Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
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Elevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude de l’impact des cellules immunitaires sur le foie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Baguées à l'oreille, amputées d'un bout de queue pour lire leur ADN, sexées et séparées de leur mère à trois ou quatre semaines, 1 090 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans ce projet d'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les femelles retenues passent en accouplement vers six semaines, les autres entrent en expérience à partir de dix semaines. Le porteur affirme que les souris porteuses de la mutation ne développent aucune maladie et ne diffèrent pas des autres, l'élevage servant à alimenter des projets sur les maladies des petits vaisseaux du foie. Celles qui ne portent pas les bonnes modifications de gènes sont tuées dès réception du génotype, les reproductrices deux mois après leur dernière portée, et celles gardées en réserve passé 20 semaines pour les femelles et 30 pour les mâles.
Objectifs
Notre projet est d'étudier le rôle de certaines cellules de défense de l'organisme dans le développement des maladies des petits vaisseaux du foie. Nous allons pour cela utiliser des souris possédant une mutation à l'origine d'une diminution de leurs cellules de défense de l'organisme. Pour ce projet, nous avons tout d'abord besoin d’identifier ces souris (par une bague à l’oreille) et d'étudier l'ADN de ces souris (prélèvement d'un petit bout de leur queue) pour s'assurer de la présence de la mutation qui permet la diminution des cellules de défense avant de pouvoir réaliser des accouplements des souris ou de réaliser des expérimentations.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre l'élevage des lignées de souris nécessaires pour étudier la maladie des petits vaisseaux du foie qui est encore largement incomprise. Améliorer sa compréhension est très important à la fois pour : 1/ prévoir quels patients risquent de développer cette maladie, quelle sévérité attendre et donc prévoir un suivi plus approprié. 2/ trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Ce projet consiste en l’élevage de souris génétiquement modifiées. Pour s’assurer que les souris ont bien la mutation d’intérêt, nous réaliserons le prélèvement d’un petit bout de queue à 3-4 semaines dans la vie de la souris. Ce geste nécessitera le maintien de l’animal pendant une trentaine de secondes. Ce petit bout de queue permettra d’obtenir l’ADN de la souris et ainsi de s’assurer de la présence de la mutation génétique d’intérêt. Les souris nées des accouplements seront sexées (identification et séparation des mâles et des femelles) et sevrées (séparation d’avec leur mère) à l’âge de 3-4 semaines.
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement du petit bout de queue, une contention de courte durée est nécessaire, pouvant entrainer un stress et une légère douleur à la queue, de très courte durée. Un léger saignement est également possible. Les animaux qui ont la mutation d’intérêt ne développent pas spontanément de maladie particulière et ne sont pas différents des animaux non mutés.
Devenir
Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).
Remplacement
Les pathologies du foie sont des pathologies complexes sous l'influence de nombreux facteurs notamment environnementaux. Cette pluralité des facteurs de risque et d’interactions à l'origine du développement de la maladie des petits vaisseaux du foie, rend particulièrement difficile l’étude chez l’humain. Grâce au modèle des souris nous nous affranchirons ainsi de nombreux facteurs environnementaux à l’origine du développement de la maladie des petits vaisseaux et pourrons étudier l’effet d’un seul facteur.
Réduction
Nous adapterons l’élevage au besoin de souris pour réalisation des expériences permettant l’étude de l’effet d’une variation du nombre de cellules de défenses sur le développement de la maladie des petits vaisseaux du foie. Nous connaissons bien l’ensemble de ces lignées de souris génétiquement modifiées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d’abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d’éviter qu’elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnels, coton pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures).
Choix des espèces
Le modèle de souris permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome, développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l’étude. Enfin la maladie des petits vaisseaux du foie étant une maladie multifactorielle, la proximité génétique de la souris par rapport à l’homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le sevrage, le sexage, l’identification (mise de la bague à l’oreille) et l’analyse de l’ADN des souris pour rechercher la mutation d’intérêt seront réalisés entre 3 et 4 semaines de vie. Nous choisissons cet âge pour déterminer tôt les souris portant la mutation qui pourront être utilisées pour une mise en accouplement (vers 6 semaines de vie) ou une utilisation dans les expériences prévues à partir de 10 semaines de vie.
Etude des mécanismes de résistance des poux à l’ivermectine administrée oralement à des lapins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Contenus une demi-heure par semaine pendant six mois pour que des poux de corps humains se nourrissent de leur sang, quatre lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux d'entre eux reçoivent en plus de l'ivermectine par la bouche une fois par semaine, contention comprise, sur la même durée. L'objet est d'observer comment les poux développent une résistance à ce médicament, parfois prescrit contre les pédiculoses qui résistent aux traitements classiques. Le porteur ramène les nuisances à quelques minutes de stress et quelques secondes de gêne, tout en fixant comme points limites l'hépatite aiguë, le coma et la neurotoxicité, et annonce que les quatre lapins seront proposés à l'adoption en famille d'accueil sauf pathologie ou blessure grave.
Objectifs
La pédiculose, est une parasitose qui touche des millions de personnes à travers le monde. Vecteur de bactéries pathogènes pour l’Homme, ce parasite est cause de problèmes économiques et de santé publique. L’utilisation intense de pédiculicides pour le traitement de la pédiculose du cuir chevelu a entrainé une perte de leur efficacité liée au développement de résistances des poux, contribuant à l’augmentation de l’incidence des pédiculoses. Dans certains cas d’infestations massives ou d’échecs des traitements classiques, un traitement par l’ivermectine peut alors être prescrit. Bien que la pédiculose ne soit pas une indication du traitement par l’ivermectine, sa prescrition pourrait à l’avenir être plus fréquente. Compte tenu de ces données, l’étude des mécanismes de résistance des poux à l’ivermectine constitue un enjeu essentiel. L’ivermectine est connue pour agir sur les récepteurs impliqués dans les neurotransmissions. L’objectif du projet est d'étudier l'impact de l'ivermectine administrée par voie orale sur l'apparition de résistance chez les poux et d'en étudier les mécanismes moléculaires au niveau des récepteurs cibles. Les poux étant des insectes hématophages stricts, cette étude sera réalisée sur des poux de corps humains d'élevage sélectionnés il y a plusieurs décennies pour leur capacité à se nourrir exclusivement de sang de lapin. Le projet est prévu sur un an et nécessitera 4 lapins, 2 non traités et 2 traités par l'ivermectine par voie orale.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet devraient permettre d’appréhender les bases potentielles de la résistance des poux à l'ivermectine et ainsi d'adapter sa prescription dans les cas de pédiculose. Il pourra également servir de base pour appréhender les bases moléculaires de la résistance à l'ivermectine dans les pathologies pour lesquelles elle est massivement administrées (diverses parasitoses dont la gale, rosacée…).
Procédures
Ll'administration d'ivermectine par voie orale et la contention nécessaire durent moins de 10 minutes. Elles seront réalisées une fois par semaine, pendant 6 mois maximum (24 fois), sur les animaux concernés. Le nourrissage des poux et la contention nécessaire durent environ 30 minutes une fois par semaine, pendant 6 mois maximum (24 fois).
Impact sur les animaux
La contention du lapin nécessaire à l'administration orale d'ivermectine peut engendre du stress pendant quelques minutes. L'administration d'ivermectine par voie orale peut entrainer une gêne pendant quelques secondes. L’ivermectine est largement utilisée en médecines humaine et vétérinaire et des effets indésirables variables peuvent survenir suite à son administration. Par exemple chez l'humain, des atteintes cutanées (prurit, urticaire...), oculaires (conjonctivite, kératite...), digestives (vomissement, diarrhée...), respiratoires (toux, asthme...) ou du système nerveux (somnolence, tremblement...) ont été rapportées à des fréquences inconnues. Les points limites sont l'apparition d'atteintes graves telles que hépatite aiguë, coma ou neurotoxicité. Le nourrissage des poux peut entraîner une irritation cutanée qui disparaît après une dizaine de minutes.
Devenir
A l'issue de la procédure "traitement oral de lapins par l'ivermectine suivi du nourrissage des poux", tous les animaux seront proposés à l'adoption en famille d'accueil. Les animaux ne seront mis à mort qu'en cas de pathologie grave dépendante ou non du traitement, de blessure grave accidentelle ou d'impossibilité de les placer en fin de projet. La décision de mise à mort sera préalablement soumise aux responsables du projet initial et au vétérinaire référent.
Remplacement
Aucun mode de nourrissage in vitro permettant l'obtention d'une colonie conséquente et viable sur plusieurs générations n'est actuellement possible pour les poux humains. Le cycle de vie des poux d'élevage, insectes hématophages, est assuré par des repas sanguins sur le lapin, seul animal sur lequel ils ont été adaptés il y a plusieurs décennies.
Réduction
Le nombre d'animaux est le minimum requis pour un nourrissage des poux en alternance, 2 fois par semaine chacun sur une période de 6 mois maximum.
Raffinement
Les lapins seront hébergés en accord avec les directives européennes à 2 par cage double comportant une tablette leur permettant de grimper ou de se cacher. De plus, leur environnement sera enrichi d’une balle en plastique pour jouer et régulièrement d'un bouchon de fibres pour se faire les dents. Une habituation à la contention se déroulera sur plusieurs jours avant de procéder au premier traitement par ivermectine et avant de procéder au premier nourrissage des poux. A chaque étape d'habituation et après chaque nourrissage des poux, le lapin recevra de la carotte de culture biologique en renforcement positif. A la fin du projet, les lapins seront proposés à l’adoption en famille d’accueil. Des points limites liés au traitement par l'ivermectine sont mis en place.
Choix des espèces
Le lapin est la seule espèce sur laquelle les poux de corps humains d’élevage peuvent se nourrir et assurer leur survie sur plusieurs générations. Le projet ne nécessite pas un stade de développement particulier mais des animaux adultes sont préférables pour le nourrissage d’un grand nombre de poux en une seule fois.
Impact d’une exposition alimentaire aux pesticides sur un modèle murin génétiquement prédisposé à la MASLD
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une perte de poids supérieure à 20 % vaut le score maximal sur la grille de suivi et retire la souris de l'expérimentation. 112 souris, dont le récepteur CAR a été rendu non fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées après un prélèvement de sang aux veines porte et cave. Elles mangent pendant soixante semaines une nourriture additionnée de glyphosate ou d'un mélange de boscalid et de lambda-cyhalothrine, subissent une glycémie à jeun tous les deux mois, deux prélèvements de sang à la joue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept mesures sur deux heures chacun, un gavage qui peut irriter l'œsophage et 23 heures seules en cage à métabolisme. Le porteur revendique des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde, sur des paramètres que les études toxicologiques réglementaires explorent peu.
Objectifs
La maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) et les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin (MICI) sont en constante augmentation. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation), l’exposition aux pesticides peut être un facteur de risque au développement de ces pathologies. Des études montrent que le microbiote intestinal est aussi impliqué. Le glyphosate est l’herbicide le plus utilisé dans le monde et on le retrouve dans les aliments. Il agit sur une enzyme présente chez les champignons, les végétaux et certaines bactéries du microbiote intestinal avec comme conséquence un blocage de la synthèse des protéines. L’exposition au glyphosate change la composition du microbiote et modifie l’expression de gènes du foie parmi lesquels le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor). Le boscalid (fongicide) et le λ-cyhalothrine (insecticide) sont également retrouvés dans l’alimentation. Des résultats préliminaires obtenus sur une lignée de cellules de foie montrent qu’un mélange de boscalid et de λ-cyhalothrine agit sur le récepteur CAR. Par ailleurs, ce récepteur CAR est impliqué dans le développement des MASLD, associées à des perturbations du microbiote intestinal et à une inflammation intestinale. Dans ce projet nous voulons tester l’hypothèse que ces pesticides seuls ou en mélange, dans un contexte où les capacités de détoxification de l’organisme sont altérées via l’inactivation du récepteur CAR, favorisent le développement de la MASLD et des MICI. Nous étudierons donc l’impact d’une exposition alimentaire chronique au glyphosate et à un mélange boscalid/ lambda-cyhalothrine en utilisant des souris mâles et femelles dont le gène CAR a été inactivé.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate et à un mélange de pesticides dans un contexte de prédisposition génétique à la maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et à l’inflammation intestinale. Le projet fournira des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde mais également sur l’effet d’un mélange de pesticides retrouvés dans l’alimentation. Il permettra d’étudier aussi certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal et l'inflammation intestinale.
Procédures
Ces souris seront nourries pendant 60 semaines (14 mois) avec un régime standard, et exposées via l’alimentation au glyphosate ou au mélange du Boscalid/Lambda-Cyhalothrine à des doses toxicologiques de référence (dose journalière admissible ou dose sans effet nocif observable). Tous les 2 mois, la glycémie à jeun sera réalisée par dosage du glucose dans une goutte de sang prélevée à la veine de la queue, ainsi qu’un dosage de lipocaline (marqueur de l’inflammation intestinale) en récupérant les fécès des animaux. Durant les 60 semaines, du sang sera prélevé à la joue (maximum 100 μl/prélèvement), à deux moments, afin de doser des marqueurs de dommages hépatiques. Les souris subiront également : - un test de tolérance au glucose, qui sera administré par gavage (moins d'1 minute par animal) et à la suite duquel la glycémie sera mesurée à intervalle régulier sur 2h (7 fois) comme décrit précédemment. - un test de tolérance à l’insuline par une injection intrapéritonéale avec une seringue adaptée (insuline), suivi d’une mesure de glycémie à intervalle régulier sur 2h (7fois), comme décrit précédemment. - un test de perméabilité intestinale qui nécessitera un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée (moins d'1 minute par animal), suivi de deux prélèvement d’1 goutte de sang (10µl) à la queue - enfin, afin de récupérer les urines et fèces, les animaux seront placés en cages à métabolisme 1 fois au cours de l’expérimentation durant 23 h maximum. Selon les résultats obtenus, les animaux recevront un régime enrichi en gras et en sucre (Western Diet) pendant les 8 dernières semaines ou seront exposés au Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson destiné à provoquer une inflammation intestinale. A la fin de l’essai, un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale sera réalisé.
Impact sur les animaux
Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, une douleur possible au point d’injection. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. Le challenge au Dextran Sulfate Sodium, visant à provoquer une inflammation intestinale de faible intensité pourrait entraîner une baisse de poids et une colite plus importante chez les animaux exposés aux pesticides comparés aux animaux contrôles. Le régime Western Diet induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation suite aux prélèvements de sang à la veine porte et cave (entrée et sortie du sang dans le foie), et différents organes seront récupérés pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de 4 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 4 aspects de l'état de l'animal : (i) variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; (ii) apparence physique externe ; (iii) changement dans les comportements non provoqués et (iv) réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacun de ces aspects indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 ou plus après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint, l'animal sera retiré de l'expérimentation. Par exemple, une perte de poids supérieure à 20% entrainera un score de 3 pour cet aspect de l’état de l’animal, et constituera un critère d’arrêt. Ce score sera calculé sur chaque animal, de façon hebdomadaire. Lors du séjour en cage à métabolisme, les animaux bénéficieront d'un abri inox et les contacst olfactif et visuel avec leurs congénères seront maintenus.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la toxicité des pesticides grâce à un modèle murin dont le gène CAR est non fonctionnel. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines (au sevrage). En effet, c’est au moment du sevrage que le microbiote intestinal de l’animal se met en place avec le changement d’alimentation. Les animaux recevront donc les régimes expérimentaux dès le sevrage et jusqu’à l’âge de 64 semaines. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme des différences entre sexes dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression du récepteur CAR.
Circuits neuronaux des biais émotionnels dans un modèle murin de dépression.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Chirurgie du cerveau sous anesthésie générale jusqu'à deux heures, deux interventions possibles par animal, implants portés jusqu'à deux mois, dix tests comportementaux à raison d'un par jour : 3 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur induit chez elles un phénotype qu'il qualifie de dit-dépressif et annonce une détresse "induite et attendue", tout en écrivant que les procédures du projet sont "relativement bien tolérées par les animaux". Les dix tests comportementaux ne sont pas nommés, alors qu'ils servent à mesurer l'approche et l'évitement de stimuli plaisants ou déplaisants. Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que des études histologiques sur leurs tissus sont prévues.
Objectifs
La dépression représente une cause majeure d’incapacité à l’échelle mondiale, affectant environ 300 millions de personnes dont 50% davantage de femmes. Or, la physiopathologie des troubles dépressifs est encore assez méconnue, tout comme les mécanismes par lesquels agissent les traitements antidépresseurs existants, dont l’efficacité est d’ailleurs limitée puisqu’environ un tiers des patients ne répondent pas aux thérapies classiques et plusieurs semaines sont nécessaires pour pouvoir observer ces effets. En outre, la dépression est accompagnée d’altérations sensorielles : les patients dépressifs percevraient les stimuli sensoriels comme étant moins plaisants, ou davantage déplaisants que des sujets sains. On parle ainsi d’un biais de valence négatif, qui est cependant peu considéré dans les critères diagnostiques. Or, ces biais émotionnels sont particulièrement intéressants à étudier d’un point de vue translationnel. D’une part, la réponse émotionnelle est assez facilement mesurable chez la souris, notamment à travers le comportement d’approche (stimuli plaisants) ou d’évitement (stimuli déplaisants), contrairement à d’autres symptômes plus classiques de la dépression comme l’humeur dépressive ou les idées suicidaires qui sont difficilement évaluables chez l’animal. D’autre part, ces biais perceptifs seraient rapidement restaurés après l’administration d’un traitement antidépresseur, c’est pourquoi la prise en compte de la réponse émotionnelle en clinique pourrait permettre de déterminer beaucoup plus rapidement si un patient répond efficacement ou non à la thérapie proposée et donc améliorer la prise en charge thérapeutique. Puisque l’amygdale basolatérale est une région du cerveau jouant un rôle majeur dans la régulation émotionnelle et l’attribution de la valence, et que l’activité de certaines voies neuronales de l’amygdale basolatérale serait modifiée dans des modèles de dépression, l’objectif de ce projet est ainsi (1) d’étudier la réponse émotionnelle dans des modèles de dépression de souris mâles et femelles en nous concentrant sur des stimuli olfactifs, (2) de comprendre quels circuits neuronaux sont impliqués dans ces biais émotionnels, et enfin (3) de chercher comment des traitements antidépresseurs à la fois classiques et innovants modulent l’état émotionnel ainsi que la réponse neuronale associée dans notre modèle murin de dépression.
Bénéfices attendus
En cherchant à comprendre quels sont les mécanismes sous-jacents au biais émotionnel négatif associé à un état dit-dépressif à l’échelle des circuits neuronaux, cette étude permettra d’améliorer notre connaissance et notre compréhension de la physiopathologie de la dépression. De plus, les diagnostics en psychiatrie reposent actuellement sur une approche catégorielle qui consiste à classer les patients selon la présence ou l’absence d’un certain nombre de symptômes discrets. Cependant, cette approche fait face à un nombre grandissant de limitations. En réponse à ces critiques, l’approche RDoC (Research Domain Criteria) propose de changer de paradigme diagnostique pour se fonder sur un continuum de symptômes et de biomarqueurs. De façon notable, les systèmes de valence positive et négative constituent deux des six domaines fonctionnels majeurs d’intérêt relevés par cette approche. Ainsi, en s’inscrivant dans cette approche alternative, notre étude des biais émotionnels négatifs dans une perspective translationnelle chez la souris pourrait non seulement permettre d’élucider de façon fondamentale certains mécanismes physiopathologiques de la maladie (bénéfices à court terme du projet), mais également d’ouvrir la voie au développement de nouveaux outils diagnostiques et de détection de réponse aux traitements antidépresseurs (bénéfices à long terme du projet). En particulier, la restauration de la réponse émotionnelle par un antidépresseur serait obtenue de façon très précoce après administration du traitement, bien avant des effets sur l’amélioration de l’humeur, c’est pourquoi ces biais sont particulièrement intéressants à étudier et pourquoi une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux sous-jacents serait cruciale d’un point de vue thérapeutique. Enfin, la dépression est une maladie qui touche 50% davantage de femmes que d’hommes. Toutefois, les mécanismes neuronaux à l’origine de cette différence sont encore largement méconnus. Ainsi, en comparant systématiquement des souris mâles et femelles tout au long de notre étude, nous pourrons également mettre en lumière l’existence ou non de mécanismes spécifiques au sexe à la fois dans l’installation du phénotype dit-dépressif et du biais de valence négatif, mais aussi dans l’efficacité de la réponse à un traitement antidépresseur.
Procédures
Dans ce projet, les souris pourront être soumises à différents types d’interventions : - Induction d’un phénotype dit-dépressif. Chaque souris ne pourra subir qu’une seule fois un des modèles de dépression. - Tests de comportement non-invasifs pour tester le phénotype dit-dépressif. Les souris devront réaliser au maximum 10 tests comportementaux différents (1 test/jour). - Administration chronique d’un antidépresseur (3 semaines), par voie orale ou par injection intrapéritonéale (1 injection tous les 3 jours) - Procédures chirurgicales sur le cerveau sous anesthésie générale. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris et chaque souris sera soumise à un maximum de deux interventions séparées par un minimum de 30 jours. - Ponction sanguine (environ 1 min par souris). Chaque animal subira un maximum de deux prélèvements sanguins, séparés au minimum de quatre semaines.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés aux procédures : 1) détresse induit et attendu pour les modèles de dépression. Cependant, notre stratégie expérimentale par rapport a des travaux précédents (durée réduite à 4 semaines de traitement, hébergement groupé) est conçue de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux et en réduisant la détresse et l’inconfort de l’animal. 2) les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort de courte durée (2-3 jours) liés à la chirurgie. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Des implants seront introduits par chirurgie sous anesthésie générale chez les souris. 3) La présence de ces implants pourrait générer un stress, une douleur légère et de l’inconfort (durée maximale de l’expérience : deux mois). Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative aux techniques in vivo pour étudier les circuits neuronaux impliqués dans le phénotype dit-dépressif et les biais émotionnels. Toutefois, notre stratégie expérimentale est conçue de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux tout en évitant au maximum tout stress et inconfort de l’animal non-nécessaire à l’induction du modèle expérimental de dépression.
Réduction
L’étude statistique impose des cohortes comprenant un nombre suffisant d’animaux afin d’avoir une évaluation pertinente de l’effet des différentes conditions expérimentales sur le comportement. Le nombre de souris minimum par groupe a été calculé pour pouvoir utiliser des tests paramétriques, plus puissants que les tests non paramétriques grâce à des expériences similaires déjà réalisées dans notre laboratoire. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour comparer les groupes. De plus, nous nous attacherons à décrire au mieux le phénotype des animaux utilisés à l’aide d’une grande batterie de mesures comportementales et physiologiques. Cela nous permettra de réduire la variabilité intra-individuelle de chacun des tests, et ainsi de nécessiter d’un moins grand nombre d’individus pour évaluer l’effet de nos modèles et des traitements. Enfin, lorsque cela s’y prête, nous aurons recours à une étude longitudinale de l’état phénotypique et de la réponse neuronale des individus, ce qui nous permettra également d’augmenter notre puissance statistique et d’avoir besoin de moins d’animaux par groupe.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avec recours à : - un complément alimentaire hautement calorique (gel hydrique) - chauffage des cages - réhydratation sous cutanée - renforcement d’enrichissement des cages De plus, la durée d’acclimatation à l’animalerie sera d’une semaine minimum. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats des tests comportementaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle animal est justifié par le fait que les circuits impliqués dans l’attribution de valence aux stimuli sensoriels sont très bien conservés entre l’homme et les rongeurs. Par conséquent notre travail permet de délimiter de nouvelles approches pour le diagnostic et les thérapeutiques des troubles de l’humeur chez l’homme tout en travaillant sur une espèce mammifère mais phylogénétiquement éloignée de l’homme. De plus, en dehors de l’induction du phénotype dit-dépressif souhaité pour l’étude, le type de procédures effectuées dans ce projet sont relativement bien tolérées par les animaux et des traitements anesthésiques et antidouleurs très efficaces existent pour cette espèce et seront appliqués pour ce projet. Nous utiliserons tout au long du projet des jeunes souris adultes, âgées de 8 semaines, car nous étudions des modèles de dépression chez le sujet adulte.
Effet du mercure par l’alimentation chez le gardon
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un demi-degré de plus par jour, jusqu'à cinq degrés au-dessus de la température habituelle : c'est le réchauffement que subiront des gardons nourris de moules contaminées au mercure. 160 poissons sont capturés au piège puis sexés par prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les 80 mâles seront tués pour mesurer la bioaccumulation dans leurs organes, les 80 femelles retournent à l'étang et pourront être utilisées dans d'autres études. Le porteur retient le gardon parce qu'il est le principal prédateur de la moule Dreissena polymorpha en Europe et parce qu'il figure parmi les poissons consommés par les humains, en sélectionnant des adultes de 15 centimètres et 40 grammes.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans les préoccupations actuelles du changement climatique global. Son originalité réside dans l'approfondissement des relations existants entre la présence d’un contaminant chimique présentant une activité biologique et une modification climatique issue des prédictions du GIEC pour 2100. Ce projet vise à améliorer nos connaissances sur le transfert et les effets toxiques du méthyl-mercure dans un contexte de réchauffement climatique par l'alimentation de la moule Dreissena polymorpha aux poissons Rutilus rutilus. Le transfert vers l’homme sera aussi estimé grace à une expérience de digestion par des fluides intestinaux artificiels. La bioaccumulation et la toxicité du methyl-mercure alimentaire pour R. rutilus sera analysée par des approches à haut débit et des approches ciblées moléculaires et cellulaires, donnant une vision holistique du phénotype.
Bénéfices attendus
Très peu d’études cherchent actuellement à mener de front les effets d’une modification des paramètres physiologiques des poissons en présence de contaminants chimiques dans un contexte de changement climatique. Ces connaissances fondamentales sont essentielles pour mieux comprendre et prédire la propagation des effets entre les niveaux trophiques des systèmes aquatiques d'eau douce et pour identifier des biomarqueurs innovants et précoces pour une meilleure évaluation des risques liés aux polluants. Ce projet permettra d’acquérir des connaissances fondamentales essentielles afin d’améliorer l’évaluation des risques liés aux contaminants dans le contexte du changement climatique. Dans ce cadre, trois hypothèses peuvent être formulées. Premièrement, le changement climatique ne va pas induire d’effet plus notable que celui du contaminant ; deuxièmement, la physiologie des individus va être fortement déstabilisée par la combinaison des deux stress ; troisièmement, l’effet du stress chimique peut être amoindri par l’apparition d’un stress supplémentaire. L’originalité de ce projet est de tenter de mieux comprendre l’interaction existant entre ces différents stress pour les poissons. Par ailleurs cette compréhension est cruciale pour évaluer les conséquences du changement global sur la fitness individuelle, susceptibles d'affecter les services écosystémiques.
Procédures
Tous les poissons seront capturés par piège passif. Le sexage se fera sur prélèvement d’un fragment de nageoire pris sous anesthésie par balnéation et dure moins de 2 minutes. Après le prélèvement le poisson est placé 5 minutes dans de l'eau propre sans anesthésiant et bien oxygénée. A son réveil, il est retourné en aquarium. Les femelles seront directement retournées à l'étang. Les lots de mâles subiront différentes conditions d’exposition impliquant une augmentation de température graduelle un demi degré par jour pour 5 degré Celsius au total ou température standard avec ou sans alimentation avec dreissenes préexposées au mercure pendant 4 jours. A l’issue de la période d’exposition, les poissons seront euthanasiés par une méthode règlementaire afin de procéder aux différents prélèvements et analyses.
Impact sur les animaux
Pour le sexage, une anesthésie et un petit prélèvement de nageoire (fin clip) seront nécessaire. La manipulation des individus avant anesthésie génère du stress sur l’animal. L’anesthésie pourrait provoquer une baisse de la respiration et donc de l’apport en oxygène. Nous n’avons jamais remarqué de nuisances liées à l’anesthésie (très courte durée, moins de 2 minutes) ni au prélèvement. Le prélèvement est vraiment minime et n’occasionne pas de gêne dans la nage. Une douleur légère de courte durée pourrait être associée à ce geste. L’augmentation de la température de l’eau peut également générer un stress; elle sera donc très graduelle pour le limiter au maximum. Pour l’exposition au mercure, nous attendons des effets à l’échelle moléculaire et cellulaire de faibles intensités pour le mercure et la température.
Devenir
Les males seront euthanasié par une méthode réglementaire. L’expérience implique un prélèvement des organes pour mesurer la bioaccumulation, les réponses moléculaires et les réponses cellulaires. Les femelles seront retournées à l'étang. Les femelles qui ne sont pas impliqués dans cette étude d’exposition aux changement climatique, seront retournées à l’étang et pourront être utilisées dans le cadre de la reproduction et/ou d’autres études ultérieures, le cas échéant.
Remplacement
Ce projet nécessite une chaine alimentaire réaliste. La prise alimentaire, l’absorption intestinale et surtout la distribution dans les organes ne peut pas être mimé par des méthodes se substituant à l’utilisation des gardons entiers vivants
Réduction
Au total 160 poissons sont concernés. Nous estimons que le nombre de femelles est équivalent au nombre de males. Ainsi, 160 poissons sont nécessaires pour obtenir 80 poissons males qui seront euthanasiés, les 80 femelles seront relachées. Le sexage concernera 80 femelles et 80 males. Le sexage permettra de réduire le nombre de poissons utilisés au strict nécessaire tout en préservant la pertinence statistique des données indispensable pour une interprétation fiable des résultats. 4 poissons sont nécessaire pour mener toutes les analyses. Au total, nous aurons 4 conditions à tester avec 20 animaux par conditions afin de mettre en œuvre les différentes analyses nécessaires. Ils seront répartis en 20 bacs de 4 poissons, soit 80 poissons mâles et 160 au total incluant la partie identification du sexe.
Raffinement
Les individus ne seront pas transportés car présents sur site. Une acclimatation progressive à la température et à la nourriture sera menée pendant 3 semaines, la concentration d'exposition au mercure est réaliste sur une durée courte. Cette exposition par l'alimentation provoquera des effets à l'echelle moléculaire et cellulaire de faibles intensités, sans, à notre connaissance, produire de douleur, de perte de poids ou de modifications comportementales. Un enrichissement sera fourni aux poissons grâce à l'alimentation par proie vivante. Les aquariums seront equipés de parois transparentes et percées pour ne pas perturber le comportement grégaire. Une cachette dans l'aquarium sera fournie. Le prélèvement d'un fragment de nageoire se fera sous anesthésie. Des points limites permettront de juger de la pertinence d'arrêter les expositions. Afin de maximiser le bien être animal, les poissons bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine dans la salle d'essai dédiée à l'expérimentation animale (thermoregulée, cycles nyctheméraux adaptés aux besoins physiologiques des poissons, faible passage du personnel) avant exposition. De même pour avoir une qualité d'eau optimale, les paramètres physicochimiques sont vérifiés à minima une fois par semaine. Les animaux sont nourris tous les jours avec une alimentation appropriée et leur eau est changée quotidiennement. Les poissons sont transferés delicatement dans un aquarium contenant le milieu renouvelé. Si une mortalité anormale est observée dans les aquariums témoins, l'expérimentation est immédiatement stoppée.
Choix des espèces
Le transfert du mercure par l'alimentation constitue un problème majeur de santé publique, susceptible de s'aggraver avec les changements climatiques. Cependant, les effets du mercure transmis par l'alimentation sur la faune sauvage sont encore peu documentés, en particulier à des concentrations réalistes. Le gardon, très répandu dans les plans d'eau en France, est couramment utilisé en aquaculture, capturé lors de compétitions de pêche et figure parmi les poissons populaires consommés par les humains. Il représente également le principal prédateur de Dreissena polymorpha en Europe, une espèce qui pourrait constituer une voie d'entrée du mercure dans son alimentation, puis dans celle des humains. Dans le cadre de cette étude sur le transfert alimentaire du mercure, nous nous intéresserons aux gardons matures (15 cm, 40 g) possédant une mâchoire pharyngienne, indispensable pour se nourrir de D. polymorpha.
Modulation par l’exercice des effets vasculaire du diabète ou d’une stimulation spécifique de la O-GlcNAcylation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tous tués à l'issue pour prélever leur aorte et d'autres tissus, 270 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils courent sur un tapis motorisé quarante-cinq minutes par séance, une fois pour le protocole aigu, cinq fois par semaine pendant cinq semaines pour le protocole chronique, et reçoivent une à cinq injections dans le ventre. Le porteur mentionne des lésions aux pattes liées à la course, qu'il dit peu fréquentes et concentrées sur la phase d'apprentissage, ainsi qu'une augmentation de la fréquence des urines liée à la hausse du sucre dans le sang. Des expériences sur cellules portent déjà sur les mêmes mécanismes vasculaires, mais le porteur conclut que l'évaluation de l'effet de l'exercice rend l'expérimentation animale "nécessaire".
Objectifs
Ce projet vise à investiguer l'influence de l'exercice sur les mécanismes de régulation au niveau des vaisseaux dans un contexte d'augmentation du taux de sucre dans le sang. Un postulat de ce travail est que cette hausse du sucre dans le sang, telle qu’observer dans le cadre du diabète, perturbe l'équilibre entre différentes mécanismes favorisant ainsi une altération de la fonction des vaisseaux. L’objectif principal sera de déterminer si l’exercice, via une action directe sur ces mécanismes permet de contrer les effets néfastes de l’augmentation du sucre dans le sang. Pour cela nous étudierons donc les effets de l’exercice aigu (réalisé une seule fois) ou chronique (réalisé plusieurs fois) dans des modèles ne présentant pas de pathologies mais soumis à une augmentation du sucre dan sle sang ou induisant une hausse de certains mécanismes spécifiques ou dans un modèle pathologique de type diabétique.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche s'avère crucial pour comprendre comment l'exercice, à la fois aigu et chronique, peut influencer les mécanismes régulant la fonction des vaisseaux sanguins, particulièrement sous l'effet de l'augmentation du sucre dans le sang, souvent rencontrée dans le diabète. Ce projet est d'autant plus pertinent qu'il explore ces effets dans différents contextes, y compris des modèles sans pathologies mais exposés à une augmentation du sucre dans le sang, ainsi que dans un modèle pathologique de diabète. Les implications de cette recherche sont significatives, offrant des perspectives pour de nouvelles stratégies thérapeutiques en vue de traiter les troubles vasculaires liés au diabète et d'améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à de l'exercice sur tapis (1 exercice unique pour les animaux du protocole aigu et 5 fois par semaine pendant 5 semaines pour les animaux du groupe chronique) de course ainsi qu' à une ou plusieurs injections (1 injection intrapéritonéale durant approximativement 3 secondes pour une partie des animaux et 5 injections intrapéritonéales durant approximativement 3 secondes/injection pour l'autre partie). Concernant l'exercice, chaque session durera 45 minutes et se déroulera sur un tapis motorisé adapté aux animaux.
Impact sur les animaux
Les injections intra-péritonéales peuvent entraîner des douleurs faibles au site d'injection. L'augmentation de la glycémie peut entraîner une augmentation de la fréquence des urines. La course sur tapis peut engendrer des légères lésions aux pattes des animaux, néanmoins ces dernières restent peu fréquentes et arrivent généralement en début de protocole pendant la phase d'apprentissage. Pour éviter ce problème une phase d'apprentissage avec augmentation progressive de la vitesse de course est systématiquement prévue.
Devenir
Le prélèvement des tissus pour les différentes analyses nécessite la mise à mort de 270 rats à l'issu de la procédure.
Remplacement
Des expérimentations sur cellules sont actuellement conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des vaisseaux. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet de l’exercice nécessite l’utilisation de modèle animaux vivants afin d’évaluer l’influence de ces différentes conditions. L’intégration d’expérimentations animales apparait donc comme nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.
Réduction
Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Pour la partie réactivité vasculaire, plusieurs morceaux d'aorte sont récupérés sur chaque animaux ce qui permet d'augmenter notre nombre de mesure et ainsi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à n’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale (injections et exercice physique), les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue.
Choix des espèces
Le rat est un modèle pertinent pour l’étude du système cardiovasculaire. En effet, la description anatomique de cette espèce réalisée par le passé a pu démontrer une similitude forte notamment au niveau du coeur et des vaisseaux. De plus son utilisation permet d’obtenir des quantités de tissu suffisantes pour la réalisation de plusieurs dosages biochimiques permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux nécessaires. En effet, l'aorte du rat permet de récupérer une quantité importante qui permet de réaliser plusieurs expérimentations sur organes isolés mais aussi une plus grande quantité de tissu pour les analyses biochimiques ce qui permet d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Les animaux seront des animaux de quelques semaines pour éviter de confondre les effets de l'exercice et des traitements avec ceux de la maturation et du vieillissement).
Etude du rôle des lymphocytes T gamma delta dans la réponse immunitaire dirigée contre le cytomégalovirus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour établir chez la souris ce que des études humaines ne font que suggérer, le rôle protecteur de certains lymphocytes T contre le cytomégalovirus, 568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées en fin d'expérience pour récupérer leurs lymphocytes. Elles reçoivent une à quatre infections virales dans le péritoine à raison d'une par semaine, certaines une injection de lymphocytes par voie intraveineuse, d'autres des anticorps, et cinq prélèvements de sang hebdomadaires sur 42 jours. Le porteur indique qu'après dix jours d'infection les souris peuvent présenter piloérection, dos arrondi, perte de poids et isolement, et qu'avec des souris immunodéficientes les points limites sont fixés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère de la mutation.
Objectifs
Notre projet a pour but une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre un herpès virus nommé Cytomégalovirus (CMV). Nous nous intéressons plus particulièrement au rôle de cellules immunitaires particulières ( lymphocytes T) dans ce contexte. Il comprend une étude chez la souris pour répondre à des questions innaccessibles chez l'Homme. L'étude chez la souris permet d'établir la preuve de l'implication de cellules ou facteurs immunitaires dans la protection antivirale en modélisant une thérapie cellulaire. le modèle murin d'infection par le MCMV est utilisé depuis 20 ans par notre équipe et bien maîtrisé.
Bénéfices attendus
L'objectif final est une prise en charge plus efficace des patients à risque (immunodéprimés), en évitant notamment l'utilisation de traitements anti-viraux à effets secondaires.
Procédures
Les animaux vigiles sont soumis à une ou 4 infections virales (1/semaine) en intrapéritonéal sur une durée de un mois. Un deuxième lot de souris sont anesthésiées et soumises à une injection intraveineuse de lymphocytes à J0. Le lendement les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de virus. Les souris sont soumises à des prélèvements de sang une fois par semaine sous anesthésie courte pendant 42j (5 prélèvements). Un 3ème lot de souris reçoit deux injections intrapéritonéales (une de virus et une d'anticorps) à 24h ou 7 jours d'intervalle pendant 3 semaines.
Impact sur les animaux
Après 10 jours suite à l'infection à CMV, les souris peuvent montrer des signes de souffrance classique tels que la piloérection, le dos arrondi, perte de poids et isolement s'accompagnant d'une augmentation des transaminases hépatiques et de la charge virale.
Devenir
Les animaux sont tous infectés par du cytomégalovirus et sont donc mis à mort en fin d'expérience. Cette mise à mort est nécessaire pour récupérer les lymphocytes.
Remplacement
Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet. Le modèle murin de l'infection à CMV est largement utilisé car il récapitule ce qui est observé chez l'homme. L'utilisation de souris immunodéficientes permet de se rapprocher du contexte d'immunosuppression thérapeutique appliquée aux receveurs de greffes, et de tester l'impact d'une thérapie cellulaire par transfert adoptif. L'utilisation de souris et/ou l'injection d'anticorps permettent de conclure sur l'importance des facteurs étudiés dans la protection. Ces conclusions ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo qui ne permettent pas de modéliser la complexité d’un organisme pour l’étude du système immunitaire .
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé pour obtenir des résultats statistiques interprétables et les expériences seront répétées à deux reprises. Par souci de réduction nous utilisons dans nos expériences aussi bien des souris mâles que des souris femelles.
Raffinement
1.Hébergement: les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect du bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Du fait de l'utilisation de souris immunodéficientes, les points limites sont adaptés de manière à ne pas laisser s'exprimer le caractère délétère. Les conditions d'hébergement permettent d'éviter les contaminations par des pathogènes opportunistes (portoirs ventilés, filtration entré et sortie) Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention: les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise les méthodes de préhensions douces. Les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation: une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur: les prises de sang sous mandibulaires, les injections intraveineuses et sous-cutanées sont réalisées sur des animaux anesthésiés afin de réduire inconfort et douleur.
Choix des espèces
Le modèle d'infection par le CMV chez la souris est très bien étudié. Nous utilisons des souris adultes, entre 8 et 12 semaines d'age. Les CMV murins et humains ont un même tropisme et la réponse immunitaire anti-CMV chez la souris est très proche de celle de l'Homme. Cependant le suivi de cette réponse chez les patients ne donne qu'une réponse partielle puisqu'il ne peut se faire qu'au niveau du compartiment sanguin. L'étude chez la souris permet une étude spatio-temporelle de la dissémination du virus et de la réponse immunitaire. Le rôle protecteur des cellules/facteurs que nous étudions est suggéré chez l'homme par des études corrélatives mais impossible à prouver. Le transfert adoptif de sous-populations de cellules immunitaires chez des souris immunodéficientes est le seul moyen de tester leur caractère protecteur. L'utilisation de souris invalidées pour un facteur mis en évidence en amont par des études in vitro chez l'Homme est indispensable pour étudier l'importance de ce facteur dans la protection. Les conclusions recherchées ne peuvent en aucun cas être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro.
Évaluation de l’efficacité de la buprénorphine par administration orale guidée par micropipette chez des souris C57BL/6 et des souris Balb/c : étude comparative de la pharmacocinétique par rapport à la technique d’administration par voie sous cutanée
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
132 souris BALB/c et C57BL/6 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour comparer deux façons d'administrer un analgésique. La moitié reçoit la buprénorphine en injection sous la peau, l'autre à la micropipette par la bouche, avec neuf microprélèvements de sang, quatre administrations et trois anesthésies à l'isoflurane. Le porteur présente la voie orale comme un progrès pour le bien-être des souris de laboratoire, susceptible de devenir une technique de référence, ce qui suppose d'en passer par ces 132 souris. 68 pourront être réutilisées si le microprélèvement suffit aux dosages, les autres seront tuées, les volumes de sang nécessaires étant alors incompatibles avec leur maintien en vie.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de l’administration orale de buprénorphine, un analgésique (médicament utilisé pour diminuer la douleur) classiquement utilisé chez les animaux de laboratoire chez des souris par rapport à la voie sous-cutanée classiquement utilisée dans nos laboratoires, afin de réduire le stress associé aux injections sous-cutanées et de prolonger la durée d’analgésie par cette voie alternative d’administration. L’hypothèse, basée sur des études chez le rat, permettrait à cette voie d’administration d’offrir des concentrations dans le sang plus efficaces de buprénorphine par rapport à la voie sous-cutanée avec une réduction des manipulations. Des médias comme le Nutella® ou des gels médicamenteux ont également été testés pour l’ingestion volontaire de buprénorphine chez la souris, évitant le stress du gavage mais demandant de l’entrainement et l’isolement des animaux pendant la durée d’administration. Cette étude vise donc à tester des véhicules ne perturbant pas le métabolisme et d’utiliser l’administration guidée par micropipette afin de ne pas isoler les animaux pour leur faire ingérer la buprénorphine, de travailler en coopération avec eux et d'avoir une quantité fiable et définie de buprénorphine administrée. Des prélèvements sanguins réguliers seront effectués pendant les 6 premières heures, puis à 12 h et 24 h, voire 36h et 48h pour tracer un profil de distribution sanguine de la buprénorphine qui nous permettra de savoir si la buprénorphine est suffisament présente dans le sang des souris pour apporter un effet analgésique optimal. Ce projet vise donc à optimiser la délivrance de l’analgésie tout en minimisant les manipulations invasives et en améliorant le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Un premier bénéfice attendu sera d'évaluer l'efficacité d'une méthode d'administration orale de buprénorphine via micropipette guidée (MDA) chez les souris BALB/c et C57BL/6. Cette approche non invasive offre une alternative aux injections sous-cutanées, connues pour provoquer du stress chez l’animal et pour avoir une durée d’efficacité assez brève dans cette espèce. L'habituation des souris à cette méthode permettra de valider la faisabilité et la reproductibilité de l'administration orale pour obtenir une analgésie efficace sur une période plus longue (au-delà des 4 à 6 heures actuellement observées avec les injections répétées en SC). La mise en place de prélèvements sanguins permettra de tracer un profil pharmacocinétique complet, validant ainsi les concentrations sériques optimales et efficaces telles que décrites dans la littérature. Ces données permettront d'ajuster les doses administrées et de prolonger l'effet analgésique. À plus long terme, les résultats de ce projet pourraient avoir des retombées significatives sur les pratiques courantes en recherche animale. La méthode d'administration MDA pourrait devenir une technique de référence, non seulement pour la buprénorphine, mais aussi pour d'autres analgésiques ou médicaments administrés de manière répétée par voie orale. Une technique d'administration fiable et efficace, permettant un effet prolongé sans nécessiter de manipulations fréquentes, améliorerait considérablement le bien-être des animaux, réduisant ainsi les biais expérimentaux associés au stress. En conclusion, ce projet a pour objectif immédiat d’améliorer l'administration d'analgésiques chez les souris, et à long terme, de fournir une méthode fiable et éthique d'administration non invasive, applicable à la recherche biomédicale et à la gestion de la douleur animale. Ces avancées bénéficieront aux scientifiques, aux animaux de laboratoire et à l’ensemble du domaine de la recherche, garantissant des conditions plus respectueuses du bien-être animal et des résultats plus fiables.
Procédures
Stress et douleur légères dûs à l'Injection sous-cutanée (15 secondes ; 1 fois) pour la moitié des animaux; Stress léger dû à l'administration médiée par micropipette (30 secondes ; 4 fois) pour la moitié des animaux; Stress et douleur légères dûs aux microprélèvements de sang (30 secondes ; 9 fois) pour la moitié des animaux; Stress léger dû à l'anesthésie générale à l'isoflurane (1 minutes ; 3 fois) pour la moitié des animaux
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sur les souris BALB/c et C57BL/6 peuvent être anticipés. Ces effets sont principalement liés à la procédure de l'anesthésie, aux prélèvements sanguins réguliers, et à la manipulation des animaux pour les diverses procédures expérimentales. L'anesthésie, nécessaire pour certains prélèvements sanguins est une source de stress pour les souris. Cependant, cette période de stress sera limitée à la durée de l'anesthésie et les souris devraient retrouver un comportement normal peu après leur réveil, généralement en quelques minutes. Les prélèvements sanguins par ponction de la veine de la queue, peuvent entraîner une douleur légère au site de ponction, ainsi qu'une gêne temporaire limitée étant donné l’utilisation d’un analgésique local. La douleur et la gêne devraient disparaître rapidement après l'intervention, et aucune conséquence à long terme n'est attendue. Même si l'administration de buprénorphine est réalisée par voie orale, limitant ainsi les injections stressantes, les manipulations nécessaires pour l'habituation à la méthode de micropipette (MDA) et les prélèvements peuvent générer du stress. Afin de minimiser ce stress, les manipulations seront réalisées avec précaution, en suivant des protocoles établis pour réduire au maximum l'impact sur les animaux. La durée des effets de stress devrait être limitée à la période de manipulation, avec un retour à un comportement normal dans les minutes qui suivent.
Devenir
En cas d'utilisation du microsampling pour le suivi de la buprénorphine dans le sang des souris, tous les animaux pourront être réutilisés. Si la technique du microsampling n'est pas utilisable car les volumes de sang obtenus seraient insuffisants pour effectuer les dosages, les souris seraient mises à mort à la fin de la procédure car les volumes de sang ne seraient pas compatibles avec leur maientien en vie. cette décision a été prise dans le but d'utiliser moins d'animaux. Dans ce cas, seuls les animaux utilisés dans la procédure de mise au point du dosage de la buprénorphine pourront être réutilisés, soit 4 animaux.
Remplacement
Les souris ne peuvent être remplacées dans ce projet, car l’objectif est de déterminer l’efficacité de l’administration orale de buprénorphine spécifiquement chez ces deux souches. Aucune méthode alternative in vitro ou sur un autre modèle animal ne permettrait de fournir des données équivalentes pour ces deux souches largement utilisées en recherche biomédicale.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire, en se basant sur les recommandations issues de la littérature scientifique. Le calcul du nombre d'animaux tiendra compte de la variabilité génétique entre mâles et femelles, afin de permettre une analyse statistique tout en limitant l’utilisation excessive d'animaux. Le n a été calculé en se basant sur la littérature, grâce à un logiciel et est de 8 animaux par lot.
Raffinement
Des techniques de raffinement seront appliquées pour réduire la douleur et le stress infligés aux animaux. Le microsampling sera utilisé autant que possible pour minimiser les volumes sanguins prélevés, associé à un analgésique local lors des prélèvements. Cette approche évitera le prélèvement rétro-orbitaire plus invasif. De plus, l’utilisation de la méthode de micropipette guidée (MDA) pour l’administration orale de la buprénorphine limitera le recours au gavage, réduisant ainsi le stress et l'inconfort associés à cette méthode. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 2 animaux minimum dans des cages enrichis et seront visités quotidiennement afin de déceler au plus tôt toute forme de souffrance, de douleur ou d’angoisse si elles devaient apparaître. Enfin des points limites précoces et précis seront mis en place et vérifiés lors des expériences afin d'éviter toute forme de souffrance de douleur ou d'angoisse.
Choix des espèces
Nous utilisons des souris dans ce projet car elles sont l'espèce la plus couramment utilisée en recherche. Il existe déjà une étude sur l’administration de buprénorphine par gavage oral chez le rat mais rien en ce qui concerne la souris avec la technique de MDA. Ce projet vise donc à combler ce manque de données et à mieux comprendre comment ces traitements fonctionnent spécifiquement chez les souris. De plus, l’utilisation de 2 souches distinctes et de 2 sexes différents permettra de les comparer et de déceler d’éventuelles différences intra spécifiques Les souris utilisées dans ce projet auront 8 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est considéré comme mature. C’est aussi l’âge de début de la plupart des projets de notre laboratoire.
Impact du neurodéveloppement dans l’évolution des ataxies spinocérébelleuses de type 3 sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 867 souris pour treize animaux par génotype, par sexe et par stade de développement, en deux répétitions : c'est le compte annoncé sur cinq ans pour comparer le développement du cerveau de souris porteuses du gène humain de l'ataxie spinocérébelleuse de type 3. Les procédures déclarées se limitent à un prélèvement au bout de la queue et relèvent d'un niveau de souffrance léger, l'atteinte venant de la mutation elle-même, qui provoque des troubles moteurs à partir de 90 semaines. Les souris mutées sont tuées après douze mois pour que ces effets n'apparaissent pas, les reproductrices dès que leur fécondité baisse, et les petits sans intérêt génotypique sont proposés à d'autres équipes ou tués dès réception du génotype. Pour une maladie qui touche 1 à 9 personnes sur 100 000, les cibles thérapeutiques annoncées restent une perspective à long terme.
Objectifs
L’ataxie spino-cérébelleuse de type 3 (SCA3) est une maladie neurodégénérative héréditaire faisant partie du groupe des ataxies spino-cérébelleuses. Elle a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle provoque notamment des contractions musculaires involontaires et des troubles cognitifs. Cette maladie est causée par une anomalie génétique. Même si cette maladie se manifeste à l’âge adulte, la protéine mutée est exprimée dès le stade embryonnaire, ce qui pose la question de l’aspect neurodéveloppementale dans cette maladie. Peu d’études se sont intéressées aux phases de développement dans cette maladie cependant certaines études ont montré des modifications pertinentes dans le modèle murin de celle-ci. De plus la protéine en question a de nombreux rôles importants, elle est notamment impliquée dans la réparation de l’ADN. Ainsi, comprendre son rôle dans le développement du cerveau est crucial pour comprendre cette pathologie, ce qui aiderait à développer des nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet sera de suivre le développement du cerveau chez les animaux portant le gène humain normal et le gène humain anormal afin de les comparer. Pour cela, nous allons élever nos animaux modèle de la pathologie et nous réaliserons des analyses histologiques et de biologie moléculaire à différents stades de développement. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’ataxie spinocérébelleuse est de 1 à 9 personnes sur 100000. Elle a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle provoque notamment une dystonie et des troubles cognitifs. Cette étude permettra de mieux comprendre l’effet de cette mutation sur le développement du cerveau et les potentiels mécanismes compensatoires. Cela permettra de mettre en évidence des marqueurs spécifiques, permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades précoces. De plus, elle vise à long terme à identifier des cibles thérapeutiques afin de corriger les symptômes associés à la maladie.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles pour déterminer la présence de la mutation (moins d’une minute par animal, réalisé 1 fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux peut générer une légère douleur chez l’animal. Les manipulations et contention des animaux peuvent être source de stress. La modification génétique apportée par les animaux provoquera des troubles moteurs significatifs à partir de l'âge de 90 semaines et commencera par une présence non significative de symptômes vers l'âge de 12 mois (45 semaines).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à différents âges afin de récupérer des tissus post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques. Les animaux reproducteurs seront euthanasiés pour conserver des capacités de reproduction optimales. Les petits ne présentant pas d’intérêt génotypique seront soit proposés à d’autres équipes de recherche si cela est possible ou seront euthanasiés à la réception du génotype.
Remplacement
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. L’étude de l’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Il n’existe pas d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux et permettant d'étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation d’animaux pour trois raisons majeures : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement puisqu'ils adoptent un comportement migratoire dans le cerveau et un comportement de croissance une fois mis en culture ; la mise en place des couches du cortex, ainsi que les connexions neuronales qui y sont formées, ne peuvent être reproduits en culture cellulaire. Ainsi les modèles de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisés. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. La variabilité interindividuelle peut être élevée, nous avons donc défini qu’il sera nécessaire de tester 13 souris par génotype et par sexe (en deux réplicas) pour chaque stade de développement du cerveau. Ainsi, pour l’ensemble de l’analyse neurodéveloppementale nous estimons que nous utiliserons 1867 souris maximum au cours des 5 années du projet.
Raffinement
Les cages sont maintenues en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau (biberon). La nourriture est adaptée au stade physiologique. Les conditions de luminosité, température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum et couple en trio). Afin de récupérer des embryons à des stades précis nous réaliserons des accouplements contrôlés d’une nuit, ce qui pourra nécessiter de laisser un mâle hébergé seul pendant cette nuit. Toutes les cages sont enrichies d’un nid et de stick en bois. Les cages d’accouplements bénéficient également d’une maison et/ou de papier kraft et d’une alimentation adaptée. Dans le cadre du maintien courant de la lignée les souris seront observées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Conformément au bien-être des animaux, une femelle n'aura pas plus de 6 portées. Les mâles mutants ne seront pas accouplés au-delà de l'âge de 8 mois, afin de maintenir une capacité de reproduction optimale basée sur l'expérience de l'équipe. Dans le cadre de la maintenance de la lignée, les accouplements sont effectués avec des femelles sans mutation provenant d'un fournisseur, afin d'éviter toute dérive génétique susceptible d'aggraver le phénotype nuisible. Les animaux mutés seront euthanasiés après l'âge de 12 mois pour s'assurer que les effets néfastes de la mutation ne sont pas atteints. Les animaux seront également particulièrement surveillés à l'approche de l'âge de 12 mois, afin de détecter d'éventuels signes précoces de souffrance dus à la mutation. Une attention particulière sera accordée aux difficultés locomotrices et à la prostration, qui sont deux signes caractéristiques de la souffrance liée à la mutation. Des points limites ont été établis et seront respectés pour éviter toute souffrance aux animaux. Un protocole d'analgésie sera utilisé pour assurer une euthanasie sans douleur de certaines souris.
Choix des espèces
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Notre choix se porte sur la souris car les techniques de transgénèses sont bien maitrisées chez cette espèce, ce qui permet de créer une lignée d’intérêt qui permet de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet est de suivre le développement du cerveau aux âges suivants : · Stade embryonnaire, donc femelle gestante : pour suivre la mise en place des couches du cortex · Jour post-natal 0, 4, 7 et 15 : Il s’agit de stade critiques pour la maturation du cerveau. · Jour post natal 21,30 : à ce stade on estime que le cortex et le cervelet sont matures. Enfin nous utiliserons des souris adultes à 3 mois pour considérer des effets de la maladie sur un cerveau adulte.
Étude du rôle de la réponse immunitaire dans un modèle ectopique de cholangiocarcinome murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Choisies parce que l'établissement en héberge déjà et que son personnel en maîtrise les techniques, 7 488 souris vont être utilisées dans ce projet sur le cholangiocarcinome, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et jusqu'à vingt-cinq injections, 360 subissent une immunisation en trois temps destinée à provoquer une cholangite, 384 un traitement par l'alimentation pendant 82 jours, et toutes jusqu'à trois prélèvements de sang. Le porteur cite parmi les effets attendus la cachexie, des saignements au site tumoral, des hématomes, des infections aux sites d'injection et, rarement, un arrêt cardiorespiratoire sous anesthésie. Toutes seront tuées pour prélever des tissus qui seront aussi partagés avec des collaborateurs, et aucune médication supplémentaire ne leur sera donnée pendant les expériences, le porteur indiquant que les effets secondaires pourraient interférer avec les résultats.
Objectifs
Le cholangiocarcinome est le second cancer du foie en fréquence avec une incidence de 1.5/100.000 habitants en Occident. Il présente un des pronostics les plus sombres avec une survie à 5 ans inférieure à 20 pour cent, en raison notamment d’un arsenal thérapeutique actuel peu efficace. Ce projet a pour objectifs de mieux caractériser les cellules et facteurs immunitaires impliqués dans l’immunosurveillance du cholangiocarcinome et de développer des traitements capables de la stimuler.
Bénéfices attendus
Ce projet identifiera des acteurs/facteurs clés de l’immunosurveillance du cholongiocarcinome qui pourront servir de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, il proposera des stratégies vaccinales pour la thérapie et la prophylaxie du cholongiocarcinome, non disponibles à ce jour en clinique.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une seule injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes/animal). Toutes les souris seront soumises à des injections intra-péritonéales, intramusculaires, ou intraveineuses (pour un maximum total de 25). La cholongite sera induite chez 360 animaux, par une immunisation en 3 étapes (Jour 0 : 1 injection intra-péritonéale et 1 injection intraveineuse; Jour 14 : 1 injection intra-péritonéale et 1 injection intraveineuse; Jour 28 : 1 injection intra-péritonéale). Les injections intra-péritonéales et intraveineuses n’excèderont pas 1 minute et seront réalisées sur animal vigile. Les injections intramusculaires seront réalisées sous anesthésie gazeuse (moins de 5 minutes/animal). 384 animaux recevront un traitement via l’alimentation (pour une durée de 82 jours). Tous les animaux vigiles seront soumis à un maximum de 3 prélèvements sanguins (durée d’environ 2 minutes). A la fin des expériences, tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances découleront des épisodes de contention des animaux vigiles qui peuvent entrainer un stress chez l’animal. Les traitements et les régimes spéciaux peuvent entrainer une perte d’appétit et donc une perte de poids chez la souris. Les injections peuvent induire une douleur légère (éventuellement accompagnée d’une irritation au niveau du site d’injection) et les sites d’injections et prélèvements peuvent s’infecter. Les prélèvements sanguins peuvent induire des hématomes. L’anesthésie peut induire une hypothermie ou, en cas rare, un arrêt cardiorespiratoire. La croissance tumorale peut induire une gêne chez l’animal ainsi que une baisse ou perte d’appétit qui peut causer une perte de poids des animaux. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (cachexie, apparition de saignements au site tumoral).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin d'obtenir plusieurs tissus qui seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire).
Remplacement
Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues ex vivo et in vivo. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique du système immunitaire.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 7488 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes homogènes de souris pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous utiliserons des tests statistiques pour évaluer et comparer les effets immunologiques dans les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification, bâtons à ronger, maisonnettes, etc). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Avant l’administration des produits, les sites d’injections seront désinfectés. Des points limites surveillés seront mis en place lors des procédures de croissance tumorale. L’anesthésie gazeuse des animaux sera effectuée (avec tapis chauffants). Aucune médication supplémentaire ne sera administrée au cours des expériences, car les effets secondaires sur le système immunitaire pourraient interférer avec les résultats. Si les souris apparaissent affaiblies (prostration) pendant la procédure, la nourriture et l’eau seront mises à l’intérieur de la cage pour leur faciliter l’accès ainsi que du coton pour les réchauffer.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques. La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Notre établissement utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Décontamination de lignées de souris par transfert d’embryons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
90 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. 60 d'entre elles reçoivent deux injections d'hormones pour produire davantage d'embryons, et 40 seront tuées pour récupérer ces embryons. 30 autres subissent une chirurgie de réimplantation d'une quinzaine de minutes, avec une agrafe dans le dos, puis seront tuées après la naissance des petits, tandis que 20 femelles sans bouchon vaginal repartent en zone d'élevage. Le porteur annonce comme bénéfice une amélioration des conditions d'hébergement des lignées et écrit qu'il n'est "pas possible de remplacer l'utilisation d'animal" puisque le projet consiste précisément à décontaminer des lignées de souris.
Objectifs
Cette technique de décontamination, permet à des lignées hébergées en animalerie conventionnelle (zone exempt de pathogènes responsables de maladie qui peut se transmettre de l'animal à l'homme ou de l'homme à l'animal) d'être transférées en animalerie protégée EOPS (zone exempte d'organismes pathogènes spécifiques) et donc d'être étudiées au niveau immunitaire sans interférence des stimulis du milieu environnant. Tous les éléments entrant en contact avec les animaux sont ainsi contrôlés: air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie. Les lignées ainsi décontaminées sont ensuite récupérées par les chercheurs afin de poursuivre leurs études phénotypiques dans le cadre de leurs projets. La décontamination de lignées se fait par transfert d'embryons et est basée sur le principe que l'embryon est protégé par sa membrane pellucide de tout contaminant présent chez la mère. Les lavages successifs des embryons permettent d'éliminer tout contaminant éventuellement présent autour de l'embryon lors de sa collecte.
Bénéfices attendus
La décontamination de lignées de souris par transfert d'embryons permet de modifier le statut sanitaire des lignées et donc leurs conditions d'hébergement, qui sont ainsi améliorées, sans perdre le génotype des animaux. Des souris hébergées dans des conditions d'animalerie conventionnelle sont exposées en permanence à des stimulations de leur système immunitaire par l'environnement (air, litière, nourriture, eau de boisson, personnes fréquentant l'animalerie). Ces stimulations ont forcément un impact sur les réponses immunitaires des animaux. Les études scientifiques qui portent sur des modèles de souris et qui s'intéressent à l'effet de mutation génétique sur les réponses immunes doivent s'affranchir des stimulations non contrôlées des animaux par leur environnement. La décontamination de ces lignées permet leur hébergement en animalerie protégée dans des conditions extrêmement contrôlées (air filtré, eau de boisson filtrée, nourriture irradiée, litière autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes en contact avec les animaux).
Procédures
Au cours de ce projet, les différents femelles utilisées seront soumises à: - 2 injections intrapéritonéales lors du parcours de superovulation pour les 60 femelles fertiles des lignées à décontaminer - 1 chirurgie de réimplantion d'embryons lors du transfert d'embryon d'une durée de 15 minutes maximum et 3 administrations sous-cutanées sous anesthésie gazeuse pour les 30 femelles pseudo-gestantes.
Impact sur les animaux
La piqûre d'aiguille pour l'injection des hormones aux femelles recevant le protocole de superovulation entraine une douleur légère et de courte durée et un stress physique de courte duré. La piqûre d'aiguille pour l'injection de la buprénorphine aux femelles recevant les embryons entraine une douleur légère et de courte durée et stress physique de courte duré. L'intervention chirurgicale des femelles recevant les embryons entraine un stress physique ainsi qu'une gêne liée à la présence de l'agrafe sur le dos.
Devenir
A la fin de la procédure "Superovulation et prélèvement d'embryon": 20 animaux seront replacés en zone d'élevage (20 femelles des lignées à décontaminer non bouchées). Au cours de ce projet, 70 animaux seront euthanasiés (40 femelles fertiles des lignées à décontaminer seront euthanasiées pour recupérer les embryons + 30 femelles réimplantées aprés naissance des petits)
Remplacement
Ce projet consiste à décontaminer des lignées de souris. Il n'est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animal. La décontamination des lignées intervient dans le contexte de recherches fondamentales visant à comprendre, dans sa globalité et sa complexité, le contrôle de la réponse immune et les lymphoproliférations. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas pour l'étude des systèmes complexes et multi-localisés tel que le système immunitaire. La décontamination des lignées permet de contrôler l'impact du milieu environnant sur les animaux et limiter les stimulations du système immunitaire car tous les éléments entrant en contact avec les souris sont contrôlées (air filtré, nourriture irradiée, eau de boisson filtrée, litère autoclavée, procédures strictes d'habillement et de circulation des personnes fréquentant l'animalerie).
Réduction
Les femelles utilisées pour la production d'embryons vont recevoir un traitement hormonal afin d'augmenter le nombre d'embryons récoltés, ceci permet de limiter le nombre de femelles utilisés. Le nombre de 6 femelles par expérimentation de décontamination a été determiné en prenant en compte les expérimentations passées. Ce nombre permet d'avoir un nombre suffisant de femelles bouchées et par conséquent un nombre suffisant d'embryons nous permettant d'avoir des résultats dès la première expérimentation. Les femelles ne présentant pas de bouchon vaginal seront remises dans leur zone d'hebergement afin d'être utilisées pour d'autres expérimentations du laboratoire.
Raffinement
Les animaux bénéficient d'enrichissement dans les cages conformes aux recomandations de la structure bien être de l'établissement. Le personnel est formé à l'expérimentation (manipulation, injection) ainsi qu'à la chirurgie sur le petit animal et maintien ses compétences au cours du temps. Ainsi, toutes les précautions sont prises pour induire un minimum de douleur chez l'animal. La surveillance des animaux en expérimentation est renforcée les jours suivants afin de s'assurer du bien être animal. Un protocole de gestion de la douleur est établi et mis en place dès que le score de douleur établi lors des surveillances quotidiennes le prévoit. Aprés la chirurgie, des croquettes humides sont placés dns la cage afin que l'animal puisse avoir accés à l'eau et à la nourriture le temps de recouvrer une mobilité normal (moins de 24h).
Choix des espèces
L'utilisation des souris est justifiée dans les projets du laboratoire les utilisant et faisant l'objet d'autres demandes d'autorisation de projets. De fait, le présent projet visant à décontaminer des lignées de souris pour les soumettre à un environnement microbien plus strict ne peut se faire que sur l'espèce Mus musculus. Les animaux seront utilisés entre 2 et 12 mois qui correspond, chez la souris, à l'âge correct à optimal de fertilité. De plus, à cet âge, les femelles receveuses d'embryon supportent bien la chirurgie.
Etude du microenvironnement immunitaire des tumeurs épithéliales
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système urogénital
Endormies au masque, implantées une fois avec des cellules tumorales sous la peau, dans le péritoine ou dans la bouche, puis attrapées trois fois par semaine pour le suivi, 2 520 souris vont être utilisées dans ce projet sur le microenvironnement immunitaire des tumeurs. Suivent douze injections de substrat pour l'imagerie par bioluminescence, trois injections d'immunothérapie et deux administrations nasales d'un vaccin expérimental. 1 376 souris relèvent d'un niveau de souffrance léger, 1 144 d'un niveau modéré. Toutes seront tuées pour prélever les tumeurs et un grand nombre d'organes associés, le porteur indiquant que 70 % des expériences s'arrêtent au dixième jour, avant les premiers signes de douleur.
Objectifs
Notre projet a pour but de comprendre les mécanismes liés aux cellules immunitaires se trouvant à l’intérieur des tumeurs et en particulier aux lymphocytes qui sont les cellules immunitaires tueuses de tumeurs. A l'intérieur des tumeurs, la capacité tueuse des lymphocytes est inhibée par l'expression de molécules, appelées "checkpoints", à la surface des lymphocytes. Nous cherchons à comprendre les mécanismes menant à l'expression des "checkpoints" sur les lymphocytes. Nous cherchons à tester dans nos modèles précliniques l’efficacité de traitements bloqueurs de chekpoints (dont certains sont déjà utilisés en clinique) ainsi que d’un vaccin anti-cancer et comprendre ce que leur utilisation déclenche dans l’organisme. Nous planifions d’utiliser des modèles précliniques tumoraux permettant d’étudier 1) le développement des tumeurs primaires localisées sous la peau des souris (modèle classique d'oncologie préclinique), 2) le développement des tumeurs primaires localisées en orthotopique (c’est-à-dire dans l’organe duquel les cellules tumorales sont issues, comme par exemple intra-oral pour les tumeurs de cancers oraux).
Bénéfices attendus
En utilisant ces modèles précliniques de cancer, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires caractéristiques des lymphocytes "tueurs de tumeurs". Nous comprendrons comment les tumeurs contournent leur activité cytotoxique en induisant l'expression des checkpoints. Pour cela, nous avons besoin que les tumeurs évoluent dans leur environnement de prédilection, à savoir dans leur organe d'origine. D'où l'utilisation des modèles d'implantations orhtotopiques, qui nous permettent de positionner les cellules tumorales dans leurs organes d'origine. Ainsi, en ciblant, de façon appropriée à chaque type tumoral, les checkpoints exprimés par les lymphocytes, et en développant des vaccins permettant d'activer ces mêmes lymphocytes, nous pourrons proposer une amélioration des stratégies thérapeutiques déjà en place. Cela pourrait permettre, à terme, de faire évoluer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de cancers oraux, du col de l'utérus, des ovaires.
Procédures
Les animaux sont soumis: 1) à des procédures d'implantations de cellules tumorales (implantation sous-cutanée (SC), implantation orthotopique intra-péritonéale (IP), implantation intra-orale (IO), 2) à des procédures d'injection intra-péritonéale de composants de type: anesthésiant, substrat de l'enzyme exprimée par les cellules tumorales, immunothérapies (anticorps inhibiteurs de checkpoints), et 3) à une procédure d'administration intra-nasale de vaccin - Les procédures d’implantation de cellules tumorales ne seront effectuées qu'1 seule fois par animal, chacune dure environ 5 min par animal. - Les procédures d’ injection d'anesthésiant IP seront effectuées 2 fois par animal (1 fois à l'implantation du cancer), elles durent 2 min par animal. L’injection de substrat sera effectuée 12 fois par animal (à chaque mesure lors du suivi par caméra bioluminescente), sur souris déjà anesthésiée et dure 2 min par animal. 2): l'immunothérapie sera injectée 3 fois par animal, elle dure 2 min par animal. – L’administration du vaccin sera effectuée 2 fois par animal, sur animal anesthésié, elle prendra 5 min par animal.
Impact sur les animaux
L’injection des tumeurs requiert une intervention modérée et nécessite une contention (indolore) puis un positionnement sur les masques pour induction d’endormissement. L’injection des lignées tumorales dans les différents organes nécessite de piquer avec une aiguille de très faible diamètre, et n’aura lieu qu’une seule fois, sur des animaux endormis, évitant ainsi douleur ou stress. Pour l’injection des traitements, les animaux recevront maximum 3 doses, au début du développement de leur tumeur avec une préhension des souris à chaque fois (temps limité à moins de 30sec) et une piqûre avec une aiguille de très faible diamètre (douleur légère et de courte durée). Pour les mesures de suivi de développement tumoral, les animaux seront régulièrement attrapés (3x/semaine, induisant un léger stress). Nous veillerons à ce que le même expérimentateur suive et traite les souris, afin de créer au maximum une habituation, limitant le stress lié à la contention et à l’injection.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, le développement des tumeurs sera suivi chez les animaux et les animaux seront mis à mort pour prélèvements. Les tumeurs, ainsi qu'un grand nombre d'organes/de compartiments associés aux tumeurs, seront prélevés juste après l'euthanasie.
Remplacement
Notre étude vise à explorer les mécanismes immunitaires dans les tumeurs épithéliales de plusieurs origines afin de développer des immunothérapies (anticorps et vaccin) et de comprendre la résistance des tumeurs aux immunothérapies actuelles. Le modèle d’étude doit nécessairement refléter la complexité multi-cellulaire d'une tumeur avec son microenvironnement. Nous ne pouvons pas in vitro (ni dans des organoïdes, ni dans une flasque de culture in vitro) reconstituer un microenvironnement complet autour des cellules tumorales, qui contiendrait un réseau complexe multicellulaire et reflèterait la réalité d’une tumeur chez un patient.
Réduction
Afin de Réduire le nombre d’animaux en expérimentation, une étude complète de la littérature actuelle concernant notre projet a été effectuée pour de ne pas reproduire des résultats d’expériences déjà effectuées sur des animaux. Par ailleurs, nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats, standardiser et limiter le nombre d’expériences à effectuer à 2, réduisant ainsi le nombre d’animaux. Nous désignons également nos manips afin d'obtenir un maximum d'informations par animal testé, ce qui évite l'utilisation d'animaux supplémentaires. Le groupe témoin sera utilisé pour comparaison avec plusieurs lots d’animaux afin de diminuer l’utilisation inutile d’animaux.
Raffinement
Pour optimiser le raffinement, notre long recul (>18ans) sur ces modèles permettra un suivi et une évaluation au plus juste de l’inconfort et de l’éventuelle apparition de souffrance. En effet, 70% des expériences seront arrêtées à J10, bien avant les 1ers signes de douleur. Dans les 30% d’expériences de suivi longitudinal, aucune nécessité de maintenir les animaux en souffrance, ainsi les animaux seront euthanasiés avant d’atteindre le point limite. Les procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés à l’expérimentation animale et au bien-être animal. Ces procédures seront réalisées sous anesthésie, pour éviter le stress et la douleur. La préhension des animaux se fera en dirigeant doucement sur notre main posée en coupelle dans la cage, avant de la poser sur une grille et d’effectuer la contention. Puis une fois endormis, les animaux seront posés sur un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Du gel oculaire sera déposé sur leurs yeux pour éviter le dessèchement. Une attention particulière sera portée à la récupération post-implantation des tumeurs : les cages ne seront enclenchées sur les portoirs ventilés qu’une fois les animaux bien réveillés afin d’éviter une baisse de température liée à la ventilation dans les cages. Egalement en post-opératoire, les souris recevront une alimentation enrichie dans des contenants déposés au sol afin qu’elles n’aient pas à se redresser pour se nourrir. Les conditions d’hébergement se feront selon les recommandations européennes, dans des cages collectives. Des objets appropriés (tubes cartons, lanières papier kraft, papier absorbant.) seront placés dans les cages afin d’améliorer le bien-être des animaux, de diminuer leur stress, de faciliter leur thermorégulation et de leur donner la possibilité de satisfaire leur instinct de nidification. L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations quotidiennes comportementales et physiologiques des souris. Même si les points limites ne devraient pas être atteints pour nos procédures, nous veillerons à éviter toute souffrance ou détresse chez les animaux. Dès les 1ers signes anticipant l’apparition du point limite, la décision d’euthanasier l’animal sera prise et aucun animal ne sera maintenu en souffrance.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies comme modèle d’étude selon plusieurs critères : -La litérature scientifique, définissant le système immunitaire murin comme pertinent pour étudier et comprendre le système immunitaire humain. -leur petite taille qui facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (où plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie). -la biodisponibilité des souris transgéniques permettant d’étudier des mécanismes immunitaires en détail. Les souris adultes peuvent être utilisées pour le projet (à partir de 6 à 8 semaines). En effet, nous nous intéressons à la pathologie du cancer épithélial humain chez l’adulte.