Recherche fondamentale

9 900 souris vont être utilisées pour des groupes expérimentaux de quatre à huit individus, répliqués sur trois expériences indépendantes. Chacune est anesthésiée puis infectée par instillation nasale de Bordetella pertussis, bronchiseptica ou holmesii, ou vaccinée par voie nasale ou intrapéritonéale, avant d'être tuée sept à vingt et un jours plus tard. 3 276 relèvent d'un niveau de souffrance léger et 6 624 d'un niveau modéré, aucune ne pouvant être réutilisée puisque la vaccination ou l'infection modifie durablement leur réponse immunitaire. Le porteur affirme employer des souches virulentes "à des doses qui n'ont aucun effet délétère pour la souris", et reconnaît ne disposer d'aucun modèle établi pour Bordetella holmesii, dont le pouvoir pathogène reste à déterminer.

Objectifs

Les objectifs de notre projet consistent en la découverte de nouveaux facteurs bactériens impliqués respectivement dans la colonisation/maintien des bactéries dans le tractus respiratoire (nez et poumon) de la souris et pouvant potentiellement médier une protection contre un challenge avec une souche pathogène. Ainsi dans un premier temps des isolats cliniques récents de Bordetella pertussis, Bordetella bronchiseptica et Bordetella holmesii seront testés dans un modèle murin pour déterminer leurs capacités à coloniser et persister dans le tractus respiratoire et également à disséminer dans le cadre d’une infection. Une recherche des déterminants bactériens surexprimés dans un environnement mimant le nez est en cours in vitro et in cellulo (cellules épithéliales nasales) par des études de transcriptomiques et de protéomique. Des souches bactériennes déplétées de certains de ces facteurs de virulence seront ainsi testées dans le modèle murin afin de définir le rôle de ces facteurs in vivo. Des candidats vaccins utilisant des antigènes modèles ou issus de l’étude in vitro en cours seront utilisés pour formuler des vaccins mARN, saARN (self amplifying RNA) ou protéiques. Ceux-ci seront ensuite testés chez la souris par administration nasale afin de définir les bases cellulaires et moléculaires de la réponse immune induite. Ces vaccins seront ensuite testés pour déterminer leurs pouvoirs protecteurs dans un modèle de challenge utilisant différentes souches pathogènes humaines de Bordetella.

Bénéfices attendus

Les bénéfices apportés par ce projet seront multiples. Nous allons ainsi pouvoir mettre en place de nouveaux modèles de colonisation animale utilisant des souches virulentes humaines de B. pertussis, B. bronchiseptica et B. Holmesii. Il est à noter qu’il existe très peu d’études publiées à ce jour ayant étudié le comportement de Bordetella holmesii dans un modèle murin. Enfin, nous testerons des vaccins innovants à base d’ARNs ou de protéines, en cours de développement contre ces souches pathogènes. L’importance de cette étude est soulignée par l’augmentation croissante de cas de coqueluche à travers le monde. D’autre part, ce projet nous permettra de mettre en place un modèle murin pour étudier la pathogénèse de B. holmesii, considéré comme un pathogène émergent lié à des pathologies humaines respiratoires et disséminées. L’objectif final du projet est de concevoir des vaccins plus performants contre la coqueluche et mettre au point et évaluer un vaccin qui protégerait contre une infection à B. holmesii.

Procédures

les souris seront infectées sous anesthésie par une instillation nasale de la suspension bactérienne. Les souris seront vaccinées sous anesthésie par instillation ou injection des candidats vaccins par voie nasale ou intrapéritonéale respectivement.

Impact sur les animaux

Le modèle de coqueluche induit par B. pertussis ou B. bronchiseptica ne provoque pas de pathologie chez la souris aux doses que nous utilisons . Ceci a déjà été démontré par de nombreuses études dans notre laboratoire et d’autres laboratoires à travers le monde. Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons des souches virulentes de B. pertussis et B. bronchiseptica à des doses qui n'ont aucun effet délétère pour la souris car aucun dommage pulmonaire ou autre n'est observé. Il n’existe cependant pas de modèle murin pour B. holmesii et une étude exploratoire doit être menée pour déterminer la plus faible dose infectieuse permettant d’établir un modèle de colonisation/dissémination sans induire de pathologie préjudiciable chez la souris. Il n’existe aucun modèle animal pour Bordetella holmesii, cependant c’est une bactérie strictement humaine qui probablement comme Bordetella pertussis et Bordetella bronchiseptica ne mime pas parfaitement la pathologie humaine et donc induit des symptômes beaucoup plus légers dans le modèle murin. Pour les administrations par voie intranasale, nous pratiquerons au préalable une anesthésie chimique des souris. L'euthanasie se fera par dislocation cervicale ou par injection létale d’euthanasiant chimique.

Devenir

Les souris ne pourront pas etre réutilisées pour une autre étude car elles auront été soit vaccinées soit infectées ce qui engendre une réponse immunitaire empechant leur reutilisation

Remplacement

Nous appliquons la règle des 3R dans l’ensemble de nos projets. Cependant, lorsque l’on fait de la recherche en vaccinologie et pathologie, les modèles in vitro et in silico ne suffisent pas pour étudier les réponses du système immunitaire et l’établissement de l’infection chez l’hôte, et dans ces cas, les modèles animaux sont indispensables. De même, pour tester l’efficacité des vaccins à protéger contre les souches virulentes, le modèle animal reste incontournable. La tolérance locale des candidats vaccins et de leurs composants seront évaluées sur de la muqueuse nasale humaine avant l’utilisation dans le modèle murin. Ainsi l’épithélium différencié des voies respiratoires humaines sera reconstitué à l’aide d’un mélange de cellules primaires isolées à partir de 14 donneurs nasaux normaux différents. Uniquement les formulations vaccinales présentant une absence de toxicité sur les cellules seront testées chez la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux est basé sur un calcul de puissance statistique en fonction de la variabilité attendue concernant la significativité des différences observées entre les groupes expérimentaux. Si la variabilité inter-individus et inter-expérimentation est faible, le nombre d’animaux par groupe sera revu à la baisse. Pour atteindre des valeurs statistiques satisfaisantes, 4 souris par groupe et par point de temps seront nécessaires pour les expériences de colonisation et d’immunisation, et 8 souris pour les expériences de challenge. Trois expériences identiques mais indépendantes seront réalisées pour renforcer les résultats. Pour les procédures où plusieurs groupes seront comparés, un test statistique sera réalisé. La significativité sera considérée si p < 0.05.

Raffinement

Nous definirons les doses infectieuses permettant de définir les modèles optimaux de colonisation de chaque souche bactérienne sans induire de pathologie préjudiciable chez la souris. Pour tester le pouvoir protecteur des vaccins, les animaux vaccinés ou naïfs seront infectés intranaselement par des souches virulentes. Les souris sont euthanasiées 7 jours plus tard pour B. pertussis ou B. bronchiseptica ou au maximum 21 jours plus tard pour B. holmesii dont on ne connait pas encore le pouvoir pathogène. Nous respecterons les points limites ainsi nous surveillerons régulièrement l’aspect physique des souris au cours de l'expérience, si nous observions des paramètres de souffrance nous sacrifierions les animaux immédiatement..

Choix des espèces

B. pertussis et B. bronchiseptica colonisent de façon efficace et transitoire le tractus respiratoire de la souris. Ce modèle animal nous permet donc d'étudier correctement les paramètres qui nous intéressent, à savoir la colonisation du nez et des poumons et l'induction de protection contre une souche bactérienne virulente. Pour B. holmesii le modèle murin n’est pas établi et doit être testé. D'autre part, de nombreux outils d'analyses sont disponibles dans le modèle murin pour regarder les réponses immunitaires induites, de type cellulaires, anticorps, cytokines etc... Nous utilisons des souris adultes, âgées entre 6 et 8 semaines. Notre objectif est d’étudier la colonisation du tractus respiratoire et la dissémination (pour Bordetella holmesii) des souches bactériennes et la mise en place d’une réponse immunitaire induite soit par les vaccins soit par les colonisations.

Opérées sous anesthésie en moins de quinze minutes pour installer une arthrose ou une ostéoporose, 440 souris transgéniques dépourvues de tissu adipeux subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour 400 d'entre elles et léger pour les 40 autres. Leur glycémie est contrôlée tous les quinze jours par une piqûre à la queue, et une partie passe par des tests de douleur et d'activité physique, deux fois avant l'induction du modèle et deux fois après, sur animal vigile et pendant une demi-heure. Sept jours puis deux jours avant leur mise à mort, elles reçoivent deux injections intrapéritonéales. Toutes sont tuées pour prélever des tissus, une partie sans jamais être analysée puisqu'elle est mise à mort au titre de l'entretien de la lignée.

Objectifs

L’ostéoporose et l’arthrose sont deux maladies osseuses liées au vieillissement. L’ostéoporose se caractérise par une diminution de la qualité et de la quantité d’os qui entraîne un risque élevé de fracture et une faible capacité de régénération osseuse. L’arthrose inclut une disparition du cartilage et une modification de l’os sur lequel il repose. Ces dernières peuvent précéder les lésions du cartilage, suggérant que le contrôle de l’intégrité osseuse est important pour la physiologie des articulations. Un symptôme majeur des patients souffrant d'arthrose est la douleur qui est déclenchée par des changements périphériques et centraux dans les voies de la douleur. Cependant, les mécanismes impliqués dans la douleur aiguë et chronique ne sont pas encore bien compris dans l'arthrose. Le tissu adipeux de la moelle osseuse a peu été étudié jusqu’à présent et ses fonctions demeurent très mal connues. Des données récentes suggèrent qu’il contribue à réguler l’intégrité de l’os. Toutefois, son rôle dans la régénération osseuse en cas de fracture et celui dans l’arthrose n’ont jamais été investigués. Nous pensons que le tissu adipeux de la moelle osseuse pourrait jouer un rôle dans les altérations de l’os associées à l’arthrose et à la régénération osseuse après fracture. Les souris transgéniques que nous souhaitons étudier présentent une absence de tissu adipeux, notamment celui de la moelle osseuse. Nous voulons déterminer si cette absence est associée à des modifications de l’intégrité osseuses lors de l’arthrose et dans la régénération osseuse en cas de fracture. Nous voulons déterminer si l’absence d’une protéine spécifique jouant un rôle clef dans la fabrication du tissu adipeux et le stockage de lipides chez la souris est associée à des modifications de l’intégrité osseuses lors de l’arthrose et dans la régénération osseuse en cas de fracture.

Bénéfices attendus

Grâce à cette étude nous pourrons déterminer les conséquences de l’absence de tissu adipeux de la moelle osseuse sur l’homéostasie et la vascularisation osseuses au cours du vieillissement et dans deux contextes de pathologies osseuses : l’arthrose et l’ostéoporose. D’un part l'ostéoporose est la maladie osseuse la plus courante, touchant une femme sur trois et un homme sur cinq de plus de 50 ans dans le monde. D’autre part l'arthrose est la maladie inflammatoire et dégénérative des articulations la plus courante, touchant près de 528 millions de personnes en 2019. La majorité des personnes touchées ont plus de 55 ans, et environ 60 pourcents d'entre elles sont des femmes. Par ailleurs, la lipodystrophie congénitale généralisée (absence de tissu adipeux, notamment dans la moelle osseuse) est une maladie rare, dont la prévalence est estimée à 1-10 cas pour 10 millions. Les patients qui présentent une lipodystrophie congénitale généralisée ont des problèmes osseux. Le modèle utilisé récapitule le phénotype observé chez l'homme, ce qui permettrait de poursuivre les recherches sur l’arthrose et la régénération osseuse post-fracture chez ces patients. Enfin, tester l'effet de l'absence de tissu adipeux de la moelle osseuse au cours du vieillissement ouvrirait les possibilités de traitements thérapeutiques et/ou pharmacologiques visant à moduler ce tissu chez les patients à haut risque de fracture et d’arthrose.

Procédures

Le modèle murin transgénique utilisé présentent une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), elles peuvent également développer une insulinorésistance et un diabète. Nous mettrons en œuvre deux modèles expérimentaux : un modèle d’arthrose et un modèle d’ostéoporose. Les procédures opératoires seront effectuées sous anesthésie et analgésie (pré- et post-opératoire) pour une durée inférieure à 15 minutes en incluant toute la préparation. Pour ces animaux, un suivi de la glycémie sera mis en œuvre tous les 15 jours par un prélèvement d’une goutte de sang (très faible volume) au niveau de la veine caudale (quelques secondes par animal). Nous réaliserons une évaluation de la douleur et de l’activité physique sur une partie des animaux avant l’induction des modèles d’arthrose (2 fois) et après (2 fois). Ces évaluations seront effectuées sur animal vigile non contraint pour une durée d’environ 30 minutes (temps de préparation/nettoyage compris). Les animaux recevront également deux injections intrapéritonéales d’une solution 7 jours et 2 jours avant l’euthanasie sur animal vigile (quelques secondes par animal). A l’issue de la période de maintien les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements pour répondre à la question scientifique.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisée présentent une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), elles peuvent également développer une insulinorésistance et un diabète. La mise en œuvre des modèles d’arthrose et d’ostéoporose pourront entrainer des douleurs post-opératoires, une altération de la locomotion et une perte de poids associé. L’anesthésie nécessaire à la mise en place des modèles représente un risque de complication possible mais faible (hypothermie, hypoventilation, arrêt cardio-respiratoire, etc.). Le suivi de la glycémie au cours du temps par un prélèvement d’une goutte de sang (faible volume) de manière régulière ainsi que les injections intrapéritonéales de solution pourront entrainer une douleur et un stress de courte durée. Enfin, l’évaluation de la douleur et de l’activité physique peuvent provoquer un stress et un inconfort de courte durée.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires adaptée afin de prélever des tissus pour analyse. Une partie des animaux ne seront pas analysés puisqu’ils seront euthanasiés dans le cadre de l’entretien de la lignée.

Remplacement

Un organisme vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement de l’arthrose et de l’ostéoporose nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans ces pathologies complexes et multifactorielles. Notre projet se concentre sur le rôle du tissu adipeux de la moelle osseuse dans les altérations de l’os et de l’articulation au cours de ces maladies osseuses liées au vieillissement. Nous pensons qu’il joue un rôle essentiel dans le contrôle du microenvironnement osseux ce qui implique des interactions fonctionnelles étroites entre les cellules du tissue adipeux de la moelle osseuse et celles de son microenvironnement. Certains aspects de ces interactions peuvent être mimés par des co-cultures. Néanmoins dans une vision plus intégrée de ces maladies et dans un souci de comprendre leur développement et leur progression, aucun modèle cellulaire ou moléculaire actuel ne peut remplacer l’approche in vivo.

Réduction

Le projet impliquera un total de 440 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Compte-tenu que les caractéristiques du tissu adipeux de la moelle osseuse sont différentes selon le sexe, les expériences seront réalisées sur des animaux des deux sexes. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, la définition des groupes/temps choisis sont basés sur les résultats d’études antérieures permettant connaître la cinétique d’apparition de l’arthrose. Par ailleurs, l'analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress en utilisant de l’analgésie pré et post opératoire et de l’anesthésie. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Par exemple dans ce projet, le choix de la litière est adapté au modèle mis en œuvre afin que celle-ci soit la moins désagréable possible et n’augmente pas les potentiels douleurs liées au développement de l’arthrose. De même l’accès à l’alimentation sera facilité et son appétence améliorée notamment durant les phases post-opératoires. Le traitement analgésique sera prolongé au-delà de la période de couverture standard en cas de signe de douleur ou de difficulté dans les déplacements des animaux.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le projet est mis en œuvre sur un modèle murin transgénique présentant une faible masse de tissu adipeux (lipodystrophie), et pouvant développer une insulinorésistance. Une telle déficience n’est disponible que chez la souris. De plus, les modèles d’arthrose et d’ostéoporose sont développés chez la souris. Justification des stades : Les études se feront avec des animaux adultes. Le modèle d’arthrose utilisé est le modèle expérimental le plus fréquemment utilisé pour étudier la physiopathologie de l'arthrose et l'efficacité des médicaments contre cette maladie. La chirurgie sera réalisée sur des souris de 12 semaines matures sur le plan squelettique. Le modèle d’ostéoporose sera mis en œuvre sur des souris de 6 à 7 semaines. Il permet de récapituler certains aspects du développement et de la croissance du squelette et de s’affranchir afin des problèmes associés au syndrome métabolique.

Placés seuls en cage de 17 h à 9 h pendant trois nuits, en gardant un contact visuel avec leurs congénères, pour un test de préférence du saccharose, les rats passent aussi des tests de locomotion, d'anxiété, de coordination, de force, de mémoire et de comportement compulsif, ainsi qu'une prise de sang et une mesure de la fonction musculaire sous anesthésie. 100 rats porteurs de mutations du gène CLCN4 vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet vise à vérifier si ces lignées reproduisent une maladie neurodéveloppementale rare, et le porteur indique qu'une des mutations rend les mâles "plus chétifs, plus agressifs". Hormis le test du saccharose, il désigne chaque test par ce qu'il mesure sans dire lequel est employé, et mentionne un "test impliquant de l'eau", après lequel les rats sont séchés sous une lampe chauffante, sans l'identifier.

Objectifs

La maladie liée au gène d'intérêt est une maladie neurodeveloppementale rare liée au chromosome X. Elle affecte les deux sexes et est associée à une déficience intellectuelle, à l'épilepsie, à des problèmes gastro-intestinaux et à des troubles du mouvement et du comportement. Ce gène code pour une protéine dont la fonction et le mode d'action n'est pas encore bien compris. Ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie de ce syndrome et les développements thérapeutiques potentiels. Les besoins médicaux des patients souffrant de cette pathologie restent largement insatisfaits. Seules des thérapies multidisciplinaires de soutien sont disponibles. Il est donc nécessaire de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie en utilisant un modèle animal approprié.

Bénéfices attendus

Étant donné l'absence actuelle de modèle animal approprié pour cette pathologie, nous pensons que si la caractérisation des modèles de rats montre une récapitulation précise des symptomes associés à cette maladie, les résultats du travail proposé auront un impact significatif : Cela ouvrira la voie à une analyse plus approfondie des aspects génétiques, fonctionnels et cliniques de la maladie, avec la possibilité de générer des données significatives et translationnelles, et ainsi mieux comprendre la physiopathologie. Ce projet nous permettra ainsi d'évaluer dans quelle mesure le modèle de rat correspond au spectre clinique de la maladie, et de déterminer son utilité pour les recherches futures sur la physiopathologie du syndrome et les développements thérapeutiques potentiels.

Procédures

Nous allons réaliser les tests d'exploration fonctionnelle suivants de 12-20 semaines d'âge, chacun des tests étant réalisé une seule fois : Mesure de l'activité locomotrice et anxiété (30 minutes) observations cliniques (5 à 10 minutes); tests de coordination (4 sessions de 20 minutes maximum en 2 jours + 18 minutes au total sur 3 jours); test de force musculaire (5 minutes environ); test pour évaluer des troubles compulsifs (30 minutes); test d'apprentissage et mémoire (45 minutes au total en 8 jours); AMENDEMENT - ajout d'un test pour évaluer la dépression (3*16h); test pour évaluer la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie; le suivi du poids des animaux (1X/semaine); prélèvement des fécès (30 secondes) et prélèvement sanguin (30 secondes) sous contention rapide AMENDEMENT - sous anesthésie. L'ensemble des animaux de l'étude recevront pour le test de la fonction musculaire, une injection d'anesthésique et une autre de son réversant.

Impact sur les animaux

Une des mutations ponctuelles induit un léger phénotype, les mâles sont notamment plus chétifs, plus agressifs, ils peuvent présenter des problèmes locomoteurs. Lors des injections d'anesthésique, les animaux sont maintenus en contention rapide de quelques secondes le temps d'injecter le produit, ce qui peut stresser un court instant l'animal avant d'être relaché dans sa cage. De même, la prise de sang pour les animaux qui ne seront pas perfusés au paraformaldéhyde (PFA), sera réalisée sous contention durant quelques secondes. AMENDEMENT - une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux. AMENDEMENT - Le test de préférence du saccharose nécessite d'isoler les animaux pendant 3 nuits, tout en gardant le contact visuel avec leurs congénères: les animaux seront placés seuls dans des cages d'hébergement de 17h à 9h le lendemain matin pendant 3 jours. De 9h à 17h, les animaux retrouveront leur cage et leur congénère d'origine.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques et de protéomique)

Remplacement

L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant des mutations dans le gène d'intérêt et d'observer si ces modèles sont représentatifs de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser les phénotypes comportementaux, déficience intellectuelle, hypotonie, troubles neurologiques, anomalies cérébrales, anxiété, comportement compulsif, déficit d'attention, constipation, difficultés d'alimentation, petite taille et microcéphalie. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptômes de la pathologie associés au gène d'intérêt.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons 64 animaux mutants (16 mâles mutation 1 + 16 femelles mutation 1 + 16 mâles mutation 2 + 16 femelles mutation 2) et 32 animaux contrôles (16 mâles + 16 femelles) pour évaluer le phénotype des animaux. Les animaux contrôles seront mutualisés pour les deux mutations, permettant ainsi de réduire le nombre total de rats. Ce nombre de rats permettra d'assurer un nombre d'animaux suffisant durant le protocole afin de pouvoir réaliser des analyses statistiques robustes. Afin de monter les cohortes expérimentales, nous allons réaliser un type de croisement qui va générer des animaux tous potentiellement constitutifs de la cohorte expérimentale, ce qui permet de limiter fortement le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâton à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. Le type de croisement choisi pour monter cette cohorte expérimentale permet d'optimiser le nombre d'animaux pour créer la cohorte et également de ne pas maintenir de mâles reproducteurs dans la colonie et ainsi ne pas avoir d'animaux avec un potentiel phénotype dommageable (puisque seul les mâles sont atteints). Les animaux auront passé une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors des différents transferts de leur cage d'hébergement vers les différents tests. Dans le test impliquant de l'eau, les rats après les séances, seront séchés à l'aide d'une serviette puis placés sous une lampe chauffante afin d'être parfaitement secs au moment du retour dans leur cage d'hébergement. Lors de l'anesthésie, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. AMENDEMENT- L'isolement des animaux lors du test de préférence du saccharose (3*16h) se déroulera dans des cages d'hébergement avec enrichissement (nid, bâton et balle à ronger). Ces cages sont transparentes et les animaux continueront d'avoir un contact visuel avec leurs congénères.

Choix des espèces

Le modèle rat portant des mutations dans le gène d'intérêt permet de reproduire tout ou partie des symptômes de la pathologie observés en clinique humaine (données préliminaires). Par ailleurs, le gène d'intérêt du rat se trouve sur le chromosome X comme chez l'Homme, contrairement à la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le calendrier échelonné des divers tests de phénotypage démarrera à l'âge de 12 semaines, et durera 6-8 semaines pour réaliser l'ensemble des tests.

153 850 souris vont être utilisées, chacune recevant une puce électronique sous la peau avant le sevrage et une biopsie d'un fragment de queue dès deux à trois semaines d'âge. 250 d'entre elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales d'un agent chimique mutagène à quatre, cinq et six semaines, qui peut rendre stériles 70 % des mâles, les autres naissant, étant génotypées et maintenues pour l'entretien de la lignée. Toutes seront tuées dès les premiers signes biologiques de la maladie auto-immune, ce que le porteur présente comme un moyen d'éviter toute souffrance. Il annonce un effectif établi sur des études statistiques permettant d'utiliser "le moins d'animaux possible", sans expliquer comment ce calcul aboutit à 153 850 souris.

Objectifs

Ce projet concerne les maladies auto-immunes qui ont une cause génétique et sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs. Le but est de caractériser les gènes impliqués en utilisant la souris comme modèle. Dans ce projet nous induirons des mutations au hasard dans le génome grâce à l’injection d'un agent chimique. Nous identifierons les mutations qui modifient les caractéristiques physiques de la maladie en suivant les descendants des souris traitées. Les mutations qui modifient de manière significative les caractéristiques de la maladie seront ainsi identifiées. Les protéines codées par les gènes identifiés seront des cibles thérapeutiques potentielles chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Identifier de nouveaux gènes impliqués dans la maladie. Cette démarche donnera accès à de nouvelles cibles thérapeutiques pour la maladie ainsi qu’à de nouveaux marqueurs génétiques et/ou biologiques permettant de dépister la maladie à des stades précoces. Nous prévoyons que de nouveaux gènes modifiant les caractéristiques de la maladie seront découverts.

Procédures

Chez certaines souris une injection unique intrapéritonéale sera pratiquée dans les 3 jours qui suivent la naissance (le geste dure 15 secondes). Le projet comporte l'injection intrapéritonéale de 250 animaux avec un agent chimique 1 fois par semaine pendant 3 semaines (à 4, 5 et 6 semaines d'âge) (chaque geste dure moins de 15 secondes). Chez certaines souris un prélèvement unique de sang sera effectué à 6 semaines sous anesthésie générale (le geste dure 30 secondes). Toutes les interventions citées précédement seront réalisées dans un seul établissement utilisateur. Une puce électronique sera implantée à tous les animaux avant le sevrage par voie sous cutanée et des biopsies d’un fragment de queue seront effectuées à partir de 2-3 semaines d’âge (le geste dure 15 secondes). Ces deux interventions pourront être réalisées dans les deux établissements utilisateurs

Impact sur les animaux

Les injections de l’agent chimique peuvent entraîner une infertilité chez 70% des mâles. L'injection intrapéritonéale peut en soi être à l'origine d'une douleur, les prélèvements de sang sous anesthésie peuvent être associés à une douleur à l'œil au réveil, les biopsies de queue peuvent engendrer une douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dès l'apparition des premiers signes biologiques de la maladie afin d'éviter toute souffrance.

Remplacement

Ce projet concerne l'étude de maladies auto-immunes qui sont d’origine génétique. Il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico pour aborder le sujet. D’où le besoin d'avoir recours aux modèles de souris dont les caractéristiques récapitulent la maladie humaine. Les expériences proposées nécessitent de comparer des individus qui ne diffèrent pas de façon majeure pour leur fond génétique ou l’environnement. C’est le cas de la souche de souris que nous proposons d’étudier.

Réduction

Pour respecter le principe de la Réduction, le nombre proposé de souris a été établi sur la base d’études statistiques permettant d’utiliser le moins d'animaux possible pour aboutir à des résultats fiables. La méthode utilisée permet de cumuler les individus à des temps différents de suivi en diminuant ainsi de manière très importante le nombre de souris analysées à chaque temps individuel. Pour les expériences impliquant des croisements, le nombre d’individus prévus tient compte de notre expérience dans le domaine. Par ailleurs, le protocole prévoit un nombre limité de croisements (3) pour constituer les groupes d'animaux qui feront l'objet de l'analyse génétique.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour respecter le confort maximum des conditions d’hébergement, faire pratiquer les gestes nécessaires par un personnel formé et ayant de l’expérience des pratiques, réduire le stress et la douleur. Les souris sont hébergées dans des portoirs ventilés. Les cages sont dotées de tunnels d’enrichissement rouges et de cotons de nidification. Pour les prélèvements sanguins et les biopsies une prise en charge de la douleur sera mise en place avec des antalgiques et des anesthésiques. Une observation quotidienne avec une grille de points limites sera effectuée afin qu’en cas de besoin des mesures soient mises en place pour garantir le bien-être de l‘animal. Quand des livraisons d’un établissement à l’autre seront réalisées, les animaux aptes au transport seront livrés via un transporteur agréé et en respectant le bien-être des animaux (colis comprenant alimentation, gel d'hydratation et enrichissement). Une période d’acclimatation sera appliquée après réception des animaux.

Choix des espèces

L'espèce animale choisie est une souche de souris qui développe une maladie dont les caractéristiques sont similaires à celles de la maladie humaine correspondante. Les souris sont engagées dans les procédures dès la naissance. La maladie apparait chez les souris adultes après 12 semaines d’âge. Les souris sont suivies une fois par semaine, à partir de 10 semaines d’âge, pour détecter de manière précoce la survenue de la maladie. Les expériences seront toujours interrompues dès les premiers signes biologiques de la maladie avant que celle-ci n’ait donné lieu à des manifestations physiques entraînant une souffrance des animaux.