Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Fonctions embryonnaires de la voie de signalisation purinergique
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Réutilisées pour la ponte tous les quatre à six mois, soit dix à quinze fois au cours du projet, 150 xénopes femelles reçoivent deux injections d'hormone HCG dans les sacs lymphatiques du dos, sur animal vigile, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Elles retournent ensuite à l'animalerie aquatique, et celles qui ne répondent plus à la stimulation après trois essais successifs sont tuées et remplacées. Les œufs pondus servent à étudier les fonctions embryonnaires de la voie purinergique, les embryons étant partagés entre plusieurs équipes de recherche. Sur les 3R, le porteur écrit que la règle "est surtout applicable au nombre d'animaux utilisés" et que les possibilités de raffinement sont "très limitées", l'enrichissement se réduisant à des sections de tube en PVC.
Objectifs
Le projet a pour objectif l'étude des fonctions embryonnaires de la voie purinergique, qui fait intervenir les purines extracellulaires, telles que l'ATP, ADP et adénosine. Leurs actions sur les cellules nécessitent un grand nombre d'acteurs (tels que des récepteurs). Cette voie de signalisation constitue un système de communication cellule-cellule universel et régule la physiologie de nombreux organes, tels que les systèmes neural (central et périphérique) et rénal. Elle est aussi impliquée dans de nombreuses conditions pathologiques neurologiques mais aussi rénales et les différents acteurs de cette voie sont devenus des cibles thérapeutiques pour un grand nombre de maladies. Toutefois, les fonctions de cette voie lors de l’embryogénèse demeurent moins comprises, notamment car peu d’études se sont penchées sur le rôle de cette voie de signalisation dans un contexte in vivo. Nous avons montré que les acteurs de cette voie sont exprimés lors de l'embryogénèse et que la mise en place du rein et de l'oeil est controlée par cette voie de signalisation. Les objectifs de ce projet sont d'étudier les fonctions de cette voie dans un contexte embryonnaire, dans l'embryon de l'amphibien xénope, et d’établir les fonctions de la voie de ces purines au cours de l’embryogénèse.
Bénéfices attendus
D'un point de vue fondamental, ce projet devrait permettre d'élucider les fonctions de la voie purinergique dans un contexte in vivo, notammentes mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués lors du développement d'un embryon d'un vertébré. mais également d’un point de vue appliqué afin de mieux appréhender les mécanismes dérégulés dans les conditions pathophysiologiques.
Procédures
Les animaux femelles X.laevis recevront deux injections d'hormones HCG dans leur sacs lymphatiques dorsaux. Cesinjections seront faites sur animal vigile. Cette procédure dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont du stress léger du à l'injection sous-cutanée et à la contention de l'animal durant celle-ci. La quantité d'ovocytes pondus suite à la stimulation hormonale correspond à un nombre d'ovocytes pondus dans le milieu naturel par les femelles. Les animaux adultes femelles sont réutilisées (tous les 4 à 6 mois) pour la ponte d'ovocytes, ce qui est inférieur au nombre de pontes dans le milieu naturel (jusqu'à 4 par année). Chaque femelle sera utilisée 2 fois (maximum 3 fois) par année, soit 10 à 15 fois au cours du projet.
Devenir
Les animaux adultes femelles apres stimulation et ponte sont remises dans l'animalerie aquatique et sont re-utilisées pour la ponte tous les 6 mois (4 mois minimum). En cas de non réponse (3 fois successives) à la stimulation hormonale, les animaux peuvent etre euthanasiées et devront etre remplacées si besoin.
Remplacement
La regle des 3R esr surtout applicable au nombre d'animaux utilisés. Il est clair que l’étude des fonctions embryonnaires de voies de signalisation requiert de pouvoir analyser les processus cellulaires et moléculaires impliqués dans un contexte in vivo, et que l’embryon ne peut pas être remplacé.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour les expériences, nous faisons en sorte de partager les embryons qui sont très nombreux entre les chercheurs de différentes équipes de recherche travaillant avec ce modèle . Une femelle de Xénope peut pondre plusieurs milliers d’œufs, ce qui permet d’obtenir assez d’embryons plusieurs expériences. 2 journées de poonte sont prévues par semaine d'experimentations.
Raffinement
Les possibilités de raffiner les protocoles utilisés sont très limitées. Un programme d’enrichissement a été mis en place dans l’animalerie qui permet aux animaux de bénéficier d’un environnement mimant un habitat naturel (abris constitués de section de tubes PVC).
Choix des espèces
L’embryon de Xénope est un modèle classique d’étude de voie de signalisation complexe au cours de l’embryogénèse de par ses nombreux avantages biologiques : progéniture importante, taille des embryons, développement externe et température dépendant, résistance aux manipulations (micro-injections). De plus, les progrès technologiques permettent d’effectuer facielemnt et rapidement des expériences de perte et gain de fonction. Les animaux males et femelles sont utilisés à l'age adulte, apres acquisition de leur maturite sexuelle.
Validation en modèle murin de l’effet thérapeutique d’un vaccin muqueux anti-SARS-CoV2 contre les symptômes du covid-long
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Une souris qui perd 15 % de son poids ou présente des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 est mise à mort sans délai. 96 souris vont être utilisées, toutes tuées à la fin du protocole pour prélever poumons, cerveau et sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous la peau du dos, huit prises de sang hebdomadaires, de deux à dix doses de vaccin par le nez sans anesthésie et une inoculation du virus par voie nasale sous anesthésie générale. Le porteur indique qu'après l'infection, les souris perdent en moyenne 15 % de leur poids entre trois et cinq jours, puis montrent une léthargie et des difficultés respiratoires pouvant entraîner la mort au huitième jour. Il annonce étudier les symptômes du covid long, "y compris les atteintes cérébrales", et ne décrit aucun test neurologique ou comportemental pour les mesurer.
Objectifs
Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.
Bénéfices attendus
Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.
Procédures
Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sans anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 2 à 10 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire. Après chaque prise de sang et chaque instillation nasale sur animaux vigiles, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruitée ou rondelle de banane séchée ou popcorn ou graines de tournesol sera réalisée.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.
Identification et rôle de gènes bactériens à expression hétérogène dans la virulence de Citrobacter rodentium chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées une seule fois avec une souche de Citrobacter rodentium, 145 souris sont ensuite manipulées chaque jour pendant quatorze jours pour la récolte de leurs excréments. Pour 115 d'entre elles, le niveau de souffrance déclaré est sévère, avec perte de poids et inconforts liés à la maladie intestinale, les 30 autres relevant d'un niveau léger. Le porteur écrit que la première procédure "ne génère aucune nuisance sur les animaux mise à part le gavage", formulation qui cohabite mal avec les 115 souris déclarées en souffrance sévère dans la seconde. Toutes sont tuées par dislocation cervicale, et il précise qu'ayant reçu des souches pathogènes, elles ne peuvent être ni réhabilitées ni transférées vers un autre établissement.
Objectifs
Les Escherichia coli entéropathogène (EPEC) et E. coli entérohémorragique (EHEC) sont des bactéries responsables d’infections intestinales chez l’homme. Si la plupart de leurs facteurs de virulence ou de fitness ont été identifiés et bien caractérisés dans la littérature, le comportement dynamique des pathogènes au cours du processus infectieux a été moins étudié. Dans le même temps, les progrès récents en technologies de la cellule unique ont révélé qu’une population bactérienne clonale n’est pas une somme de cellules bactériennes identiques mais rassemble plutôt des individus avec des phénotypes potentiellement distincts, un phénomène appelé hétérogénéité phénotypique. Cette nouvelle vision des populations bactériennes a conduit à l’émergence de concepts écologiques qui changent notre compréhension de la façon dont les micro-organismes s’adaptent à leur environnement fluctuant. Cependant, le rôle de l’hétérogénéité phénotypique dans le processus infectieux bactérien a été peu étudié à ce jour. Afin de caractériser le rôle de l’hétérogénéité phénotypique dans les processus de virulence, le projet aura pour objectif d’identifier des gènes exprimés de façon hétérogène par un pathogène au cours de l’infection. Pour cela, nous prévoyons d’utiliser la bactérie Citrobacter rodentium comme modèle d’étude car i) il s’agit d’une bactérie aux propriétés de virulence similaires à celles des EPEC et des EHEC et ii) c’est un agent pathogène intestinal naturel de la souris avec un processus infectieux très bien caractérisé dans la littérature.
Bénéfices attendus
Nous espérons identifier plusieurs gènes de C. rodentium dont l’expression est hétérogène lors de la première étape du processus infectieux. La mise en évidence de ces gènes est un point de départ pour i) comprendre comment C. rodentium s’adapte à l’environnement intestinal et prépare son expansion dans le côlon et ii) explorer si l’hétérogénéité phénotypique a un rôle dans la virulence de C. rodentium et plus largement dans la virulence d’agents pathogènes proches tels que les EPEC et les EHEC. A plus long terme, ces données pourraient conduire à de nouvelles pistes thérapeutiques via une interférence de l’expression de gènes clés dans l’adaptation des pathogènes à leur environnement infectieux.
Procédures
Les animaux subiront un seul gavage intra-gastrique avec la souche infectieuse (durée~10sec). Les souris seront manipulés quotidiennement pendant 14 jours afin de récolter des féces.
Impact sur les animaux
La première procédure impliquant une infection des souris pendant 24h seulement ne génère aucune nuisance sur les animaux mise à part le gavage par voie orale. La seconde procédure évaluant le rôle des gènes identifiés sur la virulence de C. rodentium pendant 15 jours va quant à elle induire différents effets indésirables sur les animaux tels que perte de poids et inconforts associés à la pathologie intestinale.
Devenir
L’ensemble des animaux prévus pour chaque procédure expérimentale sera euthanasié par dislocation cervicale. Les souris ayant été gavées avec des souches pathogènes, il est impossible de réhabiliter ces animaux ou de les transférer vers d'autres établissement expérimental pour réutilisation.
Remplacement
L’objectif du projet est d’évaluer le rôle de l’hétérogénéité phénotypique au cours du processus infectieux. Il est donc nécessaire de réaliser ces essais chez l’animal afin de prendre en compte la complexité du tractus intestinal qui intègre à la fois la réponse immunitaire, la structure du tractus digestif ainsi que la présence du microbiote. Il n’existe pas de modèles cellulaires reproduisant la complexité de ces interactions. Cependant, les étapes de tri cellulaire prévues dans le projet seront d'abord réalisées in vitro en mélangeant une culture bactérienne seule ou en mélange avec des feces de souris dilués de facon à optimiser le process de tri sans devoir ajouter des animaux supplémenatires.
Réduction
Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé par une approche statistique. Ce nombre est nécessaire pour réaliser la sélection de gènes d'intérêt et pour répondre aux différentes questions scientifiques tout en gardant une puissance statistique suffisante dans le traitement de nos résultats, et pour palier à l’exclusion de certains animaux au cours de l’expérimentation. Il s’agit d’un nombre d’animaux maximal qui sera revu à la baisse en fonction des premiers résultats obtenus qui pourront dans certains cas ne pas nécessiter de répétitions pour valider les observations.
Raffinement
Les protocoles expérimentaux ont été raffinés à partir des données de la littérature et de notre expérience antérieure. Un enrichissement de l'environnement est prévu par ajout de cylindre de coton dans les cages. L’ensemble des animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié selon une grille de suivi clinique claire comprenant 4 stades distincts établis en fonction de la perte de poids et de l'état visuel des animaux (pelage et comportements). Si les points limites tels que définis dans le projet sont atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole expérimental et euthanasiés selon la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
La souris est l’hôte naturel de l’agent pathogène Citrobacter rodentium utilisé dans cette étude et constitue un bon modèle pour étudier les infections bactériennes intestinales chez les mammifères. Animaux de 4 à 6 semaines. L’utilisation d’animaux pesant entre 18 et 20 g le jour de l’infection permet de limiter la variabilité de réponse entre animaux vis-à-vis de l’infection
Impact du transfert de microbiote fécal chez la souris sur la formation et la maturation de structures lymphoïdes tertiaires au sein d’une tumeur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Sept jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson, une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires, cinq gavages de microbiote fécal ou cinq administrations intranasales sous anesthésie, puis jusqu'à vingt séances d'imagerie chacune précédée d'une injection dans l'abdomen : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur mentionne des diarrhées, une déshydratation, des microlésions du tube digestif, de rares fausses routes lors des gavages et une gêne respiratoire transitoire. L'objectif est de voir si un transfert de microbiote fait apparaître des amas de lymphocytes dans la tumeur et améliore la réponse à une immunothérapie à laquelle 60 % des patients ne répondent pas. Toutes sont tuées pour que les tumeurs soient récupérées et l'organisation du système immunitaire autour des cellules tumorales examinée.
Objectifs
Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, environ 60 pourcents des patients ne répondent pas aux ICI nécessitant de trouver d’autres thérapies pour soigner cette majorité de patients non répondeurs aux ICI. La présence de cellules immunitaires dans la tumeur est primordiale pour répondre aux ICI. En particulier, les lymphocytes organisés en agrégats (communément appelés structures lymphoïdes tertiaires, TLS) sont associés à une meilleure survie des patients et une meilleure réponse aux ICI. Très récemment, il a été montré que des bactéries peuvent stimuler l’activité des TLS. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer la capacité des bactéries d’un microbiote intestinal à induire la formation de TLS pour améliorer l’efficacité des ICI dans un modèle pré-clinique.
Bénéfices attendus
Le cancer du poumon est le 3ème cancer le plus fréquent et la 1ère cause de décès par cancer en France (source : site de l’INCa). Seulement 40 pourcents des patients répondent aux immunothérapies. Le présent projet portera sur un modèle murin de cancer du poumon. L’étude du transfert du microbiote fécal chez la souris déterminera : 1) si ce traitement induit la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) et 2) si la réponse à l'inhibiteur de point de contrôle et la survie des animaux sont améliorées. Les résultats de ce projet pourraient permettre d'améliorer les traitements en médecine humaine pour le cancer du poumon.
Procédures
Les animaux seront soumis à : un traitement antibiotiques dans l'eau de boisson (animal vigil, traitement en continu pendant 7 jours); des injections intraveineuses pour inoculation de tumeurs (animal vigil, 1 fois, 1 minute); des gavage pour implanter le microbiote sur certains groupes (animal vigil, 5 fois, 1 minute); des administrations intranasales sur d'autres groupes (animal anesthésié, 5 fois, 5 minutes); puis un suivi par imagerie (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 minutes) avec injection intrapéritonéale au préalable (animal vigil, 20 fois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs ainsi qu'un suivi du microbiote intestinal (animal vigil, 3 fois, 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables possibles sont : L’antiobiothérapie via l'eau de boisson pourra engendrer des diarrhées et une déshydratation. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages peuvent induire des microlésions ou des irritations et dans de rares cas une fausse route. Les administrations intranasales et l'imagerie seront effectuées sous anesthésie qui pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée ainsi qu'une réduction de la mobilité. Le recueil des fèces se fera par contention manuelle douce qui pourra toutefois engendrer un léger stress.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées pour qu'on puisse récupérer les tumeurs et étudier la façon dont le système immunitaire s'organise autour des cellules tumorales.
Remplacement
Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. Ainsi, les modèles souris sont considérées comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumorale.
Réduction
300 animaux seront utilisés pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. En effet, les groupes sont constitués de 5 ou 10 animaux, groupes établis grâce à un calcul de puissance mathématique et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques pour permettre une interprétation fiable des résultats. L'utilisation de l'imagerie dans ce projet, permet un suivi longitudinal (plusieurs mesures sur le même animal) et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés (5 animaux maximum par cage) et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (isolement limité à la fin d’une seule expérience) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique (ou biberon d’eau lors de l’antibiothérapie) et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière Kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).
Choix des espèces
En accord avec la littérature scientifique sur le microbiote, les structures lymphoïdes tertiaires et les réponses anti-tumorales et la disponibilité de l'ensemble des réactifs nécessaires à la procédure, ce projet sera entièrement réalisé chez la souris. De plus, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature. Ils sont donc applicables sans avoir besoin d’utiliser des animaux supplémentaires pour réaliser la mise au point des protocoles expérimentaux. Le projet utilisera des souris non génétiquement modifiées car particulièrement adaptées à l'étude des réponses anti-tumorales. Les animaux seront reçus à l'âge de 11 semaines puis mis en acclimatation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les expériences dureront de 13 jours à 2 mois maximum.
Etude de l’effet de la ventilation liquidienne totale sur l’œdème pulmonaire induit par la réanimation cardio-pulmonaire chez le porc
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Quand la circulation ne repart pas au bout de trente minutes de réanimation, le porc est tué. 40 porcs juvéniles de 30 kg vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, tués avant tout réveil, après une chirurgie, un arrêt cardio-respiratoire provoqué, un massage cardiaque et trois heures de surveillance. L'objet est de comparer une ventilation liquidienne totale à la ventilation mécanique classique sur les lésions pulmonaires que la réanimation elle-même provoque. Trente animaux suffiraient au calcul statistique annoncé, dix de plus sont prévus pour couvrir des "pertes chirurgicales ou techniques" que le porteur attribue à la difficulté du modèle.
Objectifs
L’apparition d’une dysfonction respiratoire est fréquente chez les patients réanimés après un arrêt cardiaque. Cette dysfonction s’explique par l’induction d’un œdème pulmonaire lors de la réanimation cardiopulmonaire. Si les compressions thoraciques et la ventilation mécanique sont indispensables pour permettre le retour à une activité circulatoire spontanée, elles peuvent en effet provoquer l’apparition de lésions pulmonaires sévères. Dans ce contexte, l’effet de la ventilation liquidienne totale (VLT) serait une approche thérapeutique pour la prévention de l’apparition de ces lésions, en plus de l’effet neuroprotecteur de l’hypothermie qu’elle est capable d’induire, telle que démontré antérieurement par le laboratoire. En effet, la VLT s’appuie sur un dispositif médical capable d’assurer les échanges d’oxygène et de dioxyde de carbone à chaque cycle respiratoire. L’objectif du présent projet est de comparer l’effet de la VLT et de la ventilation mécanique conventionnelle (VMC) sur les lésions pulmonaires induites après le massage cardiaque. Son effet a été étudié dans des modèles animaux de détresse respiratoire, pour sa capacité à favoriser le recrutement alvéolaire à basse pression et à améliorer les échanges gazeux, mais pas dans le modèle présenté dans ce projet.
Bénéfices attendus
Nous évaluerons les paramètres hémodynamiques (fréquence cardiaque, pression artérielle), gazométriques (pression partielle en oxygène et dioxyde de carbone dans les poumons) et respiratoires. L’intensité des lésions pulmonaires sera quantifiée par analyse histologique. Ainsi nous comparerons les bénéfices entre les différentes modalités de ventilation. La VLT favorisant le recrutement alvéolaire à basse pression et améliorant les échanges gazeux, nous supposons que les 2 groupes soumis à la VLT présenteront des bénéfices supérieurs par rapport au groupe VMC.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale et à un arrêt cardio-respiratoire. Des prélèvements sanguins à l'état anesthésié seront réalisés tout le long de la procédure. Les animaux seront mis à mort au terme des 3 heures de suivi après le début réanimation cardio pulmonaire.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les échecs de réanimation sont possibles chez tous les animaux, puisque cela fait partie des conséquences d’un arrêt cardiaque. En cas d’absence de reprise de la circulation spontanée au bout de 30 min, la réanimation cardiopulmonaire sera interrompue. La mise à mort sera réalisée dans ce contexte précis.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de protocole.
Remplacement
L’arrêt cardiaque induit une dysfonction de plusieurs organes après la réanimation. Le caractère intégratif de l’affection ne permet pas de la reproduire in vitro ou in silico (absence de Remplacement possible). L’étude de médicaments ou dispositif permettant de lutter contre ses séquelles doit se faire in vivo, en utilisant des animaux à des fins scientifiques.
Réduction
Le critère de jugement principal sera la compliance pulmonaire. D’après des travaux préliminaires, considérant une compliance pulmonaire en fin de protocole de 0,72 ml/cmH2O/kg dans le groupe « ventilation conventionnelle » et une compliance pulmonaire de 1,11 ml/cmH2O/kg dans les groupes « ventilation liquide », il faudra 10 animaux dans chacun des 3 groupes. Le calcul a été déterminé par une approche statistique. Ce calcul permet d’utiliser le nombre d’animaux le plus faible possible pour conduire le projet présenté. Des pertes chirurgicales ou techniques sont possibles chez 10 animaux correspondant à 30% de l’effectif total pour le modèle porcin d’arrêt cardiaque, compte tenu de la difficulté du modèle. Nous envisageons donc d’inclure un total de 40 animaux.
Raffinement
Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés dans des boxes avec des copeaux de bois au sol et enrichissement avec des jouets en plastique. Les animaux seront maintenus sous anesthésie générale, avec administration d’antalgiques puissants, tout au long de la procédure.
Choix des espèces
Notre choix s’est porté sur l’espèce porcine compte tenu de sa proximité avec l’homme au vu de sa masse corporelle, de son anatomie cardiaque et des valeurs usuelles des paramètres hémodynamiques systémiques et cérébraux. Porcs juvéniles de 30 kg car à ce poids les porcs sont plus manipulables. Les valeurs des paramètres hémodynamiques étudiés sont similaires aux valeurs observées chez l’homme.
Etude de la fixation d’anticorps thérapeutiques sur les cellules sanguines de souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tuées sans reprise de conscience par le prélèvement lui-même, 200 souris vont être utilisées dans une procédure unique de quelques minutes, une ponction du cœur sous anesthésie. Le porteur explique qu'après cette ponction le volume sanguin restant ne permet pas à l'animal de survivre dans de bonnes conditions. Le sang recueilli est mis en commun pour tester la fixation d'une série d'anticorps sur les cellules sanguines de souris, première étape d'un programme visant un traitement des caillots accompagnés d'inflammation. Sur le remplacement, il écrit que des expériences de laboratoire seront faites "autant que possible", puis qu'il reste "nécessaire" de tester la fixation des anticorps sur des cellules sanguines de souris.
Objectifs
Le but du projet est de développer un traitement innovant visant à lutter contre les phénomènes de caillots sanguins avec inflammation. Nous travaillons plus particulièrement sur les mécanismes de l’agrégation entre les globules blancs et les plaquettes lors de la thrombose. L’objectif du programme de recherche vise à démontrer la preuve de concept préclinique en utilisant notre molécule. Le but de ce projet est de tester la fixation de nos molécules sur les cellules sanguines de souris.
Bénéfices attendus
Nous avons pour objectif à court terme de développer une molécule bloquant les interactions excessives et anormales entre les globules blancs et les plaquettes sans augmenter le risque de saignement. Cette approche est une stratégie thérapeutique particulièrement innovante et unique. Elle pourrait représenter un traitement possible pour certaines maladies cardiovasculaires et auto-immunes.
Procédures
Les souris seront anesthésiées, un prélèvement sanguin sera réalisé en ponction intracardiaque sous anesthésie . Il s'agit d'une procédure sans réveil. Une seule procédure par animal (occurence par animal de chaque intervention => 1 fois) pendant une durée de quelques minutes.
Impact sur les animaux
Une injection intrapéritonéale d'anesthésique (qui peut entrainer un stress et une douleur légère de courte durée).
Devenir
La ponction cardiaque nécessite la mise à mort de l’animal car le volume sanguin restant ne sera pas suffisant pour que l’animal survive dans de bonnes conditions.
Remplacement
Des expériences au laboratoire seront réalisées pour remplacer autant que possible les expériences pour lesquelles des souris doivent être utilisées. Il est cependant nécessaire de tester la fixation des anticorps sur des cellules sanguines de souris.
Réduction
Les molécules susceptibles d’être évaluées dans cette étude de fixation des anticorps aux cellules de sang de souris murines seront évaluées en amont afin d’en diminuer le nombre. En effet, les molécules n’ayant pas les propriétés requises seront écartées. L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Un nombre minimal d’animaux par expérience est utilisé afin de pouvoir exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Le sang des animaux sera collecté et poolé afin de pouvoir tester la fixation d’une série d’anticorps. Le nombre d’animaux a été calculé de manière à obtenir une quantité suffisante de sang pour chaque expérience.
Raffinement
Nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation. Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons) Quarantaine et acclimatation : après réception dans l’animalerie, les souris sont acclimatées pendant 6 jours avant la procédure expérimentale. Pendant cette période, le personnel de l’animalerie surveille leur bien-être quotidien.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme le modèle de choix, en raison de ces similarités génétiques et physiologiques proches de l'homme. Les animaux C57BL/6 seront des adultes âgés de 8 à 20 semaines. Il s’agira de mâles et de femelles. Cette tranche d’âge se justifie par les modèles de pathologie qui seront utilisés pour la suite du projet.
Cinétique microglie AVC
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
182 souris vont être utilisées, dont 152 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. 128 d'entre elles subissent un accident vasculaire cérébral provoqué par injection de thrombine, une intervention d'une heure et demie, suivie d'IRM, certaines recevant en plus un cathéter intraveineux, des microparticules d'oxyde de fer ou des injections de microglie fluorescente. Le porteur indique un affaiblissement de la patte avant gauche, une perte de poids et des déficits fonctionnels ou cognitifs possibles, avec un suivi allant jusqu'à trente jours après l'accident. L'effectif retenu inclut 15 % d'animaux comptés pour l'entraînement des expérimentateurs et les pertes, marge chiffrée puis rapportée à l'"aisance" des équipes.
Objectifs
L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale responsable de déficits à long terme. La majorité des études précliniques sur l’AI se sont concentrées sur des temps précoces et sur la mesure du volume de la lésion, définitif 24 à 48 heures après le début de l'AVC, comme critère d'évaluation principal. Cependant, l'AI peut être considéré comme une maladie chronique. En effet, les patients peuvent souffrir de séquelles des mois, voire des années après la phase aigüe. Ainsi, au moins 1/3 des patients développent une dépression et une fatigue en post-AVC. L'origine de ces symptômes n'est pas claire et peut être difficile à traiter, ce qui en fait une priorité de la recherche sur l'AVC. Malgré cela, nos connaissances sur les phases subaiguës et chroniques de l'AI sont très limitées à ce jour. Il a été suggéré que l'apparition de la dépression et de la fatigue post-AVC pourrait être liée à une dérégulation de la réponse immunitaire. La microglie joue un rôle dans la modulation de la neurogenèse et de l'angiogenèse post-AVC. Dans ce projet, nous examinerons la cinétique temporelle et la dynamique spatiale de la microglie après un accident vasculaire cérébral dans les phases aigues et chroniques post-AVC. Une meilleure compréhension de la dynamique microgliale post-AVC pourrait conduire à l'identification de nouvelles stratégies ciblant la microglie pour combattre les séquelles à long terme.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension de la dynamique microgliale post-AVC pourrait conduire à l'identification de nouvelles stratégies ciblant la microglie pour combattre les séquelles à long terme.
Procédures
Une partie des animaux recevra une injection d'un agent dépletant la microglie (n=48, durée de la procédure 15min) pour étudier l'impact de la dépetion. Une partie des animaux (n=64) recevra une injection 24 heures avant AVC d'un agent fluorescent et de microbilles fluorescentes (durée de la procédure : 1 heure) pour étudier la dynamique de la microglie et ses interactions avec les macrophages périvasculaires et des méninges. Une partie des animaux fera l'objet d'une pose de cathéter intraveineux 24 heures avant AVC pour l'injection de MPIO (microparticules d'oxyde de fer) (n=10, durée de la procédure : 15 minutes) pour évaluer la dynamique de la microglie. Le modèle d'ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine sera réalisé sur 128 animaux (durée de la procédure 1,5 heures) et les lésions cérébrales seront évaluées par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=128, durée de la procédure : 15min). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en imagerie IRM à J7, J15, J30 post-AVC pour évaluer la localisation de MPIO et donc la localisation de la microglie. Une partie des animaux recevra une injection de microglie fluorescente (n=60, durée de la procédure 1h). Une partie des animaux (n=10) sera suivi en microscopie biphotonique à A 2h, J2, J15, J30 post-AVC pour observer la dynamique de la microglie.
Impact sur les animaux
Chirurgies : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC. Ils peuvent également présenter une perte de poids, du stress, des déficits fonctionnels et/ou cognitifs. Injections : certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la réalisation du geste qui disparait dans les jours suivant la procédure. Imagerie : Certains animaux peuvent montrer des signes de stress lié à la nuisance sonore durant les procédures d'imagerie, une perte de masse corporelle après les anesthésies.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveaux pour analyses ultérieures.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques. Afin d'avoir une idée de la numérotation des groupes, un test de numérotation a été effectué. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les AVC ischémiques. Les souris utilisés seront âgées de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Effets neuromodulateurs d’une stimulation électrique transpinale non-invasive à courant continu sur la Sclérose Latérale Amyotrophique. Etude sur la souris SOD1(G93A).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à six heures de chirurgie et d'enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde, une partie des 820 souris utilisées est tuée sans reprise de conscience, 340 d'entre elles relevant de procédures sans réveil et 480 d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de virus dans un muscle ou une stimulation électrique de la moelle épinière de quinze minutes. Toutes portent une mutation reproduisant la sclérose latérale amyotrophique et sont tuées entre 45 et 55 jours pour que la moelle épinière soit prélevée, le porteur précisant aussi que la mise à mort évite de "laisser les symptômes moteurs se développer". La stimulation transpinale est présentée comme une méthode "non-invasive et non douloureuse" pour de futurs patients, alors que l'évaluer suppose ici d'ouvrir et de tuer des souris.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), appelée aussi Maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative touchant spécifiquement des cellules de la moelle épinière, appelées motoneurones, qui commandent les muscles. La maladie se déclare à l’âge adulte, elle provoque la paralysie du patient et son issue est fatale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. La stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS) est une méthode non-invasive et non-pharmacologique, qui agit sur les cellules de la moelle épinière, et dont les effets bénéfiques ont déjà été montrés en réhabilitation motrice, dans le traitement du syndrome de la jambe sans repos, et dans le traitement de la douleur. Le présent projet a pour objectif d'étudier si la tsDCS peut aussi avoir une éffet bénéfique dans le traitement de la SLA. Cette étude sera réalisée dans un modèle murin de la SLA. Comme cette étude implique non seulement les cellules qui commandent les muscles mais aussi les cellules environnantes qui jouent un rôle important dans l'évolution de la maladie (autres neurones et cellules gliales dans la moelle épinière, cellules musculaires), il est nécessaire d'effectuer l'étude sur des animaux afin de préserver les relations anatomiques et fonctionnelles entre ces différents types de cellules. Il n'y a pas, pour ce projet, d'alternative à l'utilisation d'animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de démontrer si la tsDCS a un effet bénéfique ou non sur les cellules de la moelle épinière qui commandent les muscles (motoneurones) à un stade précoce de la SLA. Dans le cas où l'évolution de la maladie serait ralentie dans les motoneurones par la tsDCS, nous pourrions proposer cette méthode non-invasive et non douloureuse comme moyen thérapeutique utile dans la prise en charge des patients SLA.
Procédures
Stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS) sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure 15 minutes et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal. Chirurgie et enregistrements électrophysiologiques sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure au total 6 heures environ et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal. Injection intramusculaire d'un virus sous analgésie et anesthésie profondes: cette intervention dure 15 minutes et ne sera réalisée qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Certains animaux recevront une injection intramusculaire. La douleur éventuelle générée par cette injection sera prévenue par un traitement antidouleur qui sera donné systématiquement avant l'injection, et pendant les deux jours qui suivent durant lesquels les animaux seront surveillés afin de vérifier qu'ils ne présentent aucun signe de souffrance. Toutes les autres interventions (chirurgie et électrophysiologie, tsDCS) seront réalisées sous analgésie et anesthésie profondes pour éviter toute douleur, et les animaux seront mis à mort dès la fin de l'intervention en maintenant la profondeur de l'analgésie et l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de pouvoir prélever la moelle épinière et l'étudier, et pour ne pas laisser les symptômes moteurs se développer.
Remplacement
L'étude des effets de la tsDSC sur les propriétés électriques des motoneurones ne peuvent s'étudier que sur l'animal vivant entier pour plusieurs raisons: 1°) la SLA est une maladie de l'adulte, or à ce stade les motoneurones spinaux, qui sont les plus grandes cellules du système nerveux central, ne peuvent pas s'étudier dans des systèmes cellulaires in vitro dans lesquels ils ne survivent pas (tranches de moelle épinière, moelle épinière entière ex-vivo). 2°) Les propriétés des motoneurones spinaux dépendent étroitement de leur environnement cellulaire en particulier des circuits spinaux, des astrocytes (mais aussi des oligodendrocytes et des cellules gliales) et de leur interaction avec les fibres musculaires à la périphérie. 3°) Les lignes de champ électrique produites par la tsDSCT dépend étroitement des propriétés électriques et géométriques des tissus environnants les motoneurones et la moelle épinière.
Réduction
Chaque procédure est conçue pour apporter le plus possible de résultats avec des lots dont les effectifs ont été réduits au minimum pour obtenir des résultats fiables. Les données obtenues dans chaque procédure seront soumises à des analyses statistiques modernes qui permettront de déterminer quels sont les effets de la stimulation tsDCS sur les différents paramètres considérés.
Raffinement
Les expériences sont conçues pour apporter le moins d'inconfort possible aux animaux. Toutes les interventions (stimulation électrique transpinale à courant continu, injection intramusculaire de virus, chirurgie et enregistrements électrophysiologiques) seront réalisées sous analgésie et anesthésie profondes. Un traitement antidouleur sera donné systématiquement avant l'injection intramusculaire d'un virus, et pendant les deux jours qui suivent l'injection pendant lesquels les animaux seront surveillés afin de vérifier qu'ils ne présentent aucun signe de souffrance. Dans les autres interventions, sans réveil, la profondeur de l'analgésie et de l'anesthésie seront surveillées en continu en utilisant des points limites appropriés. Si la souffrance ne pouvait pas être soulagée, les animaux seraient immédiatement mis à mort. De plus, les expériences sont conçues pour obtenir le plus d'informations possibles sur chaque animal.
Choix des espèces
La découverte d’un lien génétique chez certains patients a permis de développer des modèles murins de la SLA. Nous utiliserons ici des souris transgéniques modèles de la SLA. Histologiquement, ces souris présentent une dégénérescence progressive des neurones moteurs spinaux et aussi des neurones du cortex moteur, reproduisant les atteintes spinales et corticales caractéristiques de cette maladie. Cette souris est un modèle de choix pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la SLA et l'effet de thérapies potentielles, comme dans ce projet, la stimulation électrique transpinale à courant continu (tsDCS). Les trois procédures du projet se termineront lorsque les souris seront âgées de 45 à 55 jours. Dans cette tranche d'âge, les animaux sont adultes mais les symptômes moteurs de la SLA ne sont pas encore apparus. Nous voulons en effet étudier les conséquences électrophysiologiques et cellulaires d'une stimulation tsDCS chez un animal mature (adulte) avant l'apparition des symptômes.
Evaluation de déterminants moléculaires de la transformation d’un cancer cutané de type A en un cancer de type B plus agressif dans un modèle souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si un carcinome épidermoïde peut se transformer en carcinome à cellules de Merkel, un cancer cutané dont la survie à cinq ans atteint 40 %, 80 souris immunodéficientes reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines. Celles qui développent des tumeurs sont ensuite injectées trois fois par semaine dans l'abdomen, avec une molécule inhibitrice ou un produit témoin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur alterne les côtés d'injection pour éviter la douleur répétée au même point et donne des cacahuètes en récompense après le geste. Toutes les souris tumorisées sont ensuite tuées pour l'examen histologique de la tumeur, l'usage d'un "modèle murin immunodéficient" étant présenté comme "indispensable" faute d'autre matériel que des lignées tumorales humaines.
Objectifs
Le carcinome à cellules de Merkel (CCM) est un cancer neuroendocrine primitivement cutané, rare et agressif dont le taux de survie à 5 ans n’est que de 40%. L’intégration du génome d’un virus appelé Polyomavirus à cellule de Merkel ou l’exposition aux UV induit la transformation neuroendocrine d’une cellule saine en cellule tumorale de type neuroendocrine. Dans certains types tumoraux, le phénotype neuroendocrine est associé à une aggresivité tumorale accrue. A ce jour, la cellule dans laquelle a lieu la transformation reste inconnue. Des résultats préliminaires de notre équipe suggèrent que les CCM UV-induits dériveraient d’un autre type de tumeur cutanée appelé carcinome épidermoïde (CE) suite à l’acquisition d’altérations génétiques et épigénétiques. L’objectif de ce présent projet est de déterminer si les dérégulations génétiques et épigénétiques permettent la transformation d’un CE en CCM.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’impact de différents facteurs moléculaires de la transformation neuroendocrine. Les enjeux sont doubles : i) physiopathologique en permettant une meilleure caractérisation des étapes précoces du développement tumoral et ii) diagnostique et thérapeutique par l’identification des facteurs moléculaires précoces contribuant au développement des CCM qui favoriseront la prise en charge diagnostique des patients et pouvant conduire à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentiellement utilisables en clinique.
Procédures
Des injections sous cutanées de cellules de carcinome épidermoïde (CE) seront réalisées aux souris vigiles afin d’établir le modèle tumoral. Par la suite, les animaux présentant des tumeurs seront injectés 3 fois par semaine avec une molécule inhibitrice ou avec un contrôle par voie intrapéritonéale. Ces deux types de gestes ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront subir un stress lors de la contention pour les injections en intrapéritonéales ou lors des pesées. Une douleur peut également survenir au point d’injection.
Devenir
L’évaluation histologique de la tumeur pour évaluer son caractère neuroendocrine impose la mise à mort de l’ensemble des souris tumorisées, mise à mort réalisée après sédation.
Remplacement
Afin d’étudier l’impact des différents déterminants moléculaires sur le phénotype tumoral et l’agressivité tumorale, l’évaluation sur modèle murin est obligatoire.
Réduction
L’utilisation d’une dose unique de molécule inhibitrice (précédemment utilisée par notre équipe dans le cadre d’expérimentations animales précédantes) nous permet de réduire le nombre de groupes d’animaux et ainsi le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les injections en intrapéritonérales sont rapides et peu douloureuses, le geste technique est déjà maitrisé au sein de notre laboratoire. De plus, bien que les injections soient fréquentes (une injection tous les deux jours), elles se feront en alternance entre le côté gauche et le côté droit pour éviter d’engendrer des douleurs répétées au même point d’injection. Après les injections intra-péritonéales de molécule inhibitrice, les souris recevront sous forme de récompense des friandises (cacahuètes en coque). Une sédation précèdera la mise à mort afin de limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Le seul modèle disponible étant des lignées tumorales humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris immunodéficientes utilisées sont un modèle de référence dans les études de xénogreffes. Les souris seront receptionnées à l’âge de 6 semaines, et utilisées à 7 semaines, après leur semaine d’acclimatation. Elles seront ainsi dans un stade physiologique de croissance, stade utilisé usuellement dans ce modèle de xénogreffe.
Etude de l’impact de la surexpression de la fascine sur la carcinogenese hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
160 souris vont être utilisées pour une seule injection dans l'orbite de l'œil, longue de moins d'une minute, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles peuvent développer des dysfonctionnements hépatiques et subir une gêne oculaire, puis toutes sont tuées pour que le foie et les autres organes cibles soient prélevés. L'objet déclaré est de vérifier si une protéine, la fascine, favorise le développement des cancers du foie pédiatriques. Le bénéfice annoncé se limite à "envisager le développement de nouvelles thérapeutiques", quand le porteur affirme que la culture cellulaire est "loin d'être un modèle représentatif" et qu'un "modèle physiologique complet" reste requis.
Objectifs
Notre travail au laboratoire s’intéresse particulièrement aux cancers du foie pédiatriques qui sont mutés pour une protéine qui favorise le développement des tumeurs. Une des cibles de cette protéine a un impact délétère sur la formation des canaux biliaires, structure importante dans la sécrétion de la bile dans le foie. Notre premier objectif est d’étudier ce phénomène chez l’animal pour voir les effets sur l’organisme en entier. Notre deuxième objectif est de vérifier l’implication de cette protéine dans le développement des tumeurs du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de confirmer le potentiel oncogénique de notre protéine d’intérêt et ainsi envisager le développement de nouvelles thérapeutiques pour les cancers hépatiques.
Procédures
Les animaux subiront une injection retro-orbitale rapide (moins de 1 minute) ,160 animaux concernés.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un stress dû à la contention/préhension des animaux,2/ une gêne oculaire suite à l’injection en retro-orbitale, 3/ Les souris pourront développer des dysfonctionnements hépatiques.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de prélever les organes cibles et ainsi réaliser les analyses protéiques et histologisques nécessaires à la conclusion de l'étude La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques
Remplacement
Tous les tests cellulaires in vitro réalisés en amont de cette étude montrent les rôles importants de notre protéine d’intérêt dans les cancers du foie. Toutefois la culture de cellules in vitro est loin d’être un modèle représentatif, le microenvironnement tumoral permettant l’interaction des systèmes physiologiques avec la tumeur manque et nous éloigne de résultats pouvant directement être bénéfiques en clinique chez l’homme. Afin de confirmer nos premières observations in vitro nous devons donc avoir recours à un modèle physiologique complet et fonctionnel pour cette dernière étape : le modèle animal
Réduction
Nous combinerons nos lots témoins dans le but de restreindre le nombre d'animaux. Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes.
Raffinement
Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (administration d’analgésiques et anesthésiques en pré et/ou postopératoire), mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de critères d’arrêt)
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris immunocompétentes âgées de 8 à 12 semaines, modèle animal qui permet un développement reproductible des tumeurs avec un microenvironnement efficient, gage d’utilisation de moins d’animaux pour nos expériences
Utilisation de nouveaux outils moléculaires visant à retarder le déclin cognitif dans un modèle de souris Alzheimer 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
555 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses biochimiques ou histologiques. Chacune subit une chirurgie du crâne d'environ quarante-cinq minutes pour qu'un virus soit injecté dans le cerveau, puis des tests comportementaux quotidiens de un à huit jours, dont un conditionnement à la peur par chocs électriques de 0,4 mA appliqués une seconde. Une partie de ces souris est transgénique et modélise la maladie d'Alzheimer, l'objectif étant de tester trois molécules candidates censées retarder le déclin de la mémoire. Le porteur qualifie la douleur du conditionnement de "fugace" et écrit qu'elle n'induit "aucune douleur ni mal-être durables", tout en affirmant que l'évaluation de la mémoire "ne peut se faire que sur des animaux".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative, touchant environ un million de personnes en France. On estime environ 225 500 nouveaux cas diagnostiqués chaque année. A l’heure actuelle, il existe quatre traitements disponibles dont la Rivastigmine et la Mémantine. Néanmoins, ces molécules ne traitent que les symptômes de la maladie d’Alzheimer et ne permettent pas de guérir ou de stopper la progression de la maladie. Au bout de quelque années ces traitements deviennent donc inefficaces et la balance bénéfices/risques n’est plus positive dû aux effets secondaires de ces molécules (troubles digestifs, cardiovasculaire, insomnie etc.). Comprendre et traiter les mécanismes sous-jacents à la maladie d’Alzheimer est donc d’intérêt public. La maladie d’Alzheimer se caractérise par un déficit précoce de la mémoire épisodique, qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Ce type de mémoire repose en partie sur le processus de pattern separation, qui permet la discrimination de souvenirs plus ou moins similaires. Des défauts en pattern separation ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. De plus, la mémoire de travail (court terme ; ex : retenir un numéro de téléphone) est une des premières atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Ces troubles cognitifs sont associés à une dysfonction précoce du cortex et de l’hippocampe, impliqués respectivement dans la modulation de la mémoire de travail et du pattern separation. Notre équipe a récemment découvert des molécules qui améliorent le pattern separation chez la souris adulte saine, sans aucun effet délétère. Nous souhaitons maintenant tester l’effet de ces molécules dans des tests comportementaux permettant d’évaluer le pattern separation et la mémoire de travail, chez des souris transgéniques modèle pour la maladie d’Alzheimer. Les expériences seront réalisées dans 2 établissements utilisateurs différents. L’ensemble de ces analyses comportementales nous permettra de tester et valider l’effet nos molécules candidates sur l’amélioration de la mémoire dans des modèles murins sain et de vieillissement pathologique, afin de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus exprimant une de nos molécules candidates, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris contrôles. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer avec ce même virus à 4-5 mois ou 8-9 mois, nous espérons retarder l’apparition du déclin cognitif précoce (6 mois) ou retarder son évolution (10 mois). En testant 3 molécules candidates, nous espérons identifier le meilleur candidat afin de restaurer à la fois le pattern separation et la mémoire de travail affectés chez les souris modélisant la maladie d’Alzheimer. Ce projet permettra donc la mise en évidence et la caractérisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les résultats obtenus nous permettrons d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Nous souhaitons tester des molécules candidates chez la souris adultes et les utiliser ensuite chez des souris modélisant la maladie d'Alzheimer, afin de retarder le déclin cognitif. Pour se faire, nous injecterons directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus (maximum 1µl). La durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux évaluant la mémoire épisodique et la mémoire de travail. Le test de conditionnement à la peur peut générer de la douleur (faible et brève) et de la peur. Ces tests comportementaux sont d’une durée allant de 1 à 8 jours. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate injectée.
Impact sur les animaux
1) Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique pour injecter des virus dans une zone précise du cerveau, impliquée dans le pattern separation. Cette chirurgie, rapide et standardisée entraîne une douleur post-opératoire légère pendant environ 48h, qui sera suivie et contrôlée. Les virus injectés n’ont aucun effet dommageable connu ou prévisible sur l’animal. 2) L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Le test de conditionnement à la peur nécessite l’utilisation de charges électriques très brèves et de faible intensité, suffisants pour intaurer de la peur uniquement liée au contexte du test et de la douleur fugace chez l’animal, mais n’induisant aucune douleur ni mal-être durables.
Devenir
A l’issu de chaque procédure les animaux seront euthanasiés et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou biomoléculaire au comportement. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en culture en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. De plus, ce projet fait suite à un projet déjà réalisé dans le laboratoire pour lequel des données préliminaires sur animaux sains sont encourageantes. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux. Par ailleurs, nous utiliserons les mêmes animaux pour tous les tests comportementaux avec une évaluation de l’état de l’animal avant le début de chaque test. Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés lors des tests comportementaux, nous n’utiliserons qu’un groupe contrôle pour les tests concernant les souris modèles pour la maladie d'Alzheimer, ce qui nous permet de passer de 7 groupes de souris à 4 groupes.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Les animaux provenant de notre institut sont tous transportés entre les établissements, qui se trouvent dans le même bâtiment, sur des chariots en limitant au maximum bruits et secousses. Le transport est réalisé au moins une semaine avant le début des expérimentations pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire les biais expérimentaux liés au stress du transport. De plus, les animaux seront placés dans la salle de test 30 minutes avant le début des tests comportementaux pour les acclimater. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal (carrés de cellulose + papier kraft), surveillés régulièrement et des points limites de l’établissement et du projet suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un anesthésique gazeux pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite (e.g. administration d’un antalgique si l’animal est prostré, désinfection d’une plaie paraissant infectée, injection de glucose si l’animal perd trop de poids malgré la nourriture humide mise à disposition dans sa cage, chambre de réveil chauffée à 30°C, etc…). Nos animaux sont habitués à la manipulation 7 jours avant le début des tests comportementaux et ils sont pesés et observés tous les jours lorsqu’ils sont en test comportemental. Si une perte de poids et/ou l’animal paraît faible, froid, prostré etc., de la nourriture humidifiée est mise à disposition dans la cage. Si l’état de l’animal se dégrade, nous effectuons une injection de glucose 5% et nous demandons l’avis du vétérinaire référent. Pour réduire la peur et la douleur dans le test du conditionnement à la peur, le choc électrique est réduit à une durée (1 sec) et une intensité (0.4 mA) minimales.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. Les lignées sélectionnées pour notre projet sont déjà bien référencées et caractérisées. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier le pattern separation et la mémoire de travail chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous souhaitons utiliser un seul stade de développement pour la procédure 1. En effet nos virus nécessitent 4 semaines pour s’exprimer totalement au sein de la structure cérébrale d’intérêt. Il est donc nécessaire d’utiliser des animaux âgés de 4-5 mois pour pouvoir étudier le comportement et la morphologie chez la souris adulte âgées d’au moins 5-7 mois. Pour la procédure 2, nous souhaitons utiliser 3 stades de développement différents. Les souris saines seront injectées avec nos virus à l’âge de 6 semaines pour être testées à 10 semaines en comportement, afin de répliquer les résultats obtenus précédemment chez les souris adultes de 10 semaines injectées avec une molécule candidate à 6 semaines (amélioration du pattern separation). Les souris modèles pour la maladie d'Alzheimer seront utilisées de 4 à 7 mois et de 8 à 11 mois. En effet, nous voulons injecter nos souris Alzheimer avant l’apparition du déclin cognitif précoce (4-5 mois) ou tardif (8-9 mois) et les tester à des âges subséquents (5-7 mois ; 9-11 mois) pour évaluer l’effet de nos protéines candidates sur la prévention du déclin cognitif.
Élevage de souris transgéniques utilisées pour l’étude du rôle des cellules immunitaires dans le développement des maladies inflammatoires de la peau
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Un fragment de queue de moins de cinq millimètres est coupé aux ciseaux au moment du sevrage, et les phalanges sont tatouées pour identifier chaque animal. 5 200 souris vont être utilisées dans cet élevage de douze lignées génétiquement modifiées, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus faible. Le porteur décrit pourtant une rigidification progressive de la peau à partir de quarante semaines, avec perte de mobilité et démangeaisons, et, chez les lignées dépourvues de certaines cellules immunitaires, des infections pouvant évoluer vers une dégradation brutale de l'état général et une atteinte sévère de l'organe touché. Les souris de mauvais génotype sont tuées immédiatement, les reproductrices deux mois après leur dernière portée, les autres à vingt ou trente semaines selon le sexe, et celles qui conviennent partent vers d'autres protocoles expérimentaux.
Objectifs
Ce projet explore le rôle des cellules du système immunitaire dans la régulation de l’inflammation de la peau en condition normale et au cours des maladies inflammatoires cutanées. Ces maladies, dont les causes sont mal connues, sont caractérisées par l’apparition d’une inflammation et d’une modification de la structure de l’organe. Ceci affecte la peau notamment, mais aussi possiblement d’autres organes comme les poumons, le cœur et les reins. Une dérégulation du système immunitaire est aussi souvent associée à cette maladie. Dans ce contexte, nous souhaitons utiliser des lignées de souris comme modèle d’étude de l’inflammation cutanée et les combiner avec des lignées de souris dépourvues de certains types de cellules immunitaires ou au contraire nous permettant de suivre ces cellules dans les souris. L'objectif de ce projet est donc la description des élevages de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées, des méthodes d’identification (tatouage aux phalanges) et de détermination des gènes modifiés par technique invasive (biopsie de queue) en deux temps nécessaires à la préservation de l’intégrité des oreilles (organe d’intérêt pour nos expériences), ainsi que des méthodes de raffinement mises en place. Les animaux produits dans ce projet seront utilisés dans d’autres projets de recherche fondamentaux mais aussi à visée thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre l’élevage des lignées de souris nécessaires pour étudier le rôle des cellules du système immunitaire dans la régulation de l’inflammation de la peau et comment ces cellules, lorsque dérégulées, peuvent participer à l’apparition de modification de la structure de la peau. Au-delà des aspects de recherche fondamentale, l’utilisation de ces lignées de souris pourraient nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de ce type maladie.
Procédures
Ce projet consiste en l'élevage de 12 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées comme modèles d’étude de maladies inflammatoires de la peau et/ou dépourvues de certains types de cellules du système immunitaires. Un fragment de tissu sera prélevé au niveau de la queue (moins de 5mm) au moment du sevrage (à 3-4 semaine, âge de séparation d'avec la mère) à l’aide de ciseaux préalablement désinfectés (durée du geste: 10 secondes) pour déterminer les gènes modifiés dans chaque souris.
Impact sur les animaux
La coupure d’un bout de la queue nécessite de tenir les souris, source de stress, et peut conduire à un léger saignement. Le développement progressif des modifications de la structure de la peau peut entrainer un inconfort pour les souris et une perte de mobilité (phénomène observé 40 semaines après la naissance) dû à la rigidification progressive de la peau ; ainsi qu’une réaction inflammatoire locale source de démangeaison. L’absence de certains types de cellules du système immunitaire peut peut augmenter la vulnérabilité aux infections par des microbes, qui restent cependant très rare en condition d’élevage dans les laboratoires, puisque l’atmosphère est contrôlée pour éviter l’entrée des microbes. Dans certains cas les signes cliniques restent modérés, mais l’infection peut évoluer rapidement vers une dégradation brutale de l’état général, un amaigrissement et une réduction musculaire marquée, et une atteinte sévère de l’organe atteint puisque les souris ne sont pas capables de se débarrasser de l’infection.
Devenir
Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).
Remplacement
L’étude à l’échelle du tissu et de l’organisme est indispensable pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’inflammation de la peau au cours des maladies inflammatoires de la peau. Cette approche globale et intégrative nécessite l’utilisation de modèles animaux qui ne peuvent être totalement remplacés par des approches in vitro. Cependant, dans les études que nous menons, des techniques alternatives (cocultures cellulaires, organes-sur-puce) sont largement employées et remplaceront l’utilisation d’un modèle animal dans la mesure et autant que possible. Ces techniques in vitro permettent de reconstituer dans des boites de culture au laboratoire des organes ou partie(s) d’organes en utilisant différents types de cellules afin d’étudier certains mécanismes sans utiliser d’animaux.
Réduction
Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche de l’équipe. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris en termes de nombre et taille des portées, ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Une attention particulière sera portée à génotyper et sélectionner les animaux de génotypes d’intérêt dès le sexage pour former les groupes expérimentaux dès le sevrage.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront hébergés en portoirs ventilés réglés avec une surpression (nourriture irradiée conditionnée en double emballage) et leur manipulation se fera systématiquement sous une hotte afin d'éviter leur contamination par des microbes. Les souris seront surveillées quotidiennement (par les animaliers) et une fois par semaine par les expérimentateurs afin de détecter des signes de souffrance liés à l’apparition progressive des modifications de la structure de la peau et/ou d’une infection en tenant compte de leur apparence et de leur comportement (activité/mobilité spontanée des souris sans manipulation/attitude prostrée). En cas de suspicion de dégradation de l’état de la souris, une stimulation de la souris (main dans la cage pour entrainer le déplacement de la souris) sera faite afin de vérifier sa mobilité, et d’identifier des réactions de défense/agressivité, signes de douleur). Les contrôles cliniques seront alors rapprochés (tous les 2 jours) et en cas de dégradation de l'état général, la souris sera immédiatement euthanasiée. Des contrôles sanitaires (3 à 4 fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Concernant la méthode pour déterminer les gènes modifiés dans les souris et qui nécessite de couper un petit bout de la queue des souris, nous surveillerons dans les minutes qui suivent le prélèvement l'absence de saignement. Dans le cas contraire, une compression sera réalisée afin de favoriser la coagulation sanguine.
Choix des espèces
Le modèle souris a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. Les modèles murins de maladies inflammatoires de la peau sont largement décrits dans la littérature scientifique. Ils sont robustes et reproductibles et représentent d’excellents modèles des pathologies humaines. De plus, la bonne connaissance des modèles murins, notamment d’un point de vue génétique, permet le développement d’outils (souris génétiquement modifiées) permettant l’étude du rôle des cellules du système immunitaire in vivo, en prenant en compte le microenvironnement tissulaire. Enfin, nous avons une bonne connaissance du comportement de la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement. Les souris seront mises en accouplement entre 6 et 8 semaines d’âge (maturité sexuelle), sans dépasser 20 semaines pour les femelles et 30 semaines pour les mâles au début du croisement.