Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
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Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés de cellules tumorales quarante-huit heures après la fécondation, des embryons de poisson zèbre passent ensuite une à deux heures par jour sous anesthésie et sous microscope, quinze jours durant, isolés dans leur bac. D'autres, injectés au stade d'une seule cellule, développent des mélanomes et sont imagés sous intubation pendant quatre heures, une fois toutes les deux semaines, de la huitième à la cinquante-deuxième semaine de vie. 1 040 poissons zèbres sont concernés, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit chez les adultes malades une nage dégradée, des abcès, des œdèmes, des difficultés respiratoires et un éloignement de leurs congénères, et indique que le vieillissement accéléré provoque un amincissement et une mort prématurée. Tous sont tués en fin de procédure, pour les prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes (EU1). Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) (EU1). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule) (EU1). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum (EU1), sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie et analgésie, jusqu'à une fois toutes les deux semaines (EU2). Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage (EU1).
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement analgésique et anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. Lors de leur transport, les animaux sont conservés dans leur eau d'origine et une fois arrivés sur place un temps de récupération est prévu.De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Effet de l’apprentissage et le phénotype dit-dépressif sur le connectome neuronal du système olfactif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Privées d'eau en dehors de deux heures par jour pendant un mois, des souris enchaînent des sessions d'apprentissage olfactif de trente à quarante-cinq minutes, six jours sur sept. Elles sont 560 au total, dont 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées pour l'analyse histologique de leur cerveau. Une partie reçoit de la corticostérone dans l'eau de boisson pendant un mois pour induire ce que le porteur nomme un phénotype dit-dépressif, avant cinq jours de tests comportementaux. Chaque souris peut subir jusqu'à deux chirurgies stéréotaxiques d'une heure, et des souriceaux de six jours sont également utilisés. Les retombées annoncées, de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la dépression et les troubles bipolaires, sont renvoyées au futur.
Objectifs
Les troubles de l’humeur, parmi lesquels la dépression et les troubles bipolaires, sont des maladies psychiatriques hétérogènes affectant environ 15 % et 2 % de la population mondiale, respectivement. Malgré le grave problème de santé publique que représentent ces troubles (l’OMS prédit qu’ils deviendront la cause majeure de morbidité à travers le monde à l’horizon 2030), les traitements existants ont une efficacité limitée et 60-70 % des patients sont partiellement ou non-répondeurs. Il est nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie pour proposer de nouveaux outils diagnostiques et pouvoir développer des thérapeutiques plus spécifiques. Outre la modification de l’humeur, des études cliniques ont également montré l’existence d’altérations sensorielles. Chez l'homme, les troubles olfactifs qu'accompagnent les symptômes dépressifs sont cependant peu considérés dans les critères diagnostiques. Chez l'animal, l'ablation du bulbe olfactif, qui constitue un premier relai dans le cerveau pour le traitement des odeurs, induit un phénotype dit-dépressif et un modèle murin de dépression a révélé une déficience olfactive. De manière intéressante, ce déficit olfactif a été associé à un déficit dans a production des nouveaux neurones dans le cerveau mature, processus nommé neurogenèse adulte. En parallèle, des travaux récents ont démontré que les nouveaux neurones pourraient jouer un rôle dans l’attribution de la valeur hédonique des odeurs après un apprentissage olfactif.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont d’approfondir nos connaissances sur le phénomène d’intégration des nouveaux neurones dans un cerveau adulte ainsi une meilleure compréhension de la physiopathologie des troubles de l’humeur. Une meilleure connaissance des liens entre neurogenèse, la fonction du système olfactif et troubles psychiatriques pourrait aider à déchiffrer la physiopathologie de maladies comme la dépression majeur or les troubles bipolaires. Ainsi, la connaissance des mécanismes de neurogenèse adulte pourrait alors permettre dans le futur la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour contrôler cette production neuronale, dans le but de restaurer les fonctions cérébrales de patients atteints de maladies neurodégénératives ou psychiatriques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales (injections stéréotaxiques). Ces interventions ne durent pas plus d’une heure et chaque animal sera soumis au maximum à deux interventions séparées au minimum par 90 jours. Ils seront également soumis à des tâches d’apprentissage olfactif de type associatif avec renforcement positif pour évaluer les effets de l’apprentissage sur la connectivité du système olfactif. Au cours de cette tâche, les animaux sont progressivement soumis à un contrôle hydrique. Les animaux auront accès à l'eau une fois dans la journée pendant et immédiatement après la tache de comportement (durée totale d’accès à l’eau = 2hs). Ce type d’apprentissage a une durée maximale de 1 mois, avec une session de 30 à 45 minutes par jour, chaque jour (6 jours sur 7). Pour l’induction du phénotype dit-dépressif les souris seront administrées avec de la corticostérone dans l’eau de boisson pendant un mois. Ensuite, des tests comportementaux seront réalisés pendant 5 jours. Chaque test aura une durée maximale de 10 min et on réalisera au maximum 2 tests par jour.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : stress induit et attendu pour les modèles de dépression Le contrôle hydrique peut aussi engendrer du stress aux animaux. Douleur, inconfort modérée de courte durée liés à la chirurgie De plus, les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier la réorganisation des connections à la suite d’un apprentissage olfactif ou de l’apparition phénotype dit-dépressif. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes. De plus, l’analyse des connexions par la technique d’imagerie volumétrique sur du tissu cérébral rendu transparent à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière, nous permettra d’obtenir un maximum d’information pour chaque échantillon, de réduire la variabilité des donnés et ainsi de réduire le nombre d’animaux pour l’évaluation statistique de l’effet des différentes manipulations.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis. Des interventions adaptées seront mises en oeuvre en focntion des signes cliniques présentés par les animaux. De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
On étudie les modifications des connexions neuronales du système olfactif des souris car ce système est impliqué dans une modalité sensorielle très importante chez les rongeurs : l’olfaction. En conséquence, l’utilisation de cette espèce nous permettra d’obtenir des résultats éthologiquement satisfaisants. De plus, les stimuli olfactifs au cours de l’apprentissage olfactif peuvent participer à l’enrichissement de l’environnement des animaux et donc favoriser leur bien-être durant le temps de ces expériences. Notre objet d’étude étant les cellules produites par la neurogenèse chez l’adulte, on utilise dans ces expériences des jeunes souris adultes (8 semaines). Cependant, il faudra comparer l’impact de l’apprentissage et le phénotype dit-dépressif sur les cellules produites dans le cerveau post-natal (neurogenèse post-natale). Pour ce faire, des souriceaux de 6 jours seront utilisés.
modulation de l’activité des canaux HCN et douleur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Section des nerfs tibial et péronéal, injection d'un produit pro-inflammatoire dans une articulation de la patte arrière, injections d'un anticancéreux deux fois par semaine pendant trois semaines : les douleurs chroniques sont ici provoquées délibérément. 1 568 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent jusqu'à trois prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire par animal, et une surveillance hebdomadaire de l'automutilation de la patte opérée, traitée le cas échéant à l'argile verte. Le porteur range la contention, le gavage, l'isolement et les injections parmi les gestes provoquant "une douleur légère", et réserve la douleur sévère aux "modèles et tests de douleur" eux-mêmes.
Objectifs
Les antalgiques sont peu efficaces et entrainent des effets indésirables qui limitent leur utilisation répétée chez les patients douloureux chroniques. Une nouvelle stratégie, basée sur la modulation de la fonction de certains canaux ioniques, pourrait conduire au développement d’un traitement antalgique efficace et bien toléré. La preuve de concept de l’efficacité de cette stratégie a été validée au laboratoire. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’effet antalgique de ces molécules dans différents modèles de douleur chronique chez l’animal. De plus, ces canaux ioniques étant également impliqués dans certains effets indésirables des opioïdes, nous évaluerons la capacité de ces molécules à limiter les effets secondaires des opioïdes en les administrant conjointement avec des opioïdes.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet fera progresser les connaissances sur la physiopathologie de la douleur, en particulier l’implication des canaux ioniques et le rôle de leur protéine partenaire. A moyen terme, ce projet inclut l’exploration du potentiel antalgique, seul ou conjointement avec des opioïdes, de molécules innovantes dans différents modèles de douleur qui à plus long terme pourraient être évaluées chez les patients douloureux.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront subir les gestes et contraintes suivants (tous les gestes seront réalisés par des personnels formés) : - contentions et injections pouvant induire un stress, éventuellement douleur légère; - prélèvements sanguins au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie dans le respect des volumes recommandés (jusqu'à trois prélèvements par animal, espacés d'une semaine au minimum). Une procédue chirurgicale (section des nerfs tibial et péronéal, réalisée sous anesthésie (durée de l’intervention 10-15 minutes maximm) sera réalisée chez certains animaux. Une induction d’une inflammation articulaire par injection d'un produit pro-inflammatoire sera réalisée dans l'articulation d'une patte arrière chez certains animaux. L'injection d'un anticancéreux sera réalisé 2 fois par semaine pendant 3 semaines pour induire une douleur chez certains animaux.
Impact sur les animaux
Les gestes et contraintes nécessaires à la réalisation de ce projet peuvent occasionner chez les animaux du stress et une douleur légère (contention, gavage, isolement, injections) voire une douleur sévère (modèles et tests de douleur).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure. Les animaux utilisés dans les procédures 1 à 3 seront mis à mort puis leurs tissus d'intérêt (ganglions rachidien dorsaux, moelle épinière et éventuellement cerveau) prélevés pour des analyses biochimiques, immunohistologiques ou de biologie moléculaire. Les animaux utilisés dans la procédure 4 seront mis à mort. Il n'est pas prévu d'analyses biochimique ou de biologie moléculaire sur leur tissus.
Remplacement
Ce projet concerne l’étude de l’implication de canaux ioniques dans la physiopathologie et la pharmacologie de la douleur chronique. Il n’existe aucune méthode alternative permettant d’intégrer ces différents niveaux de complexité
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué en fonction de la littérature et de l’expertise du laboratoire sur les modèles proposés de sorte à favoriser des résultats fiables et statistiquement significatifs. Lorsque nécessaire, un maximum de prélèvements seront réalisés sur chaque animal après la mise à mort. L’analyse statistique des résultats sera réalisée par des tests de comparaison de médianes paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données.
Raffinement
L’entretien des lignées ayant un gène non fonctionnel sera réalisé en animalerie dans les conditions standard d’hébergement. Un enrichissement est apporté dans les cages : dômes en carton, et galets de lanières de papier compactées et des bûchettes de bois. Le bien-être des animaux sera régulièrement évalué par du personnel formé. Les animaux ayant fait l’objet d’une chirurgie font l’objet d’un suivi spécifique et de soins post opératoires. Les animaux encore anesthésiés sont dans une cage remplie de litière propre et située sur un tapis chauffant permettant de chauffer uniformément la cage et de réduire l'hypothermie. Les aliments sont placés dans la cage de l’animal si difficultés à se nourrir. Une solution glucosée en post chirurgie ou en cas de déshydratation pourra être administrée. Une solution hydratante est déposée sur chaque œil de l’animal afin d’éviter une sècheresse oculaire durant la chirurgie. Le lendemain de la chirurgie, un antiseptique local est appliqué sur la cicatrice. Outre la surveiillance quotidienne, la première semaine après chirurgie et une fois par semaine ensuite, une surveillance accrue des animaux et un suivi pondéral est réalisé afin de vérifier la présence ou non d’automutilation au niveau de la patte opérée. Si besoin, de l'argile verte est déposée sur les plaies.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est motivé par la disponibilité des outils moléculaires pour cette espèce, l’importance des données bibliographiques et des données déjà acquises par notre laboratoire sur le projet initié il y a une dizaine d’années. Les animaux seront utilisés à l'âge jeune adulte (8 à 12 semaines) en cohérence avec les données déjà obtenues chez les modèles de douleur utilisés au laboratoire.
Impact d’une délétion d’un marqueur de l’insuffisance rénale chez les souris atteintes par la maladie de Dent
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si la suppression d'un marqueur de lésion rénale ralentit la maladie de Dent, 1 505 souris vont être utilisées, dont 130 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent cinq jours en cage à métabolisme individuelle, subissent une mesure de filtration rénale sous anesthésie suivie de deux heures d'observation, une mesure de composition corporelle en tube clos et un prélèvement sanguin que le porteur décrit comme pouvant provoquer une hémorragie, voire la mort. Le groupe suivi jusqu'à dix mois repasse cette série entière à quatre, sept et dix mois. Les souris écartées faute du bon génotype sont tuées sans prélèvement, et le poids, l'apparence et le comportement relevés chaque jour en cage à métabolisme servent à fixer le moment de la mise à mort.
Objectifs
La maladie de Dent de type 1 est une maladie rénale rare caractérisée par une perte urinaire de protéines et de calcium, la présence de calculs rénaux, et une insuffisance rénale progressive. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement spécifique pour cette maladie. Une souris modifiée génétiquement présentant les mêmes traits cliniques observés chez les patients a été générée. Cette souris présente dans l’urine et des reins de fortes quantités d’un marqueur de lésion rénale mais connu comme jouant aussi un rôle actif dans l’apparition de dommages rénaux. L’objectif de ce projet est de déterminer si ce marqueur joue un rôle actif aussi dans la maladie de Dent, et si sa délétion permet de ralentir la progression de la maladie et freiner l’apparition de l'insuffisance rénale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’importance d’un marqueur de lésion rénale dans l’évolution de la maladie de Dent 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques de la maladie, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par la maladie de Dent. En faisant appel à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, celui-ci aura un impact significatif sur la santé humaine car il permettra d’apporter de nouvelles perspectives conduisant au développement de pistes thérapeutiques, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie.
Procédures
Un premier lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 mois, une mesure non invasive de composition de la masse corporelle sera effectuée en plaçant les souris dans un tube clos pour la mesure (environ 2 minutes). Ensuite, une mesure de la filtration rénale sera effectuée impliquant une anesthésie gazeuse, la pose d’un capteur de fluorescence maintenu par un adhésif adapté, une injection intra-veineuse du traceur fluorescent (environ 10 minutes) puis un suivi sur animal vigile d’environ 2 heures. Après, ces souris seront placées en cage à métabolisme individuelle dans une enceinte spécifique permettant de prélever l’urine durant 5 jours (3 jours d’habituation et 2 jours de d'expérience). A l’issue de cet hébergement, un prélèvement sanguin de faible volume sera réalisé sur souris vigiles (environ 1 minute). Ensuite, les animaux seront soit euthanasiés (groupe 4 mois) ou retourneront en stabulation en attendant la prochaine phase d’analyse (groupe 10 mois). En effet, le groupe 10 mois, repassera par la même série d’analyses précédemment décrites à 7 mois et à 10 mois avant euthanasie et prélèvements. Un second lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 ou 10 mois, les organes seront récupérés après l’euthanasie effectué sous anesthésie et analgésie. Des animaux auront potentiellement un phénotype dommageable. Durant l’élevage une biopsie sera nécessaire pour effectuer l’identification génétique de ces animaux (quelques secondes sur animal vigile).
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées présentent un phénotype dommageable avec une pathologie rénale pouvant induire une diminution de la filtration rénale, une augmentation de l’excrétion de solutés tels que les protéines et le calcium, augmentation de la fibrose rénale qui n’entraînent pas de douleur. Une biopsie sera nécessaire afin d’identifier génétiquement les animaux qui seront utilisés. Celle-ci est susceptible d’entrainer une douleur légère de courte durée. Une partie des animaux recevront un traitement incorporé dans leur croquette habituel, lors du changement de régime cela pourrait causer un léger stress et entrainer une diminution de la consommation en raison de la néophobie des souris. Les souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle pouvant engendrer un léger stress le temps de la mesure de résonance magnétique. Les souris seront anesthésiées et reçoivent une injection intraveineuse pour réaliser la mesure de l’activité de leurs reins. Cette intervention est susceptible de générer une hypothermie et un risque de détresse respiratoire ainsi qu’une douleur au réveil au site d’injection. Les souris seront placées en cage à métabolisme, ce type d’hébergement peut générer un stress en raison du changement d’environnement. Les souris subiront un prélèvement de sang qui est susceptible de causer une douleur de courte durée associée à la piqûre de l’aiguille, mais pouvant également causer une hémorragie dans de rare cas, voire la mort.
Devenir
L’euthanasie est requise pour réaliser des prélèvements en vue des analyses pour répondre à la question scientifique. Une autre partie des animaux sera euthanasié sans prélèvement en fin de période de reproduction ou en raison de l’absence du gène d’intérêt après l’identification génétique.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux pour des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront de déterminer l’effet des traitements sur leur phénotype rénal (notamment les modifications du débit de filtration glomérulaire, des contenus urinaires et plasmatiques, les altérations histologiques et moléculaires des cellules rénales) en comparaison avec celui des animaux non traités.
Réduction
Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera la génération de 1505 souris (couvrant l’ensemble des demandes). Nous avons calculé le nombre d’animaux au plus faible grâce à un calcul de puissance et de notre expérience passée. Pour une interprétation fiable des résultats il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques robuste. Pour raffiner nos animaux au maximum nous réaliseront le plus d’expérience possible par animal. Les souris exclues des procédures en raison d’un génotype non conforme ou non pertinent pour les procédures ou le maintien de la lignée pourront être réaffectées à d’autres projets au sein de l’animalerie ou de l’équipe, notamment pour la récupération d’organes ou comme animaux de réforme ; si aucune réaffectation n’est possible, elles seront euthanasiées.
Raffinement
Durant leur hébergement en stabulation et en élevage, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et/ou des maisons. L’hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l’établissement utilisateur. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. De plus, la mesure de leur débit de filtration glomérulaire sera effectuée sous anesthésie avec réveil. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux recevront une anesthésie sans réveil. Par ailleurs, la gestion de la douleur sera prise en compte avec la mise en place d’une grille de score, de la définition de points limites et la réalisation des certaines procédures sous anesthésie et analgésie. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Au moment du pucage, les animaux vigiles sont prélevés d’un bout d’oreille à l’aide d’un poinçon d'oreille afin d’éviter une manipulation supplémentaire. Ces manipulations ont lieu dans une pièce dédiée, au calme. Le geste est effectué sur un animal très jeune afin de limiter la douleur et car il a une cicatrisation rapide. Le geste est parfaitement maitrisé par les zootechniciens et est fait rapidement avec un poinçon adapté et désinfecté après chaque animal. L’animal est surveillé immédiatement après cet acte pour s’assurer qu’il ne saigne pas et est bien repris en charge par sa mère. Le bout d’oreille est envoyé à l’analyse de génotypage.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux nous permettront d’évaluer l’effet d’une invalidation d’un marqueur de lésions rénales visant à ralentir l’évolution de la maladie. Nous utiliserons des souris mâles contrôles et transgéniques âgés de 4, 7 et 10 mois afin d’évaluer l’effet de l’invalidation d’un marqueur de lésions rénales sur l’évolution de la maladie. Nous utiliserons aussi des femelles contrôles et transgéniques suivies à 4, 7 et 10 mois afin de s’assurer que leur phénotype ne diffèrent pas de celui observé chez les femmes portant la maladie.
Neuro-inflammation et apport de l’imagerie TEP dans deux modèles murins d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) (étude pilote
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Immunisées pour développer une encéphalomyélite auto-immune, 80 souris enchaînent trois à cinq séances d'imagerie TEP sous anesthésie gazeuse, dont une de quatre-vingt-dix minutes au dixième jour. Toutes relèvent d'un niveau de souffrance sévère et sont tuées vers le vingt-et-unième jour pour des analyses complémentaires. Les atteintes annoncées vont des troubles moteurs à la paralysie, avec une perte de poids "rapide et drastique" et une possible nécrose de la queue au point d'injection du radiotraceur. Il s'agit d'une étude pilote de mise au point du modèle. Un score clinique et une grille de points limites sont annoncés, sans qu'aucun seuil ne soit précisé.
Objectifs
Les pathologies de la myéline, et en particulier la sclérose en plaques (SEP), sont douloureuses, invalidantes et/ou handicapantes, entraînant des conséquences socio-économiques graves comme une perte d’emploi, un manque de productivité, une prise en charge financière élevée pour la sécurité sociale, ainsi qu’une souffrance physique et psychologique majeure chez les patients et leurs familles, ceci générant d'autres problèmes comme la dépression ou l'anxiété pathologique. Par conséquent, il est justifié de travailler à une meilleure compréhension de ces pathologies pour, in fine, mettre au point des traitements spécifiques et ciblés.. Ce projet pilote vise ainsi à produire des connaissances en rapport avec la description précise des mécanismes à l'origine des anomalies de la myéline dans deux modèles animaux de cette pathologie. L'évolution de la maladie sera suivie lors d'une étude longitudinale en imagerie nucléaire avec des radiotraceurs spécifiques de la neuro- inflammation présente ans cette maladie. Ces données en vivo seront complétées par des études ex-vivo complémentaires en fin d'étude. Cette étude pilote de mise au point du modèle et de son suivi permettra par la suite de tester et/ou développer de nouveaux marqueurs plus pertinents pour détecter cette pathologie. Ces résultats permettront également le transfert d'hypothèses physiopathologiques vers la clinique et vice-versa.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la production de connaissances dans le but d’élaborer des stratégies permettant de traiter efficacement les pathologies de la myéline. Plus particulièrement, nous aurons des éléments de décryptage concernant la neuroinflammation et l’activation de la microglie au décours d’une pathologie de la myéline.
Procédures
Les animaux auront des anesthésies répétées: - immunisation des animaux : une anesthésie gazeuse durée 3 minutes – 1 à 3 injections de radiotraceur par voie intraveineuse d'une durée de 3 minutes maximale chacune sous anesthésie gazeuse -examens d'imagerie : 3 à 5 séances d'imagerie TEP/TDMX d'une durée de 10 à 20 minutes sous anesthésie gazeuse espacées de plusieurs jours (minimum 5) ou de 90 minutes pour J10
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : a) le développement de troubles moteurs des membres postérieurs et antérieurs, b) la paralysie, c) la perte rapide et drastique de poids, d) l’éventuelle formation d’un hématome au niveau du site d'injection du radiotraceur et une nécrose de la queue subséquente , e) une miction excessive en début de maladie et une réduction de la miction au pic de la maladie, f) les effets d’anesthésies répétées.
Devenir
A l'issue de la dernière séance d'imagerie (J~21), l'ensemble des animaux seront mis à mort pour pouvoir réaliser des études complémentaires ex-vivo.
Remplacement
Les études planifiées dans ce projet ne peuvent être réalisées in vitro car il s’agit d’explorer les mécanismes pathogéniques d’une maladie autoimmune, la slérose en plaques, impliquant différents organes en interaction.
Réduction
L’imagerie TEP est peu invasive, et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin,il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons 20 souris par groupe à l'inclusion pour pouvoir faire des statistiques sur les résultats obtenus. Ce nombre d'animaux par groupe est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude pour atteinte de point limite
Raffinement
Les animaux sont placés à plusieurs par cage et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois). La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite la thermorégulation de l’animal ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle de nidification. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de pointslimites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.
Choix des espèces
Le modèle animal d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) a été mis au point dans la littérature sur les souris, que ce soit pour mimer la forme de la maladie évoluant progressivement sans poussées ou le modèle qui se rapproche des formes rémittentes de la maladie. Par ailleurs, la souris permettrait d’obtenir des animaux génétiquement modifiées homogènes. Dans ce projet, les souris femelles sont immunisées au stade jeune adulte (8 semaines). L'âge des souris est celui recommandé dans la littérature pour que l'immunisation soit efficace et que la pathologie se développe de façon optimale.
Décontamination par transfert d’embryons de lignées murines EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées à cinq semaines parce que le prélèvement de leurs ovules l'exige, les femelles donneuses ne sont qu'une part des 5 305 souris de ce projet : les mâles vasectomisés sont tués à deux ans lorsqu'ils cessent d'être de bons reproducteurs, les femelles receveuses à quatre mois après le sevrage des souriceaux, une sur trois partant en laboratoire d'analyse pour le contrôle sanitaire. Le niveau de souffrance déclaré va de léger à modéré. Les procédures tiennent en deux injections d'hormones pour les donneuses, une vasectomie de dix minutes pour les mâles, une chirurgie de réimplantation d'embryons de dix minutes pour les receveuses. L'objet du projet est un service rendu aux animaleries, rendre des lignées exemptes de pathogènes pour qu'elles circulent entre établissements. Le porteur écrit que la décontamination d'une lignée "nécessite obligatoirement qu'elle soit respirante", et conclut que la souris ne peut pas y être remplacée.
Objectifs
Les animaleries d'hébergement gèrent leur statut sanitaire. Suivant le statut sanitaire d'une animalerie, il se peut que des animaux ne puissent pas être transférés d'un établissement utilisateur vers un autre ce qui peut être un frein à un projet et au bon déroulement de la recherche scientifique. De plus, harmoniser le statut sanitaire des animaux permet de diminuer l'hétérogénéité entre les individus et donc d'améliorer les résultats des différents projets. Pour pallier à ce problème de statut sanitaire, la plateforme scientifique propose à la communauté scientifique de réaliser la décontamination de leurs animaux. Ceci signifie : rendre des animaux dépourvus de pathogènes spécifiques pour pouvoir permettre leur importation dans le maximum d'animalerie du monde entier.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont 1) permettre des importations d'animaux dans un grand nombre d'animalerie grâce à leur statut sanitaire exempts de pathogènes et d'opportunistes spécifiques 2) contribuer aux développements et aux collaborations dans les projets de recherche 3) réduire les biais dans les résultats scientifiques en diminuant l'hétérogénéité entre les animaux. Les lignées décontaminées sont nécessaires dans le cadre de nombreux projets scientifiques préalablement validés qui permettront de répondre à des questions scientifiques précises et aux enjeux de santé/société (domaines de recherche : pathologies respiratoires, musculaires, du système nerveux, métaboliques, cardiovasculaires ou génétiques).
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales d'hormones (vigil, 2x par femelles donneuses, quelques secondes) ou une chirurgie de vasectomie sous anesthésie et analgésie (1x par mâle, 10 minutes) ou une chirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie et analgésie (1x par femelles receveuses, 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales pourront induire un stress et une douleur de courte durée aux animaux. Les chirurgies peuvent induire des difficultés post-opératoire comme des douleurs ou une mauvaise cicatrisation. Les anesthésies pourront engendrer une baisse de la thermorégulation. L'hébergement individuel des mâles pourra engendré un stress.
Devenir
Une femelle receveuse sur trois sera exportée en laboratoire d'analyse pour obtenir les résultats sanitaires et valider la procédure de décontamination des animaux. Les autres animaux seront euthanasiés à la fin du projet : les mâles vasectomisés lorsqu'ils ne seront plus de bons reproducteurs (2 ans), les autres femelles receveuses (deux sur trois) à 4 mois de vie après le sevrage des souriceaux car elles ne pourront pas avoir une seconde chirurgie puis les femelles donneuses d'ovules à 5 semaines de vie car le prélèvement nécessite l'euthanasie.
Remplacement
Actuellement il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Un organisme vivant est donc nécessaire pour mener à bien les divers projets scientifiques autorisés au sein de l'établissement. La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. La décontamination d'une lignée murine nécessite obligatoirement qu'elle soit respirante. La souris ne peut donc pas être remplacée dans ce projet.
Réduction
5305 animaux pourront être utilisés dans ce projet pour les 5 ans. Le nombre de mâles et de femelles utilisées par lignée pour les transferts d'embryons est le minimum requis pour obtenir les animaux d'intérêt suite à la redérivation. Les mêmes mâles vasectomisés sont utilisés pendant 2 ans. Les lignées décontaminées seront utilisées dans un projet de recherche autorisé. La plateforme scientifique propose la cryoconservation de sperme si une lignée n'est plus utilisée dans un projet de recherche. Ceci permet de conserver une lignée de manière non respirante et donc d'éviter de produire des animaux uniquement pour le maintien d'une lignée. Il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les chirurgies sont réalisées par des spécialistes sous anesthésie et analgésie pour garantir le bien être des animaux. L'analgésie est poursuivie en post-opératoire et des croquettes humidifiées seront disposées au fond de la cage pendant 1 semaine. Les animaux nécessitant un hébergement individuel bénéficieront de 3 enrichissements dans leur cage. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. La surveillance attentive quotidienne sera accompagnée de points limites définis.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé par les chercheurs pour étudier les fonctions biologiques et les pathologies. En effet, il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés pour de très nombreuses pathologies humaines. Les mâles vasectomisés sont vasectomisés à 5 semaines. Les femelles receveuses sont utilisés à partir des 8 semaines car elles doivent être matures sexuellement. Les femelles donneuses d'ovule sont utilisées à 5 semaines. Les injections d'hormones doivent se faire sur des femelles prepubères pour maximiser le nombre d'ovules relachés et, ainsi, améliorer le taux de reusite de la décontamination. Les mâles pour accouplement sont utilisés entre 8 et 15 semaines.
Etude de l’intégrité et du couplage des réseaux neuronaux et vasculaires dans un modèle de retard de croissance intra-utérin chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mis en reproduction une nuit, puis soumis à un frottis vaginal sans anesthésie pour dater la gestation, 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des femelles gestantes passent les vingt-deux jours de gestation sous régime pauvre en protéines, avec inactivité et perte de poids attendues. Au seizième jour, chacune subit une laparotomie pour une électroporation in utero de quarante minutes, dont le réveil peut être suivi de douleurs pendant deux à trois jours. Les nouveau-nés sont maintenus en vie jusqu'au prélèvement de leurs tissus à trois, huit ou trente jours. Les mères et les petits surnuméraires sont proposés en interne pour un autre projet avant d'être tués.
Objectifs
Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.
Bénéfices attendus
Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.
Procédures
Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minutes à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.
Impact sur les animaux
Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.
Devenir
Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.
Réduction
Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative. Des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. Les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins à partir desquelles le projet s’est inspiré. Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour deux stades dedévelopement. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.
Raffinement
De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.
Choix des espèces
Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.
Traitement pour améliorer le bien-être de souris modèles de myopathie
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
715 souris génétiquement modifiées pour perdre progressivement leur force musculaire vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour la collecte de tissus. 238 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, alors que les interventions décrites se limitent à une biopsie de l'oreille, une injection anesthésique et un prélèvement de sang de vingt secondes : l'essentiel de ce qu'elles subissent tient à la myopathie elle-même. Le projet, intitulé "Traitement pour améliorer le bien-être de souris modèles de myopathie", consiste à ajouter une molécule dans l'eau de boisson pour relancer le nettoyage cellulaire des muscles atteints. Le porteur affirme que le modèle murin est "l'unique moyen" d'étudier ces mécanismes chez les mammifères et qu'il est "essentiel" pour cette étude.
Objectifs
Ce projet repose sur deux types de souris de laboratoire dont les muscles s'affaiblissent progressivement. Ces souris imitent ce qui se passe dans plusieurs maladies musculaires chez l'humain, que ce soit des maladies génétiques, liées au vieillissement ou causées par certains médicaments. Le premier type de souris développe une maladie musculaire qui s'aggrave lentement à l'âge adulte. Le deuxième type est touché plus tôt et plus rapidement, dès le jeune âge. L'objectif est de comprendre comment ces maladies fonctionnent pour trouver de nouveaux traitements. Il semblerait que le "nettoyage cellulaire" (appelé autophagie) ne fonctionne plus correctement dans les muscles malades. Cela provoque l'accumulation de déchets toxiques dans les cellules musculaires. Pour vérifier cette idée, ce projet propose de relancer ce "nettoyage cellulaire" par l’utilisation d une molécule naturelle qu'on trouve dans certains aliments et qui a déjà montré des effets positifs sur les muscles de souris dans d'autres études, sans effets secondaires négatifs. En donnant ce traitement aux souris dans leur eau de boisson, cela pourrait permettre de réactiver le "nettoyage cellulaire" et d'améliorer la santé des muscles des souris malades.
Bénéfices attendus
La perte d’intégrité musculaire s’observe dans de nombreuses conditions (vieillissement, myopathie, traitement médicamenteux). De nombreuses recherches sont en cours pour identifier des composés visant à rétablir l’intégrité musculaire pour une application clinique. Nous nous attendons à ce que le traitement des souris modèles de myopathie étudiées dans ce projet permette une récupération musculaire significative. Cette recherche pourrait révéler le potentiel thérapeutique de ce traitement pour de nombreux patients, jeunes et adultes, atteints de pathologies neuromusculaires.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - biopsie à l'oreille pour le génotypage (1 fois, courte durée) - injection pour l'anesthésie (1 fois, courte durée) et prélèvement de sang (1 fois, durée de 20 secondes environ).
Impact sur les animaux
Les deux modèles murins génétiquement modifiés dans les muscles qui sont étudiés dans ce projet développent une myopathie induisant une perte progressive de force musculaire. Le traitement pourrait induire une diminution transitoire de la consommation de boisson au début du traitement due à un goût inhabituel. La consommation de boisson sera donc attentivement surveillée pendant le traitement. La biopsie à l'oreille induira une douleur légère de courte durée. L’injection pour l’anesthésie induira une douleur transitoire et du stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation afin de collecter différents tissus pour des analyses.
Remplacement
Le modèle murin est l’unique moyen pour étudier les mécanismes induisant une myopathie et de caractériser les conséquences physiologiques chez les mammifères. En effet, les modèles in vitro ne représentent pas l’organisme entier dans lequel les interactions inter-organes sont nombreuses et nécessaires en particulier pour le métabolisme. Le modèle murin est donc essentiel pour cette étude, d’autant plus que les processus étudiés sont très conservés au cours de l’évolution. Le modèle murin permet aussi d’évaluer l'efficacité des traitements potentiels dans un contexte physiologique complet.
Réduction
Nous ciblons notre étude sur un mécanisme précis dans la progression de la myopathie des souris, nous réduisons ainsi les pistes d’exploration et donc le nombre d’animaux utilisés. Nous travaillons avec des lignées pures réduisant ainsi la variabilité entre animaux et donc le nombre d’animaux nécessaire pour l’étude. Nous prélèverons les organes, tissus et liquides biologiques sur un même animal réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires. Nous utiliserons le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous utilisons les outils permettant de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour l’étude de chaque paramètre, en tenant compte de l’amplitude des effets attendus.
Raffinement
- Nous plaçons de la nourriture à l’intérieur des cagées et des grandes tétines sur les biberons, ainsi qu'un ustensile appelé Nombrero qui permet de faciliter l'accés à la nourriture et à l'eau aux jeunes souris atteintes de la myopathie. -Le traitement proposé aux souris myopathes devrait améliorer leur bien-être. - Nous avons choisi d’utiliser l’eau de boisson pour traiter les souris afin de limiter le stress chez l’animal et reproduire un comportement naturel, plutot que le gavage ou l’injection qui sont sources de stress. -Une surveillance régulière des animaux sera réalisée pour détecter les signes de mal-être ou de souffrance. Nous nous assurerons que la prise d'eau n'est pas modifiée (pesée biberons) et que les animaux ne présentent pas de signe de déshydratation par la surveillance de la tonicité de la peau. La durée du traitement pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. - Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si nous constatons des signes de souffrance.
Choix des espèces
Les chercheurs utilisent des souris pour étudier les maladies musculaires car c'est le meilleur moyen de comprendre comment ces maladies se développent chez les mammifères, dont font partie les humains. Les muscles des souris ressemblent beaucoup à ceux des humains dans leur structure et leur fonctionnement. De plus, les scientifiques peuvent modifier les gènes des souris pour créer des modèles de maladies spécifiques, ce qui leur permet de comprendre le rôle de certains gènes dans ces maladies. Avec les souris, ils peuvent étudier la maladie à différents niveaux, allant des molécules jusqu'au corps entier. Dans cette étude, deux types de souris sont utilisées. Le premier type développe une maladie musculaire rapidement, dès le jeune âge. Ces souris recevront un traitement entre 4 et 6 semaines de vie pour essayer de ralentir la progression de la maladie. Le deuxième type développe une maladie musculaire plus lentement, à l'âge adulte. Ces souris recevront le traitement entre 10 et 25 semaines de vie pour tenter d'empêcher l'apparition de la maladie. Par l’observation des souris en réponse au traitement, de nouvelles pistes pourraient être trouvées pour soigner les maladies musculaires chez les humains.
Immunothérapie préventive dans le développement d’adénocarcinome intestinale de type MSI (Instabilité des MicroSatellites) chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris utilisées ici sont génétiquement construites pour développer d'elles-mêmes des lymphomes et des tumeurs intestinales dès leur première année de vie. Elles sont 1 614, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et des occlusions intestinales sont possibles. Un régime riche en gras alterné deux semaines par mois accélère l'apparition des adénocarcinomes, ce qui permet de ramener les groupes de trente à vingt souris, auxquelles s'ajoutent jusqu'à seize injections intraveineuses sous anesthésie sur huit mois. Toutes sont tuées, et une partie ne sera jamais analysée : ces souris-là meurent dans le cadre de l'entretien de la lignée.
Objectifs
Les cancers MSI (pour microsatellites instables) sont des tumeurs fréquentes, présentant des niveaux élevés de mutations notamment dans des séquences répétées de l’ADN appelées microsatellites. Ces tumeurs sont caractérisées par l’inactivation du système de réparation de l’ADN appelé MMR (pour MisMatch Repair). Il existe un syndrome héréditaire appelé syndrome de Lynch, dû à une mutation sur un des gènes impliqués dans ce système de réparation et qui cause le développement de tumeurs MSI chez les patients atteints de ce syndrome, entre 20 et 50 ans. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences d’un traitement d’immunothérapie sur l’initiation et la progression tumorale de type MSI. En effet, il s’avère que les cellules tumorales utilisent un système de contrôle en charge de réguler la réponse immunitaire (appelé ICK), normalement prévu pour éviter des inflammations trop importantes ou des maladies auto-immunes, afin d’échapper à la réponse immunitaire antitumorale. Ce type de tumeurs répondent généralement bien aux traitements d’immunothérapie anti ICK et ce type de traitement est proposé aux patients atteints de cancer colique MSI au stade métastatique. Avec ce projet nous voulons démontrer qu’un traitement d’immunothérapie anti ICK préventive induit une augmentation de la réponse immunitaire antitumorale en ralentissant le développement des cancers MSI. Avec ce projet nous proposons de tester plusieurs nouvelles monothérapies/bithérapies et d’évaluer les mutations des cellules tumorales qui échappent au traitement en espérant à termes ouvrir des nouvelles pistes thérapeutiques pour les malades de cancers coliques de type MSI.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’élucider dans un point de vue fondamentale l’expression des protéines exprimées par les cellules tumorales lui permettant d’échapper au système immunitaire ICK et d’un point de vue clinique et thérapeutique de valider l’intérêt d’un traitement préventif utilisant une immunothérapie anti ICK afin d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancer colique MSI (pour Microsatellites instables) notamment d’origine héréditaire. Ce projet pourra ouvrir à termes de nouvelles perspectives thérapeutiques innovantes pour les patients avec un cancer MSI résistant aux chimiothérapies standards.
Procédures
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome) dans la première année de vie. D’autres modèles développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables après induction par injection d’une solution en intrapéritonéale sur animal vigile (5 fois à raison de quelques secondes par animal). Le modèle de greffes de cellules tumorales impliquera une anesthésie et une injection sous-cutanée unique de cellules effectuées (7-8 minutes par animal). Une partie des animaux recevront un régime riche en gras à raison de 2 semaines par mois et retrouveront un régime classique les 2 semaines suivantes tout au long du projet. Tous les animaux recevront différents traitements par injections intraveineuse sur animal anesthésiés à raison toutes les 2 semaines pendant maximum 8 mois (environ 1 minutes temps par animal, 16 fois maximum).
Impact sur les animaux
Les modèles murins transgéniques utilisés développent spontanément des cancers dit MSI pour microsatellites instables (lymphome et adénocarcinome/tumeur intestinale). Les effets indésirables sont donc principalement liés à ce développement tumoral. Les principaux symptômes du lymphome sont une augmentation de la taille des organes lymphoïdes comme la rate, le thymus et le foie ainsi que dans certains cas des ganglions. Pour l’adénocarcinome/tumeur intestinale, il s’agit d’une tumeur qui reste localisé et n’envahi pas les tissus/organes à distance (pas de métastase). Les souris dans ce contexte peuvent faire des occlusions intestinales. Un autre modèle murin utilisé au cours de ce projet impliquera l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée dans des souris commerciales et effectué sous anesthésie de courte durée pouvant induire un léger stress thermique, un risque d’arrêt cardiorespiratoire (très rare). Le risque d’une croissance tumorale importante pouvant entrainer dans les cas les plus sérieux : une nécrose des tissus (peu probable d’après notre expérience), des difficultés de mobilité, ou encore une perte de poids. L’alternance entre régime standard et régime riche en gras pourra induire un léger stress en raison du changement d’alimentation (néophobie de la souris). Les injections nécessaires à l’induction de certains modèles par injection intrapéritonéale pourront induire un stress et une douleur de courte durée lié à la piqure de l’aiguille. L’administration des différents traitements par injection intraveineuse seront effectuées sous anesthésie de courte durée pouvant induire un léger stress thermique, un risque d’arrêt cardiorespiratoire (très rare) et également un risque de lésion/infection au site d’injection. Les traitements devraient réduire les effets liés au développement tumorale avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités.
Devenir
À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.
Remplacement
Un organisme vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement tumoral qui est au cœur de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Dans le cas d’un projet qui vise à étudier l’effet d’une nouvelle immunothérapie, il est nécessaire travailler sur un modèle in vivo car mieux adaptés à l'observation des effets globaux sur un sujet vivant et en particulier pour ce qui concerne l’initiation et la progression tumoral ainsi que les effets autres qui pourraient se manifester sur l’organisme.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1614 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures d’élevage et expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Par exemple, pour les modèles génétiquement modifiés l’utilisation de la stratégie du régime riche en gras alterné permet d’accroitre la fréquence du développement des adénocarcinomes qui sont nécessaires dans ce projet, ce qui permet de réduire la taille des groupes à 20 souris (contre 30 sous régime standard). Il apparait nécessaire de mettre en observation 20 souris par groupe pour espérer mettre en évidence un impact significatif du traitement dans le cadre de notre expérience en restant respectueux de la règle des 3R. Pour les expériences impliquantes des greffes de cellules tumorales, les groupes seront réduits à 10-15 souris. Ces cohortes devraient nous permettre de mettre en évidence l'impact des traitements par immunothérapie simple ou combiné en respectant la règle des 3R. Si l'impact est significatif, ce que nous espérons, il ne sera pas utile de répéter l'expérience.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite). Les contraintes induites par le manipulateur dans ce protocole sont faibles (uniquement l’injection des traitements). Elles sont réalisées par du personnel formé et compétent et avec du matériel adapté en condition stérile. Durant les phases de traitement la surveillance sera augmentée afin de mettre en évidence toute intolérance liée au traitement. Un suivi pondéral des animaux sera réalisé afin de mettre en évidence une éventuelle perte/prise de poids. Pour le modèle de xénogreffe sous-cutanée, nous mettrons également en place un suivi bi-hebdomadaire de la croissance tumorale avec des points limites associés. La principale douleur pouvant être subit par les animaux concerne surtout le développement naturel des tumeurs. Ainsi, grâce au suivi et à la très bonne connaissance des modèles murins utilisés, nous pouvons détecter les premiers signes d’un développement tumoral. Dans ce cas, les souris seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Justification de l’espèce/modèle : Les souris sont des animaux modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation des modèles murins est la seule approche permettant d'intégrer le développement tumoral MSI et la complexité de la réponse aux traitements de chimiothérapie. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Les modèles animaux qui développent des tumeurs spontanément seront à partir d’environs 8-10 semaines. Les souris auront alors atteint un poids et une taille favorable pour réaliser les gestes techniques. De plus, la mise en œuvre d’un traitement à partir de 8-10 semaines nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement préventif. Pour le modèle de greffe sous-cutanée de cellules tumorales, les souris seront traitées par immunothérapie dès 6 semaines et la greffe sera réalisée à 9 semaines de vie. Cela nous permettra d’évaluer l’efficacité d’un traitement préventif.
Cibler les macrophages dans un modèle murin de Sclérose Latéral Amyotrophique (SLA) pour ralentir la progression de la maladie.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
165 souris atteintes d'un modèle de sclérose latérale amyotrophique reçoivent chacune jusqu'à 45 injections intrapéritonéales en neuf semaines, auxquelles s'ajoutent trois prélèvements sanguins et onze mesures de force musculaire. Cent cinquante-cinq d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue pour prélever tissus nerveux, muscles et cellules sanguines. La maladie leur fait perdre leur force musculaire puis les paralyse progressivement, et le critère de jugement principal retenu est leur durée de vie, en moyenne 165 jours sans traitement. Le passage en essai clinique chez l'humain reste envisagé "à plus long terme" et "en cas d'efficacité".
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative grave, caractérisée par la mort des motoneurones (cellules nerveuses qui contrôlent la contraction des muscles) entrainant une paralysie et le décès des patients en 2 à 5 ans. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 3 mois en moyenne. Etant donné que les macrophages (cellules immunitaires présentes dans les tissus) sont impliqués dans la progression de la maladie, l’objectif de notre projet est de moduler l’activation des macrophages périphériques grâce à 2 molécules qui ciblent une voie activée spécifiquement dans les macrophages et les cellules microgliales (cellules immunitaires du système nerveux) et qui peuvent ainsi réduire leur réactivité. Cette approche a une visée thérapeutique directe si nous montrons qu’elle peut ralentir la progression de la maladie. Ces molécules ont déjà été utilisées dans d’autres modèles de maladies neurologiques et ont montré des résultats encourageants avec une diminution de l’activation des cellules microgliales. Notre hypothèse est que cette voie pourrait être impliquée dans la progression de la SLA et la cibler par l'intermédiaire de ces 2 molécules pourrait ralentir de façon importante la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative actuellement incurable entrainant une paralysie progressive et la mort des patients en moyenne en 2 à 5 ans. La SLA touche 8000 personnes en France avec une prévalence de 4/100000 personnes. L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie dans un modèle de souris de SLA, en modulant une voie du système immunitaire présente dans les macrophages, cellules immunitaires des tissus, par l’injection de 2 molécules régulant cette voie. Un bénéfice du remplacement des macrophages des souris SLA par des macrophages moins toxiques a été montré dans ce modèle. L’utilisation de molécules pharmacologiques pour moduler la réponse toxique des macrophages pourrait donc être bénéfique et rapidement transférable en clinique. Ces molécules ont déjà été utilisées dans des modèles de souris d’autres maladies neurologiques et ont montré un bénéfice. Notre hypothèse est que ces molécules pourront permettre de ralentir la progression de la maladie en ciblant les macrophages chez les souris SLA. Le critère de jugement principal (et communément reconnu dans la littérature) sera ainsi la durée de vie des souris, sachant que les souris SLA vivent en moyenne 165 jours sans traitement (5,5 mois). Les critères de jugements secondaires seront la détection, par des marquages dans les tissus nerveux, de la survie des motoneurones (cellules qui meurent au cours de la maladie) et de la réponse des cellules immunitaires (macrophages) du système nerveux et du sang en fonction du traitement par les 2 molécules testées. Ces molécules ont des propriétés capables de réduire l’activation des macrophages ce qui pourrait leur conférer des propriétés remarquables pour la SLA. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’humain est envisagé pour cette maladie sans traitement curatif.
Procédures
Les animaux modèles de la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) et leurs contrôles seront soumis à des traitements par injections intra-péritonéales (animal vigil, 45 fois sur 9 semaines, 1 minute), des prélèvements sanguins (animal vigil, 3 fois en 11 semaines , 1 minute) et des mesures de force musculaire (animal vigil, 11 fois sur 11 semaines , 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les souris auront : 1) un phénotype dommageable entrainant la perte de force musculaire et la paralysie progressive de l'animal, 2) des injections répétées intrapéritonéales qui pourront induire une douleur légère de courte durée au site d'injection et une inflammation au niveau du péritoine (rare), 3) des prélèvements sanguins pouvant induire une douleur légère de courte durée au point de prélèvement et dans de rare cas un hématome, puis 4) un léger stress lors du test comportemental de force musculaire.
Devenir
L’euthanasie est nécessaire afin de collecter les tissus nerveux, les muscles et les cellules sanguines affectés par la maladie afin de les étudier au laboratoire.Tous les animaux seront utilisés à la fin des procédures pour des études d’histologie ou de leurs ARN et protéines et seront donc euthanasiés.
Remplacement
Nous avons déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester avant de passer à l’expérimentation sur le modèle de souris. Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles notre projet nécessite l’utilisation de souris modèle de la pathologie.
Réduction
Nous utiliserons le nombre d’animaux maximal de 165 souris nous permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif et afin de pouvoir obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Nous utiliserons le même groupe d’animaux témoins pour toutes les concentrations des molécules à tester afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Pour la stimulation environnementale, un programme d’enrichissement sera suivi, nous utilisons toujours des petites maisons en carton « Mouse house » et des fibres en carton ou carrés de coton permettant de faire des nids dans chaque cage. Les femelles seront hébergées ensemble à 5 souris par cage. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie SLA) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront dans ce cas hébergées avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris par cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Une attention particulière sera portée aux yeux des souris qui seront fréquemment nettoyés (à l’eau stérile) en cas de suintement, pour éviter toute infection. De la solution antiseptique sera utilisée si les yeux paraissent trop souillés comme désinfectant. Proche de la fin du projet, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini des points limites.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la Sclérose Latérale Amyotrophique ou SLA : souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre motoneurones et cellules immunitaires dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons/mouches/vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat; C’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. Les souris SLA seront utilisées à l’âge adulte, de 7 semaines à 24 semaines maximum.
Mise en place de xénogreffes d’origine humaine chez la souris pour tester de nouvelles thérapies contre les lymphomes à cellules B
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées avec des cellules de lymphome humain, 581 souris reçoivent ensuite jusqu'à vingt gavages, vingt injections et cinq séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie l'implantation de la tumeur d'intervention chirurgicale "légère" et décrit les traitements comme sources d'une douleur "légère à court terme", tout en prévoyant de peser et d'observer les souris deux fois par semaine pour les mettre à mort avant leur mort "naturelle". La mise à mort sert à récupérer les organes et les tumeurs.
Objectifs
Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Les analyses génomiques des lymphomes diffus à grandes cellules B ont montré des altérations de l'épigénome (modifications des histones et méthylation de l'ADN), ainsi que des mutations fréquentes dans les gènes ayant un rôle épigénétique. Ces connaissances ont conduit au développement de médicaments inhibant les protéines épigénétiques. Cependant, les résultats des essais cliniques testant des médicaments épigénétiques pour traiter le lymphome n’ont pas été aussi prometteurs que prévu. Nous émettons l'hypothèse que les médicaments épigénétiques ont montré une faible efficacité jusqu'à présent car ils ont été utilisés en monothérapie, ce qui plaide en faveur de l'utilisation de thérapies combinatoires. L'objectif de ce projet est d'étudier l'efficacité des thérapies épigénétiques combinatoires dans le lymphome dans le but de concevoir de nouveaux traitements prometteurs qui peuvent être testés plus avant dans des essais cliniques.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’étudier de nouveaux traitements contre le lymphome diffus à grandes cellules B . Bien qu’il existe un traitement standard pour ce type de lymphome, il n’est efficace que chez 60 % des patients et repose sur la chimiothérapie, qui est associée à des effets secondaires toxiques. Par conséquent, la découverte de thérapies plus efficaces et ciblées constituerait une avancée significative dans le traitement des patients atteints de lymphome diffus à grandes cellules B .
Procédures
Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux une ou deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Certaines souris subiront une intervention chirurgicale légère pour recevoir la tumeur (une fois), ce qui implique l’utilisation d’anesthésie ; certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer les cellules tumorales (une fois) ou détecter les cellules tumorales (une fois par semaine) ; et certaines souris recevront le traitement par injection ou par voie orale quotidiennement pendant 4 semaines maximum. Types d’interventions : - Contentions pour pesées et mesures : durée = 5 secondes / nombre = 12 - Intervention chirurgicale sous anesthésie/analgésie : durée = 10 minutes / nombre = 1 - Administration par gavage sur animal vigile : durée = 1 minute / nombre = 20 - Administration par injection sur animal vigile : durée = 30 secondes / nombre = 20 - Administration par injection sur animal anesthésié : 30 secondes / nombre = 1 - Imagerie corporelle non invasive sous anesthésie : durée = 5 minutes / nombre = 5
Impact sur les animaux
Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Les souris qui reçoivent des lymphomes diffus à grandes cellules B primaires subiront une intervention chirurgicale, qui implique l'utilisation d'anesthésie. Le traitement par injection ou par voie orale peut également provoquer du stress et des douleurs légères à court terme.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.
Remplacement
Compte tenu de la complexité des mécanismes impliqués dans le lymphome, aborder ce problème uniquement par des analyses in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est indispensable pour étudier cette maladie humaine. Les différents composés étudiés ont été testés in vitro sur des cellules de lymphome et les concentrations toxiques déterminées pour chaque composé contre les cellules tumorales mais pas contre les cellules saines. Il faut maintenant vérifier que cet effet se produit également in vivo en utilisant différents modèles de lymphome humain. Aucune méthode alternative n’est donc pour l’instant apte à remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expériences in vivo permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux.
Réduction
Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes, ce qui permettra de calculer le nombre d'animaux strictement nécessaires à ce projet. Par ailleurs l’utilisation de l’imagerie permettant une étude sur la durée des mêmes animaux est un élément de réduction.
Raffinement
Nous avons établi une grille d’évaluation avec des seuils de coupure précoces adaptés pour détecter le lymphome suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant la rigueur scientifique, notamment en augmentant la surveillance lors de l’observation des changements de poids, de mouvement, d’apparence physique et de comportement ; et en ajoutant de l’eau gélifiée et de la nourriture à l’intérieur de la cage lorsque des symptômes de lymphome apparaissent. D’autre part, après le transfert des cellules de lymphome et le traitement avec les composés, les animaux seront surveillés quotidiennement, permettant de détecter toute apparition de signes durables de souffrance. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone. Concernant les souris immunodéficientes, elles seront hébergées à raison de 5 maximum par cages, sur des portoirs ventilés où les paramètres environnementaux sont contrôlés, nourries à volonté avec de l'eau stérilisée par filtration et des aliments adaptés, dans un milieu enrichi (neslets et igloo dans chaque cage). Un suivi journalier est effectué par le personnel animalier. L'ensemble des manipulations se fera en conditions stériles avec des gants et du matériel stérile pour éviter toute contamination des souris qui sont immunodéficientes.
Choix des espèces
Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Les conditions optimales de réalisation des xénogreffes nécessitent d’implanter de jeunes adultes, soit des souris âgées de 6-8 semaines.
Test de stratégies expérimentales permettant de prévenir les troubles moteurs et cognitifs dans un modèle murin de paraplégie spastique héréditaire
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Nées dans l'élevage de l'équipe, d'une lignée génétiquement modifiée porteuse d'une mutation responsable d'une paraplégie spastique héréditaire, et croisée toutes les dix générations avec des souris d'un élevage extérieur, 3 086 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Après une coupe du bout de la queue pour le génotypage, elles reçoivent selon les groupes un médicament mêlé aux croquettes pendant sept mois, ou une dose unique par gavage de leur mère gestante. Une partie passe trois séries d'un test de mémoire et d'un test de coordination motrice, que le porteur ne nomme pas, chacune suivie d'une prise de sang sous anesthésie, et un groupe subit jusqu'à 14 prises de sang, une toutes les deux semaines. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leurs tissus ou des embryons, comme les couples reproducteurs quand leur fécondité diminue. Le porteur juge "indispensable" le recours aux souris, tout en disant utiliser des méthodes in vitro "dès que possible".
Objectifs
Les paraplégies spastiques héréditaires sont des maladies neurodégénératives d’origine génétique caractérisées par une mort neuronale, mais aussi parfois des troubles de développement du cerveau. Ces maladies sont très hétérogènes et sont causées par des mutations dans environ 80 gènes différents. Elles touchent environ 3 personnes sur 100.000 en Europe, avec un début généralement à l’âge adulte mais qui peut apparaitre dans l’enfance. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif pour la prise en charge de ces pathologies. Nous travaillons sur une des formes les plus fréquentes de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles de développement du système nerveux. Nous utiliserons un modèle animal (souris) pour cette forme de paraplégie spastique héréditaire. Nous avons déjà montré que ce modèle présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau et il récapitule les principaux signes observés chez les patients. L’objectif du projet est de mieux caractériser les différentes étapes d’évolution de la maladie, de son développement à la mort neuronale, et d’évaluer dans un modèle animal des stratégies thérapeutiques qui pourraient permettre de prévenir l’apparition des symptômes et la mort neuronale.
Bénéfices attendus
Nous travaillons sur une des formes les plus fréquente de paraplégie spastique héréditaire, qui est caractérisée par une mort neuronale, mais aussi des troubles du neurodéveloppement et actuellement aucun traitement ne peut être proposé aux patients. Un premier aspect du projet permettra de tester l’efficacité de deux médicaments sur la mort neuronale dans le modèle animal de la maladie. Si nous pouvons démontrer qu’au moins un de ces deux médicaments retarde la mort neuronale, notre projet pourrait permettre d’avancer vers une stratégie thérapeutique pour les patients atteints de cette paraplégie spastique héréditaire. Par ailleurs, nous savons que la maladie que nous étudions est associée à de légers défauts de développement du cerveau, mais nous ne savons pas si, et dans quelle mesure, ces défauts participent à l’apparition des symptômes de la maladie. Notre projet pourrait permettre de répondre à cette question. Comme le diagnostic des patients a généralement lieu à l’adolescence, après la phase de développement, la compréhension du rôle du développement permettra de mieux expliquer la maladie aux patients et d’améliorer leur prise en charge.
Procédures
La mutation génétique portée par certains animaux peut générer des souffrances à partir de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids. Pour déterminer la présence de la mutation (génotypage), un petit prélèvement de l’extrémité terminale de la queue sera effectué sur les jeunes animaux. Cet acte sera réalisé rapidement (moins d’une minute par animal) et une seule fois sur chaque animal. Nous réaliserons des traitements pour évaluer leur impact sur l’évolution de la maladie. Une approche sera un traitement chronique pendant 7 mois qui sera administré par incorporation dans les croquettes pour éviter des gestes invasifs. Une autre approche sera une administration unique par gavage de la mère gestante à un moment précis du développement embryonnaire (une fois, inférieur à une minute). Une partie des animaux sera soumise à trois séries de 2 tests comportementaux sur des animaux vigiles (à l’âge de 6 semaines, 4 mois et 8 mois). Le premier test est répété pendant 5 jours et vise à étudier les troubles de la mémoire (3minutes maximum par session, 2 fois 5 jours) ; le second test est répété pendant 3 jours et vise à tester la coordination motrice (5 minutes maximum par session, 5 fois 3 jours). A l’issue de chaque série de tests comportementaux, les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (3 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement). Un groupe d’animaux sera soumis à des prélèvements sanguins répétés sous anesthésie générale toutes les 2 semaines (14 prélèvements maximum, durée inférieure à 1 minute par prélèvement) L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire en fin de procédure expérimentale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de l’extrémité de la queue pour le génotypage peut générer une légère douleur chez l’animal et un risque rare de saignement. Pour l’étude de l’effet thérapeutique de médicaments, des effets secondaires (diarrhées, perte de poids) pourraient être associés au traitement. Pour l’étude sur la contribution du développement à la maladie, nous administrerons un médicament par gavage, ce qui peut générer une gêne et un inconfort et des effets indésirables liés à la molécule administrée. Les tests comportementaux peuvent générer du stress chez les animaux liés à leur manipulation et aux changements de pièces. Les prélèvements de sang peuvent générer un stress, une douleur et un inconfort lié à la piqûre, et leur répétition peut engendrer une déshydratation. Il existe un risque d’hématome après le prélèvement. L’anesthésie générale mise en place pour les prélèvements sanguins sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque rare de dépression cardiorespiratoire. La mutation génétique portée par les souris porteuses de 2 copies du gène muté peut générer des souffrances après de l’âge de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et perte de poids.
Devenir
Les couples ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de récupérer les tissus post-mortem ou prélever des embryons.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, nous utilisons dans la mesure du possible des modèles in vitro qui évitent l’utilisation d’animaux. En effet, nous utilisons des modèles in vitro qui miment le développement du cerveau et qui permettent de répondre à certaines questions sur la contribution de ce développement sur la maladie que nous étudions. Cependant ce modèle in vitro ne permet pas de répondre à toutes les questions car : (i) le comportement des neurones diffère selon leur environnement in vitro et in vivo ; et (ii) la mise en place de l'organisation du cerveau ne peut pas être reproduite in vitro. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de mener des expériences comportementales. L’utilisation d’un modèle animal est donc indispensable pour notre projet, mais nous utiliserons le modèle in vitro dès que possible afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans le cadre de la maladie que nous étudions, il existe un modèle de souris permettant d’évaluer les différents aspects que nous souhaitons étudier dans ce projet et ainsi obtenir des données transposables chez l’homme. L’étude de l’effet thérapeutique de médicaments sur les symptômes de la maladie ne peut se faire que sur un modèle animal et ne peut pas être remplacé par un modèle in vitro. De même, l’étude de l’influence d’un développement anormal sur l’organisation du cerveau adulte et ses conséquences comportementales ne peut se faire qu’avec des modèles animaux. Il n’existe pas de méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux vivants qui permettent d'étudier le développement du cerveau et ses effets sur des troubles moteurs et cognitifs. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé en prenant en compte la lignée de souris génétiquement modifiée nécessaire à l'étude et en réduisant au plus le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables et valides. Nous affinerons les analyses statistiques en fonction de données à analyser. De plus, afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. En nous basant sur nos études précédentes, nous estimons qu’il nous faudra de 8 à 20 animaux par groupe en fonction des analyses à réaliser. Ainsi, au total, nous estimons qu’il faudra 3086 animaux pour obtenir des résultats significatifs dans ce projet. Toutefois, si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux, tous ne seront pas utilisés, ni produits. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires pour nos lots expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce et seront observés quotidiennement. Les animaux que nous utilisons sont génétiquement modifiés. Comme seules les souris porteuses de 2 copies du gène muté présentent un phénotype dommageable, nous privilégierons un schéma de croisement permettant de limiter le risque d’expression du phénotype dommageable seulement aux animaux nécessaires pour les lots expérimentaux. Le maintien de la lignée privilégiera les animaux avec une seule copie du gène muté. Les animaux porteurs de 2 copies du gène muté seront particulièrement surveillés pour détecter tout signe précoce d’expression du phénotype dommageable, notamment des difficultés locomotrices et une prostration qui sont 2 signes caractéristiques liés à la mutation. La biopsie pour génotypage sera la plus petite possible et réalisée sur un animal jeune (cicatrisation rapide). Il s’agit d’un geste rapide, réalisé au calme et parfaitement maitrisé. Pour le maintien de notre lignée, afin d’éviter toute dérive génétique, toutes les 10 générations, nous croiserons notre lignée de souris avec des souris sauvages provenant d’un élevage extérieur. Les souris qui recevront des traitements à visée thérapeutique seront traitées à des doses déjà utilisées dans des publications et n’entrainant pas d’effets délétères. Ces souris seront néanmoins surveillées dans les jours qui suivent l’intervention pour vérifier qu’elles continuent à s’alimenter. De plus, les traitements chroniques seront administrés par incorporation à la nourriture afin de diminuer la manipulation des animaux. Pour réduire le stress en lien avec les prélèvements de sang ils seront réalisés sous anesthésie générale. Pour les animaux soumis à des prélèvements répétés, après chaque prélèvement une injection de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir toute déshydratation. Des points limites spécifiques à chaque procédure sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Un protocole d’analgésie sera utilisé lors de l’euthanasie des souris afin qu’elle se fasse sans douleur et sur un animal pré-sédaté.
Choix des espèces
Dans le projet, nous utiliserons un modèle de souris déjà caractérisé et qui récapitule les principaux symptômes observés chez les patients atteints de la forme de maladie que nous étudions. L’étude de ce modèle nous permettra donc d’obtenir des données transposables chez l’homme. Le modèle de souris utilisé présente une mort neuronale et des altérations du développement du cerveau. Ce modèle est donc parfaitement adapté pour répondre à notre question scientifique, et il est impossible de répondre à cette question sans l’utilisation d’un modèle animal. Afin d’étudier les différentes composantes de la maladie et l’impact d’un traitement à différents âges sur son évolution, nous étudierons des animaux à partir du stade embryonnaire jusqu’à l’âge de 8 mois. La mutation génétique des animaux sera vérifiée à l’âge de 7 à 10 jours.