Recherche fondamentale

900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Ce premier volet d'un projet en deux parties repose sur des chirurgies d'une à six heures, jusqu'à deux par animal, pour implanter des électrodes cérébrales et une canule nasale, suivies de sessions quotidiennes d'enregistrement de deux heures pendant plusieurs mois. Les retombées annoncées concernent les apnées du sommeil et les troubles respiratoires observés dans la maladie d'Alzheimer, alors que l'objet immédiat reste de décrire comment le rythme respiratoire module l'activité des neurones. Le porteur affirme qu'il faut travailler sur des animaux vigiles, ce qui rend selon lui l'étude impossible in vitro, et que les questions posées ne peuvent pas non plus être traitées in silico.

Objectifs

La respiration est intimement liée à la physiologie du cerveau. D’une part, l’activité respiratoire est modulée par les stimuli sensoriels, par l’attention, l’état émotionnel et elle peut être affectée dans certaines pathologies du cerveau. D’autre part, la respiration impacte le fonctionnement cérébral, influençant la perception, les émotions et la cognition en général. Un grand nombre de neurones sensoriels situés dans la cavité nasale sont des mécanorécepteurs sensibles au flux d’air et transmettent le signal de respiration aux structures en aval, dont le bulbe olfactif et de nombreuses régions cérébrales. Ce signal est supposé jouer un rôle important dans la coordination des réseaux neuronaux et pourrait participer aux processus cognitifs dans les phases d’eveil mais aussi pendant le sommeil au cours duquel, entre autres, nous consolidons nos souvenirs. L’objectif général de ce projet est de comprendre la nature du dialogue entre respiration et activité neuronale et en particulier : 1- De comprendre comment la respiration, de par son activité rythmique, influence l’activité neuronale dans le système olfactif et les régions associées 2- De comprendre comment la respiration – de par son rôle dans l’oxygénation du cerveau - influence l’activité neuronale 3- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est identique dans plusieurs lignées de souris sauvages 4- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est déficient dans un modèle de maladie neurodégénérative 5- D’identifier des mécanismes de contrôle de la respiration par l’activité des neurones. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé humaine étant donné que la prévalence des apnées du sommeil dans la population et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies (y compris la maladie d’Alzheimer).

Bénéfices attendus

Notre activité cérébrale est intimement liée à la façon dont nous respirons. La respiration module le fonctionnement cérébral (émotions, attention etc) et notre état cognitif régit en retour notre comportement respiratoire. Cependant les mécanismes impliqués dans ce dialogue sont peu connus. Cette étude apportera des éléments essentiels à la compréhension de cette question. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé étant donné que de nombreuses personnes souffrent d’apnées du sommeil et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies humaines (dont la maladie d’Alzheimer).

Procédures

Les souris seront étudiées lors de l’expression de comportements naturels et spontanés, lorsqu’elles dorment, mais aussi lors de courtes sessions où leur tête devra rester fixée face à un masque à oxygène. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau et son lieu avec la respiration, les souris seront équipés d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). Les enregistrements seront réalisés au maximum une fois par jour pour une durée de 2 heures environ (1h30 pour les expériences tête fixée). Au cours de certains enregistrements, nous ferons légèrement varier le taux d’oxygène présent dans l’atmosphère de la souris (variations

Impact sur les animaux

Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. La respiration sera enregistrée via une canule placée au niveau de la cavité nasale. Ceci nécessite la réalisation de chirurgies sous anesthésie et analgésie avec un impact très limité sur l’animal. Le port des implants suite à ces chirurgies peut générer une légère gêne pour l’animal. De plus, afin de contrôler le taux d’oxygénation des souris, nous devrons les placer dans une enceinte fermée dans laquelle l’atmosphère peut être contrôlée de manière précise. Dans une autre série d’expérience, il nous faudra maintenir la tête des souris au niveau d’un masque à oxygène, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La restriction des mouvements de l’animal pendant ces deux procédures ainsi que les variations de taux d’oxygénation peuvent être légèrement désagréables pour l’animal, tout du moins avant qu’il n’y soit y habitué. Enfin, nous prévoyons d’utiliser des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui parfois présentent des crises d’épilepsie et une mortalité accrue à partir de 4.5 mois.

Devenir

L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Ceci concerne les souris dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements naturels, interagissent avec leurs congénères, explorent, courent ou dorment : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est 900 souris adultes sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris pendant plusieurs sessions d’enregistrement, ceci donnant accès à un jeu de données riche. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique. Pour les expériences visant à tester l’impact de l’oxygénation sur le cerveau, avec différents taux d’oxygénation, une souris sera son propre contrôle car elle sera testée à différent taux d’oxygénation : ce qui augmentera notre puissance statistique et donc le nombre de souris nécessaires. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment à la fixation de tête). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésiques et analgésiques permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Lors des sessions d’enregistrement, les souris seront étudiées alors qu’elles expriment des comportements spontanés et naturels : elles seront exposées à des stimuli sensoriels différents de leur cage d’hébergement ce qui constituera, en soi, une forme régulière d’enrichissement.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction complexe entre cerveau-et respiration, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’influence de la respiration sur les fonctions cognitives a été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme ce qui appuie la pertinence de ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-12 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. L’utilisation de souris >6mois sera notamment réservée aux souris APP-PS1 qui développent un phénotype pathologique uniquement à partir de 3 mois chez les femelles et 6 mois chez les mâles.

Cinq à dix chocs électriques en une séance de douze minutes servent à installer une peur durable chez des souris dont la tête est ensuite fixée pour observer leur amygdale pendant leur sommeil. Les 240 souris du projet sont d'abord opérées une heure et demie à deux heures pour la pose d'un implant, habituées deux semaines à la contention, puis toutes tuées pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie d'entre elles est soumise à un protocole censé produire un phénotype comportemental de stress post-traumatique, que des stimulations optiques doivent ensuite corriger. Le porteur qualifie ces chocs de légers tout en visant une réponse de peur durable, et cite les attentats et la pandémie de COVID-19 parmi les motifs du projet.

Objectifs

Le cerveau relie les informations importantes de notre environnement aux émotions que nous ressentons, ce qui renforce nos souvenirs et facilite leur rappel au bon moment. Ce processus se déroule à la fois lorsque nous sommes éveillés et pendant le sommeil, notamment pendant le sommeil paradoxal (ou sommeil REM). Pendant la journée, nos expériences émotionnelles sont enregistrées, puis consolidées pendant le sommeil. Ce traitement peut réduire l'impact émotionnel de certains souvenirs, d'où l'expression "la nuit porte conseil". Améliorer la qualité du sommeil réduit l'anxiété, le stress et la dépression, tout en augmentant la satisfaction de vie. Les troubles du sommeil paradoxal sont souvent liés à des problèmes émotionnels comme le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Ce projet vise à comprendre comment le sommeil stabilise les souvenirs émotionnels et à explorer de nouvelles pistes pour traiter les souvenirs traumatisants. Nous étudierons le cerveau de souris en utilisant des techniques d'imagerie avancées et en observant leur sommeil pendant des tâches émotionnelles, en nous concentrant sur l'amygdale, une région clé pour les émotions souvent impliquée dans des troubles comme le TSPT.

Bénéfices attendus

Ces dernières années, la France a traversé des périodes difficiles qui ont entraîné une augmentation des troubles psychologiques, notamment le trouble de stress post-traumatique (TSPT). Les attentats terroristes ont laissé des séquelles profondes, non seulement chez les personnes directement touchées, mais aussi dans l'ensemble de la population. Environ 20 % des médecins ayant soigné des victimes d'attentats montrent des symptômes de TSPT. Plus récemment, la pandémie de COVID-19 et le confinement ont aussi augmenté les troubles psychologiques, y compris le TSPT. Le sommeil est crucial pour la santé et la qualité de vie. En France, environ quatre millions de personnes souffrent d'insomnie sévère. Le sommeil aide à apprendre et à consolider les souvenirs. Manquer de sommeil affecte notre capacité à nous concentrer et à retenir des informations. Ce projet vise à comprendre comment le cerveau retient les souvenirs pendant le sommeil et pourquoi certaines personnes, comme celles atteintes de TSPT, ont des difficultés avec leurs souvenirs émotionnels. Nous nous concentrerons sur l'amygdale, une partie du cerveau importante pour les émotions, souvent liée à des problèmes de sommeil.

Procédures

Tous les animaux (240 souris) subiront une intervention chirurgicale (1.5-2 heures) pour l'implantation permettant l'imagerie ou le contrôle optique des populations neuronales dans l'amygdale (neurones excitateurs ou inhibiteurs). Ils suivront ensuite un protocole d'habituation à la fixation de la tête pour l'imagerie à deux photons pendant le sommeil naturel ou aux câbles implantés de manière chronique (2 semaines). Ensuite, un groupe d'animaux (40 souris) subira un processus d'imagerie des populations neuronales de l'amygdale pendant le sommeil immédiatement après un protocole de conditionnement de la peur (durée totale de la procédure: 25 jours). Un deuxième groupe (80 souris) suivra un protocole de contrôle optique d'une sous-population neuronale dans l'amygdale suite à une tâche de conditionnement de la peur (durée totale de la procédure: : 25 jours). Enfin, un troisième groupe subira un protocole de génération de phénotypes comportementaux de TSPT et l'activité de l'amygdale de ces souris sera soit imagée (40 souris) soit contrôlée optiquement pendant le sommeil pour restaurer les performances comportementales normales des animaux (durée totale de la procédure: : 25 jours).

Impact sur les animaux

Les désagréments possibles sont les suivants : 1. Stress lié au génotypage : Lorsqu'on prélève un petit morceau de la queue pour analyser l'ADN, il peut y avoir un léger saignement. Pour y remédier, nous utilisons du tissu hémostatique et désinfectons la zone. 2. Stress dû à l'isolement : Les souris peuvent ressentir du stress et développer des comportements répétitifs lorsqu'elles sont isolées. Pour y remédier, nous enrichissons leur environnement. 3. Stress léger lié aux manipulations : Lorsque les souris sont manipulées par les chercheurs, elles ressentent un stress léger. Cependant, elles s'habituent rapidement à ces manipulations. 4. Complications chirurgicales : Lors des chirurgies, des gonflements, inflammations ou saignements peuvent survenir. Nous utilisons des médicaments spécifiques pour prévenir ces problèmes et appliquons du tissu hémostatique pour contrôler les saignements. 5. Inconfort au réveil après anesthésie : Après les chirurgies, les souris peuvent ressentir un inconfort. Toutefois, grâce à un protocole efficace de médicaments antidouleur et anti-inflammatoires, elles récupèrent rapidement. 6. Gêne liée à l'implant : Les premiers jours après l'installation d'un implant, les souris peuvent ressentir une gêne. Cependant, elles s'y habituent en quelques jours, et au bout de 5 jours, la plupart des souris retrouvent un comportement normal. 7. Perturbations dues à la fixation de la tête : Lors de la fixation de la tête, nous suivons un protocole pour minimiser le stress. En général, les souris retrouvent un cycle de sommeil normal après 5 à 6 jours. 8. Perturbation du sommeil par la lumière : Pendant les expériences d'optogénétique, la lumière utilisée peut perturber le sommeil des souris. Pour réduire cela, nous recouvrons la zone avec un vernis noir pour minimiser les réveils. 9. Perturbations dues au conditionnement à la peur : Lors du conditionnement à la peur, une seule séance de courte durée (12 minutes maximum) est réalisée, avec 5 à 10 chocs électriques légers pour induire une réponse de peur durable.

Devenir

Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie à la fin du deuxième jour de l'expérience.

Remplacement

Bien que des animaux plus simples comme la drosophile, le poisson rouge ou le ver C. elegans soient parfois utilisés pour étudier l'activité du sommeil, ils n'ont pas de sommeil paradoxal, une phase spécifique que l'on trouve chez les mammifères et les oiseaux (et peut-être chez les reptiles). Leur système nerveux est beaucoup moins complexe que celui des mammifères, et donc pas comparable pour comprendre des processus neurologiques complexes. De nouvelles méthodes, comme la modélisation informatique, l'intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puce ou les organoïdes cérébraux, sont prometteuses mais ne remplacent pas encore la souris pour analyser et comprendre les dysfonctionnements du cerveau ou reproduire des observations cliniques liées à des pathologies neurologiques. Notre recherche vise à comprendre comment le sommeil est régulé et ses fonctions sur la physiologie et la cognition. Pour cela, nous avons besoin d'utiliser des animaux vivants et en bonne santé. Les techniques utilisées pour étudier les réseaux neuronaux et les mécanismes complexes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme, car elles nécessitent des interventions invasives et des modifications génétiques ciblées, possibles uniquement chez la souris. Dans ce contexte, l'utilisation de la souris reste essentielle pour mener des études physiologiques et comportementales sur le long terme.

Réduction

Les expériences ont été conçues pour utiliser le moins d'animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Pour chaque type d'expérience, nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaires, en prévoyant une petite marge pour les pertes éventuelles. Par exemple, pour les expériences d'imagerie à 2 photons, nous prévoyons un groupe de 10 animaux, en incluant une marge pour une perte possible de 20 %. Ces calculs sont basés sur des méthodes statistiques reconnues, qui nous aident à déterminer la taille minimale des groupes tout en maintenant la fiabilité des résultats. Une fois les données collectées, elles seront analysées à l'aide de tests statistiques, pour vérifier que les résultats sont significatifs et fiables.

Raffinement

Le projet a été conçu pour minimiser la douleur et le stress des animaux. Hébergement et soins : Les souris seront logées à quatre par cage pour favoriser leurs interactions sociales et réduire le stress. Elles auront un environnement enrichi pour leur bien-être. Après la chirurgie, elles seront placées par deux dans des cages doubles avec un séparateur pour qu'elles puissent interagir sans se nuire. Elles seront surveillées quotidiennement pour s'assurer de leur bonne récupération, avec des ajustements comme des analgésiques si nécessaire. Lorsque l'isolement est nécessaire, nous leur fournirons des matériaux pour construire un nid et ajouterons de nouveaux objets régulièrement pour stimuler leur environnement. Le stress affecte le sommeil, donc nous surveillerons leur comportement et leur sommeil avec des enregistrements polysomnographiques, qui permettent de suivre les cycles de sommeil et les signes de stress. Chirurgie : Toutes les procédures chirurgicales, y compris l'anesthésie et l'analgésie, sont réalisées selon les meilleures pratiques pour minimiser la douleur. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement. Une grille de notation (0 : meilleur état à 2 : état dégradé) évaluera leur état général en se basant sur plusieurs critères tels que le poids, la mobilité, la préparation du nid et l’état du pelage. Si le score atteint ou dépasse 4 pendant 3 jours consécutifs, ou si l’état des animaux se détériore malgré les soins après 7 jours, les animaux seront retirés de l’étude.

Choix des espèces

L’étude des mécanismes neurobiologiques des comportements complexes, comme le sommeil, nécessite l’utilisation d’animaux vivants. Le sommeil paradoxal est commun aux mammifères tels que la souris, le rat et l'homme, avec une organisation cérébrale similaire. Les modèles animaux alternatifs (drosophile, poisson zèbre, Caenorhabditis elegans), bien que populaires, n’ont pas de sommeil paradoxal et ne sont pas pertinents pour nos travaux. Depuis plus de 20 ans, les modèles de souris génétiquement modifiées ont fourni des résultats importants. L'utilisation de ces modèles pour étudier les circuits veille-sommeil est justifiée par la conservation de ces circuits chez les mammifères. Les résultats obtenus sont donc transposables au cerveau humain. En raison des ajustements souvent nécessaires dans les modèles transgéniques, nous utilisons une technique appelée transfection neuronale. Cette méthode consiste à introduire des gènes spécifiques dans les neurones (les cellules nerveuses du cerveau) en utilisant des virus modifiés, afin de mieux comprendre et modifier leur fonctionnement. Cette approche est reconnue comme très efficace pour étudier les fonctions cérébrales. Nous utiliserons des souris de souche standard et des souris transgéniques spécifiques (comme celles portant des gènes pour activer ou inhiber certains neurones) âgées de 10 à 12 semaines au début des procédures. À cet âge, les souris ont atteint leur maturité cérébrale, avec un système locomoteur et un cycle veille-sommeil stabilisés. De plus, l’efficacité de la transfection neuronale est maximale chez les souris jeunes adultes et diminue avec l’âge.

156 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune passant soixante-douze heures puis quatre-vingt-seize heures seule en cage à métabolisme, sur un sol grillagé que le porteur décrit lui-même comme peu confortable. Sept fois, elles sont enfermées deux minutes dans un tube étroit pour une mesure de composition corporelle, la vessie vidée au préalable par massage abdominal. Un régime carencé en potassium leur est imposé et deux prélèvements sanguins sont pratiqués sous anesthésie, avant une chirurgie de quinze minutes sans réveil pour prélever les reins. Le porteur annonce comme bénéfice humain une prise en charge peut-être différente des hypokaliémies féminines, et comme bénéfice pour les animaux non-humains le fait de pouvoir désormais associer les femelles de ses élevages aux expériences.

Objectifs

Au-cours de l’évolution, nous avons considérablement changé nos habitudes alimentaires passant d’un régime riche en potassium et pauvre en sel à un régime (dit régime occidental) diamétralement opposé. Nous sommes actuellement très loin des recommandations de l’organisme mondial de la santé concernant les apports nutritionnels en sodium et potassium. Heureusement nos reins sont là pour nous aider à faire face à ces changements. Cependant, à long terme cette alimentation peut contribuer au développement de maladie comme l’hypertension et être corrélée à un risque accru de mortalité. Il est bien connu que le manque de potassium dans l’alimentation va induire une adaptation :1) le muscle peut relarguer du potassium contribuant rapidement à la modulation du potassium plasmatique et 2) le rein va diminuer sa sécrétion de potassium dans les urines et augmenter sa réabsorption vers le sang. Deux protéines essentielles à l’adaptation à un régime dépourvu de potassium ont été mise ne évidence : un transporteur rénal spécifique et un facteur de croissance,. L’ensemble de ces études ont été réalisé chez le mâle. Cependant une étude récente montre une différence d’adaptation à un régime carencé en potassium entre des souris mâles et femelles. Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium, et en comprendre les différences. L’ensemble des études seront réalisées chez des souris mâles et femelles sauvages ou n’exprimant pas le transporteur rénal spécifique ou le facteur de croissance .

Bénéfices attendus

La prévalence de l'hypertension artérielles est très élevées dans nos populations avec une différence notoire entre les hommes et les femmes (36 pourcents contre 25.2 pourcents - Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire, 2018). Notre étude est un projet original de recherche fondamentale dans le domaine de la physiologie et physiopathologie rénale. Du point de vue des animaux, les résultats permettront de mettre en œuvre un des aspects des 3R, à savoir la réduction puisque nous pourrons associer les femelles de nos élevages à nos expériences. Du point de vue bénéfice humain, les résultats nous permettront de peut-être envisager une prise en charge différente des hypokaliémies féminines. Nos recherches désigneront des protéines importantes, potentielles cibles thérapeutiques, qui pourraient être différentes chez les hommes et les femmes.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons 5 prélèvements urinaires en cages à métabolisme sur animal vigile au cours de 2 sessions en cage spécifique. La première session en cage métabolique implique un hébergement individuel de 72h à raison de 48h d’habituation et 24h pour le recueil. La seconde session dure 96h correspondants à 4 fois 24h pour 4 recueils. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation en continue dans ces cages. Nous effectuerons 7 mesures de la composition corporelle en fluides (masse grasse, masse maigre et eau libre) en utilisant un appareil de résonance magnétique nucléaire dédié à ces mesures . Cette technique est non invasive et n’induit aucune douleur chez l’animal. L’animal est placé délicatement dans un petit tube qui restreint ces mouvements, le tube est placé dans l’équipement de mesures durant 2 minutes, puis l’animal est sorti du tube et replacé dans sa cage. Nous réaliserons également 2 prélèvements sanguins de faible volume réalisés sur des animaux anesthésiés et analgésiés : les 2 prélèvements seront espacés d’environ 11 jours, le geste dure 1min/animal. Enfin, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et analgésie au cours d’une chirurgie sans réveil (15 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables des interventions sont connus car déjà testés chez l’animal. Le régime carencé en potassium est normalement bien toléré. La mise en cage à métabolisme peut entrainer un stress chez l’animal, par le fait qu’elle restreint légèrement la liberté de mouvement des souris et qu’elle impose un hébergement individuel des animaux . Leur structure rend l’ hébergement peu confortable sur une grille. La mesure de Kalièmie nécessite un prélèvement sanguin qui sera fait sous anesthésie et qui peut entrainer une hémorragie. Les risques liés à l’anesthésie sont à prendre en compte, comme par exemple, la survenue d’une l’hypothermie. Certaines souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle par mesure de résonance nucléaire magnétique. Cette procédure peut entraîner un léger stress au moment de la manipulation des souris pour vider leur vessie par massage abdominale et le temps de la mesure (2 minutes ).

Devenir

A la fin de chaque procédure , tous les animaux de la procédure seront euthanasiés par une méthode réglementaire sous anesthésie et analgésie. L'euthanasie des animaux est requise en raison des prélèvements d'organes nécessaire pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

Notre projet vise à comparer l’adaptation rénale de souris mâles et femelles à la restriction en potassium. Cette adaptation met en jeu différents organes qui vont interagir les uns avec les autres via différents stimuli (messages hormonaux, humoraux…). L’analyse d’une telle complexité nécessite de travailler sur des organismes vivants entiers (ici des souris).

Réduction

Pour les procédures mise en œuvre, le nombre de souris par groupe sera de 12 animaux pour une procédure et 14 animaux pour l'autre. Il y aura 6 groupes par procédure soit un total de 156 animaux. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ce chiffre correspond au nombre de souris nécessaires afin de mettre en œuvre les analyses statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans la mesure du possible, un même animal sera utilisé pour la mesure de plusieurs paramètres comme décrit dans les différentes procédures.

Raffinement

Les procédures de raffinement mises en place sont les suivantes : 1) 5 souris maximum par cages en portoir ventilé, dans des conditions d’hébergement conforme à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée 2) Libre accès à l’eau et la nourriture sous forme de croquettes (en hébergement individuel, la nourriture sera en poudre et déposée dans la mangeoire adéquate), 3) Enrichissement par nids végétaux et/ou tunnels en carton ou plastique dans les cages et/ou buchettes en peuplier de taille moyenne, sans traitement chimique et autoclavable (les animaux peuvent les ronger, les déplacer…). Lors du passage en hébergement individuel, étape indispensable pour avoir accès aux métabolites urinaires et à la fonction rénale, les cages sont placées côte à côte afin que les animaux gardent un contact visuel, auditif et olfactif. Nous placerons une petite coupelle en verre de 6 cm de diamètre et de 1cm de hauteur de bord dans la cage qui servira de nid à la souris. Nous avons, au préalable, vérifier que la majorité des souris s’installent dans cette coupelle pour dormir et que cela ne change pas les recueils d’urine ou de fèces. Pour la mesure dans l’appareil à résonnance magnétique nucléaire, les animaux seront habitués à être manipulés et à être placés dans le tube de mesure. Les mesures de kaliémie seront réalisées sous anesthésie totale . L’expérimentateur qui fera ces prélèvements a plus de 10 ans d’expérience. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux subiront une anesthésie sans réveil, avec analgésie. L’ensemble des expériences sera mené par des personnels hautement qualifiés et formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie.

Choix des espèces

L’intérêt d’utiliser des souris est que nous possédons des résultats préliminaires chez cette espèce. De plus les modèles transgéniques que nous voulons étudier existent chez la souris et nous les élevons à l’animalerie. Nous utiliserons des souris adultes mâles et femelles « normales » (dites sauvages) et transgéniques âgées de 8 à 16 semaines. L’âge adulte est nécessaire pour que la néphrogénèse (développement du rein) soit totalement terminée.

Opérées une ou deux fois sous anesthésie, pendant une à six heures, pour l'implantation d'électrodes cérébrales et d'une canule dans la cavité nasale, 900 souris sont ensuite enregistrées jusqu'à deux heures par jour, la tête fixée face à un masque à oxygène pendant une heure trente. Le taux d'oxygène de l'air qu'elles respirent est abaissé par séquences de moins d'une minute toutes les quatre minutes, et des stimulations optogénétiques leur sont appliquées jusqu'à une fois par minute, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les enregistrements se poursuivent quatre mois, jusqu'à dégradation du signal, sur des souris parfois hébergées seules pour protéger leurs implants et, pour une partie du dispositif, sur des souris modèles de la maladie d'Alzheimer qui présentent des crises d'épilepsie et une mortalité accrue à partir de quatre mois et demi. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau, y compris celles dont la canule nasale s'est bouchée.

Objectifs

La respiration est intimement liée à la physiologie du cerveau. D’une part, l’activité respiratoire est modulée par les stimuli sensoriels, par l’attention, l’état émotionnel et elle peut être affectée dans certaines pathologies du cerveau. D’autre part, la respiration impacte le fonctionnement cérébral, influençant la perception, les émotions et la cognition en général. Un grand nombre de neurones sensoriels situés dans la cavité nasale sont des mécanorécepteurs sensibles au flux d’air et transmettent le signal de respiration aux structures en aval, dont le bulbe olfactif et de nombreuses régions cérébrales. Ce signal est supposé jouer un rôle important dans la coordination des réseaux neuronaux et pourrait participer aux processus cognitifs dans les phases d’eveil mais aussi pendant le sommeil au cours duquel, entre autres, nous consolidons nos souvenirs. L’objectif général de ce projet est de comprendre la nature du dialogue entre respiration et activité neuronale et en particulier : 1- De comprendre comment la respiration, de par son activité rythmique, influence l’activité neuronale dans le système olfactif et les régions associées 2- De comprendre comment la respiration – de par son rôle dans l’oxygénation du cerveau - influence l’activité neuronale 3- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est identique dans plusieurs lignées de souris sauvages 4- De déterminer si le dialogue respiration-cerveau est déficient dans un modèle de maladie neurodégénérative 5- D’identifier des mécanismes de contrôle de la respiration par l’activité des neurones. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé humaine étant donné que la prévalence des apnées du sommeil dans la population et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies (y compris la maladie d’Alzheimer).

Bénéfices attendus

Notre activité cérébrale est intimement liée à la façon dont nous respirons. La respiration module le fonctionnement cérébral (émotions, attention etc) et notre état cognitif régit en retour notre comportement respiratoire. Cependant les mécanismes impliqués dans ce dialogue sont peu connus. Cette étude apportera des éléments essentiels à la compréhension de cette question. Les résultats de cette étude pourront avoir un impact sur la santé étant donné que de nombreuses personnes souffrent d’apnées du sommeil et sachant que des problèmes de respiration ont été observés dans certaines pathologies humaines (dont la maladie d’Alzheimer).

Procédures

Les souris seront étudiées lors de l’expression de comportements naturels et spontanés, lorsqu’elles dorment, mais aussi lors de courtes sessions où leur tête devra rester fixée face à un masque à oxygène. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau et son lieu avec la respiration, les souris seront équipés d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). Les enregistrements seront réalisés au maximum une fois par jour pour une durée de 2 heures environ (1h30 pour les expériences tête fixée). Au cours de certains enregistrements, nous ferons légèrement varier le taux d’oxygène présent dans l’atmosphère de la souris (variations

Impact sur les animaux

Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. La respiration sera enregistrée via une canule placée au niveau de la cavité nasale. Ceci nécessite la réalisation de chirurgies sous anesthésie et analgésie avec un impact très limité sur l’animal. Le port des implants suite à ces chirurgies peut générer une légère gêne pour l’animal. De plus, afin de contrôler le taux d’oxygénation des souris, nous devrons les placer dans une enceinte fermée dans laquelle l’atmosphère peut être contrôlée de manière précise. Dans une autre série d’expérience, il nous faudra maintenir la tête des souris au niveau d’un masque à oxygène, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La restriction des mouvements de l’animal pendant ces deux procédures ainsi que les variations de taux d’oxygénation peuvent être légèrement désagréables pour l’animal, tout du moins avant qu’il n’y soit y habitué. Enfin, nous prévoyons d’utiliser des souris modèles de la maladie d’Alzheimer qui parfois présentent des crises d’épilepsie et une mortalité accrue à partir de 4.5 mois.

Devenir

L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Ceci concerne les souris dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements naturels, interagissent avec leurs congénères, explorent, courent ou dorment : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est 900 souris adultes sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris pendant plusieurs sessions d’enregistrement, ceci donnant accès à un jeu de données riche. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique. Pour les expériences visant à tester l’impact de l’oxygénation sur le cerveau, avec différents taux d’oxygénation, une souris sera son propre contrôle car elle sera testée à différent taux d’oxygénation : ce qui augmentera notre puissance statistique et donc le nombre de souris nécessaires. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage), cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment à la fixation de tête). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésiques et analgésiques permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Lors des sessions d’enregistrement, les souris seront étudiées alors qu’elles expriment des comportements spontanés et naturels : elles seront exposées à des stimuli sensoriels différents de leur cage d’hébergement ce qui constituera, en soi, une forme régulière d’enrichissement.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction complexe entre cerveau-et respiration, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’influence de la respiration sur les fonctions cognitives a été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme ce qui appuie la pertinence de ce modèle. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-12 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. L’utilisation de souris >6mois sera notamment réservée aux souris APP-PS1 qui développent un phénotype pathologique uniquement à partir de 3 mois chez les femelles et 6 mois chez les mâles.