tissu sain biliaire. Les bénéfices attendus du projet sont 1/ de réduire drastiquement l’utilisation des animaux ; 2/ d’avoir à disposition des modèles expérimentaux nouveaux (ex = organoïdes) de tissus sains pour les comparer à des modèles in vitro de tissus tumoraux.
Procédures
Tous les animaux subiront une intervention chirurgicale unique et terminale sous anesthésie générale et analgésie d’une durée maximale de 15-20 minutes.
Impact sur les animaux
Les seuls actes réalisés sur les animaux seront effectués sous anesthésie et les nuisances sont donc celles associées à l’anesthésie. Les animaux ne se réveilleront pas à l’issue de l’anesthésie car l’euthanasie interviendra durant celle-ci.
Devenir
L'isolement cellulaire ne permet pas la survie des animaux. Les animaux seront donc tous euthanasiés à la fin des procédures pour perfusion ou explantation du foie qui est requis pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, Un système vivant est nécessaire 1/ pour isoler toutes les populations cellulaires du foie grâce à des marqueurs spécifiques de chacune de ces sous populations et 2/ modéliser un tissu in vitro, en culture en 3 dimensions. Même s’il existe des lignées de cellules du foie, celles-ci ne sont pas représentatives des sous-populations cellulaires qu’il existe dans le foie et ne peuvent être étudiées qu'en culture primaire. Le modèle animal est donc indispensable dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le projet impliquera un total de 115 animaux. Des expériences préliminaires réalisées au laboratoire, nous indiquent que ce nombre est suffisant pour développer nos modèles cellulaires en 3 dimensions. Aucune apporche statistique n'est réalisée.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie) et avec l'application de points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour isoler les différents types cellulaires du foie et ainsi développer des modèles expérimentaux alternatifs car 1/ nous pouvons avoir à disposition des cellulaires d'origine hépatiques facilement pour développer nos nouveaux modèles de culture en 3D et 2/ qu'il existe de nombreux outils commercialisés et à disposition dans la communité scientifique pour étudier les cellules provenant de souris. Les souris seront utilisées à l'âge adulte/jeune adulte, 5 à 8 semaines dont 1 semaine d’acclimatation.
IGUANA : Suivi et conservation d’Iguana delicatissima, l’iguane des Petites Antilles en danger critique d’extinction
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Capturés au lasso dans leur milieu naturel, immobilisés sans anesthésie ni analgésie pendant dix minutes au maximum, 210 iguanes des Petites Antilles subissent une biométrie, un marquage sous-cutané, une prise de sang à la veine caudale et un écouvillonnage de la bouche ou de la peau. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger, le rythme respiratoire et la tonicité musculaire étant contrôlés toutes les deux minutes pour décider d'interrompre. Le porteur reconnaît des griffes arrachées chaque année sur les terrains rocailleux et de rares autotomies de la queue, sur moins de 1 % des individus capturés. Tous sont gardés vivants et relâchés à l'endroit exact de leur capture, parfois après deux heures de repos dans un sac de coton.
Objectifs
L’iguane des Petites Antilles, Iguana delicatissima, espèce en danger critique d'extinction (UICN), a disparu de >80% de son aire de répartition originelle et est limité à 6 îles des Petites Antilles. Elle est menacée par la perte d'habitat, la prédation, le braconnage, les maladies, la concurrence et l'hybridation avec l’iguane commun, I. iguana, invasif sur l’ensemble de l’arc antillais. Actuellement, seules 5 îles inhabitées abritent l’iguane des Petites Antilles en l'absence d’iguane commun, avec des effectifs extrêmement faibles, menaçant la survie de cette espèce endémique des Antilles. Ce projet, programmé sur 3 ans, a pour but d’acquérir des connaissances pour répondre à 2 objectifs de conservation de cette espèce : ● Rétablir l’iguane des Petites Antilles dans un état favorable par des actions de conservation adaptées (conserver sa diversité génétique et augmenter ses populations) ● Suivre l’évolution des populations d’iguanes des Petites Antilles et de leurs habitats (particulièrement leur état sanitaire et écologique). 1) Collecter des échantillons d’ADN pour évaluer la diversité génétique de l’espèce sur l’ensemble de son aire de répartition et prévoir sa conservation. Dans le but de conservation, il est impératif d’estimer le niveau de diversité génétique et d’hybridation actuel des populations. Il est donc prévu de réaliser une campagne de prélèvements de sang sur l’ensemble des populations de l’espèce. Une telle collection biologique de référence a pour intérêt de regrouper des échantillons de grande qualité qui peuvent être préservés pendant une longue période de temps et permettre de réaliser les analyses génétique et de séquençage de génomes prévus dans le cadre de ce projet ainsi que de prévoir de réaliser de futures analyses sans avoir besoin de réaliser de nouveaux prélèvements sur animaux. 2) Collecter des échantillons microbiologiques pour évaluer la distribution de la bactérie Devriesea agamarum causant de graves lésions cutanées chez les iguanes des Petites Antilles. Le projet prévoit de réaliser un état des lieux de référence de la distribution de cette maladie sur l’ensemble des populations d'I. delicatissima, afin de pouvoir (1) suivre son évolution sur l’ensemble des îles et (2) détecter la bactérie sur les individus avant l’apparition de symptôme. Au final, ce projet vise à améliorer sur le long terme l'état de conservation des populations de l'une des espèces de vertébrés les plus menacées et emblématiques de la Caraïbe.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet visent tout d’abord à acquérir des connaissances afin de réaliser un état des lieux de référence sur l’ensemble de l’aire de répartition de l’iguane des Petites Antilles concernant : - L’évaluation de la diversité génétique de l’espèce, en estimant le patrimoine génétique des différentes populations reliques, mesurant la différenciation et la migration entre populations, évaluant la perte de diversité due à la consanguinité ainsi qu’en quantifiant le niveau d’hybridation avec l’iguane commun. Pour cela il sera utilisé une combinaison de marqueurs génétiques classiques (microsatellites - permettant la comparaison directe avec les données génétiques antérieures, précédemment publiées) et de séquençage génomique, permettant une analyse à plus haute résolution (RADseq). - L’évaluation de l’état sanitaire des populations, pour vérifier la répartition et le taux de contamination par la bactérie Devriesea agamarum au sein de l’ensemble de l’aire de distribution de l’espèce, afin de pouvoir prévoir et surveiller l’expansion de cette maladie. Ce projet contribue à combler les lacunes de connaissances sur l’iguane des Petites Antilles à l’échelle régionale, de renforcer la collaboration internationale entre l’ensemble des partenaires de la Caraïbes, en réalisant des suivis et collectant des échantillons et les données qui en découlent, afin de faciliter les futures analyses et suivis temporels. Il vise ainsi à pallier aux soucis d’échantillons biologiques précédemment rencontrés (e.g. échantillons dégradés, inadaptés, épuisés et/ou indisponibles), en permettant de constituer à la fois (i) une collection biologique de référence, qui sera disponible au niveau local/régional et pourra être utilisée et complétée sur le long terme, et (ii) un état des lieux génétiques des populations en vue de leur conservation et de leur suivi dans le temps. Sur le plus long terme, ce projet vise à sensibiliser à la protection de la biodiversité endémique de la Caraïbe et à ses menaces, notamment les impacts des espèces exotiques envahissantes et des pathogènes, tout en renforçant les capacités des gestionnaires des ressources naturelles en matière de conservation des espèces menacées à l’échelle régionale.
Procédures
La procédure prévoit la capture d’individus d’iguane des Petites Antilles dans le milieu naturel, en privilégiant les adultes, avec 30 individus par population (afin d’obtenir une précision suffisante des paramètres biologiques étudiés), soit au total 210 individus provenant de 7 populations. Cette procédure sera réalisée une seule fois par individu, grâce au marquage individuel. Au regard de l’environnement d’intervention, de la biologie et physiologie de l’espèce étudiée, le raffinement et la rapidité d’exécution de la procédure, réalisée exclusivement par des personnes formées, seront privilégiés par rapport aux contraintes et risques anesthésiques. Ainsi aucune médication, anesthésie ou analgésie n’est envisagée dans la procédure. La durée de contention pour la réalisation de la procédure sera réduite au minimum (maximum 10min au total). De plus, tout au long de la procédure, l’évaluation de la douleurs et du niveau de stress de l’individu seront suivis par rapport au rythme respiratoire et la tonicité musculaire, toutes les 2 minutes, afin de les minimiser ou le cas échéant interrompre la procédure (au regard des points limites définis – voir section 5.10.3 Raffinement). 1. Biométrie et marquage : Après la capture, l'iguane est immobilisé pour réaliser les mesures en minimisant l’impact sur l’animal : observation générale (recherche de signes d'hybridation, détermination du sexe, stade de vie, état général et sanitaire), mesures morphométriques standardisées et marquage individuel sous-cutané des individus non-marqués. 2. Prélèvements d’échantillons génétiques : Ceux-ci seront réalisés par prise de sang (prélèvement de 0,35 à 0,6% du poids vif) , au niveau de la veine caudale, pour obtenir des échantillons biologiques permettant l’extraction d’ADN de haute qualité, en vue de réaliser des analyses de séquençage génomiques. 3. Prélèvements d’échantillons microbiologiques : Ils seront effectués par écouvillonnage simple, au niveau buccal ou cutané, pour évaluer l’état sanitaire des individus. 4. Relâcher des individus : Une fois la procédure réalisée, la condition de stress de l’individu est évaluée. S’il ne présente pas de signe de stress particulier, l’iguane est relâché immédiatement à l’endroit exact de sa capture. Si l’individus présente certaines conditions de stress, il est placé pour récupérer dans un endroit ombragé et calme (éventuellement dans un sac en toile de coton), pour une durée maximum 2 heures, avant d’être relâché.
Impact sur les animaux
Le projet nécessite la capture temporaire de spécimens vivants, leur contention, leur marquage individuel et la réalisation de prélèvements simples et sanguins, sur des individus adultes d’iguane des Petites Antilles du milieu naturel. Ces procédures ont fait l’objet de monitoring sur de nombreuses années de suivi de l’espèce, permettant d’avoir un certain recul sur l’impact de ces activités sur le bien-être animal individuel. Elles ont de plus été discutées par la Structure chargée du Bien Être des Animaux (SBEA) de l’Établissement Utilisateur. Les effets indésirables possibles à envisager sur les individus lors de ces procédures sont principalement de 3 types : - Les effets de stress, principalement liés à la capture et la contention des individus ; - Les blessures éventuelles, liées à la capture et contention ou lors des prélèvements buccaux ; - Les risques septiques lors du marquage individuel et/ou du prélèvement sanguin. Concernant les blessures pour l’espèce cible, trois cas principaux ont été identifiés. Lors de la capture et de la contention, il s’agit de griffes arrachées notamment dans les habitats les plus rocailleux (quelques individus tous les ans), et des autotomies au niveau de la queue. Ces dernières sont très rares et concernent moins de 1% des individus capturés sur l’ensemble des missions opérées. Lors des prélèvements buccaux, les individus de grandes tailles peuvent vouloir mordre l’écouvillon : un animal cassant l’écouvillon en fermant la bouche risque d’avaler la partie mordue, ce qui peut entraîner des lésions internes, toutefois ce risque est totalement annulé dès lors qu’un ouvre-bouche est utilisé. Enfin, un soin tout particulier sera pris pour réduire tout risque potentiel de transmission/propagation d’infection (y compris par la bactérie Devriesea agamarum) entre individus. Pour cela, un protocole de désinfection stricte, impliquant utilisation de matériel à usage unique et de gants ainsi que la désinfection des zones de prélèvements chez les iguanes capturés à la bétadine, des manipulateurs au gel-hydroalcoolique ainsi que du lasso et de la zone de travail à l’alcool, sera mis en place.
Devenir
Le projet étudie une espèce protégée dans son milieu naturel. Tous les animaux capturés pour l’étude seront gardés en vie et, dès la fin de la procédure, relâchés dans le milieu naturel à l’endroit exact de la capture.
Remplacement
Le projet portant sur l’acquisition de données scientifiques génétiques des populations de l’espèce Iguana delicatissima en vue de développer un projet de conservation sur celle-ci et directement basé sur les paramètres biologiques, génétiques et microbiologiques propres, il apparaît donc impossible de remplacer le modèle biologique par une autre espèce, ni un équivalent cellulaire ou in silico. De plus, il est ici considéré de constituer une banque d’échantillons biologiques de références, incluant des échantillons de grande qualité qui pourront être préservés et continuer d’être utilisés pendant une longue période, pour de futures analyses. Pour cela, seront préférés les prélèvements de sang, qui correspondent à la méthode conseillée pour les iguanes en bon état de santé et permet de collecter une grande quantité d’ADN avec un impact réduit pour l’animal.
Réduction
Le protocole d’échantillonnage est prévu ici pour permettre d’estimer de manière optimale à la fois (i) les paramètres de diversité génétique et (ii) l’état sanitaire des différentes populations d’iguane des Petites Antilles, actuellement afin de constituer un état de référence pour l’évolution de ces populations et les programmes de conservation à venir. Un échantillonnage de 30 individus par population est couramment recommandé pour assurer une bonne représentativité des variations génétiques au sein de la population, et obtenir des estimations suffisamment fiables des paramètres génétiques. De la même manière, l'évaluation de l'état sanitaire des populations d'iguanes des Petites Antilles, incluant une estimation robuste de la présence/absence de la bactérie pathogène Devriesea agamarum ainsi que de sa prévalence au sein des populations nécessite également un échantillonnage approprié et optimal de 30 individus par population. Compte tenu d’une taille d’échantillonnage optimale identique entre les deux volets du projet, les deux types échantillons seront collectés autant que possible sur les mêmes individus, afin de minimiser le nombre total d’individus sauvages capturés, manipulés et prélevés. Par ailleurs, bien que les écouvillons buccaux puissent constituer une source d’ADN pour réaliser des génotypages simples, ceux-ci ne permettent pas de constituer une collection d’échantillons biologiques de qualité suffisante pour être utilisables sur le long terme et avec des analyses génomiques haut-débit. C’est pour cela qu’il est prévu de réaliser dans ce projet des prélèvements sanguins, qui restent pour les iguanes le type de prélèvement le moins impactant permettant d’obtenir une quantité importante d’ADN nécessaire aux analyses génomiques.
Raffinement
La capture temporaire de spécimens vivants, leur manipulation, le prélèvement de matériel biologique ont déjà fait l’objet d’autorisations administratives dans le cadre des programmes de protection de l’Iguane des Petites Antilles, sur l’ensemble de l’aire de distribution. Un recul a été accumulé sur l’impact de ces activités sur le maintien d’un état de conservation favorable des populations et le bien-être animal individuel. L’ensemble des opérateurs impliqués sont formés et titulaires d’agréments individuels. Ces opérations de captures et biométries, éventuellement marquages individuels et prélèvements biologiques génèrent de facto un stress individuel. Ce dernier est réduit en : - diminuant le temps d’attente entre la capture et le relâché d’un individu, - réduisant le nombre de personnes présentes lors de la manipulation, - garantissant la qualification des opérateurs pour l’ensemble des gestes de procédure expérimentale. À ce jour et après plusieurs milliers de captures dans les Antilles Françaises, aucune mortalité directe n’est à déplorer. Par ailleurs, y compris dans le cadre de suivi de type CMR (Capture-Marquage-Recapture), aucun effet de captures répétées n’a pu être mis en évidence quant au comportement de l’espèce. Afin de réduire cet impact au maximum, la qualification des opérateurs, la vigilance tout au long des procédures et la définition de points-limites (cf. ci-dessous) permettent de s’assurer que la santé de l’animal est primordiale, et passe avant le protocole. Ainsi, afin d’assurer la sécurité des animaux entrant en procédure, des points-limites adaptés sont définis : - Occurrence d’une blessure superficielle : Si localisation hors d’une zone de manipulation et n'entraînant pas de comportement de stress, poursuite de la procédure avec une surveillance accrue ; dans le cas contraire, arrêt de la procédure, désinfection locale, surveillance et relâché. - Apparition d’un comportement de stress : arrêt de la procédure, surveillance et relâché. - Occurrence blessure lourde : arrêt de la procédure, évaluation vétérinaire et procédure adaptée au diagnostic. - Occurrence blessure engageant le pronostic vital : arrêt de la procédure, évaluation vétérinaire et selon diagnostic mise à mort selon méthode réglementaire.
Choix des espèces
Le projet porte directement sur l’acquisition de connaissances sur les populations naturelles de l’iguane des Petites Antilles, Iguana delicatissima, en vue de développer un projet de conservation de cette espèce au niveau de l’ensemble des Petites Antilles. Dans ce cadre, pour avoir un intérêt scientifique les paramètres biologiques étudiés doivent être mesurés sur cette espèce et non une autre. Le protocole d’étude vise à estimer à la fois la diversité génétique au sein de cette espèce et la prévalence de la bactérie Devriesea agamarum au sein de ses populations. Ceci requiert un échantillonnage aléatoire des populations, ciblé principalement sur les individus adultes ou à défaut sub-adultes (i.e. d’un poids supérieur à 200g), afin de caractériser les populations de géniteurs et de minimiser l’impact des manipulations sur les individus étudiés.
Elevage de lignées murines présentant une inflammation chronique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Aucun animal porteur du phénotype dommageable n'est gardé au-delà de vingt semaines, et tout individu atteignant un point limite est tué aussitôt. 2 880 souris vont être utilisées dans cet élevage de lignées à inflammation chronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin. Le phénotype produit une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires, et les souris qui ne l'expriment pas rejoignent les groupes témoins. L'élevage alimente un projet sur le métabolisme des lipides dans le syndrome d'Aicardi-Goutières, et le porteur écrit que les animaux développeront une inflammation chronique vers vingt semaines tout en affirmant que les conditions d'élevage seront adaptées pour qu'ils ne développent pas de symptômes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’élever des animaux spécialement conçus pour nos expériences scientifiques. Grâce à ces expériences, nous cherchons à comprendre comment le métabolisme des lipides influence certaines maladies inflammatoires chroniques (ici par exemple le syndrome d'Aicardi-Goutières).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de découvrir des solutions thérapeutiques pour alléger les symptômes présents chez les patients souffrant d’inflammation chronique.
Procédures
Les animaux développeront aux alentours de 20 semaines d'âge une inflammation chronique liée à leur phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Les nuisances liées à l'inflammation chronique dans ces modèles sont une mort prématurée, un poids réduit et des difficultés respiratoires. Les animaux ne seront pas maintenus plus de 20 semaines, les conditions d'élevage seront donc adaptées pour qu'ils ne dévellopent pas de symptômes.
Devenir
Les animaux issus de l'élevage seront soit utilisés pour renouveler les accouplements soit utilisés pour les expérimentations dans le cadre d'une utilisation continue sur site. Les animaux ne présentant pas le phénotype dommageable seront intégrés dans les groupes "contrôles". Tous les animaux seront utilisés. A la fin, ils seront tous euthanasiés.
Remplacement
L'objectif du projet scientifique associé à ces élévages nécessite l'utilisation de modèles animaux. Les méthodes substitutives notamment l'utilisation de modèle in vitro ne permet pas d'étudier la communication inter-organes.
Réduction
Afin de réduire le biais associé au sexe, des groupes équivalents d’animaux des deux sexes seront utilisés dans les protocoles expérimentaux proposés. Tous les animaux issus des accouplements seront conservés pour l'expérimentation.
Raffinement
Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues à la délétion génétique dommageable. Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. De plus les besoins sociaux et biologiques des modèles murins sont bien connus et parfaitement maîtrisés, permettant de minimiser tout effet indésirable, douleur, souffrance ou tout dommage durable. De fait, afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux, les animaux seront placés en cage 3 individus (trio d'accouplements) avec pour enrichissement une maisonnette en carton et du coton pour la nidification. Les animaux avec un phénotype dommageable ne seront pas gardés en vie au delà de 20 semaines d'âge.
Choix des espèces
Les modèles murins, sont les plus utilisés dans les procédures expérimentales visant à étudier l’immunité et le métabolisme et en particulier l’impact de régimes alimentaires spécifiques sur les processus biologiques. La communauté scientifique bénéficie d’un large éventail de modèles génétiquement modifiés permettant l’obtention de résultats robustes et des comparaisons avec d’autres études préalables. Les animaux seront utilisées pour l'élevage, les animaux seront donc mis en accouplement entre 7 et 8 semaines et les animaux à phénotype dommageable seront maintenus en accouplements pour une durée maximale de 12 à 13 semaines ( âge maximum des animaux 20 semaines).
Effet du bruit chronique sur la capacité d’adaptation et de prédation de la seiche commune.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Soixante-deux seiches communes juvéniles vont vivre trente jours sous un son continu de 140 décibels, et les 124 individus du protocole subissent chacun deux captures à l'épuisette et un "test de surprise" par stimulation sonore graduelle. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le projet part du constat que le bruit des navires nuit à la vie marine, et il classe pourtant trente jours d'exposition continue en nuisance légère, la rubrique des effets néfastes reprenant mot pour mot celle des procédures sans rien y ajouter. Aucune n'est tuée, toutes sont remises en mer près du lieu où leurs œufs ont été récoltés.
Objectifs
L’Union Européenne identifie les bruits sous-marins comme une préoccupation environnementale importante, soulignant la nécessité de maintenir des niveaux de bruit qui ne nuisent pas aux écosystèmes marins. Le transport maritime a considérablement augmenté les niveaux de bruit sur les principales routes de navigation au cours des 50 dernières années. Compte tenu de l’évolution rapide du paysage sonore océanique, il est urgent de mener des recherches plus approfondies sur les effets du bruit anthropique sur la vie marine. Ces recherches sont essentielles pour élaborer des politiques efficaces et protéger la santé des océans. Actuellement, la plupart des études se concentrent sur l'effet des sons sur les vertébrés marins. Pour bien comprendre et atténuer les effets de la pollution sonore, il est essentiel d’élargir le champ de la recherche pour inclure un plus large éventail d’espèces et de fréquences sonores. Malgré leur importance écologique et économique, l'impact de l'augmentation du bruit anthropique sur les céphalopodes a été relativement peu étudié. Les céphalopodes, dont la seiche commune, détectent les sons et sont sensibles à leur environnement acoustique. Ce projet veut mettre en évidence l’impact du bruit chronique sur (1) le développement embryonnaire, et (2) la capacité de prédation chez la seiche commune.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier comment le son pourrait affecter la phase de développement embryonnaire de la seiche commune : temps d’incubation, taux d’éclosion, et taille des nouveau-nés. Par ailleurs, ce projet ambitionne de déterminer l’impact du son sur la première alimentation, les capacités à s’adapter à de nouvelles proies, et la résilience du juvénile face aux perturbations d’environnement sonore.
Procédures
Sur la période d’expérimentation (30 jours), les juvéniles ((nombre= 124) subiront chacun deux captures à l’épuisette (nuisance légère d’une dizaine de seconde). Un lot de 62 individus sera soumis en continu à un son (140dB ; 1 Hz-1 kHz) durant toute la durée de l’expérimentation (nuisance légère, 30 jours). Tous les individus subiront un « test de surprise » qui consiste en une stimulation sonore graduelle (nuisance légère, moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Sur la période d’expérimentation (30 jours), les juvéniles ((nombre= 124) subiront chacun deux captures à l’épuisette (nuisance légère d’une dizaine de seconde). Un lot de 62 individus sera soumis en continu à un son (140dB ; 1 Hz-1 kHz) durant toute la durée de l’expérimentation (nuisance légère, 30 jours). Tous les individus subiront un « test de surprise » qui consiste en une stimulation sonore graduelle (nuisance légère, moins de deux minutes).
Devenir
A la fin de l’expérimentation, les animaux sont replacés dans le milieu naturel à proximité du lieu de récolte des œufs.
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui cherche à appréhender l’impact du son sur le développement embryonnaire et le comportement de prédation chez la seiche commune. La perception du son et le développement des organes associés nécessite un organisme entier intègre. Il n’y a pas d’alternative in vitro à l’heure actuelle.
Réduction
La mise en place de collecteurs (support de ponte artificiel) relevés quotidiennement dans le milieu naturel permet de récolter le nombre d’œuf nécessaire pour la réalisation de cette expérimentation en s’affranchissant de la conservation d’un stock de géniteurs en laboratoire. Il n’y a donc pas de maintenance de géniteurs sauvages. Le nombre de juvéniles est réduit mais optimisé pour cette expérimentation afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. A la fin de l’expérimentation, tous les animaux sont replacés dans le milieu naturel à proximité du lieu de récolte des œufs.
Raffinement
Les juvéniles éclos sont placés dans des bacs répondant aux exigences de la Directive Déléguée. Un enrichissement environnemental est mis à disposition des animaux sous la forme d’une cachette (pièce pvc) et d’un tapis imitation « sable » sous les aquariums. De plus, les juvéniles sont nourris à satiété quotidiennement avec des proies vivantes leur permettant d’exprimer un comportement naturel de chasse. Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par une feuille de suivi permettant de quantifier l’expression de points limites en expérimentation.
Choix des espèces
Les céphalopodes sont les seuls mollusques possédant des capacités cognitives et des comportements élaborés. Les céphalopodes, dont la seiche commune, détectent les sons et sont sensibles à leur environnement acoustique. Le développement de la seiche commune est court et direct, aboutissant à des juvéniles bien développés à l’éclosion facilitant la mise en œuvre de cette étude.
Etude de la réponse à la stimulation hormonale de l’ovaire chez un modèle de syndrome des ovaires polykystiques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Vingt injections sous-cutanées quotidiennes entre les épaules, puis deux injections intrapéritonéales aux jours 21 et 23: 180 souris femelles de un à trois mois vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever les tissus. L'induction du syndrome des ovaires polykystiques peut provoquer des épisodes douloureux au niveau ovarien, et les injections sous-cutanées des zones d'irritation. Le projet cherche des biomarqueurs qui prédiraient une réponse anormale à la stimulation hormonale, dont le risque d'hyperstimulation est accru chez les patientes atteintes de ce syndrome et suivies en procréation médicalement assistée. Le porteur ne nomme ni la substance qui induit le syndrome ni l'hormone injectée ensuite, et ne donne aucun chiffre à l'appui de l'effectif de 180 souris qu'il déclare avoir "restreint au maximum".
Objectifs
Le projet vise à comprendre le rôle des mécanismes qui permettent de controler la quantité de cholestérol à l'intérieur de la cellule, dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. Ce syndrome touche environ 10% des femmes en âge de procréer, il conduit à des troubles important de la fertilité et à des symptômes qui, chez certaines patientes, vont affecter leur qualité de vie. Par ailleurs, ces troubles de fertilité conduisent un large nombre de femmes à avoir recours aux techniques de procréation médicalement assistées dans le cadre d'un projet de parentalité. Ceci implique donc le recours à une stimulation hormonale de ces patientes qui présentent un risque clinique identifier d'hyperstimulation dont les conséquences peuvent être très délétaires. Il est important de noter que le risque d'hyperstimulation est très fortement augmenté chez les patientes souffrant du syndrome des ovaires polykystiques. Il a été montré que ces récepteurs jouent un rôle clé dans la réponse à la stimulation hormonale de l'ovaire. L'objectif principal du projet est donc de préciser leurs rôles dans l'apparition du syndrome des ovaires polykystiques. L'objectif secondaire sera d'identifier des biomarqueurs prédictifs de la réponse à la stimulation ovarienne associé à leur dysfonctionnement.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront de mettre en évidence une liste de biomarqueurs prédictifs potentiels d'une réponse anormale à la stimulation hormonale au cours d'un protocole de procréation médicalement assistée. Ces candidats seront par la suite utilisé à des fin de recherche translationnelle pour éprouver leur valeur prédictive en qualité de biomarqueur en clinique humaine.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injection sous cutanée quotidienne en position interscapulaire avec un volume de 0,1mL pendant 20 jour > nombre : 20 > durée : intervention de 20 à 60 secondes Injection intraperitonéale jour 21 et 23 avec un volume maximum de 0,15mL > nombre : 2 > durée : intervention de 20 à 60 secondes
Impact sur les animaux
L'induction du syndrome chez la souris, comme dans l'espèce humaine peut conduite à un impact sur la qualité du bien être suite à des épisodes douloureux au niveau ovarien. Les injections sous cutanée peuvent provoquer des zones d'irritations.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de protocole pour prélèvements et analyses des tissus.
Remplacement
Les mécanismes qui conduisent à l'émergence du syndrome des ovaires polycystiques doivent être étudier à l'échelle de l'ensemble du tissu ovarien. Cette étude ne peut-être conduite que sur modèle animaux car il n'existe pas à ce jour de modèle alternatif pour modéliser la complexité du SOPK lors de la réponse à une stimulation hormonale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole pour l'ensemble du projet. Ce nombre a été défini en s'appuyant sur les études antérieures menées dans la littérature, ce qui permet d'évaluer la variance attendue dans chaque groupe et d'en définir l'effectif optimal.
Raffinement
Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques (anti-inflammatoires). Des points limites seront mis en place et suivi lors de la visite quotidienne, ainsi que lors des pesée réalisée tous les 2 jours. Un enrichissement renforcé est prévu pour les animaux en protocole (tube cartoné, pad fibres, buchettes de bois). Une manipulation low-stress sera effectué tout au long du protocole (prise en main en coupelle, contention minimale lors des injections, renforcement positif avant le debut du protocole pour habituer les animaux à l'expérimentateur). Les animaux seront hébergés dans des cages par 2 à 4 pour conserver leurs interactions sociales. Les injections seront réalisées par voie intraperitonéale pour les hormones de stimulation, par voie sous cutanée pour l'induction du syndrome ou pour le traitement antalgique. La pesée des animaux sera réalisée toutes les semaines.
Choix des espèces
Les mécanismes qui conduisent au développement du syndrome des ovaires polycystiques et les raisons de la réponse anormale à une stimulation hormonale sont très peu connue. L’accès à du tissu humain est possible, mais limité aux cellules du cumulus produit suite à l'ovulation. L'obtention de tissu ovarien issu de patientes atteintes de ce syndrome est impossible. En effet, ni exérèse, ni prélèvements sur l'ovaire ne sont indiqués dans cette situation clinique. Ainsi, l’exploration phénotypique et la caractérisation des dysfonctionnements sur l'ensemble de l'ovaire ne peut être conduite que sur des modèles animaux. Le modèle souris est celui le plus décrit dans la littérature. Nous utiliserons des femelles post-pubertaires, entre 1 et 3 mois, les animaux doit être en âge de se reproduire au sortir du protocole d'induction du syndrome des ovaires polykystiques.
Etude de la fonction des structures cérébrales de poissons osseux doués de capacités cognitives élaborées pour mieux comprendre l’évolution du cerveau (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une brûlure superficielle de la peau au point de contact de la sonde, des troubles moteurs possibles, puis vingt jours d'hébergement individuel sans cachette: 450 poissons cichlidés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever leur cerveau. Chacun passe cinq tests de comportement avant et après une lésion cérébrale infligée par ultrasons sous anesthésie, sur trois mois au maximum. Il s'agit de savoir à quoi sert le lobe inférieur, une structure propre à ces poissons, chez des espèces qui utilisent des outils, se reconnaissent dans un miroir et identifient leurs congénères. Trois espèces ont été retenues parce que leur cerveau est assez gros pour l'imagerie, celui du poisson zèbre et du médaka ne l'étant pas.
Objectifs
Certains poissons présentent des comportements comme l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau de ces poissons, qui présentent des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez ces poissons, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables citées précédemment. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des poissons ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment des cerveaux dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires. Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs différents (EU 1/2 et EU 2/2).
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires. Ainsi, les bénéfices principaux de cette étude sont d’apporter une meilleure compréhension aux mécanismes biologiques fondamentaux d’évolution du cerveau et des comportements dits « intelligents ». L’étude de poissons permet en outre d’élargir le champ de la connaissance à ce groupe, dont l’anatomie du cerveau demeure peu connue.
Procédures
Les poissons seront soumis à 5 tests de comportement avant et après une lésion cérébrale pendant une durée maximale totale de 3 mois (durée des tests après la lésion : 3 à 20 jours, avec une à deux sessions d’une heure par jour). Les tests de comportement seront évalués sur animal vigile au sein de l’EU1/2. Les poissons seront soumis à la procédure de lésion cérébrale par ultrasons durant environ une heure sous anesthésie dans l’EU2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à: - La lésion par ultrasons, qui pourrait créer des problèmes moteurs, et provoquer une brûlure superficielle de la peau au point de contact avec la sonde ultrasons. - L’hébergement individuel et les tests comportementaux, qui nécessitent cet hébergement individuel des individus, et peuvent provoquer un stress pour l’animal. - La manipulation des animaux pour l’anesthésie (stress potentiel).
Devenir
L’euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées par des modèles in silico, puisque nous étudions des comportements complexes. Notre étude nécessite des espèces de poissons téléostéens, qui seuls possèdent la structure cérébrale d’intérêt, le lobe inférieur, et nous avons besoin d’espèces possédant un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisés que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés. Pour comprendre le rôle du lobe inférieur dans ces comportements, l'étude des lésions permet d'évaluer les déficits qui en résultent et d'établir un lien entre structure et fonction..
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses. Des études IRM précédemment publiées chez les mammifères, oiseaux et amphibiens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge et leur bien-être est évalué régulièrement par des zootechniciens compétents. La température de la pièce est surveillée. Après la lésion cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé jusqu'à euthanasie des animaux (20 jours maximum après la lésion). Aussi, la communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs est optimisée pour permettre un suivi adéquat des animaux. Des points limites tels que la nage anormale (sur le dos, sur le côté) ou la rétractation des pigments sont utilisés pour évaluer le bien-être ; ils prennent en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie diluée dans l’eau de leur bassin , ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. L’analgésie par bain en post opératoire a été choisie pour réduire le stress de l’animal, puisqu’une injection demanderait la manipulation du poisson, ce qui produirait un stress trop important. En cas de brûlure légère liée à la température de la sonde, un pansement antiseptique sera appliqué que la plaie jusqu’à cicatrisation. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement, sauf dans les jours suivant la procédure de lésion (durée maximum : 20 jours). Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’intervention puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Lors du transport des animaux, la température de l’eau sera maintenue par l’utilisation de chaufferettes dans la boîte de transport.
Choix des espèces
Les poissons utilisés sont reconnus comme des animaux modèles pour les études anatomiques des structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez 3 espèces qui ont des comportements propres et des cerveaux anatomiquement différents, mais chaque espèce présente des comportements qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée. Nous utilisons dans le cadre de ce projet des poissons adultes, puisqu’il est nécessaire que le cerveau soit mature.
Comprendre le rôle de l’histone variant H2A.X dans le processus mnésique et son ciblage contre la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour savoir si la réparation de l'ADN dans les neurones commande la mémoire et si elle peut être ciblée contre la maladie d'Alzheimer, 1 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever des organes et alimenter une biobanque. 1 152 d'entre elles subissent une chirurgie cérébrale de moins de 40 minutes, 360 une infection chronique dont la phase d'invasion provoque un syndrome fébrile de sept jours, et 216 des injections hebdomadaires pendant treize semaines. Toutes passent des tests cognitifs sur quinze jours, dont un labyrinthe de Barnes qui impose un hébergement individuel, et le porteur fixe la mise à mort à deux signes de souffrance parmi perte de poids supérieure à 20 %, déshydratation, léthargie et absence de toilettage. Les bénéfices annoncés restent de l'ordre de "mieux cerner la stratégie thérapeutique de demain", quand la fièvre, les chirurgies et l'isolement sont déjà programmés.
Objectifs
Des modifications épigénétiques notamment liées aux dommages causés à l'ADN jouent un rôle majeur dans les mécanismes liés à l'apprentissage et la mémoire. Dans ce cas, les dommages sont transitoires et efficacement réparés par des mécanismes encore mal compris dans les neurones. Des dérégulations de ces processus épigénétiques, qui aboutissent à leur signalisation chronique contribuent directement aux troubles mnésiques dans la maladie d'Alzheimer (AD), ainsi qu'au cours d'infections. Le projet a pour objectifs de déterminer l’importance de la détection ou de la réparation des dommages dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans le processus de neurodégénérescence liée à l'AD. L'étude utilisera un modèle trangénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, et l'infection subclinique ou l'expression combinée avec un modèle transgénique permettant de modifier le processus épigénétique dans des régions cérébrales d'intérêt.
Bénéfices attendus
Comprendre l'impact d'infections latentes communes (de seroprevalence 30-70% chez l'humain et qui augmente avec l'âge) sur la réponse au traitement contre la maladie d'Alzheimer est un enjeu clé pour mieux définir les stratégies thérapeutiques futures. Comprendre par quels mécanismes le senseur épigénétique contribue au processus mnésiques et à leurs altérations et évaluer par preuve de concept son potentiel thérapeutique contre la maladie d'Alzheimer permettront de mieux cerner ensuite la stratégie thérapeutique de demain concernant sa manipulation.
Procédures
Les interventions concerneront: i) des injections répétées hebdomadairement pendant 13 semaines, sur animaux vigiles (216 souris, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection de l'agent infectieux, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (360 souris, une injection de quelques secondes); iii) un type de chirurgies sous anesthésie générale de moins de 40 minutes par animal ( 1152 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), des processus cognitifs ( toutes les souris (1368), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), test d'apprentissage et de mémoire spatiale (chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), v)un prélèvement sanguin à la veine caudale pour test sérologique (360 animaux, quelques secondes).
Impact sur les animaux
Dans le cas d'infection, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes, où les souris doivent être hébergées individuellement, des mesures d'enrichissiment du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.
Devenir
A l'issue des 3 procédures, les 1368 souris seront euthanasiées par anesthésie profonde et irréversible, afin de réaliser le prélèvement d'échantillons d'organes, pour réaliser des analyses biochimiques, cellulaires ou moléculaires ou réaliser une biobanque.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant aux dommages de l’ADN. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. De plus, seule l'utilisation de l'animal permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires lors d'infection et de 12 dans le groupe non infecté. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe pour obtenir des résultats interprêtables.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. Les souris sont préalablement familiarisées avec le gel diet dans les jours précédant une chirurgie ou l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Les chirurgies seront menées sous anesthésie générale accompagnée d'une analgésie opiacée en périopératoire et maintenue pendant 48h en post-opératoire. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids) . Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatés à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les test ne requièrent que mobilité, exploration d'objets.
Choix des espèces
La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel de l'agent infectieux que nous étudions, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques de la réponse aux dommages dans l'ADN des neurones dans le cadre d’une infection pertinente. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés ( modèles exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux pour ces modifications géniques n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.