Recherche fondamentale

Trois injections intramusculaires dans la cuisse, échelonnées sur quatre semaines, sont administrées à chacune des 32 souris utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur assimile ces injections à celles de n'importe quel vaccin et n'en attend que des "nuisances très superficielles", hématomes légers, contractures passagères et inflammation locale. Il annonce vérifier si ses nanoparticules peptidiques induisent une réponse immunitaire au même niveau que les vaccins à ARN messager du marché, tout en rapportant que l'étude précédente leur avait donné 20 à 66 % de réponses positives, contre 100 % pour la formulation commerciale. Toutes les souris sont tuées au trente-cinquième jour, le sang total étant prélevé pour obtenir des "volumes de serum conséquents".

Objectifs

Ce projet vise à améliorer les vaccins à ARN messager (ARNm), comme ceux utilisés contre la COVID‑19. Aujourd’hui, ces vaccins doivent être conservés à des températures très basses (entre –20 °C et –80 °C), car leur formulation est fragile et perd rapidement en efficacité. Nous développons une solution alternative à partir de petites molécules naturellement présentes dans le corps. Ces molécules permettent de transporter efficacement différents types d’ARN, de les conserver stables plusieurs semaines à 4 °C facilitant grandement le stockage et la distribution des vaccins. Des premiers tests montrent que ces molécules peuvent déclencher une réponse immunitaire. Nous allons donc comparer, chez l’animal, des vaccins formulés avec les deux formulations puis vérifier si les anticorps produits protègent bien contre une infection virale.

Bénéfices attendus

L’évaluation de l’efficacité des nanoparticules peptidiques à induire une réponse immunitaire au même niveau que celle générée par les vaccins à ARN messager actuels sur le marché permet d'ouvrir des perspectives intéressantes pour le développement de vaccins présentant une formulation, un transport et une conservation grandement simplifiés. Ce nouveau type de formulation pourrait permettre de réduire les couts de production des préparations vaccinales en allégeant fortement les contraintes pratiques associées à l’usage de nanoparticules lipidiques. Les résultats de ces études seront publiés et accessibles à la communauté scientifique et médicale.

Procédures

Le nombre d’intervention prévu chez les animaux sont au nombre de quatre. Une première injection intramusculaire d’une dose vaccinale est programmée le premier jour de l'étude. Une deuxième injection identique se déroulera au 14eme jour de l’expérimentation et une dernière injection réalisée le 28eme jour assurera un « rappel vaccinal ». Chacune des injections sera réalisée en moins d'une minute. L’animal sera euthanasié au 35eme jour et son sang collecté pour réaliser de analyses ultérieures.

Impact sur les animaux

LLes différents groupes recevront intramusculairerement dans la cuisse trois doses vaccinales d'un volume de 50 microlitres échelonnées sur 4 semaines (J0, J14, J28). Ces injections peuvent être considérées comme de simples injections réalisées pour n'importe quel type de vaccin (COVID19, Tétanos, DTPolio...). Elles ne devraient occasionner que des nuisances très superficielles (légers hématomes, contractures musculaires passagères, inflammation locale). Lors de la première phase, aucun signe n'a été observé pour les différents groupes traités

Devenir

Pour obtenir des volumes de serum conséquents, toutes les souris seront euthanasiées et le sang total sera prélevé afin de procéder aux dosages d’anticorps correspondants aux types de vaccins utilisés.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de caractériser les réponses immunitaires induites par la plateforme vaccinale testée. Bien qu’il soit possible de réaliser des études in vitro avec des lignées cellulaires, il est impossible à l’heure actuelle de recréer in vitro la complexité des interactions entre les acteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans le fonctionnement du système immunitaire d’un mammifère. Le modèle murin (souris) dont la physiologie est proche de l’homme permet d’étudier les réponses immunitaires induites par la vaccination. Ce modèle permet donc de générer des données indispensables avant d'envisager de tester dans le futur un vaccin sur des sujets humains.

Réduction

Nous nous efforçons de maximiser le nombre d'expériences réalisées tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Pour établir la signification de la réponse immunitaire induite par nos préparations vaccinales, nous avons déterminé que des groupes de 10 animaux sont suffisants. En effet, les vaccins commerciaux actuellement sur le marché affichent des taux de réponse immunitaire d'environ 95%. Ainsi, nous avons obtenu dans l'étude précédente 100% de réponses positives à la vaccination dans le groupe ayant reçu les doses commerciales. Les groupes traités avec nos nanoparticules ont montré des taux de réponses de l'ordre de 20 à 66% seulement, ce qui constitue un écart clairement significatif. Le nombre d'animaux choisi (10 animaux par groupe) nous permet donc ainsi d'avoir un effet attendu significatif avec un écart-type acceptable.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement qui respectent leur bien-être, tout en limitant le stress et la souffrance des animaux. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux (grilles d’évaluations et points limites) sera strictement respecté, et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie. Notre projet ne nécessite pas la mise en place de mesures de raffinement plus spécifiques.

Choix des espèces

Il s’agit de souris particulièrement adaptées à des études générales incluant des études de toxicologie, de pharmacologie ou de physiologie. Les choix de cette espèce animale reposent sur des résultats probants obtenus dans une étude préliminaire. Nous souhaitons ainsi confirmer une méthodologie alternative de préparations vaccinales pour induire une réponse immunitaire équivalente. Nous recevrons les animaux âgés de 2 mois et ils seront suivis pour une durée de 6 semaines. L’âge de deux mois pour les souris traitées correspond à l’âge auquel le système immunitaire est pleinement développé. Nous maintenons ce critère afin de reproduire au mieux les résultats antérieurs qui s’étaient montrées positifs.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un extrait de romarin par voie orale pendant dix jours, ce qui peut selon le porteur provoquer des douleurs modérées, puis, aux jours huit et neuf, une injection dans le péritoine d'une molécule qui déclenche un stress cardiaque et peut accélérer leur rythme cardiaque. Le bénéfice avancé, une prévention de l'infarctus pour les patients qui ne peuvent pas pratiquer d'activité physique, dépend d'abord de savoir laquelle des formulations comparées protège le mieux du stress oxydant. Le porteur écrit que des expérimentations sur cellules ont déjà été conduites et conclut que le recours à l'expérimentation animale est "nécessaire" pour évaluer le passage de la molécule dans le sang.

Objectifs

Explorer le rôle protecteur cardiaque des extraits de Romarin (Rosmarinus officinalis), sera déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde. Notre objectif sera de comparer des effets protecteurs et anti-oxydants de différents extraits et différentes formulation de R. Officinalis sur des rongeurs, suite à une injection de molécule mimant un stress cardique modéré.

Bénéfices attendus

Explorer le rôle cytoprotecteur des phytonutriments issus d'extraits de Romarin, sera donc déterminant dans le cadre de la prise en charge préventive de patients à risque d’infarctus du myocarde (IdM). Notre approche permettra de déterminer quelle formulation est la plus efficace pour protéger du stress oxydant dans le coeur. Des stratégies préventives cardio-vasculaires sont peu nombreuses et sont très attendues pour certains patients ne pouvant pas réaliser le traitement préventif de référence (activité physique).

Procédures

Les animaux subiront chacun un traitement par voie orale pendant 10 jours (intervention évaluée à moins de 15 minutes). Puis dans l'heure suivant cette prise orale, aux jours 8 et 9, une injection de molécule entraînant un stress cardiaque modéré sera injectée.

Impact sur les animaux

Le traitement oral peut être à l’origine de douleurs modérées ou de stress pour l’animal. Il n'y a pas d'effets toxique attendus à ces doses. Nous n'attendons pas d'effets délétères pour les animaux à la dose utilisée par voie orale. Les deux doses de molécules entrainant un stress cardiaque modéré aux jours 8 et 9 du protocole par voie intra-péritonéale peuvent entrainer des rougeurs au point d'injection. De plus, la molécule entrainant un stress cardiaque modéré (une tachycardie peut être observée), donc dans l'heure suivant l'injection les animaux seront sous surveillance. L'ensemble des prélèvements sera réalisé post-mortem après pré-anesthésie puis anesthésie léthale.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de permettre le prélèvement d'organes cibles.

Remplacement

Des expérimentations sur cellules ont été conduites pour évaluer les différents mécanismes qui impactent la fonction des cellules cardiaques et vasculaires. Cependant la question posée ici est complexe et l’évaluation de l’effet des molécules, de leurs extractions et de leurs formulations sur modèle animaux vivants est nécessaire afin d’évaluer la biodisponibilité (importance du passage de la molécule active dans la circulation sanguine) et l’efficacité biologique. L’intégration de l’expérimentation animale apparait donc nécessaire afin de compléter ce projet de recherche.

Réduction

Le nombre d'animaux a été établi pour permettre d'obtenir des résultats statistiques robustes et fiables. Ceci en se basant sur des résultats de la littérature scientifique et une analyse statistique permettant de déterminer le nombre minimum d'animaux à inclure pour démontrer une différence entre nos groupes. Les tests statistiques apropriés seront ensuite réalisés.

Raffinement

Le protocole a été conçu pour limiter au maximum le stress subit par les animaux. Les animaux seront acclimatés 7 jours après leur arrivé à l’animalerie avant toute procédure. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les souris sont hébergés en cages de 5 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum (à volonté) et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un personnel formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Afin d’éviter toute douleur, les prélèvements seront réalisés post mortem suite à une anesthésie et une euthanasie. Durant toute la procédure expérimentale, les animaux seront suivis et en cas de douleur une injection d'analgésique est prévue. Afin d’éviter tout stress ou douleur, l’ensemble des prélèvements seront réalisés postmortem suite à une anesthésie et une euthanasie appropriée. Par ailleurs, durant toute la période d'hébergement des animaux, le bien-être des animaux sera évaluée par une grille de score présente en annexe. Il est prévu d'enrichir le milieu ainsi que l'alimentation. Lors de l'administration de la dose orale : les procédures seront réalisées par des personnels expérimentés ; et les animaux auront été au préalable habitués. Les animaux seront surveillés tout au long de la procédure pour s’assurer de leur bien-être. De plus, dans l'heure suivant l'injection de la molécule entraînant un stress cardiaque modéré, une surveillance accrue sera mise en place avec une grille de score adaptée présente en annexe.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix car la physiologie cardiovasculaire des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in-vivo. L’utilisation du même animal pour différentes analyses permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. De plus, notre équipe est spécialisée dans l’étude des effets cardiovasculaires ce qui facilitera nos expériences et nos analyses biochimiques. Afin d’éviter des modifications liées au développement des animaux, les souris seront utilisés à un stade mature pour être représentatif d’une population adulte.

Pour vérifier chez le rat un résultat obtenu chez la souris et jugé incertain, la présence dans le rein diabétique d'une substance impliquée dans la digestion, 22 rats Sprague-Dawley mâles reçoivent une injection de streptozotocine dans la veine de la queue. Le diabète ainsi provoqué s'installe pendant huit semaines, avec augmentation de la soif, de la faim et du volume d'urine, perte de poids modérée, déshydratation, altération du pelage et baisse d'activité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois prélèvements sanguins suivent l'évolution, et deux rats ont été ajoutés au groupe traité pour absorber un décès éventuel. Tous sont tués à huit semaines pour prélever les reins et une partie de l'intestin grêle, le porteur écrivant que ces prélèvements sont "indispensables" et qu'ils ne peuvent pas être réalisés sur des rats maintenus en vie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les effets du diabète de type 1 sur le rein. Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle l’organisme ne produit plus d’insuline, ce qui entraîne une augmentation du sucre dans le sang et peut endommager plusieurs organes, notamment les reins. Les chercheurs s’intéressent ici à une substance produite naturellement par l’organisme, appelée cholécystokinine. Cette substance est normalement impliquée dans la digestion des aliments, mais des travaux récents suggèrent qu’elle pourrait aussi être présente dans le rein chez les personnes atteintes de diabète. Cependant, ces premiers résultats restent incertains et doivent être confirmés avec des méthodes plus fiables. Le projet vise donc à vérifier si cette substance est effectivement présente dans le rein en situation de diabète, et à mieux comprendre son rôle. Cela permettra de déterminer si elle participe aux mécanismes liés aux atteintes rénales observées dans cette maladie. Les premières observations ayant été réalisées chez la souris, cette étude sera menée chez le rat, un modèle bien connu et largement utilisé, permettant d’obtenir des résultats plus robustes. À terme, ces travaux pourraient améliorer les connaissances sur les complications du diabète et contribuer à l’identification de nouvelles pistes pour le suivi ou le développement de futurs traitements.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de vérifier de manière fiable des résultats scientifiques récents suggérant qu’une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine, pourrait être présente dans le rein en cas de diabète de type 1. Les données obtenues contribueront à confirmer ou à remettre en question ces observations, et ainsi à améliorer la solidité des connaissances dans ce domaine. À plus long terme, une meilleure compréhension du rôle éventuel de cette substance dans le rein pourrait apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans les complications rénales du diabète. Ces complications étant fréquentes et importantes, toute avancée dans leur compréhension est susceptible d’avoir un intérêt scientifique et médical. Les résultats de ce projet pourraient également orienter des recherches futures visant à identifier de nouveaux indicateurs biologiques utiles pour suivre l’évolution de la maladie, ou de nouvelles pistes d’étude pour le développement de stratégies thérapeutiques. Toutefois, ces applications potentielles nécessiteront des travaux complémentaires avant toute utilisation concrète.

Procédures

Les animaux recevront une seule injection intraveineuse à la queue (durée maximum de 3 minutes) destinée à provoquer un diabète expérimental permettant l'étude de la maladie. Ils feront ensuite l'objet de trois prélèvements sanguins (durée maximale de 1 minute par prélèvement) au cours de l'étude (après 1, 4 et 8 semaines) afin de suivre l'évolution du diabète. La durée totale de suivi sera de huit semaines.

Impact sur les animaux

L'injection destinée à induire le diabète peut entraîner une augmentation durable du taux de sucre dans le sang. Les animaux concernés peuvent présenter une augmentation de la consommation d'eau et de nourriture, une production accrue d'urine, une perte de poids modérée ainsi qu'une diminution de l'activité. Les prélèvements sanguins peuvent provoquer un inconfort bref au moment de leur réalisation. Une surveillance régulière est prévue afin d'identifier rapidement tout signe de souffrance et de mettre en place les mesures nécessaires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes nécessaires aux analyses scientifiques, notamment les reins et une partie de l’intestin grêle. Ces prélèvements sont indispensables pour atteindre les objectifs du projet et ne peuvent pas être réalisés sur des animaux maintenus en vie.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de répondre pleinement à l'objectif de cette étude. L'expression de la cholécystokinine (CCK) dans le tissu rénal doit être étudiée dans le contexte d'un organisme vivant présentant un diabète induit et conservant l'ensemble des interactions physiologiques entre le pancréas, le système endocrinien, le système cardiovasculaire, le rein et les différents mécanismes métaboliques. Des approches in vitro telles que les cultures cellulaires ou les organoïdes rénaux ont été considérées. Toutefois, elles ne permettent pas de reproduire l'état diabétique systémique ni ses conséquences endocriniennes et métaboliques complexes. Les outils de modélisation informatique disponibles ne permettent pas non plus de prédire de façon fiable les modifications de l'expression tissulaire de la CCK dans ce contexte. L'utilisation d'animaux demeure donc nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux a été limité au minimum compatible avec l'obtention de résultats scientifiquement exploitables. Le projet comprend deux groupes expérimentaux : un groupe traité par streptozotocine développant un diabète (12 animaux) et un groupe contrôle (10 animaux). Le dimensionnement des groupes repose sur les données disponibles dans la publication de référence et sur l'expérience acquise avec ce modèle expérimental. Chaque animal contribue à plusieurs critères d'évaluation au cours de la même procédure (suivi glycémique, prélèvement terminal de plasma et collecte des reins), ce qui permet de maximiser les informations obtenues à partir de chaque individu. L’ajout de 2 animaux supplémentaires dans le groupe traité permet de s’affranchir d’un éventuel décès et de garantir la robustesse des résultats. Par ailleurs, les prélèvements terminaux permettront la valorisation maximale des tissus récoltés afin d'éviter la réalisation d'études complémentaires nécessitant de nouveaux animaux lorsque cela sera scientifiquement pertinent.

Raffinement

La durée d’acclimatation sera d’une semaine minimum. Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté à l’espèce, au nombre et à l’âge, avec enrichissement et manipulation selon les bonnes pratiques. Après évaluation de la douleur potentielle (paliers définis avec l’équipe vétérinaire et la SBEA), une analgésie pourra être administrée si nécessaire (signes de douleur, inconfort ou absence de fèces). Une observation quotidienne de l’état général est réalisée tout au long de la procédure, avec soins adaptés en cas de signes cliniques (traitements, soins locaux, enrichissement, réhydratation, réchauffement, ajout d’aliments et/ou gels hydratants, facilitation de l’accès à l’eau). Des points limites sont définis et ajustés selon les observations, avec traçabilité via grilles de score et documents qualité. L’induction du diabète par streptozotocine peut entraîner des symptômes du diabète : hyperglycémie, polyurie (augmentation de la quantité d'urine), polydipsie (augmentation de la consommation d'eau), polyphagie (augmentation de la consommation de nourriture), perte de poids, déshydratation, altération du pelage et baisse d’activité. Les animaux diabétiques feront l’objet d’une surveillance renforcée incluant le suivi du poids, de l’hydratation, du pelage, de la mobilité, des consommations alimentaire et hydrique et de la glycémie. La fréquence des observations sera augmentée dès l’apparition de signes compatibles. Des mesures de soutien (réhydratation, aliments accessibles ou humidifiés, gels hydratants, enrichissement complémentaire) seront mises en place précocement afin de limiter l’impact du modèle et prévenir toute aggravation. Pour l’injection intraveineuse de streptozotocine, les animaux seront habitués à la manipulation via des tunnels dans la cage. L’administration sera réalisée avec un tunnel de contention adapté afin de réduire le stress. Une vasodilatation préalable par réchauffement modéré facilitera l’accès veineux et limitera les tentatives. Les injections seront effectuées par du personnel formé afin de minimiser la durée et les complications.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans l’étude du diabète, car leur organisme présente de nombreuses similitudes avec certains mécanismes observés chez l’Homme pour cette maladie. De plus, ce modèle est bien connu et largement documenté, ce qui permet de comparer les résultats obtenus avec de nombreuses données scientifiques déjà disponibles. Des rats jeunes adultes seront utilisés. Les animaux seront transférés en zone d’expérimentation à l’âge de 4 semaines afin de bénéficier d’une période d’acclimatation d’au moins une semaine avant le début de l’étude. L’induction du diabète sera réalisée à l’âge de 5 semaines, puis les animaux seront suivis pendant 8 semaines. Le choix de cet âge est directement lié aux objectifs du projet. Lorsque la substance utilisée pour induire le diabète est administrée à des animaux très jeunes, elle conduit à un modèle présentant des caractéristiques proches du diabète de type 2. En revanche, une administration réalisée à partir de 5 semaines d’âge permet d’obtenir un modèle bien caractérisé et largement utilisé du diabète de type 1, qui correspond à la maladie étudiée dans ce projet. Par ailleurs, le projet vise à étudier une substance naturellement produite par l’organisme, la cholécystokinine. Chez le rat, la production de cette substance évolue fortement au cours des premières semaines de vie avant de se stabiliser. L’utilisation d’animaux âgés d’au moins 5 semaines permet donc de limiter l’influence du développement normal de l’animal sur les résultats et d’obtenir des données plus fiables concernant les effets du diabète.

Une partie des 1 220 souris utilisées sont des femelles gestantes, dont l'abdomen est ouvert sous anesthésie de 45 minutes pour injecter des particules dans le cerveau de leurs embryons, une injection de cinq secondes qui peut tuer certains d'entre eux. D'autres souris adultes restent anesthésiées deux heures pour une chirurgie du cerveau de quinze minutes, et des souriceaux sont anesthésiés par hypothermie pendant dix minutes avant une injection. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et une autre partie du projet consiste à induire chez des souris témoins les mutations responsables de la microcéphalie pour en caractériser les défauts. Les femelles gestantes sont tuées pour prélever leurs embryons, et les embryons, souriceaux et adultes ayant subi une procédure sont tués pour prélèvement d'organes et analyses génétiques.

Objectifs

Notre laboratoire s’intéresse au développement du cerveau. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et de différentiation cellulaire peuvent entraîner des malformations cérébrales. Des études préliminaires nous ont permis de mettre au point des particules (PLA) ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division du cerveau embryonnaire. Ce projet vise (i) à déterminer si ce type de PLA est pertinent pour développer une approche de thérapie génique au cours du développement. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des PLA à compenser la perte de ce gène et corriger les anomalies de développement du cerveau qui lui sont associées. Nous voulons également (ii) utiliser cet outil pour étudier un autre type de malformation cérébrale, la microcéphalie, en induisant des mutations du gène responsable de cette pathologie chez des souris contrôles, afin de mieux caractériser les défauts liés à la perte de ce gène.

Bénéfices attendus

Le premier bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation de PLA pour corriger une anomalie génétique constitue une approche thérapeutique valide. Le deuxième bénéfice est de comprendre les défauts développementaux qui apparaissent après une mutation d'un gène entraînant une microcéphalie chez l'humain.

Procédures

Des animaux adultes subiront une injection dans la queue d'une durée de 20 secondes. Des femelles gestantes subiront une anesthésie générale de 45 minutes au cours d’une chirurgie qui comprendra l’ouverture de l’abdomen et des points de suture. Des animaux subiront des injections d’une minute 1 fois par jour pendant 2 jours. Des embryons subiront une injection d’une durée de 5 secondes. Des animaux adultes subiront une anesthésie de 2 heures lors d’une chirurgie d'une durée de 15 minutes qui permettra l’injection des PLA dans le cerveau d’une durée de 4 minutes et des points de suture. Des souriceaux subiront une anesthésie par hypothermie de 10 minutes, et une injection d’1 minute. Des animaux subiront, au moment de la mise à mort, une anesthésie et analgésie générale terminale.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent un stress léger et une douleur légère de quelques secondes. L’induction de l’anesthésie gazeuse lors des chirurgies entraîne un stress moyen de quelques secondes, une hypothermie, un déssèchement des yeux et une déshydratation. Les injections intra-cérébrale in utero peuvent entrainer la mort de certains embryons. L'anesthésie pour les injections stéréotaxique entraîne un stress léger de quelques secondes, une hypothermie et un déssèchement des yeux.

Devenir

Les femelles gestantes sont mises à mort pour prélèvement des embryons. Les embryons, nouveaux nés et animaux adultes qui ont subi une procédure sont mis à mort à l’issue de la procédure pour prélèvement d’organes et analyses génétiques et phénotypiques.

Remplacement

Les questions scientifiques posées dans le cadre de ce projet concernent le développement du cortex cérébral, un processus complexe qui ne peut être étudié que sur des cerveaux prélevés sur des embryons de mammifères. A l’heure actuelle, aucun modèle de culture cellulaire ne permet de reproduire l’ensemble des étapes de développement cortical ni d’en mimer la diversité cellulaire et les interactions qui s’y déroulent. Le modèle murin, en particulier la souris, constitue une référence dans ce domaine en raison de la richesse des outils génétiques disponibles et de la caractérisation fine des processus qui permettent le développement du système nerveux, ce qui en fait un modèle de choix pour la conduite de ces recherches.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec le nombre minimal d’animaux nécessaires à l’obtention d’un résultat significatif déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Tous les animaux seront maintenus dans un environnement enrichi avec eau et nourriture à volonté et en groupe social avant et après la procédure. Lors des actes chirurgicaux les souris, placées sur une plaque chauffante, seront anesthésiées et recevront des analgésiques en pré et en post-opératoire. Une litière spécifique, adaptée aux animaux opérés, sera utilisée afin de minimiser le risque d’infection post-opératoire. Un gel ophtalmique sera appliqué durant toute l’anesthésie pour prévenir le dessèchement des yeux et du PBS chauffé à 37°C sera administré aux femelles afin de prévenir la déshydratation. Après l'opération chirurgicale, la surveillance des animaux sera quotidienne afin de détecter d’éventuels signes de souffrance. Une grille de score d'évaluation des animaux sera mise en place. Une injection d'analgésique ou la mise à mort de l'animal sera réalisée en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix pour mener des études sur le développement du système nerveux, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cerveau entre les rongeurs et l’humain. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce permettant de répondre à nos questions scientifiques tels que les modèles génétiquement modifiés. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Une expérimentation est menée sur des embryons entre les jours embryonnaires E12.5 et E15.5, ce qui correspond aux fenêtres d’expression de nos gènes d’intérêt. Une expérimentation se déroulera sur des animaux adultes, car la question à laquelle veut répondre cette expérimentation ne nécessite pas de stade de développement particulier. Des animaux utilisés dans une autre expérimentation seront injectés au jour post-natal P0 et mis à mort à P15 et P30. Cela nous permet d’étudier les effets de notre traitement sur les défauts qui apparaissent à ces stades.

Une seconde chirurgie de deux à quatre heures trente, après une première d'une heure : 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées. Le rythme respiratoire de chacune est manipulé, ce qui leur impose une physiologie inhabituelle, et certaines reçoivent jusqu'à sept administrations d'agents anxiogènes ou panicogènes utilisés en psychiatrie. Les séances d'enregistrement, jusqu'à trois heures par jour pendant sept jours, se déroulent sur souris éveillée maintenue en contention, et une partie exécute en plus des tâches d'une à trois heures pendant plusieurs mois, portant sur la perception de la respiration, la prise de risque et l'apprentissage. Le porteur prévoit des points limites gradués à partir d'une grille de score, appliqués au suivi après chirurgie et à l'inconfort pendant les tâches, et annonce des doses minimales d'agents pharmacologiques.

Objectifs

La perception que nous avons de notre rythme respiratoire peut réguler nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant, le rythme respiratoire est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception respiratoire. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement d’une méthode de manipulation du rythme respiratoire pour pouvoir étudier spécifiquement la perception de la respiration. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information respiratoire. Pendant les stimulations respiratoires, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations respiratoires. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information respiratoire. Nous nous intéressons au cortex car les études chez l’humain ont mis en évidence son implication dans les dérégulations de la percéption du corps liée à l’anxiété. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact de la respiration : la perception respiratoire, l’effet de la respiration sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information respiratoire. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme respiratoire sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension de l’impact de la respiration sur les émotions et certaines maladies psychiatriques.

Bénéfices attendus

La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier notre respiration, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. En effet, se concentrer sur sa respiration est une méthode de relaxation répandue et, au contraire, un emballement de la respiration peut provoquer des crises de panique. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive respiratoire ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive respiratoire en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment la respiration influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception respiratoire ? L’impact du contrôle de la respiration est très variables entre individus. Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies. La première chirurgie dure 1heure, la deuxième entre 2 et 4h30. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme respiratoire ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux. MODIFICATION: [Les animaux sont hébérgés à plusieurs mais en cas de dégradation des implants par les congéneres les animaux peuvent être co-hébérgés dans une cage commune avec séparateur, ce qui peut engendrer un stress, ce qui peut engendrer un stress dû au changement de conditions.]

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité respiratoire à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.

Réduction

Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.

Raffinement

Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. [Hébérgement : Les animaux sont hébergés dans des cages enrichis (dôme, coton) et si possible (pas de conflit ou dégradation de l'implant) à plusieurs ou alors à deux dans une cage avec séparateur pour éviter l'isolement si les animaux doivent être séparés.] Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique (ayant une modification génétique qui nous permet de cibler des sous-types cellulaires) qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

Des vésicules extracellulaires prélevées dans le plasma de patients atteints du syndrome de Sjögren sont injectées à 360 souris à l'âge de cinq mois, puis sept et vingt-huit jours plus tard, puis chaque mois jusqu'à douze mois. À chaque échéance mensuelle s'ajoutent un prélèvement sanguin, une collecte de salive et une mesure des larmes par test au rouge phénol, sous anesthésie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et se terminant par la mise à mort de toutes les souris pour examiner leurs glandes salivaires et lacrymales. Le porteur écrit que les seules nuisances attendues tiennent aux manipulations techniques et qu'elles ne génèrent ni douleur prolongée ni atteinte durable, alors qu'une partie des souris utilisées est transgénique et développe d'elle-même les manifestations de la maladie à partir de six mois. Il présente cette lignée comme "l'un des meilleur modèle murins de la maladie de SjD", du fait d'un développement lent et proche de la maladie humaine.

Objectifs

L’objectif général de ce projet est d’explorer l’impact physiopathologique de vésicules extracellulaires dérivées du plasma de différents types de patients (sur l’apparition des signes cliniques et biologiques de la maladie de Sjögren). Nous utiliserons des vésicules extracellulaires issues de donneurs sains ainsi que de patients atteints de la maladie de Sjögren. Nous voulons évaluer l’effet des vésicules extracellulaires humaines sur des souris immunocompétentes non prédisposées ou sur des souris génétiquement sensible, notamment en termes d’induction de signes de la maladie, de production d’auto-anticorps et d’infiltration lymphocytaire des glandes salivaires et lacrymales. Chaque mois des prélèvements sanguins et urinaires et des test lacrymaux et salivaires seront réalisés. Ce projet vise à répondre à une question jamais explorée à ce jour : les vésicules extracellulaires circulantes des patients Sjögren possèdent-elles un potentiel pathogène in vivo ?

Bénéfices attendus

Mieux comprendre la maladie de Sjögren est indispensable pour pouvoir développer un jour un traitement efficace, sans aucune molécule n’ayant reçu d’autorisation de mise sur la marché à ce jour dans cette maladie. Si les vésicules extracellulaires jouent un rôle dans la maladie, cela pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Ce projet contribuera donc à l’avancée des connaissances nécessaires pour améliorer la prise en charge future.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections de vésicules extracellulaires (VE) plasmatique purifiées de donneurs sains ou de patients SjD actif afin d’évaluer leur impact chez des souris saines et chez des souris pathologiques. Les VE seront injectées à une dose physiologique, doses 1 et 2 définies avant le début de l’étude. Les VE seront injectées aux souris à l’âge de 5 mois (J1), puis à J7, J28, puis une fois par mois jusqu’à l’âge de 12 mois. Des prélèvements sanguins seront réalisés à l’âge de 5 mois. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser les recherches d’auto-anticorps. Les mesures des fonctions salivaires et lacrymales seront faites tous les mois dès l’âge de 5 mois avant le début des traitements. La salive sera collectée dans la cavité buccale des souris après stimulation . La quantité de larmes sera mesurée à chaque œil par un test au rouge phenol. La mesure de la fonction lacrymale, de la fonction salivaire ainsi que le prélèvement sanguin mensuels seront réalisés en même temps afin de ne pas multiplier les procédures et de bénéficier de l'anesthésie parentérale.

Impact sur les animaux

Les seules nuisances anticipées sont liées aux manipulations techniques : injections intraveineuses, prélèvements sanguins ponctuels, tests de fonction lacrymale et salivaire. Ces gestes pourront occasionner un inconfort transitoire, mais ne génèrent ni douleur prolongée ni atteinte durable de l’état général, par ailleurs les souris seront anesthésiées par voie parentérale pour ces manipulations. Toutes les procédures seront effectuées par du personnel qualifié, entraîné aux manipulations chez la souris. Un monitoring attentif sera réalisé afin de détecter précocement tout signe de souffrance ou d’évolution anormale.

Devenir

La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour évaluer si l’injection de VE humaine de patient SjD à induit une infiltration des glandes salivaires et lacrymales ; élément caractéristique de la maladie de SjD.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo permettant de reproduire les interactions complexes entre VE humaines et un système immunitaire complet. La question posée nécessite un organisme entier, incluant les compartiments immunitaire, vasculaire et glandulaire. Aucun modèle alternatif ne peut remplacer l’expérimentation animale pour ce type de mécanismes physiopathologiques.

Réduction

Avant de commencer notre étude sur les animaux, nous allons réaliser une quantification en cytométrie en flux de la concentration moyenne de VE en circulation chez nos donneurs sains et patients SjD actif pour pouvoir injecter une quantité physiologique de VE à nos souris. De plus une revue de la littérature à été menée pour déterminer la fréquence d’injection de nos VE. Nous avons décidé d’injecter les VE à nos animaux à J1, J7, J28 puis une fois par mois jusqu’à la fin du protocole, c’est-à-dire jusqu’à la mise à mort à 12 mois. Ces deux approches nous permettront de définir une seule dose à tester et un seul schéma d’injection, donc d’empêcher la duplication inutile des conditions expérimentales et diminuer significativement le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi ; chaque cage sera agrémentée de « carfil nesting », paille, bois et coton, inoffensif pour le milieu et propre afin d'amener un enrichissement aux souris et les stimuler dans la réalisation de leur propre nid au sein de la cage. Le nombre d’animaux par cage sera compris entre 3 et 5 selon leur âge et leur taille. Les manipulations, injections et prélèvements seront effectués par du personnel expérimenté afin d’éviter toute douleur inutile et de manière à limiter le stress. Un suivi clinique quotidien permettra d’identifier tout signe de souffrance, et les points limites établis permettront une intervention rapide. Les procédures potentiellement douloureuses seront réalisées sous anesthésie selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique de pathologie auto-immune comme la maladie de SjD. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Cette espèce est donc adapté à l’étude de la physiopathologie de la maladie de SjD. Nous utiliserons des souris Il14α transgénique qui est l’un des meilleur modèle murins de la maladie de SjD de fait de son développement lent et très proche de la maladie humaine. Les souris IL14Tg développent spontanément un phénotype de type maladie de SjD avec une apparition progressive de manifestations immunologiques et glandulaires, décrite dans la littérature à partir d’environ 6 mois. Afin d’évaluer si l’administration de VE dérivées de patients atteints de la maladie de SjD peut accélérer l’apparition ou aggraver les manifestations de la maladie, les souris seront incluses dans l’étude à partir de l’âge de 5 mois.