Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisé dans l’étude de la mécano-biologie
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Nées dans les lignées génétiquement modifiées de l'établissement, 2 000 souris subissent l'amputation de deux millimètres de leur queue ou de leur oreille, à l'âge de deux à quatre semaines, pour que leur génotype soit identifié. La procédure dure cinq secondes et se fait sans anesthésie, le porteur estimant qu'une anesthésie générale ajouterait une nuisance non justifiée au regard d'un niveau de souffrance qu'il déclare léger. Aucune n'est tuée au titre de ce seul projet. Leur sort se décide au vu du résultat du génotypage : entrée dans l'expérience d'un autre projet, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement d'organes.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à cette demande d’autorisation de projet), des modèles d'animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. La gestion de l'élevage de l'ensemble des lignées génétiquement modifiées de notre établissement utilisateur répond à des programmes établis en amont par les responsables des projets dans lesquels elles sont nécessaires. Les programmes de reproduction (effectifs de reproducteurs, rythme de production) sont adaptés aux besoins des équipes de recherche en prenant en compte les caractéristiques propres à chaque modèle pour l’obtention des cohortes nécessaires (taux de fertilité, tailles des portées, résultats des génotypages). Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les procédures expérimentales de projets autorisés en utilisation continue et ceux nécessaires au maintien des lignées lorsqu’elles sont régulièrement utilisées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des biopsies de tissus selon des méthodes non invasives ou couplées à une méthode d’identification des animaux. L’objectif de ce projet est de présenter les méthodes de biopsie utilisées au sein de notre équipe pour le génotypage des lignées d'animaux génétiquement modifiés à phénotype non dommageable, utilisées à des fins scientifiques dans le cadre de nos projets et thématiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles d'animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour des projets autorisés dans le cadre d’une utilsation continue. De plus le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue ou au niveau de l’oreille constitue une méthode de génotypage de gravité légère, fiable et minimisant les risques de contaminations entre échantillons.
Procédures
Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue ou de 2mm de tissu à l’oreille x 5 secondes x 1 par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement de tissus.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de ces uniques procédures. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé dans le cadre d’une utilisation continue b/ Utilisés pour le maintien de la lignée c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
Il n’existe aucune alternative à la biopsie de tissus pour avoir accès au matériel génétique afin de le caractériser in vitro. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés utilisés dans le cadre d’une utilisation continue dans d’autres projets.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au strict nécessaire, à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement en individu de même génotype). - Développer et favoriser le recours à des méthodes de biopsies non invasives chaque fois que cela est compatible avec les impératifs scientifiques des projets.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiée au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements à l’oreille sont réalisés en routine sur des animaux de 2 à 4 semaines. Le développement de l’oreille n’atteint sa forme définitive qu'a l'age de deux semaine, permettant de réaliser des biposies sans risques hémorragiques. Les prélèvements de l’extrêmité de la queue peuvent être réalisés jusqu'a 4 semaines après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Influence d’une supplémentation alimentaire en extraits de pépin de raisin suite à une exposition à un stress thermique et/ou à des pesticides sur les performances reproductives, la fertilité et la qualité des descendants des poules et des coqs
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tués en fin d'essai pour prélever leurs organes et pour éviter que les polluants ne se disséminent, 800 poules, coqs et poussins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent une semaine de chaleur excessive, avec halètement, ailes déployées et baisse de la prise alimentaire, tout en recevant des pesticides à des doses dites environnementales. Les coqs passent neuf semaines en cage individuelle et subissent six prélèvements de sperme, les prises de sang allant jusqu'à six par animal. Le choix de l'espèce est assumé comme agronomique : il s'agit de savoir si un extrait de pépins de raisin ajouté à l'aliment protège la fertilité des élevages de volailles contre les vagues de chaleur et les pesticides.
Objectifs
Des études réalisées in vivo ont montré non seulement un effet néfaste du stress thermique (ST) mais aussi celui d'une exposition à des pesticides sur les performances reproductives chez la volaille. D'autre part, ces deux facteurs environnementaux sont associés à une augmentation du stress oxydatif. Cependant, nous ne connaissons pas les effets de leur association sur la fertilité chez la femelle et le mâle et la viabilité des descendants. Les extraits de pépins de raisin possèdent des propriétés anti-oxydantes importantes qui ont pour effet de réduire le stress oxydatif. Ces propriétés sont bénéfiques pour augmenter la durée de vie des cellules et réduire les pertes embryonnaires. Ainsi, notre hypothèse est que les extraits de pépin de raisin pourraient aider à limiter les effets néfastes du ST et/ou de l'exposition aux pesticides. Nos objectifs sont: - de mieux déterminer l'impact d'un ST observé en cas de vagues de chaleur associé ou non à une exposition à des pesticides retrouvés à des doses environnementales sur la fertilité de la poule et du coq. - de tester des approches alimentaires en particulier la supplémentation en extrait de pépins de raisin comme moyen pour réduire les effets néfastes du ST et des pesticides.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les effets physiologiques d’une exposition à un mélange de pesticides associé ou non à un stress de température chez les oiseaux. De plus, il permettra aussi de proposer des solutions afin de limiter les effets négatifs de ces expositions par une supplémentation naturelle en antioxydants.
Procédures
L’ensemble des animaux recevront un stress thermique sur une durée d’une semaine. Ils recevront entre 2 et 6 prélèvements de sang et 6 prélèvements de sperme. Ces actes durent en moyenne 30 secondes. Les coqs seront placés en cage individuelle pour une durée de 9 semaines.
Impact sur les animaux
Pour les coqs, un stress lié au passage en cage peut être observé chez nos animaux, entraînant notamment des troubles du comportement alimentaire qui durent généralement de 48 à 72 heures. Les prélèvements de semences peuvent éventuellement engendrer du stress. Pour les poules et les coqs, l’exposition des animaux à un stress thermique d’élévation de température peut entrainer un inconfort avec une réduction de la prise alimentaire et des manifestations de halètement et de déploiement des ailes pour réguler la température corporelle. De plus, la contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les pesées peuvent aussi engendrer du stress.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer le prélèvement d'organes et/ou pour éviter la dissémination des polluants.
Remplacement
Pour évaluer les réponses physiologiques telles que l’évolution du poids, l’engraissement, la performance de ponte et la fertilité, il faut disposer des mesures sur les animaux et le modèle le plus adapté est la poule, le coq et le poussin dans notre protocole.
Réduction
Du sang sera prélevé sur des poules, coqs et poussins. Pour les adultes, cela constitue l’ensemble des animaux en expérimentation alors que pour les poussins cela représente environ 20% des animaux. Nous cherchons à mettre en évidence des variations possibles du stress thermique et/ou des pesticides mais aussi celles de la supplémentation en extraits de pépin de raisin sur les performances de ponte et de fertilité et des marqueurs physiologiques de stress cellulaire. Un des paramètres principaux de ce stress est l’index de stress oxydatif de l’animal. L’unité statistique pour les analyser sera l’animal qui sera son propre témoin avant et pendant le stress thermique. Pour calculer l’effectif requis pour atteindre une puissance de 80%, nous nous sommes appuyés sur des études précédentes montrant que 10 animaux sont nécessaires pour voir une différence de ce marqueur en réponse à une supplémentation de 0.5% de la quantité d’aliment en extraits de pépin de raisin. Chez les poules, nous prélèverons non pas 10 mais les 30 animaux de chaque lot car nous souhaitons mesurer la concentration d’hormones impliquées dans l’engraissement et la reproduction dont nous supposons que les différences seront plus faibles entre les lots nécessitant plus d’animaux.
Raffinement
Les poules seront maintenues dans un bâtiment d’élevage standard, au sol sur litière avec copeaux de bois dans des parquets (9 m2) où elles resteront en groupe. Elles disposeront de plusieurs enrichissements (blocs à piquer, perchoir, …). Les animaux auront à disposition des éléments permettant de grimper et de se cacher. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux tout au cours de l’élevage. Pour limiter les phénomènes de picage, des répulsifs dit anti picage pourront être appliqués sur les animaux victimes de picage. Pour les poussins, la taille du parquet sera suffisante pour leur permettre de se déplacer avec une zone de repos significative en plus de l’espace mangeoire et abreuvement. Ils disposeront également de plusieurs enrichissements (balles de couleur…) Les coqs hébergés en cages individuelles pendant 9 semaines comprenant 2 semaines d’adaptation bénéficieront d'un milieu enrichi par un jouet à picorer et de la proximité avec leurs congénères permettant des échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les animaux seront soumis à une observation soutenue, plusieurs fois par jour, afin de détecter le plus précocement possible toute dégradation du bien-être. Un arbre de décision visant à faciliter la gestion quotidienne des animaux (atteinte ou non du point limite) a été développé et sera fourni aux techniciens chargés du suivi des animaux. Deux expérimentateurs seront mobilisés afin de permettre la réalisation d'une contention appropriée du poulet par l'un pendant que l'autre réalisera la prise de sang. Ceci permettra de limiter les mouvements éventuels des animaux susceptibles d'engendrer un échec de la prise de sang.
Choix des espèces
La poule et le coq ont été choisis comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Nous étudierons les animaux à deux stades physiologiques différents: -stade adulte (poules et coqs) afin d’étudier les performances reproductrices et la ponte chez les poules. - stade jeune poussin afin de déterminer l'effet du ST et/ou d'une exposition de pesticides sur la croissance des descendants.
Etude des mécanismes permettant aux cellules B régulatrices induites de soigner la sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
4 283 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 2 387 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 1 896 un niveau sévère. Une paralysie partielle leur est provoquée par deux injections sous-cutanées qui déclenchent une attaque de leur propre système nerveux central, et elles subissent par ailleurs quatre gavages, des prélèvements de sang, une biopsie de la queue dès l'âge de sept jours et plusieurs injections. L'enjeu déclaré est de comprendre comment des cellules B régulatrices, transférées en grand nombre, ramènent la maladie en rémission, avec l'espoir d'un traitement contre la sclérose en plaques. Le porteur affirme qu'aucune alternative n'existe, la migration des cellules immunitaires vers le système nerveux central n'étant pas modélisable in vitro à ce jour.
Objectifs
L'objectif du projet est de mieux caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B dans différents modèles de sclérose en plaques. La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire du système nerveux central. Elle est la première cause de déficit neurologique chez le jeune adulte. Les femmes sont atteintes deux fois plus que les hommes et le coût socio-économique de la sclérose en plaques est le second après les traumatismes dans ce groupe d’âge. Il n’y a actuellement pas de traitement curatif pour la sclérose en plaques qui est donc une maladie chronique persistant tout au long de la vie du patient. Certains traitements permettent d’en ralentir la progression chez certains patients. La sclérose en plaques implique des cellules du système immunitaire qui attaquent le système nerveux central. L’activation des cellules pathogènes est normalement inhibée par un autre type de cellules immunitaires appelées cellules B régulatrices. Les cellules B régulatrices sont déficitaires chez les patients atteints de sclérose en plaques si bien qu’elles ne bloquent plus l’activation des cellules qui causent la maladie. Il y a un grand espoir qu’il soit possible de traiter la sclérose en plaques en transférant des cellules B régulatrices chez ces patients. Des cellules B régulatrices peuvent être produites en grand nombre en utilisant un protocole récemment établi. La sclérose en plaques peut être modélisée chez la souris, et il a été démontré dans ce modèle que les cellules B régulatrices étaient essentielles à la rémission de la maladie. En utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, ces cellules sont capables de contrôler le développement de la pathologie ainsi que d’en induire la rémission. Nous souhaitons dorénavant mieux comprendre le mode d'action des cellules B régulatrices ainsi que de raffiner leur utilisation.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation d'une nouvelle approche de thérapie cellulaire basée sur les cellules B régulatrices pour traiter la sclérose en plaques, et la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet thérapeutique de ces cellules immunorégulatrices au niveau de l'organe atteint dans cette maladie, le système nerveux central. Ce modèle est prédictif de la sclérose en plaques, et a déjà servi à la mise en place des traitements principaux aujourd'hui utilisés pour cette maladie.
Procédures
Identification d'un animal : ~10 secondes. Biopsie caudale : ~5 secondes. Prélèvement sanguin : ~15 secondes. Gavage x4 : ~20 secondes/gavage. Anesthésie : ~15 minutes. Deux injections sous cutanées : ~30 secondes. Injection intra-péritonéale : ~10 secondes/injection. Une injection intra-veineuse : ~45 secondes. Anesthésie x2 par voie intra-péritonéale : ~15 minutes. Les injections sous-cutanées se font sur animaux anesthésiés. Les autres interventions se font sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Injection intra-péritonéale = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection sous-cutanée = douleur légère, de courte durée et localisée. Injection intra-veineuse = douleur légère, de courte durée et localisée. Contention dans un tube adapté à la taille de la souris pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Gavage = contention soutenue, introduction de la sonde dans l’œsophage et jusqu’à l’estomac pouvant induire un léger stress de manière transitoire. Prélèvement sanguin = douleur légère, de courte durée et localisée. Biopsie caudale = douleur modérée, de courte durée et localisée. Identification = douleur légère, de courte durée et localisée. Nuisance liée au modèle EAE=paralysie partielle et transitoire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tissus d'intérêt.
Remplacement
Ce projet vise à caractériser l’effet de lymphocytes B dans deux modèles de sclérose en plaques. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires entre différents organes qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du systèmes nerveux central impliquent également la migration des cellules du système immunitaire dans le système nerveux central, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du système nerveux central. Ces processus ne sont actuellement pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez l'animal.
Réduction
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Ces estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec un programme d'analyse de puissance statistique. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Une veille bibliographique sera effectuée dans ce contexte scientifique afin d'éviter la duplication inutile de travaux.
Raffinement
Le protocole d'induction du modèle expérimental de sclérose en plaques a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission après un court épisode de paralysie afin de réduire la souffrance des animaux. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites adaptés qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable et inutile des souris. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal ainsi que par le/les expérimentateur(s). Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement. les animaux sont hébergés par groupes sociaux et dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
Le modèle expérimental de sclérose en plaques chez la souris a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients. Il s'agit donc d'un modèle pertinent pour le développement et la compréhension de nouvelles pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. Utilisation de souris à partir de l’âge de 7 jours pour effectuer les gestes d'identification ainsi que le prélèvement pour la biopsie. Utilisation des souris à partir de 4 semaines pour effectuer un prélèvement pour génotypage ou pour effectuer un gavage. Cet âge est requis afin de s’assurer que les souris aient une taille appropriée et suffisante pour effectuer les gestes susmentionnés sans porter atteinte à leur intégrité physique. A partir de 6 semaines d’âge et jusqu'à 16 semaines d’âge, les souris pourront être immunisées pour induire l'encéphalomyélite autoimmune expérimentale parce que cela correspond à l'âge pendant lequel la maturité du système immunitaire est adaptée pour étudier la pathogenèse de la maladie.
Modification génétique sur le modèle souris par CRISPR/Cas9
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles "réformées", déjà destinées à la mise à mort par l'animalerie, sont utilisées pour prélever les embryons qui servent à tester les stratégies d'édition génétique. 325 souris au total vont être utilisées, 125 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 200 un niveau modéré. Les donneuses reçoivent deux injections espacées de deux jours puis sont tuées pour qu'on prélève leurs embryons, et les porteuses subissent une chirurgie de réimplantation de dix minutes. Elles sont tuées après le sevrage de leurs petits, au motif qu'une femelle déjà opérée ne peut pas être réutilisée, tandis que les souriceaux génétiquement modifiés partent vers le projet du chercheur qui les a commandés.
Objectifs
Lorsque l’on veut étudier les mécanismes biologiques complexes qui régulent le développement et le fonctionnement des mammifères, la souris est un modèle privilégié, autant pour sa facilité d'élevage que pour sa proximité génétique avec l'homme. Les recherches scientifiques en biologie s'appuient depuis de nombreuses années sur les souris modifiées génétiquement. La technique que nous utilisons consiste à délivrer un ciseau moléculaire (CRISPR/Cas9) dans un embryon de souris au stade 1 cellule, ce qui va introduire une modification génétique spécifique dans le génome. Les souriceaux issus de la réimplantation dans une mère porteuse sont testés pour détecter la modification génétique. Les animaux porteur de la modification sont ensuite accouplés pour établir une lignée génétiquement modifiée. Par rapport aux techniques précédentes (transgénèse par cellules souches embryonnaires notamment), la technique de CRISPR/Cas9 permet de produire des modèles expérimentaux plus rapidement, en utilisant moins d’animaux. Notre Institut a mis en place un plateau commun pour développer ces modèles de souris transgéniques. La mise à disposition de ce plateau équipé et de personnels expérimentés permet d’augmenter de façon importante les taux de réussite et donc à la fois de réduire le nombre d’animaux utilisés et de raffiner la mise en œuvre des procédures.
Bénéfices attendus
La souris est un modèle privilégié pour la recherche fondamentale en biologie, notamment lorsqu'il faut étudier les mécanismes complexes du développement, de la neurogénèse, etc... Les modèles transgéniques murins que nous réalisons sont indispensables pour mieux comprendre ces mécanismes. Les bénéfices attendus de ce projet sont de maintenir un niveau de compétence élevé du plateau commun, tant sur le plan matériel qu’humain, grâce à la prise en charge régulière de projets d’obtention de lignées transgéniques.
Procédures
Les animaux seront soit soumis à 2 injections d’une durée de 10 secondes chacune (espacées de 46-48 heures), soit soumis à une unique chirurgie d’un maximum de 10 minutes.
Impact sur les animaux
La réimplantation est une procédure chirurgicale qui peut entrainer des douleurs, des infections et du stress. Les signes de douleurs ne sont plus normalement présents le lendemain de la chirurgie. Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 10 secondes. Ces injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum. Les animaux génétiquement modifiés peuvent éventuellement présenter un phénotype dommageable.
Devenir
Toutes les femelles donneuses seront mises à mort afin de pouvoir obtenir les embryons zygotes. Toutes les femelles porteuses seront mises à mort lorsque leurs petits auront été sevrés. En effet, nous ne pouvons pas réutiliser une femelle qui a déjà subi une chirurgie. Les animaux générés par le plateau technique seront transférés dans le projet du chercheur qui les utilisera.
Remplacement
Le modèle souris est un modèle d’étude indispensable pour les recherches qui sont menées dans notre institut, notamment pour les thématiques de biologie du développement. Même si des modèles in vitro de remplacement sont largement utilisés (modèles in silico, cultures cellulaires 2D, cultures de neurosphères, d’organoides), seuls les modèles animaux (la souris dans notre cas) permettent des études intégrées, reflétant la complexité d’un organisme entier. Les possibilités de remplacement seront aussi évaluées en amont par chaque responsable de projet accepté par la plateforme.
Réduction
La technique d’édition du génome CRISPR/Cas9 est très efficace. Grâce aux performants outils de bio-informatique disponible, il est possible d’optimiser les résultats, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour générer les souris fondatrices modifiées génétiquement. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences nécessaires, nous avons mis en place une expérience test in vitro pour vérifier/comparer les stratégies d’édition et ainsi choisir les outils les plus performants. Pour cette expérience, nous utilisons des femelles donneuses d’embryons issus de notre animalerie et qui sont réformées (et donc normalement destinées à la mise à mort). En sélectionnant la meilleure stratégie d’édition, nous pouvons limiter le nombre de femelles à réimplanter.
Raffinement
Pour la réimplantation, les souris porteuses reçoivent une injection d’analgésique 30 min avant d’être anesthésié. En fin de chirurgie, les souris reçoivent une injection d’analgésique. Après la chirurgie, la surveillance renforcée permettra une vigilance accrue en cours d’expérimentation et la détection de l’atteinte des points limites.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris, modèle mammifère dans lequel il est possible d’introduire des mutations génétiques ciblées ou des transgènes rapporteurs de l’expression d’un gène d’intérêt. C’est aussi le modèle génétique le plus proche de l’Homme. Dans ce contexte, les résultats obtenus à la suite des expériences proposées pourront potentiellement trouver une application dans des études d’intérêt thérapeutique chez l’Homme. Les femelles donneuses seront utilisées entre 4 et 7 semaines car c’est à cet âge qu’on obtient le plus grand nombre d'embryons au stade 1 cellule. Les femelles porteuses réimplantées seront mises à mort après le sevrage de leurs petits (on ne peut pas réutiliser un animal ayant déjà subi une chirurgie).
MeCP2_Cortex_KO
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une prostration, une difficulté respiratoire majeure ou une perte de poids supérieure à 20 % déclenchent la mise à mort par dislocation cervicale. 240 souris mâles privées de la protéine MeCP2 dans le cerveau vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cortex à la naissance puis à deux, quatre, six et huit semaines. Le porteur indique que le déficit neurologique apparaît vers la cinquième semaine, avec ataxie, tremblements, nervosité et respiration difficile, et que la moitié de ces souris meurent d'elles-mêmes à six semaines, 90 % à huit semaines. Le projet vise à valider une hypothèse sur l'organisation de l'ADN dans les neurones, un traitement pour les filles atteintes du syndrome de Rett restant, lui, une perspective.
Objectifs
L'ADN, qui contient l’ensemble des informations nécessaires au fonctionnement de nos cellules, est organisé sous une forme compacte appelée chromatine. Cette structure doit être souple et adaptable pour permettre aux cellules de fonctionner correctement. Lorsque cet équilibre est perturbé, cela peut entraîner des maladies, notamment des maladies dites « épigénétiques », qui affectent l’expression des gènes sans modifier directement l’ADN. Le syndrome de Rett est un exemple de maladie épigénétique rare qui touche presque exclusivement les filles. Il se manifeste par des troubles du développement neurologique entraînant un polyhandicap sévère, incluant une déficience intellectuelle, des troubles du spectre autistique et des complications respiratoires et cardiovasculaires pouvant réduire l’espérance de vie. Cette maladie est liée, dans la majorité des cas, à une mutation du gène MeCP2, situé sur le chromosome X. Les recherches sur le syndrome de Rett reposent en grande partie sur des modèles de souris génétiquement modifiées, permettant d’étudier la fonction de MeCP2 dans le cerveau. Il a ainsi été démontré que cette protéine joue un rôle clé dans le développement du système nerveux. Nos travaux récents suggèrent que le syndrome de Rett pourrait être une maladie de la chromatine : la mutation de MeCP2 empêcherait son rôle essentiel dans l’organisation de la chromatine des neurones, en perturbant son interaction avec certaines séquences répétées d’ADN. Pour mieux comprendre cette hypothèse, nous étudierons la fonction de MeCP2 dans le développement du cortex chez un modèle murin du syndrome de Rett.
Bénéfices attendus
Ce projet associera différentes approches fonctionnelles à l'échelle du génome novatrices et complémentaires. Il permettra une meilleure compréhension de la fonction neuronale de MeCP2, et clarifia l'étiologie moléculaire du syndrome de Rett. Les données obtenues pourraient conduire au développement de nouvelles thérapies pour cette maladie neuro-développementale sévère et incurable. De plus, nos travaux contribuent à la compréhension du rôle des courtes séquences d'ADN répétées sur l'organisation tridimentionnelle du génome et l’expression des gènes au cours du développement du cerveau, et peuvent avoir un impact plus large, notamment sur l'identification des mécanismes moléculaires impliqués dans les troubles du spectre autistique et dans les maladies neurodégénératives.
Procédures
Nous envisageons d'effectuer nos expériences sur des cortex prélévés sur des souris agées de 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. Mais le déficit neurologique des mâles dépourvus en MeCP2 débute entre 4 et 5 semaines, entrainant une létalité de 50% à 6 semaines et de 90% à 8 semaines. Les souris agées de 6 ou 8 semaines seront donc probablement difficile à obtenir. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal pour ces souris, nous avons choisi une application stricte de point limite dès les premiers signes de souffrance (diminution importante de l’activité motrice ou prostration, difficulté respiratoire majeure ou perte de poids supérieure à 20% au poids attendu). Les souris seront observées quotidiennement, l'une de ces observations suffira à mettre en œuvre le point limite et les animaux seront mis à mort.
Impact sur les animaux
Les troubles neurologiques décris chez les souris où MeCP2 a été inactivée spécifiquement dans le cerveau à un stade embryonnaire précoce sont bien décris. Ils apparaisent vers la 5ème semaine et associent de l'ataxie, une hypoactivité, des tremblements, de la nervosité, une respiration diffcile et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem du cortex.
Remplacement
En associant des données biochimiques, structurales obtenues in vitro à des données génomiques obtenues à partir de cellules en culture, nous avons accumulé beaucoup de résultats préliminaires qui suggèrent que MeCP2 puisse agir comme un facteur de transcription pionnier dans les neurones, capable d'envahir la chromatine en se liant aux répétitions CA. Le syndrome de Rett pourrait ainsi être considéré comme une "maladie de la chromatine" provenant de l'incapacité qu’a MeCP2, lorsqu’elle est mutée, à moduler l'organisation de la chromatine. Nous souhaitons dans ce projet valider définitivement notre hypothèse de travail par des expériences effectuées sur l'animal, étape indispensable pour le développement d’approches thérapeutiques.
Réduction
Nous ne travaillerons que sur des souris mâles pour lesquelles l'expression de MeCP2 aura été supprimée dans le cerveau, car les femelles équivalentes ne sont pas viables. L’objectif est ensuite de minimiser le nombre d'animaux utilisé tout en assurant une puissance statistique suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives des données issues des analyses par séquençage haut-débit et atteindre l'objectif scientifique du projet. Nous estimons que de 3 à 5 réplicats biologiques seront nécessaires par expérience et par âge, soit un total de 240 souris en tenant compte de leur mortalité précoce.
Raffinement
Les mâles KO pour MeCP2 présentent une régression neurologique importante conduisant à une mort prématurée typiquement entre 6 et 8 semaines. Pour éviter d’avoir comme point limite la mort de l’animal, nous avons choisi une application stricte de point limite. Les souris seront observées quotidiennement et notées selon une grille de scoring de la douleur appliquée à l’animalerie qui repose sur l'aspect général (poids corporel, apparence physique, signes cliniques mesurables) et le comportement (modifications du comportement non provoqué, et après stimulation) : -Un score de niveau zéro n’entrainera aucune intervention particulière. -Un score de niveau 1 entrainera des soins spécifiques comme l’utilisation d’aliments gélifiés à même la litière afin de faciliter l’accès à la nourriture des animaux présentant une hypoactivité ou de l’ataxie, l’utilisation de tunnels de transfert pour la manipulation des souris présentant un phénotype de nervosité, l’utilisation d’analgésiques complémentaires, un contrôle biquotidien, une pesée régulière, une consultation éventuelle avec la Structure du Bien-Etre Animal et le vétérinaire. -Un score de niveau 2 sera le point limite et nécessitera une décision de mise à mort par la méthode de dislocation cervicale.
Choix des espèces
La lignée de souris crée est le modèle murin idoine puisqu'il développe des symptômes cliniques similaires au syndrome de Rett, avec un déficit neurologique sévère qui apparait vers la 5ème semaine et une létalité de 50% à 6 semaines. Pour ces raisons, nos expériences seront limitées aux 8 premières semaines de vie mais à différentes étapes du développement du cortex : 0, 2, 4, 6 et 8 semaines. La multiplication des points de cinétique est essentielle à notre étude puisqu'elle permettra de vérifier si la fonction chromatinienne de MeCP2 lors du développement post-natal, est concommitante à l'apparition des troubles neurologiques dans les neurones en maturation dépourvus de MeCP2.
Rôle du récepteur nucléaire des oestrogènes ERα dans le contrôle de la fertilité
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
Mutées pour le récepteur des œstrogènes, une partie des 120 souris de ce projet présente déjà un excès d'androgènes et une fonction ovarienne perturbée, à l'image du syndrome des ovaires polykystiques humain. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Leurs ovaires sont échangés par chirurgie avec ceux de souris témoins, en cinq minutes par animal, puis un accouplement est imposé un mois après la greffe pour voir si un ovaire devenu non fonctionnel peut mener une gestation. Le porteur décrit une douleur prise en charge par un analgésique morphinique local et n'annonce aucun autre effet indésirable, les femelles étant tuées en fin de procédure pour prélèvement de l'utérus et des ovaires.
Objectifs
La prévalence des problèmes d'infertilité féminine et du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez les femmes en âge de procréer varie entre 6 et 20 %, selon les critères de diagnostic utilisés. Plusieurs facteurs interdépendants, tels que l'excès d'androgènes, l'hypersécrétion de l'hormone lutéinisante (LH), des anomalies dans la sécrétion de l'hormone folliculo-stimulante (FSH) et la résistance à l'insuline, contribuent à la variabilité des manifestations cliniques du SOPK. Ces caractéristiques sont observées chez des souris mutées pour le récepteur des œstrogènes. Le projet vise principalement à étudier le rôle des mutations du récepteur des œstrogènes dans le contrôle de la fertilité. Dans ce but, nous remplacerons les ovaires des souris contrôles par les ovaires de souris mutés pour le récepteur des oestrogènes, et vice versa. Un mois après la greffe, nous analyserons i) les taux hormonauxcirculants dans le sérum de ces souris et ii) la fonction ovarienne par une analyse anatomopathologique. Enfin, après avoir réalisé des accouplements contrôlés de ces souris greffées, nous déterminerons si ces ovaires greffées non fonctionnels retrouvent leur fonction et permettent de mener à bien une gestation. Nous suivrons ainsi la prise de poids de ces souris et analyserons la gestation en observant le nombre de bébés nés et éventuellement le nombre de fœtus implantés et les résorptions. Des souris intactes serviront de contrôles pour ces expériences.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra d'étudier l'impact des mutations du récepteur des oestrogènes dans le syndrome des ovaires polykystiques et de différentier les actions respectives des oestrogènes dans l'ovaire et dans l'hypothalamus. A terme, ceci permettra de mieux comprendre la physiopathologie des troubles de la fonction ovarienne conduisant à l'infertilité dans le syndrome des ovaires polykystiques,
Procédures
Les greffe d'ovaires sont réalisées pendant 5minutes par souris avec observation quotidienne pendant 1 semaine. Un accouplement contrôlé des souris est réalisé après un mois de greffe.
Impact sur les animaux
Les greffes d'ovaires peuvent générer une douleur dûe à la chirurgie mais qui sera traitée par un analgésique injecté en sous-cutané avant et après la chirurgie, un analgésique local et pris en compte par une surveillance accrue de l'animal par le zootechnicien, avec enrichissement du milieu et chirurgie sur plaque chauffante.
Devenir
Tous les animaux sont à mis mort en fin de procédure afin de prélever les différents tissus : utérus, ovaires pour études biomoléculaires et analyses histologiques.
Remplacement
Les effets des œstrogènes, principalement synthétisés par les ovaires, impliquent de nombreuses fonctions dans l’organisme. Ces effets complexes ne peuvent être modélisés par des approches in vitro. De plus, l'étude de la fertilité, y compris la gestation et la lactation, nécessite l'observation sur animaux vivants. C'est pourquoi le recours à l'expérimentation animale est indispensable dans ce contexte.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous utiliserons principalement les femelles, étant donné que cette recherche concerne la fertilité. Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au minimum nécessaire, sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé pour assurer des résultats statistiquement significatifs, permettant de distinguer les effets du génotype, du temps et/ou du traitement. Le nombre de souris a été déterminé en utilisant généralement un test statistique, afin de préciser l'effet des variables étudiées.
Raffinement
Les souris subiront des chirurgies dans une salle séparée de la salle d’euthanasie, elle-même séparée de leur pièce d’hébergement. Pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale + anesthésie locale avec analgésique (morphinique) sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Des points limites suffisamment prédictifs et spécifiques au projet seront appliqués en utilisant une grille d’évaluation de la douleur après chaque chirurgie.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris adulte car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation.
Rôle d’HSPB5 dans la sécrétion de vésicules extracellulaires : étude dans un modèle murin de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Un inhibiteur de la protéine HSPB5 développé par le laboratoire comme candidat médicament contre la fibrose pulmonaire motive l'utilisation de 1 040 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une dose de bléomycine leur est administrée en trente secondes par aspiration au fond de la gorge sous anesthésie, ce qui déclenche entre le deuxième et le septième jour une inflammation des poumons, une perte de poids et des troubles respiratoires, puis une fibrose progressive. Le porteur justifie un effectif supérieur aux usages du domaine par la quantité de vésicules extracellulaires qu'il doit obtenir des animaux pour les injecter à d'autres souris. Sur le remplacement, il indique qu'aucun modèle in vitro ne peut se substituer à l'étude d'un "animal entier", le poumon comptant plus de quarante types cellulaires.
Objectifs
Les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique ont une accumulation de vésicules, appelées vésicules extracellulaires (EVs). . Ces vésicules aggravent la maladie de ces patients en transportant des molécules actives (protéines, ADN etc). .Si on inhibe la machine des cellules pour incorporer ces molécules actives dans ces EVs, on réduit la progression de la fibrose dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition de la protéine de stress HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Les objectifs de ce projet sont de : 1) Confirmer que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion des EVs 2) Tester si l’absence d’HSPB5 réduit l’activité des EVs pour aggraver la fibrose.
Bénéfices attendus
Notre laboratoire développe des inhibiteurs de la protéine de stress HSPB5 comme un médicament dans la fibrose pulmonaire. Nous avons déjà des données suggérant que l’inhibition d’HSPB5 modifie la sécrétion d’EVs. Nous devons mieux comprendre les rôles d’HSPB5 pour développer notre médicament et permettre une meilleure prise en charge des patients atteints de fibrose pulmonaire.
Procédures
Les souris seront soumises à une administration unique de bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale (isoflurane). Cette intervention dure 30 secondes maximum.
Impact sur les animaux
Le modèle de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine est le modèle le plus utilisé en recherche dans le domaine de la fibrose. Les souris sont exposées à la bléomycine par aspiration oro-pharyngée sous anesthésie générale. Le modèle est composé d’une étape inflammatoire puis d’une fibrose pulmonaire progressive. Entre 2 et 7 jours après bléomycine, un phénomène inflammatoire se met en place. Il est associé à une perte de poids des animaux, ce qui peut entrainer des troubles respiratoires plus ou moins importants suivant la dose injectée. Pour ce projet, une faible dose de bléomycine sera utilisée. Cette dose permettra de réduire au maximum l’apparition potentielle d’effets indésirables induits chez l’animal, et entrainera une fibrose pulmonaire détectable.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour des études biochimiques et histologiques.
Remplacement
Le poumon est un organe complexe composé de plus de 40 types cellulaires différents et le phénomène de fibrose fait lui intervenir plusieurs processus (inflammation, remodelage tissulaire etc). Aucun modèle in vitro ne pourrait se substituer à une étude sur un animal entier. L’étude de la fibrose pulmonaire chez le rongeur est de ce fait le modèle d’étude de référence dans la littérature.
Réduction
Nous réduirons le nombre d’animaux au minimum requis pour remplir les conditions des tests statistiques. Pour la procédure 2, une analyse de puissance a été réalisée pour établir les effectifs. Pour la procédure 1, les effectifs décrits sont supérieurs au nombre d’animaux utilisés classiquement. Ceci est expliqué par le nombre d’EVs que nous devons produire pour les injections décrites en partie 2 et par les contraintes statistiques associées aux études biochimiques et histologiques (méthodes indispensables à notre projet). Des tests statistiques d’analyse de variance seront réalisés pour toutes les données d’analyses (histologie, dosage de collagène etc). Après avoir déterminé la distribution normale ou non des données, nous utiliserons des tests paramétriques ou non.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé (lumière, température, bruit) au centre de zootechnie de l’université de Bourgogne. Leur surveillance et l’entretien des cages seront réalisés par un personnel expérimenté. Ils bénéficieront d’un enrichissement du milieu de vie par des éléments creux plastiques (tunnels), et des bandelettes de papiers (permettant leur isolement dans la cage). Ils bénéficieront d’un environnement enrichi avec accès ad libitum à des suppléments alimentaires (aliments gélifiés, morceaux de pommes), afin de limiter la perte de poids. Un suivi quotidien par du personnel qualifié et ayant l’habitude du modèle sera réalisé pour repérer au plus vite les éventuels signes de détresse. Les administrations oro-pharyngées seront réalisées sous anesthésie générale de l’animal (isoflurane). Après l’injection, les souris seront placées sous lampe chauffante pour favoriser le retour de l’anesthésie. Une attention particulière sera apportée à la reprise d’une activité normale de l’animal à son réveil de l’anesthésie.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car le processus de fibrose pulmonaire est bien documenté dans la littérature chez cette espèce, ce qui en fait un modèle d’étude validé par la communauté scientifique. De plus, l’utilisation de souris offre l’avantage de pouvoir travailler sur des modèles génétiquement modifiés. Dans ce projet nous utiliserons des souris délétées pour le gène Hspb5. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 14 semaines et avec un poids minimum de 21g. Ces critères correspondent à un stade de développement adulte de l’animal (développement des poumons, système immunitaire mature). D’après notre expérience du modèle, la toxicité de la bléomycine est d’autant plus importante et rapide que les souris sont petites. Pour minimiser les signes de toxicité aigüe de la bléomycine, nous utiliserons des souris de poids supérieur à 21g.
Développement des thérapies pharmacologiques et géniques des surdités
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 343
Des rates gestantes boivent chaque jour une eau additionnée de pesticides organophosphorés ou subissent une exposition quotidienne au bruit, puis l'audition de leurs 294 petits est testée à 21 jours, 3 mois et 6 mois. En parallèle, 90 souris porteuses d'une mutation responsable d'atrophie optique dominante reçoivent une injection dans l'oreille interne, et 45 autres, exposées à un bruit du niveau de ceux rencontrés au travail, reçoivent des injections à travers le tympan. 478 animaux au total, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur attendant chez les rates gestantes de l'agitation, une baisse d'activité et moins d'interactions sociales. Tous sont tués après les derniers tests, leurs cochlées prélevées.
Objectifs
La surdité représente un enjeu majeur de santé publique, avec des causes multiples telles que des facteurs génétiques, l'exposition au bruit, certains médicaments ototoxiques et le vieillissement. À ce jour, les mécanismes exacts responsables de ces pertes auditives demeurent insuffisamment compris, et aucun traitement curatif n'est disponible. Notre recherche se concentre sur trois axes principaux : 1. Développement de thérapies géniques : Nous utilisons un modèle murin simulant la maladie héréditaire d'Atrophie Optique Dominante, qui entraîne une déficience auditive ou visuelle progressive, liée à l’âge à partir de six mois, en comparaison avec les souris témoins. Nous explorons différentes stratégies visant à ralentir ou stopper l'apparition de la déficience auditive chez ces souris. 2. Utilisation des nanoparticules pour le transport de molécules thérapeutiques dans les cellules de l'oreille interne : Cette approche a pour objectif de favoriser la régénération des fibres nerveuses auditives chez des souris adultes ayant subi des lésions auditives dues à un traumatisme sonore. 3. Étude de l'impact de l'exposition au bruit et aux polluants environnementaux chez les rates gestantes : Nous investiguons les effets de ces expositions pendant la gestation sur l'audition des rats descendants.
Bénéfices attendus
Les implications cliniques, sociales et économiques de ce projet sont importantes. Le développement réussi d’une nouvelle technique innovante basée sur la thérapie génique pourrait être appliqué aux patients, offrant ainsi un nouvel espoir aux personnes souffrant d’atrophie optique dominante. Nous savons aujourd’hui que les synapses reliant les fibres nerveuses auditives aux cellules sensorielles de l'oreille interne sont particulièrement vulnérables aux effets du bruit, du vieillissement ou des substances ototoxiques. En démontrant qu’il est possible de traiter ces lésions précoces, nous pourrions proposer des solutions thérapeutiques pour améliorer la qualité de vie des personnes âgées et favoriser un vieillissement en meilleure santé. Enfin, il n'existe actuellement aucune législation européenne encadrant les risques d'exposition au bruit ou aux polluants sur l'audition du fœtus pendant la grossesse. Nos résultats obtenus de ce projet fourniront des données précieuses sur les troubles auditifs chez les descendants dont les mères ont été exposées au bruit ou aux polluants pendant la grossesse.
Procédures
1. Injection de molécules thérapeutiques génétiques dans l'oreille interne est une technique maîtrisée par notre équipe. Cette intervention, qui durera entre 10 et 20 minutes, nous permettra d'explorer différentes stratégies génétiques pour ralentir ou stopper les troubles auditifs (comme les bourdonnements d’oreille ou les difficultés à comprendre dans un environnement bruyant) causés par une mutation du gène . Pour mener à bien ces tests, nous aurons besoin de 90 souris présentant cette mutation. 2. Injection de traitements pharmacologiques pour traiter les troubles auditifs. Nous allons effectuer des injections intra-tympaniques de molécules thérapeutiques pharmacologiques chez des souris ayant subi des lésions nerveuses auditives, provoquées par une exposition à des bruits fréquemment rencontrés sur les lieux de travail. Cette injection durera environ 5 minutes. Pour cette étude, nous avons besoin de 45 souris exposées à ces bruits. 3. Effets du bruit et des pesticides sur les rats gestants: Des rates gestantes de 5 mois seront exposées quotidiennement à du bruit environnemental ou à des pesticides organophosphorés (dissous dans l’eau de boisson). Ces facteurs de pollution sont courants dans notre environnement quotidien. Nous évaluerons l’audition de leurs petits à l'âge de 21 jours, 3 mois et 6 mois, en utilisant des tests fonctionnels et morphologiques. Pour cette étude, nous avons besoin de 49 rates gestantes. Nous estimons obtenir environ 294 descendants. À la fin de chaque expérience, après les tests auditifs finaux (soit 6 mois après le traitement, soit 6 mois après la naissance), les animaux seront euthanasiés, et leurs cochlées seront prélevées pour des analyses morphologiques et immunocytologiques.
Impact sur les animaux
Lors de l’intervention chirurgicale pour l’administration locale de traitements dans la cochlée, les animaux pourraient éprouver une douleur modérée pendant leur réveil et durant les 12 heures suivant l’opération. Pendant les tests fonctionnels, une douleur légère pourrait être observée en raison de l'injection d'un médicament destiné à endormir l'animal. Selon les données publiées dans la littérature, aucune douleur ni perte de poids n'ont été observées chez les rates gestantes exposées aux doses autorisées de pesticides dans l'eau potable . Cependant, bien que le bruit utilisé dans cette expérience soit un bruit à un niveau conforme aux normes autorisées, il pourrait tout de même influencer la physiologie et le comportement des rates gestantes, qui sont plus sensibles aux changements de leur environnement. Nous nous attendons ainsi à observer des modifications de leur comportement, comme de l’agitation, une baisse de leur activité ou une diminution de leurs interactions sociales.
Devenir
A la fin des derniers tests d’exploration fonctionnelle soit à l’âge de plus 6 mois, tous les animaux participant à l'étude seront euthanasiés.
Remplacement
Dans le cadre de notre démarche visant à respecter la règle des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en matière d’expérimentation animale, nous avons déjà réalisé des études in vitro sur des cellules de patients atteints d’atrophie optique dominante ainsi que sur des cellules cochléaires provenant des souris, un modèle qui reproduit une perte de synapse de la cochlée. Cependant, pour prouver que nos stratégies thérapeutiques peuvent réellement restaurer la fonction auditive, il est indispensable d’utiliser des modèles animaux in vivo, qui sont plus proches des conditions réelles observées chez les humains. Nous avons également étudié l’effet toxique de certains fongicides sur des cellules cochléaires de souris, mais pour mieux comprendre l’impact de ces polluants sur l’audition, en particulier en lien avec des troubles comme l’autisme ou les maladies neurodégénératives, l’utilisation de modèles animaux plus complexes, tels que le rat, s’avère nécessaire. Ces études in vivo nous permettront de mieux comprendre les relations possibles entre une exposition prolongée au bruit ou à des polluants environnementaux pendant la grossesse et les troubles auditifs observés chez les descendants.
Réduction
Nous nous engageons à utiliser uniquement le nombre d’animaux strictement nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques. Voici la répartition prévue : • Pour développer des traitements génétiques visant à ralentir ou stopper l’apparition des troubles auditifs liés à un défaut génétique : Nous tiendrons compte des différences individuelles dans la gravité et la progression des symptômes. Grâce à un calcul statistique, nous avons déterminé qu’un total de 90 souris serait nécessaire, réparties en 6 groupes de 15 souris. • Pour évaluer l’effet de deux traitements pharmacologiques contre une surdité induite par l’exposition au bruit : Afin de limiter le nombre d’animaux, un seul groupe témoin sera utilisé. En tout, 45 souris seront nécessaires, réparties en 3 groupes de 15 souris. • Pour étudier l’impact de l’exposition aux polluants de rates gestantes sur l’audition de leurs descendants : Nous réduirons également le nombre d'animaux en utilisant un groupe témoin de 15 rates gestantes non exposées, et deux groupes de 17 rates chacune, exposées soit à un cocktail de polluants, soit au bruit. Cela représente un total de 49 rates gestantes. Nous prévoyons d’obtenir environ 90 jeunes rats dans le groupe témoin, 102 dans le groupe exposé aux polluants , et 102 dans le groupe exposé au bruit. Ces effectifs sont suffisants pour mener à bien l’ensemble des évaluations fonctionnelles et des analyses morphologiques prévues dans le protocole expérimental. Pour les analyses morphologiques, nous envisageons d’inclure environ 5 à 6 jeunes rats par type d’analyse, à chaque point temporel (21 jours, 3 mois et 6 mois), et pour chaque sexe. Cela représente environ : 5 rats × 3 types d’analyse × 3 âges × 2 sexes = environ 90 rats par groupe. Ces choix ont été faits afin de minimiser l’utilisation d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques solides et fiables
Raffinement
Dans les groupes d'animaux utilisés pour développer des traitements génétiques et pharmacologiques : • Les animaux seront observés quotidiennement dès leur inclusion dans le protocole expérimental. • Ils seront hébergés dans un environnement enrichi, avec des copeaux, des rouleaux de cellulose, et des refuges en plastique pour améliorer leur bien-être. • Après l’opération, une injection sous-cutanée d'antibiotiques sera administrée pour prévenir les infections. Si des signes de douleur ou d'inconfort sont détectés, une euthanasie anticipée sera effectuée pour éviter toute souffrance. • Le réveil après l’opération aura lieu dans un espace isolé. Une fois réveillées, les souris seront remises avec d’autres souris qui étaient dans la même cage et opérées le même jour. • Une visite quotidienne, y compris les week-ends, sera assurée pour veiller à leur état de santé. • Les tests auditifs seront réalisés chez les animaux anesthésiés. Ces tests, non-invasifs, sont couramment utilisés chez l’humain sans anesthésie. Dans l'étude de l'impact de l’exposition aux polluants sur l’audition des descendants de rates gestantes : • Les rats gestants seront surveillés régulièrement tout au long de la grossesse et après la naissance de leurs petits. • Une grille de suivi sera utilisée pour évaluer l'état des animaux. • Pour réduire le stress lié à l’exposition au bruit, les femelles gestantes seront maintenues en groupes sociaux, favorisant ainsi les interactions positives entre elles pour diminuer le stress.
Choix des espèces
Pour évaluer la possibilité de restaurer la fonction auditive chez les patients atteints d'atrophie optique dominante (AOD), nous avons choisi d'utiliser des souris mutantes qui présentent une neuropathie auditive et optique, reproduisant la condition humaine AODplus. Nous testerons également des traitements pour favoriser la repousse des fibres du nerf auditif à l'aide de de petites molécules qui imitent le facteur de croissance, protégées dans de très petites particules. Ces traitements seront testés sur un modèle de souris ayant une synaptopathie auditive, causée par une exposition à un bruit rencontré dans le lieu de travail. Enfin, nous étudierons l'impact sur l'audition des jeunes rats dont les mères auront été exposées au bruit ou aux pesticides pendant leur grossesse. Les souris mutantes et les souris sauvages exposées au bruit auront entre 1 et 2 mois, et seront suivies pendant 1 à 6 mois après le traitement afin d'évaluer les effets protecteurs des traitements sur l'audition. Pour examiner l'impact des bruits et polluants sur l'audition fœtale, nous utiliserons des femelles rats gestantes. Les humains et les rats réagissent de manière similaire aux sons de basse fréquence, ce qui permet d’étudier les effets de l'exposition au bruit. L’audition des rats se développe après la naissance, tandis que celle des humains est déjà active avant la naissance. Cette différence permet de mieux comprendre comment le bruit et les polluants influencent le développement et la maturation de l'audition.
Création d’un nouveau modèle d’hypertension pulmonaire thromboembolique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
188 souris vont être utilisées, dont 144 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 44 opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. L'artère pulmonaire droite leur est ligaturée, par ouverture du sternum ou par ouverture du thorax entre les côtes, avec un risque d'hémorragie, d'arrêt cardiorespiratoire et de pneumothorax, et une partie d'entre elles se réveille pour vivre quatre semaines avec cette artère fermée. L'objet du projet est de fabriquer chez la souris un modèle de maladie déjà obtenu chez le rat et le cochon, afin de disposer des outils génétiques propres à cette espèce. Le porteur qualifie l'hypertension ainsi provoquée d'asymptomatique et sans effet indésirable, en s'appuyant sur ses résultats chez le rat, et écrit que le recours aux animaux est "indispensable".
Objectifs
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) est une maladie cardio-pulmonaire sévère. Elle est caractérisée par une augmentation anormale de la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAPm) au-dessus de 25 mmHg au repos. Cette élévation de la PAP aboutie à une hypertrophie cardiaque droite puis à une insuffisance cardiaque. L’HTP-TEC est due à une obstruction des grosses artères pulmonaires suite à la mauvaise résolution d'un caillot de sang (embolie pulmonaire). L’embolie pulmonaire est une maladie fréquente. En France, au moins 35,000 cas sont traités chaque année. Chez 1 à 3% des survivants, la persistance d’une obstruction artérielle pulmonaire cicatricielle associée à des anomalies des petits vaisseaux pulmonaires peut conduire à une HTP-TEC. La plupart du temps, l'HTP-TEC se soigne bien, avec un acte chirurgical qui vise à retirer le matériel qui obstrue les vaisseaux bouchées (thromboendarectomie). Cependant, dans certain cas, l'augmentation du flux sanguin dans les territoires non obstrués conduit à une altération des petits vaisseaux pulmonaires distaux (inférieurs à 500µm de diamètre) non "débouchables" par la chirurgie. Le modèle le plus pertinent d'HTP-TEC actuel est un modèle d'embolisation pulmonaire par de la colle biologique chez le cochon. Ce modèle de gros animal est difficilement reproductible par des équipes non expertes et ne permet pas de tester à grandes échelles les traitements qui sont excessivement onéreux. Un nouveau modèle chez la souris permettra de mieux comprendre comment se mettent en place les lésions distales d'HTP-TEC et comment soigner cette pathologie. En effet, les patients deviennent symptomatiques (essoufflement à l'effort) et ne sont diagnostiqués que dans les stades terminaux de la maladie. ll n'est donc pas possible de disséquer l'histoire naturelle du développement des lésions pulmonaires chez l'homme. C'est pour cette raison que nous travaillerons avec un modèle animal de cette maladie finalement assez fréquente mais mal comprise et mal traitée en dehors du traitement chirurgical. Développer un modèle d'HTP-TEC chez la souris est donc un enjeu majeur pour augmenter la survie des malades.
Bénéfices attendus
L’hypertension pulmonaire thromboembolique chronique (HTP-TEC) représente un défi majeur de santé publique, entraînant un handicap significatif, une insuffisance cardiaque et un risque accru de mortalité en l'absence de traitement. Cette forme grave de maladie vasculaire pulmonaire est souvent méconnue, ce qui entraîne des retards dans le diagnostic et expose les patients à un risque élevé de décès prématuré. À court terme, notre projet vise à établir un modèle expérimental d'HTP-TEC chez une espèce animale pour laquelle une panoplie d'outils génétiques et scientifiques ont déjà été développés et validés. À long terme, l'objectif principal de ce projet est d'améliorer la prise en charge des patients atteints d'HTP-TEC. En développant un modèle animal pertinent de cette maladie, nous espérons mieux comprendre ses mécanismes sous-jacents et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce faisant, nous visons à réduire la morbidité et la mortalité associées à l'HTP-TEC et à améliorer la qualité de vie des patients affectés.
Procédures
Pour une partie des animaux, une hypertension pulmonaire sera induite par ligature de l’artère pulmonaire droite (chirurgie thoracique avec sternotomie, durée de l’acte chirurgical : 40 minutes maximum) sous anesthésie et analgésie. Pour une seconde partie des animaux, une ligature de l’artère pulmonaire droite est réalisée via une thoracotomie (20 minutes), puis les animaux sont réveillés. Ils sont soumis à un examen échocardiographique non invasif 28 jours post-ligature (10-20 minutes sous anesthésie gazeuse) puis sont soumis à une chirurgie terminale via sternotomie sous anesthésie et analgésie (20minutes) sans réveil avec mise à mort subséquente.
Impact sur les animaux
Dans les expériences que nous avons réalisées chez le rat, l’hypertension pulmonaire qui se développe chez nos animaux est cliniquement asymptomatique (hypertension pulmonaire modérée au niveau hémodynamique, sans insuffisance cardiaque), n’entraînant pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (aiguë ou 4 semaines). Les souris sont soumises à une chirurgie (sous anesthésie) qui est un acte douloureux et seront prises en charge par ailleurs. Cette intervention peut engendrer des complications telles qu’hémorragies, arrêt cardiorespiratoire ou pneumothorax. Ces risques restent rares dans notre expérience grâce à l’expertise chirurgicale de l’équipe. L’augmentation du nombre d’animaux demandée dans cet avenant correspond à l’ajout d’un groupe expérimental (ajout de la lignée C57BL/6J), et non à une anticipation de pertes liées à ces complications. Une partie des animaux sera soumise à une échocardiographie sous anesthésie, qui est une procédure non invasive et non douloureuse.
Devenir
Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire, cellulaire et histologique) du cœur et des poumons (nécessité de prélever les organes).
Remplacement
L'objectif de recherche est d'étudier et comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans le développement de l’hypertension pulmonaire. Le recours à des animaux est indispensable et se justifie par la nécessité d'étudier la fonction ventriculaire droite, la réactivité vasculaire, l'histologie pulmonaire dans un contexte physiologique et pathologique. Ce projet se justifie également par l'impossibilité de simuler ex vivo la mise en place d'une hypertension pulmonaire puis d'une altération cardiaque droite chez l'humain qui est un processus multifactoriel complexe.
Réduction
En fin d’expérimentation, les tissus prélevés (cœur et poumons) seront stockés pour une utilisation directe mais aussi ultérieure, pour des études mécanistiques plus poussées. Des expériences de biochimie et biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront effectuées. Des calculs de puissance ont permis de déterminer les effectifs minimums nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Le nombre total de souris utilisés sera de [modification du 17/02/2025 : 188] sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales par différents expérimentateurs sur le même animal.
Raffinement
Toutes les procédures seront pratiquées sous anesthésie générale et couverture analgésique adaptées aux actes pratiqués. Des points limites spécifiques ont également été mis en place. De la nourriture et de l’eau sous forme gélifiée seront disposés sur la litière de la cage pour permettre un accès facilité à la nourriture et à la boisson.
Choix des espèces
Nous avons développé chez le rat ce modèle qui mime les conditions hémodynamiques et les lésions vasculaires pulmonaires rencontrées dans la pathologie humaine. Pour aller plus loin dans l’étude de la pathologie (mécanistique), les modèles transgéniques constituent un outil puissant, car ils peuvent être utilisés efficacement pour tester des interventions conçues contre des voies et des processus moléculaires particuliers impliqués dans la maladie. Or la majorité de ces outils ne sont disponibles que chez la souris. C’est pourquoi, nous voulons transposer ce nouveau modèle chez cette espèce. Nous utiliserons des souris adultes (8-20 semaines) pour reproduire les caractéristiques démographiques de la pathologie étudiée et faciliter l’approche chirurgicale (en comparaison aux souris juvéniles).
Étude des modifications post-traductionnelles de la tubuline et leur implication dans les pathologies cardiaques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une échocardiographie par mois sous anesthésie gazeuse, pendant douze mois, attend 120 souris génétiquement modifiées, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Le porteur indique que l'anesthésie peut faire chuter leur thermorégulation et, plus rarement, provoquer une détresse cardio-respiratoire, et que certaines développeront une maladie cardiaque qui écourtera leur vie. L'objet reste fondamental : comprendre comment les modifications d'une protéine du squelette cellulaire pèsent sur la fonction du cœur. Le remplacement tient en deux phrases, des expériences sur lignées cellulaires étant annoncées "autant que possible", et les points limites évoqués ne sont pas précisés.
Objectifs
Ce projet a pour but d’analyser les rôles et les fonctions de différents aspects de la régulation du cytosquelette cellulaire : d’un côté ses composantes propres, de l’autre les éléments qui interagissent avec lui, au niveau de l’organisme entier, la souris. Cette étude a pour ambition d’analyser les relations entre ces différents aspects et d’établir comment ils coopèrent dans la régulation de fonctions du scytosquelette. Le cytosquelette étant impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires, sa régulation est susceptible d’avoir des effets sur de nombreux processus cellulaires, qui, perturbées, pourrait avoir des répercussions sur la bonne survie de l’organisme entier. Ainsi, comprendre la régulation du cytosquelette et pouvoir l’influencer, permettra d’élucider son impact sur le maintien de la survie cellulaire et, comment sa dérégulation participe au développement de maladies cardiaques. Ce projet a pour but l’évaluation des modifications de la tubuline sur la fonction cardiaque chez des souris genetiquement modifiées dans des gènes codant des proteines importantes pour les modifications post-tranductionnelles de la tubuline.
Bénéfices attendus
Ce projet peut aboutir à la première description du role des modifications de la tubuline dans le developement de pathologies cardiaques. Cette étude permettra de mieux comprendre les rôles des mécanismes de régulation du cytosquelette. Étant donné que le cytosquelette a des fonctions essentielles dans toutes les cellules, cela suggère que sa régulation pourrait être impliquée dans le développement normal de l’organisme. Inversement, les défauts de cette régulation pourraient être à l’origine de pathologies cardiaques. Cette étude vise à éclaircir le mode d’action de ces mécanismes de régulation du cytosquelette dans le developpment d'insufficnace cardiaque. L’insuffisance cardiaque correspond à un état dans lequel le cœur n’est plus capable d’assurer son rôle de pompe, et donc d’alimenter correctement l’organisme en sang. Le cœur ne peut alors plus répondre aux besoins énergétiques du corps, et lui apporter oxygène et nutriments. Cette pathologie chronique est irréversible. L'insuffisance cardiaque est liée à une perte de contractilité du muscle cardiaque. Dans un premier temps, le rythme du cœur s’accélère pour pallier la perte de contractilité. Ensuite, sa paroi s’épaissit et ses cavités se dilatent : c’est l’hypertrophie cardiaque. Cette dernière induit une fatigue du cœur menant à l’insuffisance cardiaque. La prévalence de l’insuffisance cardiaque est très élevée et elle concernerait 1,5 million de personnes en France.
Procédures
Nous allons procéder aux échocardiographie tous les mois sous anesthésie, sur 12 mois. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris. Les souris seront euthanasiées en fin de protocole par méthode réglementaire en vue des prélèvements tissulaires pour analyse.
Impact sur les animaux
La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie gazeuse. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Certains animaux peuvent développer une pathologie cardiaque qui peut réduire l'espérance de vie des animaux.
Devenir
Les souris seront euthanasiées en fin de protocole par méthode réglementaire en vue des prélèvements tissulaires pour analyse.
Remplacement
Le projet a pour but de comprendre la fonction d'enzymes et leur mécanisme d’action au niveau de l'organisme vivant intégré et autonome, la souris. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
120 animaux seront utilisés pour ce projet. Les processus expérimentaux seront conçus par un test de puissance de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Le nombre d’animaux nécessaires à la bonne exécution de ce projet sera suffisant pour obtenir les résultats statistiquement significatifs : nous allons analyser 10 mâles et 10 femelles d’au moins deux portées différentes. Les groupes de souris seront analysés avec des tests statistiques appropriés pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont définis dans l’agrément de l’établissement utilisateur. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier des cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement). Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. Le milieu est enrichi. Enfin, si nécessaire, la nourriture hydratée pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage pour faciliter la prise. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent et des points limites ont été définis. Nous réalisons un examen d’imagerie non invasive effectuée sous anesthésie avec tapis chauffant/gel hydratant oculaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en biologie du développement, de cancer et de la neurodégénérescence. Les modèles génétiquement modifiés des éléments de cytosquelette, protéines interagissant avec le cytosquelette et les enzymes impliquées dans la régulation du cytosquelette permettent de définir leurs rôles dans ces différentes maladies. Du fait de la parenté biologique avec l’Homme, les modèles murins sont d’excellents modèles de différentes pathologies. Les analyses seront effectuées à 6 différents âges à partir du sevrage des animaux et jusqu'à 12 mois. En effet, les niveaux de modifications changent au cours du développement de l’organisme et cela peut avoir des consequences sur la structure et la fonction cardiaque.
Exploration de nouvelles voies thérapeutiques pour la neuropathie et l’inflammation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une fibre optique implantée sur le cerveau et laissée en place quatre semaines, jusqu'à la mise à mort : 3 032 souris vont être utilisées, 1 148 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 1 884 un niveau sévère, toutes tuées à l'issue. La douleur chronique leur est provoquée soit par l'injection d'un agent inflammatoire entre les coussinets d'une patte sur animal vigile, soit par la pose d'un manchon de plastique autour du nerf sciatique, ce qui entraîne une hypersensibilité mécanique et thermique et des comportements d'anxiété. Quatre tests comportementaux suivent, chacun réalisé une seule fois, l'animal étant isolé. Le porteur retient la souris pour la conservation du système sensoriel entre cette espèce et l'humain, pour la variété des outils de modification génétique disponibles, et parce qu'un poids de 25 à 30 grammes rend l'implantation dans le crâne plus précise.
Objectifs
L’objectif de ce projet est scientifique et médical. Il s’agit d’explorer et comprendre les mécanismes impliqués dans les symptômes associés aux neuropathies et aux neuro-inflammations et d’identifier des pistes thérapeutiques. Ces pathologies peuvent être causées par diverses conditions médicales, telles que l'arthrite ou la fibromyalgie et affectent le bien-être physique, la santé mentale et la vie sociale des personnes touchées. Malheureusement, avec les médicaments actuels, seule la moitié des patients est soulagée de manière adéquate, démontrant leur efficacité limitée aggravée par la présence d’effets secondaires indésirables. Il est donc essentiel de mieux comprendre les circuits et mécanismes nerveux impliqués pour identifier de nouvelles cibles alternatives, susceptibles de déboucher sur des médicaments plus efficaces. L’objectif de ce projet est d’évaluer le rôle des mécanismes de neuromodulation dans des modèles d’inflammation ou de neuropathie. Cette étude pourrait permettre de trouver de nouvelles approches thérapeutiques, cela dans le but d’ouvrir la voie à de meilleurs traitements pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes atteintes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques et neurologiques qui sous-tendent la neuropathie et la neuro-inflammation . A court terme, cette approche pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués dans leur régulation, leur développement et leur maintien. Ce projet devrait permettre de trouver de nouvelles approches thérapeutiques, dans le but à plus long terme, d’ouvrir la voie à des traitements plus efficaces et ciblés afin d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Procédures chirurgicales : Une fibre optique sera implantée sur le cerveau de l’animal afin de délivrer de la lumière dans une zone précise du cerveau. Ce geste sera réalisé une fois sous anesthésie générale de 60 minute. La pose de la fibre optique durera maximum 25 minutes. La fibre optique sera implantée sur la tête de l’animal jusqu’à sa mise à mort (4 semaines après). Induction des deux modèles : Le modèle murin d’inflammation chronique sera induit par une seule injection d’un agent inflammatoire dans l'une des pattes de l'animal vigile entre les deux coussinets les plus volumineux. Le modèle de neuropathie périphérique sera provoqué par la pose d’un manchon en plastique autour du nerf sciatique sous anesthésie générale pendant environ 45 minutes. La chirurgie durera au maximum 20 minutes. Tests comportementaux : chaque animal sera sujet à divers tests de comportement visant à évaluer leur sensibilité sensorielle et les signes d’anxiété. Chaque test ne sera effectué qu’une seule fois par souris, les tests seront au nombre de quatre et seront répartis sur une semaine.
Impact sur les animaux
Concernant les procédures chirurgicales, l’implantation de fibres optiques dans le crâne peut éventuellement engendrer la survenue de douleurs post-opératoires, un risque d’infection ainsi qu’un stress post- opératoire. L’induction d’une inflammation chronique ou d’une neuropathie peuvent induire une altération des comportements des animaux : diminution des comportements exploratoires et augmentation des comportements stéréotypés qui sont des signes d’anxiété. Cela entraine également le développement d’une sensibilité mécanique et thermique plus élevée. Lors des tests comportementaux, les animaux seront isolés, ce qui peut engendrer un léger stress.
Devenir
Après les études comportementales, les animaux seront euthanasiés dans le but de récupérer les cerveaux des souris et d’effectuer des analyses d’imagerie ou de biochimie.
Remplacement
Nous réalisons ici des expérimentations sur des modèles murins de neuroinflammation et de neuropathie. A ce jour, il n’existe pas de modèle d’étude in vitro qui reproduise la complexité du système nerveux et sensoriel. De plus la souris que nous allons utiliser est un mammifère qui possède une physiologie semblable à l’homme et possède un réseau nerveux relativement similaire. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. L’activité des ligands testés sur la souris a été évaluée au préalable sur des modèles in vitro afin de définir leur puissance, efficacité et sélectivité sur les mécanismes ciblés.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, chaque groupe contiendra le nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats statistiquement pertinents, défini grâce à un logiciel de calculs statistiques et sur la base d’expériences comparables dans la littérature. L’analyse se fera au fur et à mesure des expériences qui cesseront dès que les résultats seront statistiquement significatifs, permettant de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire. De plus, les expérimentations seront effectuées sur des mâles et des femelles séparément dans un premier temps, puis si aucune différence intersexe n’est observée les animaux des 2 sexes seront combinés, ce qui diminuera de moitié le nombre de souris nécessaires initialement prévues. Les composés seront testés à 3 doses différentes dans un premier temps, afin de définir la dose optimale qui sera utilisée pour les expériences suivantes, permettant également de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
L’inconfort et le stress potentiel subit par les animaux seront pris en charge tout au long du protocole expérimental tout en permettant l'obtention de résultats scientifiques. Avant le début de l'expérimentation, les souris seront accoutumées à la présence humaine et manipulées quotidiennement pendant au moins une semaine afin de réduire leur stress. Pendant la chirurgie, la température des souris préalablement anesthésiées sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Après l’étape de chirurgie, les souris auront un accès libre à de l’eau sucrée et du gel alimentaire, qui seront directement placés au sol de la cage afin de favoriser une bonne réhydratation et alimentation. Une semaine de récupération sera effectuée avant la suite des expérimentations. Une surveillance accrue des animaux sera effectuée durant tout le protocole expérimental, de plus une grille de score avec des points limites a été établie afin de limiter au maximum la souffrance, l’angoisse et la douleur des animaux. Les souris seront sujettes au maximum à une expérimentation par jour. Les tests comportementaux choisis seront non invasifs et de courte durée (tests mesurant les comportements naturels de la souris tels qu’exploration de nouveaux environnements, réflexes et toilettage).
Choix des espèces
Le système sensoriel est hautement conservé entre la souris et l’Homme. Des résultats préliminaires ont permis de montrer qu’il était possible de mettre en place des modèles de neuro-inflammation et de neuropathie murins montrant les mêmes composantes sensorielles et anxio-dépressives retrouvées chez les patients souffrant de neuroinflammation. C’est donc un modèle pertinent afin de pouvoir étudier les mécanismes endogènes responsables des symptômes associés à ces maladies. La variété des techniques de modifications génétiques chez la souris permet également de visualiser ou de cibler spécifiquement des mécanismes cellulaires ou des protéines. De plus Il n’existe pas à ce jour un modèle in vitro alternatif capable de reproduire la complexité du système sensoriel d’un être vivant. Le recours à la souris est donc guidé par des considérations scientifiques et techniques. Les animaux seront utilisés lorsqu’ils auront atteint l’âge choisi de 8 à 12 semaines. Il correspond à celui d’un jeune adulte, couramment utilisé pour ces tests. De plus, l’utilisation d’implantation intracérébrale de canules par stéréotaxie sur les souris requiert un poids compris entre 25-30g pour une précision optimale.
Evaluation de l’efficacité de traitements des dispositifs médicaux vis-à-vis des prions dans des modèles expérimentaux rongeurs, dans le cadre du Protocole Standard Prion de l’ANSM
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Hamsters dorés : 1200
Pour valider des produits de décontamination des dispositifs médicaux avant leur inscription sur une liste officielle prévue pour 2027, 1 200 souris et 1 200 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun reçoit dans le cerveau une tige métallique porteuse de prions, traitée ou non par le procédé à évaluer, puis attend que la maladie se déclare, de trois à dix-huit mois chez le hamster et de six à vingt-quatre mois chez la souris. Aucune analgésie n'est prévue après l'opération, le porteur indiquant qu'elle risquerait d'interférer avec l'installation de l'infection. Agressivité, tremblements, troubles de l'équilibre et perte de poids sont attendus, et c'est l'apparition de ces signes neurologiques qui déclenche la mise à mort.
Objectifs
Plusieurs cas de transmission inter-humaine de maladies à prions ont été rapportés, liés pour certains à l’utilisation de dispositifs médico-chirurgicaux contaminés et traités par la suite de façon inappropriée (principalement lors de neurochirurgie). En effet, les prions présentent des spectres de résistance très étendus à la plupart des méthodes d’inactivation et de stérilisation classiquement utilisées vis-à-vis des agents infectieux conventionnels (bactéries, virus, champignons…). Par ailleurs, ces maladies transmissibles ont des périodes d’incubation très longues qui peuvent excéder la moitié de l’espérance de vie de l’espèce considérée (incubation jusqu’à 50 ans chez l’homme). En France, plusieurs circulaires et instructions de la Direction Générale de la Santé régissent le traitement de reconditionnement des dispositifs médicaux et chirurgicaux après utilisation vis-à-vis du risque lié aux prions. Ces textes prévoient notamment que des produits ou des procédés (autoclavage, fumigation…) puissent, dans des conditions précises d’application (concentration, temps, température...), revendiquer une élimination ou une inactivation des prions. Cependant, ces revendications doivent se faire sur la base d’études réalisées selon un « protocole standard prion », ou PSP, imposé par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament (ANSM), tel que défini en 2011 et révisé en 2018. Le projet présenté ici s’inscrit dans le cadre de ce protocole imposé par l’ANSM. Son objectif est d’étudier dans deux modèles animaux rongeurs l’efficacité de plusieurs produits/procédés pour nettoyer des dispositifs médicaux et chirurgicaux et de participer à l’optimisation de ce PSP qui est amené à évoluer dans le futur.
Bénéfices attendus
Les produits/procédés qui seront validés dans le cadre de ces études (démonstration d’une efficacité à éliminer et/ou inactiver les prions à un niveau identique ou supérieur à ceux des traitements d’efficacité maximale) seront inscrits dans la nouvelle liste des produits efficaces vis-à-vis des prions à paraître en 2027 : ces produits seront utilisés selon les mêmes paramètres (temps, concentration, température…) testés pour traiter les dispositifs médicaux utilisés lors d’actes à risque prion dans toutes les structures hospitalières françaises. Certaines variations de conditions d’utilisation des produits et procédés (mode d’exposition des outils et dispositifs, qualité de l’eau utilisée…) pourront permettre de faire évoluer le PSP dans le futur. Ces variations concernent les préparations des supports et n’ont pas d’impact sur la partie in vivo de cette étude.
Procédures
Les animaux seront chacun soumis à une seule anesthésie générale, durant laquelle une tige métallique contaminée par les prions / décontaminée par le procédé à tester est implantée dans le cerbeau; L’intervention dure moins d’une minute par animal (durée anesthésie environ 15 minutes). Ils seront surveillés au quotidien (observation et manipulation des animaux sans anesthésie) pour la détection des signes cliniques (qui apparaissent après une incubation de 3 à 18 mois chez le hamster, et de 6 à 24 mois chez la souris). Au terme de l’étude, les animaux sont euthanasiés.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées à l’anesthésie (temporaires au cours de la seule anesthésie) Hypothermie, difficultés au réveil, Nuisances liées à l’implantation intracérébrale des tiges métalliques Douleur temporaire liée à l’implantation, lésions durables (rares) se manifestant souvent par un port de tête incliné Nuisances liées au développement des maladies à prions Agressivité, troubles du comportement, hypersensibilité, tremblements, troubles de l’équilibre, troubles moteurs, perte de poids Développement de maladies intercurrentes Durant la longue période d’incubation des animaux (jusqu’à 18 mois chez le hamster et 24 mois chez la souris), des maladies intercurrentes liées à l’âge (principalement tumeurs, perte de poids) peuvent être observées.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés afin de pouvoir confirmer la suspicion de diagnostic clinique : en effet, le diagnostic définitif de maladie à prion (également chez l’Homme) n’est possible qu’après avoir mis en évidence dans le cerveau des individus concernés soit des lésions spécifiques (histologie), soit la présence de la forme anormale de la protéine prion par technique biochimique
Remplacement
Dans un premier temps, les différents traitements sont testés in vitro afin d’identifier ceux inefficaces ou avec une efficacité très limitée (
Réduction
Le nombre optimal d’animaux dans chaque groupe est défini par le PSP (équilibre entre réduction du nombre d’animaux et pertinence statistique) : « * Pour la gamme contrôle (supports contaminés avec des doses décroissantes de prion afin de juger par comparaison de l’efficacité des traitements) : un minimum de 4 animaux pour les trois concentrations les plus importantes, et un minimum de 8 animaux (préférentiellement 12 pour renforcer la puissance statistique de l’étude) pour les autres dilutions. * Pour les traitements évalués et les traitements de référence : un minimum de 12 animaux inoculés par traitement, à raison de 4 animaux pour chacun des triplicats de traitement ».
Raffinement
Les interventions (implantation des tiges métalliques et des puces d’identification) seront réalisées concomitamment pour ne réaliser qu’une seule anesthésie générale par animal. Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Lorsqu’ils sont anesthésiés, les animaux sont couchés dans leur cage sur des essuie-tout et placés sous lampe chauffante durant la période de réveil. Les protocoles d’anesthésie sont optimisés en fonction des espèces pour limiter les effets indésirables. Lors des interventions, l’animal est positionné sur un tapis chauffant. Il n’est pas prévu d’analgésie en post opératoire pour éviter toute interférence avec l’installation de l’infection par les prions. Au regard de notre expérience passée les rongeurs supportent particulièrement ces protocoles sans manifester de douleur ou de symptômes particuliers avant la mise en place des signes cliniques liés à l’infection par les prions. Néanmoins, les animaux seront surveillés avec précaution durant les dix jours suivant l’inoculation. Durant cette période, les animaux recevront en cas de signe de douleur (prostration, tête penchée…), une injection d’analgésique. Les animaux seront hébergés en groupe dans un environnement enrichi. Ils seront surveillés cliniquement au quotidien par les expérimentateurs ou les zootechniciens en charge de l’animalerie tout au long de l’expérience, pour permettre une intervention de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. A l’installation de signes neurologiques spécifiques des maladies à prions (tremblements, hyperexcitabilité) ou des points limites définis, qu’ils soient liés ou non à l'inoculation, les animaux seront euthanasiés. Le diagnostic clinique sera confirmé par la mise en évidence post mortem de protéine prion pathologique (PrPres) dans le cerveau par technique in vitro.
Choix des espèces
La souche prion requise par l’ANSM est la souche de référence pour la validation de procédures de décontamination vis-à-vis du prion, compte tenu de son potentiel de résistance vis-à-vis des principales méthodes physiques et chimiques. Cette souche a été sélectionnée et développé chez le hamster syrien, ce qui en fait le seul hôte permissif de cette souche de prion . Pour la souche de prion humaine testée dans cette étude, (responsable de la maladie de la vache folle che l’Homme), nous avons privilégié le modèle rongeur (souris) le plus sensible connu, Pour ces deux espèces, les animaux approvisionnés sont de jeunes adultes (8 semaines), pour être compatibles avec une incubation pouvant aller jusqu’à 18 mois (hamsters) ou 24 mois (souris).