Recherche fondamentale
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Combinaison de deux inhibiteurs dans un modèle de xénogreffe chez des souris immunodéficientes et des modèles d’hypercroissance 4/5
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Poids, comportement et aspect du poil servent de points limites déclenchant la mise à mort anticipée. 12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties sur cinq établissements. Chaque animal peut recevoir un implant d'œstrogène posé sous anesthésie, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines, huit prélèvements sanguins, cinq gavages au tamoxifène, des injections intrapéritonéales deux fois par semaine et des gavages quotidiens pendant jusqu'à trente semaines, plus une ligature vasculaire. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients.
Objectifs
Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.
Bénéfices attendus
Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)
Impact sur les animaux
Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.
Réduction
Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.
Raffinement
Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.
Un complément en acides gras furanique peut-il prévenir ou ralentir la fonte musculaire observée dans le cadre de pathologies cancéreuses? EU2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Une greffe de cellules cancéreuses dans le pancréas, puis une cachexie qu'il faut laisser s'installer pour l'étudier : c'est ce que subissent les 220 souris du volet EU2/2 de ce protocole, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 modéré et 40 sévère. Elles reçoivent le lipide testé par sonde de gavage, huilée pour faciliter l'introduction, et passent en RMN tous les deux jours. Le porteur ramène pourtant les nuisances attendues au stress des manipulations et à une irritation de l'œsophage, quand la fonte musculaire induite est l'objet même de l'étude. Toutes sont tuées en fin de procédure, muscles, sang, organes et tumeurs prélevés pour analyse.
Objectifs
Des études précliniques indiquent qu’un lipide spécifique augmente la masse musculaire. Ce lipide appartient à une famille de lipides synthétisés par des plantes et des bactéries, présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes. Nos études sur des cellules musculaires montrent que ces lipides stimulent la synthèse des protéines. De plus, nous avons mis en évidence, que l’ajout de ce lipide dans l’alimentation est suffisant pour induire une augmentation de la masse musculaire chez des souris normales ou chez des souris obèses. Ces résultats soulignent que ce lipide pourrait avoir des effets bénéfiques en prévenant ou en ralentissant le développement de fonte musculaire lors de cancers. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'étudier si une supplémentation avec ce lipide est capable de contrer ou de ralentir l'apparition de la fonte musculaire dans 2 modèles animaux de cancers touchant le colon et le pancréas. Ce projet fait appel à l'expertise de deux établissements : le premier pour la l'induction des tumeurs chez les animaux, le second pour leur analyse métabolique et musculaire.
Bénéfices attendus
La preuve de concept que ce lipide peut diminuer la fonte musculaire dans le cadre de cancers chez l'animal est une étape indispensable avant d’envisager des essais cliniques chez l’Homme. En cas de résultats positifs, ces lipides seront destinés à devenir un complément ou additif alimentaire en santé humaine.
Procédures
Dans l'établissement EU 1/2 la moitié des animaux subiront une administration sous-cutanée unique (30 secondes, animaux vigiles), l'autre moitié subira une procédure chirurgicale (15 min, sur animaux anesthésiés avec injection préalable d'analgésique). Ensuite les animaux seront transportés (moins de 15 minutes en voiture) dans l'établissement EU 2/2 pour y être analysés comme décrit ci-dessous. Les lipides seront administrés par voie orale 5 jours sur 7 pendant 2 à 3 semaines selon les lots d’animaux. L'administration orale prend moins d'1 minute par souris. Une pesée des animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant la durée des procédures (1 semaine, 3 semaines ou 4 à 5 semaines).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera principalement liée à la greffe, au développement de tumeurs et à l’induction de la fonte musculaire (cachexie). Les animaux pourront ressentir du stress et avoir une irritation de l’œsophage liée à l’administration orale (5j/7, de 1 à 3 semaines selon les lots), et du stress lors des mesures du poids des animaux et de la mesure de la composition corporelle (tous les deux jours pendant 3 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure. Les muscles, le sang, les organes et les tumeurs seront prélevés pour plus d'analyses.
Remplacement
Notre projet porte sur le syndrome de cachexie qui se définit comme une perte accélérée de muscle et de gras, provoquée par une diminution des apports nutritionnels, des changements énergétiques et métaboliques. Préalablement aux études que nous proposons, nous avons démontré in vitro que les acides gras furaniques (FuFAs) avaient un effet non seulement sur des cellules musculaires saines en culture mais aussi sur organisme entier (souris saines ou obèses), en impactant la régulation du métabolisme. Afin d’envisager l’utilisation chez l’Homme des FuFAs en tant que complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie, nous souhaitons à présent étudier ces molécules dans un modèle murin de cachexie cancéreuse. En effet, ce syndrome ne peut être étudié et de nouvelles thérapies évaluées que dans le contexte d’un organisme suffisamment complexe, tel que celui du rongeur en première intention.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d'animaux minimal néccessaire pour avoir des résultats statistiques fiables. Notre projet sera réalisé en 3 étapes. Si la première étape n'est pas concluante, nous ne réaliserons pas les deux autres. Le nombre d'animaux utilisé sera donc uniquement de 80 au lieu des 220 prévus.
Raffinement
Pour l'implantation des cellules cancéreuses dans le pancréas, les animaux seront anesthésiés et sous analgésique pendant et après la chirurgie. Pour le transport de courte durée (inférieure à 15 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans l'EU 273 les souris seront mises en cages traditionnelles. Elles seront hébergées par 2 jusqu'à la fin de l’étude dans des cages avec une roue d’activité leur permettant d'avoir une activité spontanée, avec pour enrichissement des copeaux et un tunnel en plexiglass rouge. Le tunnel sert à la fois au déplacement des animaux et à l’habituation pour le test de composition corporelle. Pour l’administration orale, la sonde de gavage sera enduite d’huile végétale pour faciliter l’introduction. Nous utiliserons une grille de suivi de l'état de santé des animaux et appliquerons les décisions définies préalablement pour soulager la souffrance des animaux. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de cellules cancéreuses sur souris que nous avons choisi sont couramment utilisés pour induire une perte de poids et fonte musculaire (cachéxie) similaire à celle observée dans le cadre des cancers du colon ou pancréas. Ce sont donc de bons modèles pour tester les nouvelles thérapies. Les souris étudiées seront des souris jeunes adultes de 10 semaines ayant atteint un poids suffisant, qui permet d'observer une phase de cachéxie sans atteindre les points limites de perte de poids trop rapidement. Elles seront suivies entre 4 et 6 semaines.
Un complément en acides gras furanique peut-il prévenir ou ralentir la fonte musculaire observée dans le cadre de pathologies cancéreuses? EU1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Un gavage cinq jours sur sept pendant deux à trois semaines, une pesée et un passage en RMN tous les deux jours : 220 souris porteuses de tumeurs du côlon ou du pancréas vont être utilisées, 60 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 120 modéré et 40 sévère. Toutes sont tuées, muscles, sang, organes et tumeurs prélevés. Il s'agit de tester si un acide gras furanique ralentit la fonte musculaire provoquée par le cancer, le porteur présentant cette preuve de concept chez la souris comme une étape "indispensable" avant des essais chez l'être humain. Le choix du modèle repose sur des greffes de cellules cancéreuses réputées induire une cachexie comparable à celle des patients, chez des souris de dix semaines suivies quatre à six semaines.
Objectifs
Des études précliniques indiquent qu’un lipide spécifique augmente la masse musculaire. Ce lipide appartient à une famille de lipides synthétisés par des plantes et des bactéries, présents dans le poisson, les produits laitiers et les fruits et légumes. Nos études sur des cellules musculaires montrent que ces lipides stimulent la synthèse des protéines. De plus, nous avons mis en évidence, que l’ajout de ce lipide dans l’alimentation est suffisant pour induire une augmentation de la masse musculaire chez des souris normales ou chez des souris obèses. Ces résultats soulignent que ce lipide pourrait avoir des effets bénéfiques en prévenant ou en ralentissant le développement de fonte musculaire lors de cancers. L'objectif principal de ce projet de recherche est d'étudier si une supplémentation avec ce lipide est capable de contrer ou de ralentir l'apparition de la fonte musculaire dans 2 modèles animaux de cancers touchant le colon et le pancréas. Ce projet fait appel à l'expertise de deux établissements : le premier pour l'induction des tumeurs chez les animaux, le second pour leur analyse métabolique et musculaire.
Bénéfices attendus
La preuve de concept que ce lipide peut diminuer la fonte musculaire dans le cadre de cancers chez l'animal est une étape indispensable avant d’envisager des essais cliniques chez l’Homme. En cas de résultats positifs, ces lipides seront destinés à devenir un complément ou additif alimentaire en santé humaine.
Procédures
Dans l'établissement EU 1/2 la moitié des animaux subiront une administration sous-cutanée unique (30 secondes, animaux vigiles), l'autre moitié subira une procédure chirurgicale (15 min, sur animaux anesthésiés avec injection préalable d'analgésique). Ensuite les animaux seront transportés (moins de 15 minutes en voiture) dans l'établissement EU 2/2 pour y être analysés comme décrit ci-dessous. Les lipides seront administrés par voie orale 5 jours sur 7 pendant 2 à 3 semaines selon les lots d’animaux. L'administration orale prend moins d'1 minute par souris. Une pesée des animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées tous les 2 jours à l'aide d'un appareil RMN (Résonnance magnétique) qui permet d’obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent 2 minutes par souris et sont réalisées sur des animaux vigiles pendant la durée des procédures (1 semaine, 3 semaines ou 4 à 5 semaines).
Impact sur les animaux
La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera principalement liée à la greffe, au développement de tumeurs et à l’induction de la fonte musculaire (cachexie). Les animaux pourront ressentir du stress et avoir une irritation de l’œsophage liée à l’administration orale (5j/7, de 1 à 3 semaines selon les lots), et du stress lors des mesures du poids des animaux et de la mesure de la composition corporelle (tous les deux jours pendant 3 semaines).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de la procédure. Les muscles, le sang, les organes et les tumeurs seront prélevés pour plus d'analyses.
Remplacement
Notre projet porte sur le syndrome de cachexie qui se définit comme une perte accélérée de muscle et de gras, provoquée par une diminution des apports nutritionnels, des changements énergétiques et métaboliques. Préalablement aux études que nous proposons, nous avons démontré in vitro que les acides gras furaniques (FuFAs) avaient un effet non seulement sur des cellules musculaires saines en culture mais aussi sur organisme entier (souris saines ou obèses), en impactant la régulation du métabolisme. Afin d’envisager l’utilisation chez l’Homme des FuFAs en tant que complément ou additif alimentaire pour prévenir ou ralentir le développement de la sarcopénie, nous souhaitons à présent étudier ces molécules dans un modèle murin de cachexie cancéreuse. En effet, ce syndrome ne peut être étudié et de nouvelles thérapies évaluées que dans le contexte d’un organisme suffisamment complexe, tel que celui du rongeur en première intention.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel pour calculer le nombre d'animaux minimal néccessaire pour avoir des résultats statistiques fiables. Notre projet sera réalisé en 3 étapes. Si la première étape n'est pas concluante, nous ne réaliserons pas les deux autres. Le nombre d'animaux utilisé sera donc uniquement de 80 au lieu des 220 prévus.
Raffinement
Pour l'implantation des cellules cancéreuses dans le pancréas, les animaux seront anesthésiés et sous analgésique pendant et après la chirurgie. Pour le transport de courte durée (inférieure à 15 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée, les souris seront mises en cage traditionnelle. Elles seront hébergées par 2 jusqu'à la fin de l’étude dans des cages avec une roue d’activité leur permettant d'avoir une activité spontanée, avec pour enrichissement des copeaux et un tunnel en plexiglass rouge. Le tunnel sert à la fois au déplacement des animaux et à l’habituation pour le test de composition corporelle. Pour l’administration orale, la sonde de gavage sera enduite d’huile végétale pour faciliter l’introduction. Nous utiliserons une grille de suivi de l'état de santé des animaux et appliquerons les décisions définies préalablement pour soulager la souffrance des animaux. Lorsque les points limites seront atteints, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les modèles de greffe de cellules cancéreuses sur souris que nous avons choisi sont couramment utilisés pour induire une perte de poids et fonte musculaire (cachéxie) similaire à celle observée dans le cadre des cancers du colon ou pancréas. Ce sont donc de bons modèles pour tester les nouvelles thérapies. Les souris étudiées seront des souris jeunes adultes de 10 semaines ayant atteint un poids suffisant, qui permet d'observer une phase de cachéxie sans atteindre les points limites de perte de poids trop rapidement. Elles seront suivies entre 4 et 6 semaines.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin de cardiomyopathie arythmogène d’origine génétique EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Tués parce que leur génotype les exclut du projet ou parce qu'ils sont produits en surnombre, les reproducteurs et les hétérozygotes excédentaires rejoignent les animaux mis à mort après la procédure chirurgicale finale, cœur prélevé. 640 souris au maximum sont concernées, 310 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger et 330 d'un niveau modéré. Elles subissent une biopsie de génotypage, un transfert vers un second établissement, jusqu'à quatre électrocardiogrammes et quatre échocardiographies, trois stimulations transœsophagiennes sous anesthésie, puis une stimulation intracardiaque terminale de 40 minutes sans réveil. Le porteur justifie le recours à la souris par le fait que la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce et que son système cardiovasculaire est proche de celui de l'être humain.
Objectifs
Ce projet se déroule dans deux établissements utilisateurs. Le projet s’insère dans un contexte de recherche qui a pour but de comprendre les mécanismes à l’origine de pathologies cardiovasculaires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Pour cela l’effet de diverses substances ou de protéines mutantes introduites chez des souris normales est étudié et leurs conséquences physiologiques chez l’animal sont mesurées. Ces expériences nécessitent un suivi phénotypique. L’objectif du projet est la caractérisation fonctionnelle d’une mutation humaine homozygote dans un gène qui vient d'être découvert comme responsable d'une nouvelle forme de cardiomyopathie arythmogène récessive associant des troubles du rythme atriaux et ventriculaires, pouvant conduire à des syncopes et à une mort subite. Le but de ce projet est donc de comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les régulations auxquelles participe cette protéine. Ces connaissances seront facilitées en utilisant un modèle in vivo qui garantit la présence des molécules partenaires dans un contexte physiologique.
Bénéfices attendus
L'étude de ce modèle murin nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie liée à des troubles du rythme cardiaque atrial et ventriculaire, et de déterminer si les souris développent ou non une cardiopathie associée. A plus long terme, des stratégies thérapeutiques pourront être testées sur ce modèle car ces arythmies peuvent être mortelles chez l'Homme et nous ne disposons pas de traitements efficaces. Du point de vue de l’incidence, c’est certainement une maladie rare, en particulier en Europe où il y a peu de familles consanguines. Quand les résultats de nos recherches seront publiés, d’autres études viendront conforter et compléter nos premiers résultats. Il est probable que des mutations fondatrices existent dans certaines régions du monde, transmises de génération en génération et que seuls les patients homozygotes par descendance soient atteints avec une incidence locale plus élevée et un réel besoin de traitements pour prévenir le développement d'arythmies ventriculaires possiblement léthales.
Procédures
Une biopsie sera réalisée pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1 minute, EU1). Les animaux seront transférés de l’établissement d’élevage vers l’établissement secondaire où seront effectuées les différentes explorations (EU2). Les enregistrements électrocardiographiques avec le système Tunnel sont effectués sur animal vigiles qui sont juste placés dans un tunnel, avec chaque patte positionnée sur une plaque, ce qui permet l’enregistrement de l’électrocardiogramme (4 fois au maximum, 5 min, EU2). L’échocardiographie est enregistrée sur animal anesthésié très légèrement afin de juste les maintenir immobiles. C’est une procédure non invasive et non douloureuse. Les animaux se réveillent juste après l’arrêt de l’anesthésie (4 fois au maximum, 30 min, EU2). Les animaux seront également soumis à une stimulation transoesophagienne pour mettre en évidence et analyser une éventuelle susceptibilité à déclencher une fibrillation atriale (sous anesthésie et analgésie, 3 fois au maximum, 30 min, EU2). Le protocole de stimulation intracardiaque ne sera fait qu’une seule fois (acte unique, sous anesthésie et analgésie, durée 40 min, EU2), car c’est une procédure terminale, sans réveil, avant euthanasie. Les souris subissent cette procédure chirurgicale afin d’évaluer la susceptibilité des modèles murins aux arythmies ventriculaires.
Impact sur les animaux
Les nuisances découlant des procédures sont 1) l’utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des souris réalisée par une biopsie, ce qui peut être une cause de stress et de douleur légère de courte durée, 2) ce projet consiste à phénotyper une nouvelle lignée murine, le phénotype dommageable des animaux pourrait entrainer des troubles du rythme cardiaque pouvant provoquer le décès dans les cas les plus graves, 3) le stress lié au transport des animaux de l'animalerie d'élevage à l'animalerie d'expérimentation, 4) le stress lié aux diverses manipulations pour les administrations ou durant le suivi, 5) douleur légère de courte durée au point d'injection, 6) lors de certains actes sous anesthésie gazeuse, une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire.
Devenir
Tous les reproducteurs en fin de période de reproduction ou exclus du fait de leur génotype ne pouvant être inclus dans le projet, ainsi que les hétérozygotes générés en surplus seront euthanasiés. Tous les animaux transférés pour l'expérimentation seront euthanasiés à la fin de la procédure chirurgicale et les cœurs seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n’existent pas en lignées. Nous disposons de protocoles d’établissement de cardiomyocytes issus d’iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l’organisme) et utilisons également ce modèle, mais ils présentent des inconvénients comme une immaturité, une variabilité liée des différenciations plus ou moins complètes, et la présence de plusieurs types cellulaires. Ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration de signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
640 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Une étude pilote sera effectuée afin de définir précisément les âges optimaux pour réaliser les analyses. A la fin des études expérimentales, des organes seront prélevés sur tous les animaux afin de maximiser les informations analysables. Un isolement et une étude des cardiomyocytes isolés seront également réalisés. Ce modèle cellulaire ex vivo permettra de tester l’effet de composés pharmacologiques pour tenter de corriger des anomalies à l’origine des dysfonctionnements cardiaques, plutôt que de tester directement in vivo l’effet de ces composés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. En élevage, une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Le transport entre les deux EU est réalisé sans changement de cage pour limiter le stress des animaux. Les cages sont délicatement placées dans un sac kraft et sur un chariot. Le transfert est réalisé par un tunnel sous terrain sans passage par l'extérieur. La durée du trajet est de 5 minutes. Le projet a également été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce 2) le développement et la physiologie sont bien connus. 3) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 4) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. Les animaux seront utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour réaliser une biopsie, entre 2 et 6 mois pour la reproduction et entre 15 jours et 8 mois de vie pour le suivi (poids, fonction cardiaque)
Caractérisation du rôle de régulateurs de l’intégrité génomique et du microenvironnement hépatique dans des modèles murins de stéatose-stéatohépatite et de cancer du foie.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Nourries pendant 6 à 12 mois de régimes enrichis en gras et en sucre, les souris de ce projet doivent développer une stéatose ou une stéatohépatite, et des tumeurs du foie sont attendues. 3168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements post-mortem. Une partie reçoit sous anesthésie une injection intraveineuse qui fait exprimer un gène, une autre passe une échographie du foie sous anesthésie tous les quinze jours, 8 à 12 fois en moyenne, une autre encore subit une chirurgie terminale, et le porteur annonce une prise de poids importante qui peut modifier leur mobilité et leur comportement. L'injection est intraveineuse selon la liste des procédures, sous-cutanée selon celle des effets attendus, qui évoque l'aiguille passant "au travers de la peau et du péritoine".
Objectifs
Chaque année, plus de 900 000 personnes sont diagnostiquées avec un cancer du foie et environ 800 000 personnes succombent à la maladie, ce qui en fait la troisième cause de décès par cancer dans le monde. En raison de l’épidémie mondiale de diabète et d’obésité, l’incidence de ce cancer ne cesse d’augmenter et malheureusement les options thérapeutiques restent limitées. Ce projet de recherche vise à définir le rôle d’acteurs clés dans le contrôle de l’intégrité génomique mais également du microenvironnement immunitaire hépatique lors du développement de maladies métaboliques telles que la stéatose et la stéatohépatite, qui peuvent conduire au cancer du foie ou carcinome hépatocellulaire.
Bénéfices attendus
Les stratégies thérapeutiques mises en jeu dans la lutte contre le cancer du foie sont à l’heure actuelle très limitées et souffrent d’un manque de compréhension (1) des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans le contrôle du potentiel prolifératif des hépatocytes (cellules majoritaires du foie) et (2) du rôle du microenvironnement immunitaire, lors du développement de ce cancer, notamment dans un contexte de perturbations métaboliques. Les résultats de ce projet devraient nous permettre de mieux caractériser le rôle de ces différents mécanismes et acteurs dans la maladie, de développer de nouveaux outils diagnosticet pronostic dans la prise en charge du cancer du foie et conduire également dans un futur proche à l’émergence de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse unique sous anesthésie générale permettant l’expression d’un gène d’intérêt (1 fois, 5 minutes/animal). Tous les animaux seront soumis à différents régimes alimentaires modifiés (enrichi en gras, sucre, etc.) permettant de reproduire la pathologie étudiée pour une durée de 6 à 12 mois selon les régimes. Une partie de ces animaux sera suivie par échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10 minutes tous les 15 jours (8 à 12 échographies en moyenne par souris). Une autre partie de ces animaux sera impliquée dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie (15 minutes par animal). L’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection sous-cutané et un certain inconfort ou stress, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue, pouvant modifier la mobilité et le comportement des animaux. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.
Devenir
Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (3168).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence ici le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence stéatose/stéatohépatite/carcinome hépatocellulaire. Par ailleurs, le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques, notamment lors de la stéatose non alcoolique du foie. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permettrait donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité.
Réduction
3168 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
L'ensemble de ce projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les animaux provenant de l’extérieur seront acclimatés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Le milieu est enrichi avec plusieurs enrichissements. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l’euthanasie anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au carcinome hépatocellulaire. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90 pourcents de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (6 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence stéatose/stéatohépatite.
Organisation anatomique et fonctionnelle des circuits moteurs cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1340 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur tissu nerveux. Toutes subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau qui peut durer trois heures, 480 une lésion de la substance noire avec deux injections sous-cutanées par jour pendant 14 jours, et 960 passent à trois reprises des tests de marche en champ ouvert, sur tapis roulant et en couloir, et de nage en couloir. Des enregistrements électrophysiologiques de deux heures sont prévus sur 200 d'entre elles. Le projet vise à comprendre comment le cerveau choisit et active les circuits de la marche, de la préhension ou de la mastication, et comment un syndrome parkinsonien, induit chez une partie des souris, les altère. Le porteur affirme que les approches in vitro ou in silico ne peuvent pas "reproduire ou modéliser la complexité d'un organisme entier".
Objectifs
Le contrôle de nos mouvements repose sur des réseaux complexes de neurones dont le fonctionnement reste en grande partie mystérieux. Cela s'explique par le fait que chaque niveau du système nerveux central, du cortex cérébral à la moelle épinière, joue un rôle dans nos mouvements. Des études récentes montrent que certaines zones du cerveau, situées dans les régions bulbo-pontiques, sont organisées en modules spécialisés. Ces modules contrôlent différents types de mouvements comme la marche, la préhension, la mastication, et la succion. Ils envoient ensuite des signaux aux neurones moteurs situés dans le tronc cérébral et la moelle épinière pour exécuter ces mouvements. Cependant, nous ne savons pas encore précisément comment le cortex cérébral et les ganglions de la base choisissent et activent ces modules en fonction de nos besoins comportementaux. Notre projet de recherche vise donc à comprendre comment ces structures intermédiaires, situées entre le cortex et les ganglions de la base, contribuent à la sélection des modules de commande du tronc cérébral. Pour ce faire, nous allons étudier l'organisation en réseau des structures motrices du cerveau et déterminer le rôle de chaque composant dans la réalisation et la modulation des mouvements. En parallèle, nous allons examiner comment ces circuits sont affectés par la maladie de Parkinson. Notre objectif est de développer et tester des stratégies pour restaurer des mouvements adaptés en intervenant sur le fonctionnement des réseaux moteurs du cerveau. Nous espérons que ce projet, en plus de son intérêt scientifique, apportera des résultats pré-cliniques importants pour la compréhension et le traitement des maladies humaines, notamment dans le cadre des soins pour les patients.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de comprendre comment certaines structures du cerveau, qui sont connectées entre elles et forment des réseaux moteurs, contribuent à différents types de mouvements. Ces mouvements incluent atteindre un objet, le saisir, le manipuler, ainsi que marcher. Nous nous concentrons particulièrement sur des structures cérébrales qui pourraient être contrôlées par le cortex et les ganglions de la base, car ces derniers jouent un rôle crucial dans le choix des comportements moteurs.
Procédures
-Nous réaliserons sur 1340 animaux une chirurgie stéréotaxique de (maximum) 180 minutes durant laquelle ils recevront une injection i.p. (0,15 ml), 2 injections s.c. une sur la tête (0,05 ml) et une sur le corps (0,15 ml). Puis des soins post-opératoires durant lesquels ils recevront une injection s.c. (0,5 ml). -Nous réaliserons sur 480 animaux une lésion de la substance noire compacte durant laquelle ils recevront deux injections quotidiennes s.c. (0,2 ml, une le matin et une le soir) durant 14 jours. -960 animaux réaliseront des tests moteurs d’environ 5-10 minutes de types : marche en champs ouvert, marche sur tapis roulant, marche en couloir de marche, et de la nage en couloir de nage répartis sur 4 jours. Ces tests seront réalisés 3 fois avec 14 jours entre chaque répétition. -Des enregistrements électrophysiologiques d'une durée de 2h seront réalisés sur 200 animaux. Les animaux recevront une injection i.p. (0,15 ml). L’ensemble des injections dureront moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie les animaux pourront présenter une douleur transitoire. En outre les animaux pourraient présenter une légère déshydration. Suite à l’induction d’un syndrome parkinsonien les animaux seront affectés sur le plan moteur avec pour conséquence une diminution de l’activité et des comportements de rotation sans pour autant altérer leur capacité à se nourrir. En outre les animaux pourront présenter une perte de poids limitée dans le temps pouvant induire un stress transitoire chez les animaux. Enfin, les animaux seront manipulés ce qui pourra générer un léger stress chez ces derniers.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu nerveux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, les approches in vitro ou in silico ne pouvant pas reproduire ou modéliser la complexité d’un organisme entier.
Réduction
Dans ce projet, des animaux mâles et femelles seront utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet n'excèdera pas 12 à 20 animaux par groupe, c'est à dire le nombre d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine.
Raffinement
Le laboratoire est doté de l'ensemble des infrastructures (animalerie, salles d'expérimentation etc.) nécessaires à la réalisation du projet et dispose de l'ensemble des agréments requis et délivrés par les services compétents. Les conditions d'hébergements et d'enrichissement respectent les normes dictées par les directives européennes. Nous sommes particulièrement vigilants en ce qui a trait au bien-être animal et la prise en charge de la douleur. Des points limites précoces et spécifiques de notre étude ont été fixés et des procédures adaptées ont été établies, les mesures analgésiques incluses dans protocoles permettant de garantir à la fois la pertinence des résultats et le bien-être des animaux. Les chercheurs participant au projet ont une solide expérience dans la manipulation de rongeurs et l'ensemble des compétences requises à sa réalisation (notamment chirurgicales). À ce titre, il convient de préciser d'une part que le chercheur par ailleurs référant en matière de bien-être animal au laboratoire prend part au présent projet et d'autre part que le projet est bâti en accord avec les recommandations et conseils de la vétérinaire de l’établissement. Cette dernière sera sollicitée chaque fois que nécessaire par le coordinateur du projet qui lui permettra en outre de suivre, bien que de façon externe, le déroulement du projet et de proposer des procédures de raffinement bénéfiques à tous les égards. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésies générale (isoflurane) et locale (lidocaïne) et sont associées à des traitements analgésiques (buprénorphine/meloxicam) qui seront maintenus tant que nécessaire en fonction de l'état des animaux par ailleurs suivis quotidiennement. La mise en place des points limites et des mesures analgésiques notamment chez l'animal repose sur une méthode de scoring comprenant 4 niveaux : normal, modérée, sévère, mise à mort. Cette méthode prend en considération la douleur et l'état général de l'animal (poids, hydratation, soin au pelage etc.). Un animal classé modéré ou sévère recevra un traitement adapté aux symptômes exprimés. L'ajustement des traitements sera évalué sur une base quotidienne.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris pour étudier les circuits moteurs et leurs altérations dans le cadre de la maladie de Parkinson. La maladie peut être reproduite expérimentalement chez la souris grâce à une neurotoxine. De plus, les souris transgéniques, combinées à l'injection de vecteurs viraux pour cibler des populations neuronales spécifiques, permettent d'explorer de manière précise l'organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces méthodes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme. Les souris adultes seront utilisées pour ce projet, car elles correspondent aux objectifs scientifiques et méthodologiques, notamment pour les tests moteurs, les procédures chirurgicales et l'induction de la maladie de Parkinson.
Étude de la réponse immunitaire dans un modèle d’infection articulaire à Staphylococcus aureus sur matériel étranger
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un biomatériel est implanté dans une articulation du membre postérieur de souris pour y installer une infection à Staphylococcus aureus, avec douleurs et gêne à la marche pendant trois à cinq jours. 59 souris sont utilisées, 53 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 6 sous anesthésie sans réveil, toutes tuées pour prélèvement du fémur droit. Le projet vise à comprendre comment s'installe une infection sur prothèse articulaire, complication qui touche environ 1 % des personnes opérées. La description des procédures se limite pourtant à "une seule procédure chirurgicale d'implantation de biomatériel" de trente minutes, alors que la liste des effets attendus va jusqu'à la bactériémie et à la mort prématurée de l'animal.
Objectifs
Mieux comprendre la physiopathologie du processus d’infection ostéo-articulaire tant sur le plan infectiologique que sur le plan du système immunitaire afin de proposer dans un second temps des stratégies innovantes de prévention, diagnostic et thérapeutiques. Les infections des prothèses (matériel étranger) articulaires sont de sérieuses complications qui surviennent chez environ 1% des personnes ayant bénéficié d’une chirurgie de prothèse d’articulation. Elles entraînent des problèmes de santé importants et coûtent cher à traiter, principalement en raison de leur nature chronique difficile à éliminer. De plus, avec le vieillissement de la population, ces infections deviennent de plus en plus fréquentes. Pour mieux les combattre, il est crucial de comprendre les mécanismes qui les sous-tendent, notamment la persistance des bactéries, leur résistance aux traitements et la perte osseuse associée. La recherche dans ce domaine est complexe en raison des interactions multiples entre les bactéries, l’os, les matériaux prothétiques et les cellules du système immunitaire. Il n’est pas possible d'étudier ces interactions en temps réel dans des cellules in vitro, dans des modèles ex vivo ou dans des études cliniques chez l’homme car l'environnement local joue un rôle crucial dans le développement de ces infections et il faut du temps pour confirmer la guérison, des rechutes pouvant survenir plusieurs années après le traitement initial. À ce jour, notre compréhension de la perte osseuse, de l'impact du microbiome local et des réponses immunitaires dans le contexte des infections de prothèses articulaires demeure limitée. Pourtant, développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives efficaces dépend de notre capacité à élucider ces mécanismes complexes. Ce projet va permettre de comprendre les mécanismes qui permettent la mise en place et l’évolution d’une infection sur prothèse articulaire.
Bénéfices attendus
Comprendre l'interaction entre la réponse immunitaire, la formation de biofilm et la perte osseuse impliquée dans la physiopathologie de l’infection de prothèse Générer des hypothèses pour aider à identifier les facteurs influençant le pronostic fonctionnel dans les infections de prothèse chez l’animal afin de les transposer chez homme L’utilisation de ce modèle est génératrice d’hypothèses physiopathologiques concernant les infections subaigues et chroniques de prothèse chez l’homme en vue du développement de nouvelles approches préventive, diagnostique et thérapeutique par des techniques innovantes.
Procédures
Certains animaux sont soumis à une seule procédure chirurgicale d’implantation de biomatériel sous anesthésie générale. Durée prévisible 30 minutes.
Impact sur les animaux
Douleurs du membre postérieur, gène à la marche transitoire pendant 3 à 5 jours, stress lié à la manipulation, douleur de l’introduction de l’aiguille pour l’induction de l’anesthésie, écoulement au niveau de la cicatrice, inflammation de la cicatrice, Possibles mais peu attendus : fièvre, risque d’infection disséminée (bactériémie), mort prématurée de l’animal avant la date prévue de la mise à mort
Devenir
A la fin de l’expérimentation tous les animaux sont mise à mort pour réaliser les prélèvements d’os (fémur droit).
Remplacement
Il n’existe pas de modèle non animal permettant d’étudier la physiopathologie de l’infection de prothèse articulaire, en raison de la complexité du microenvironnement infectieux sur matériel et des interactions entre hôte et pathogène spécifique qui s’exercent sur l’os, le biomatériel et le biofilm bactérien. En effet, l’étude de la mise en place et de l’évolution d’une infection sur un os vivant, vascularisé avec un matériel en place et du biofilm en constitution et engageant un dialogue constant avec le système immunitaire ne peut pas se mimer dans un modèle in silico ou in vitro sur des cellules cultivées ou des fragments osseux. Par ailleurs, l’étude des tissus ex vivo chez l’homme ne permet pas d’analyser en profondeur la physiopathologie pas de l’infection de prothèse articulaire et la mise en place des mécanismes responsables de la chronicisation des infections et de la perte osseuse en raison d’une part de l’hétérogénéité clinique et microbiologique des infections de prothèse articulaire et de la pauvre qualité des prélèvements réalisés lors de chirurgie de lavage ou reprise de prothèse articulaire infectée. De plus, l’utilisation d’un modèle invertébré n’est pas envisageable pour modéliser une infection osseuse sur prothèse car ceux-ci ne disposent pas du système osseux ni immunitaire permettant les analyses nécessaires (cytométrie de flux, histologie) à la compréhension de la physiopathologie de l’infection osseuse sur matériel chez l’homme. De la même manière, l’utilisation d’un modèle d’animaux aquatiques (amphibiens ou poissons) n’est pas envisageable pour modéliser une infection osseuse sur prothèse car ceux-ci ne disposent pas d’un système osseux articulaire ni immunitaire suffisamment proche à l’homme pour permettre une modélisation adéquate.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé pour être le minimum requis pour obtenir des données scientifiquement exploitables en se fondant sur l’étude de la littérature dans les modèles d’infection de prothèse articulaire murin et les données préliminaires du projet PROTHEE Pilote réalisé sur des prélèvements d’os et de membrane chez des patients humains avec des infections de prothèse. Soit un total de 59 animaux. Le calcul des animaux a été réalisé afin d’avoir un nombre représentatif d’animaux dans chaque groupe avec des prélèvements pour l'étude des cellules de l'os d’une part (une partie des animaux) et des prélèvements pour l'étude des bactéries.
Raffinement
Le milieu de vie des animaux sera enrichi par la présence de tube de carton et de matériel pour la confection de nids (coton et igloo), ainsi que par des buchettes en bois à ronger Les souris sont hébergées 6 animaux par cage dans une animalerie spécialisée. Afin de réduire la souffrance animale, les douleurs et l'inflammation après le geste chirurgical le protocole prévoit une administration de médicaments antidouleurs jusqu’à la fin de l’expérimentation. Les animaux seront examinés quotidiennement (matin et après-midi) pour la recherche de points limites nécessitant des actions correctives. Nous avons défini les points limites suivants permettant de noter un score associé aux actions correctives suivantes : 0 Pas d’action 1 Adaptation des pellets , changement / ajout de nourriture pour les animaux au besoin 2 Enrichissement du milieu par ajout d’une structure en plastique (maison ou cube) et de matériel de nidation (serpentin en coton ou lamelles de carton) 3-4 Administration d'antidouleurs >5 Mise à mort Ces points limites et actions correctives sont regroupés en Annexe (Tableaux 1 et 2). Enfin, nous utilisons le plus petit inoculum bactérien possible pour s’assurer que l’impact sur la qualité de vie de l’animal soit minimal et n’entraine pas d’infection disséminée ni de fièvre.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour sa capacité à représenter une alternative représentative et validée d’infection de prothèse [Bernthal et al. PloSOne 2010], et est un des modèles les mieux documentés pour l’analyse de la réponse immunitaire. 12 semaines, il s’agit du stade de développement habituellement utilisé dans la littérature, à cet âge le système immunitaire est suffisamment développé pour être considéré comme mature. [ Bernthal et al. PLoS One 2010; Marriott et al. Bone. 2005; Sokhi et al. J Bone Miner Res. 2022; Prabhakara et al. Infect Immun. 2011; Yang et al. J Bone Joint Surg Am. 2015; Thompson et al. J Bone Joint Surg Am. 2017; Masters et al. PLoS Pathog 2020]
Altérations des microcircuits préfrontaux inhibiteurs dans l’addiction à la nicotine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
348 rats et rates vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de pose de cathéter intraveineux à demeure puis une chirurgie stéréotaxique de 45 minutes pour l'implantation de fibres de photométrie ou l'injection de vecteurs viraux, avant d'être entraînés à s'auto-administrer de la nicotine jusqu'au développement d'une addiction. Le porteur table sur une attrition de 20 % au bout de trois mois d'expérience et fixe pour cela les groupes comportementaux à quatorze individus. Il conclut que l'addiction, trouble du comportement, "ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires" et qu'aucun modèle in silico valide n'existe.
Objectifs
Le but de ce projet est d’étudier le rôle des différents sous-types neuronaux du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Nous avons précédemment montré que le développement de l'addiction à la nicotine entraine des modifications de l'activité neuronale du cortex préfrontal chez le rat - une région du cerveau jouant un rôle clé dans le contrôle du comportement de recherche et de prise de drogue. Cependant, les mécanismes neuronaux locaux sous-tendant ces modifications d'activité du cortex préfrontal sont actuellement inconnus. Les réseaux corticaux du cortex préfrontal sont composés de neurones excitateurs mais aussi d'interneurones inhibiteurs locaux qui exercent un puissant contrôle sur l'activité du circuit du cortex préfrontal. Dans ce projet, nous chercherons tout d’abord à étudier le rôle respectifs des neurones excitateurs et des interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal dans l’addiction à la nicotine. Pour cela, les animaux seront tout d’abord entrainés à acquérir l’auto-administration intraveineuse de nicotine et à développer une addiction à la nicotine. Puis, nous mesurerons l’activité des différentes populations de neurones lors du développement de l’addiction à la nicotine. Enfin, nous chercherons à modifier l'activité de ces populations neuronales et à en évaluer les effets sur la consommation de nicotine.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de révéler les effets spécifiques de la nicotine sur les interneurones inhibiteurs du cortex préfrontal qui pourraient expliquer le développement de l’addiction à la nicotine, et constituerait donc une percée dans le domaine de la dépendance. Le développement de stratégies visant à inverser ou à prévenir ces changements d'activité neuronale pourrait éventuellement conduire à la découverte d'un traitement efficace contre la prise de tabac et conduire à l’arrêt du tabagisme. Enfin, comme nous proposons d’examiner l'activité neuronale du cortex préfrontal avant, pendant et après l'escalade de la consommation de nicotine, nous serons dans une position idéale pour identifier les dysfonctionnements neuronaux préexistants. Ainsi, notre projet devrait également fournir des informations sur les marqueurs neurobiologiques de la susceptibilité à l’addiction à la nicotine.
Procédures
Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...). Tous les animaux seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d’un cathéter intraveineux à demeure, puis à une chirurgie stéréotaxique pour la pose de fibres de photométrie ou pour l’injection de vecteurs viraux chémosensibles (45 min en moyenne). Toutes ces chirurgies sont effectuées sur une couverture chauffante en conditions aseptiques, sous anesthésie et analgésie profonde.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à différentes procédures successives dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie intraveineuse et à la chirurgie stéréotaxique, bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, des conditions aseptiques, suivi post-opératoire ...).
Devenir
Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin soit de prélever leurs cerveaux pour des expériences ex vivo d’électrophysiologie sur tranche ou de transcriptomiques, soit d’effectuer des contrôles histologiques pour vérifier l’emplacement des fibres de photométrie et l’expression des virus.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux ; et 2) l’addiction, contrairement à la dépendance physique, est un trouble du comportement et, en tant que telle, ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales du projet et les différents objectifs à remplir. Les expériences seront réalisées chez des rats males et des rats femelles répartis dans 3 groupes (1 groupe qui ne développe pas d’addiction, 1 groupe qui développe une addiction à la nicotine, et un groupe témoin non exposé à la nicotine), soit 6 groupes expérimentaux au total. Pour les expériences comportementales, en tenant compte du taux attrition estimé à 20% au bout de 3 mois d’expérience, il faudra démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Pour les expériences d’enregistrement de photométrie et de mesures ex vivo, l’effectif sera plus petit (n = 10) mais sera compensé par un grand nombre de mesures enregistrées par animal. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera de 348 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques.
Raffinement
Les animaux sont logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie (carprofène, dose 5mg/kg, sous-cutanée, 15min avant le début de la chirurgie) et anesthésie chimique (Kétamine 110mg/kg +Xylazine 15mg/kg, intrapéritonéale) ou gazeuse (isoflurane), sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante et durent entre 30min-1h. En fin de chirurgie, l'animal reçoit une injection sous-cutanée de NaCl pour favoriser la réhydratation. Il est ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil (i.e., remise sur pattes et locomotion) avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal est relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère pendant une période de récupération de 7-10 jours durant laquelle les animaux sont sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Avant le début des expériences, les animaux sont manipulés tous les jours et habitués aux cages expérimentales (pendant 2 jours consécutifs à raison de 2h/jour) afin de limiter le niveau de stress et d’anxiété des animaux. Plusieurs critères sont pris en compte pour quantifier le niveau de souffrance de l’animal et décider de procéder à sa mise à mort. Ces critères incluent une perte excessive de poids, une diminution de la température corporelle, une dégradation de l’apparence physique (manque de soin, pelage sale) et une altération anormale du comportement (hyper ou hypoactivité, agressivité défensive, repli sur soi), ces performances comportementales. Ces manifestations éventuelles sont donc suivies quotidiennement par des méthodes non invasives (inspection et manipulation quotidiennes ; pesée régulière [3 fois par semaine]). Lorsque l’un des critères ou point limite est franchi, l’animal est mis à mort dans les plus brefs délais. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux de la nicotine mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels et à l'addiction aux drogues.
Etude des effets d’un anticorps monoclonal bloquant l’interaction de l’activateur tissulaire du plasminogène et du récepteur N-Methyl-D-Aspartate dans des contextes pathologiques de type neurovasculaire ou neurodégénératifs chez la souris.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
1 600 souris mâles vont être utilisées, chacune traversant jusqu'à trente jours de protocole entre une chirurgie cérébrale d'une heure, des passages en IRM sous anesthésie et des injections répétées. Toutes le sont dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées, tissus prélevés. Le protocole inclut aussi des laparo-thoracotomies pour lesquelles le porteur indique qu'un morphinique fort est préconisé par le vétérinaire de l'établissement. L'objet est de déterminer la dose efficace d'un anticorps humanisé dans des modèles d'AVC, de sclérose en plaques et de traumatisme crânien, le développement d'un traitement transposable à l'être humain restant annoncé au conditionnel et "à terme".
Objectifs
L’objectif de cette étude est de déterminer la dose efficace d’un anticorps humanisé (LYS241) bloquant l'interaction de l'activateur tissulaire du plasminogène avec les récepteurs N-Methyl-D-Aspartate (NMDAR) dans des modèles de pathologies neurologiques incluant l’accident vasculaire cérébral, la sclérose en plaques et le traumatisme crânien. Ce projet permettra également de comparer cet anticorps avec des molécules approuvées en clinique dans les différentes pathologies étudiées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer la dose efficace d'un anticorps monoclonal humanisé dans différentes pathologies du système nerveux central. Ce projet vise également à développer, à terme, un nouvel agent thérapeutique transposable à l'homme.
Procédures
A J0, 150 animaux subiront pendant 1h une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. . A J+1, 150 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l'IRM pendant 15 minutes. A J+5, 50 animaux subiront une anesthésie générale de 30 minutes pour passer à l'IRM et recevront une injection intraveineuse. A J+30, 150 animaux recevront une injection sous-cutanée et seront euthanasiés sous anesthésie générale. A J0, 180 animaux subiront pendant 1h une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v.. A J+1, 180 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l'IRM pendant 15 minutes. A J+5, 60 animaux subiront une anesthésie générale de 30 minutes pour passer à l'IRM et recevront une injection intraveineuse. A J+30, 180 animaux recevront une injection sous-cutanée et seront euthanasiés sous anesthésie générale. A J0, 80 animaux subiront pendant 30 minutes une chirurgie cérébrale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. A J+1, 80 animaux subiront une anesthésie générale pour passer à l'IRM pendant 15 minutes puis une injection sous-cutanée avant euthanasie sous anesthésie générale. A J-1, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront 4 injections sous-cutanées. A J0, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront un injection intrapéritonéale. A J+2, 100 animaux auront un patch anesthésiant posé sur le dos pendant 1 heure puis recevront un injection intrapéritonéale. A J+3, J+10 et J+17, 100 animaux recevront une injection intrapéritonéale. A J+25, 100 animaux recevront une injection sous-cutanée avant euthanasie sous anesthésie générale. A J0, 100 animaux subiront une chirurgie cérébrale pendant 20 minutes sous anesthésie générale, une injection sous-cutanée et une injection i.v. A J+1, 100 animaux subiront une anesthésie générale pendant 15 minutes pour passer à l'IRM. A J+21, 100 animaux recevront une injection sous-cutanée puis sous anesthésie générale seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
Selon la procédure, des nuisances ou effets indésirables sont à prévoir sur les animaux. Toutes les douleurs liées à des lésions de la peau des animaux (comme l’insertion d’une aiguille par exemple) seront empêchées par l’utilisation de la lidocaïne en spray ou en crème 5min avant le geste. Ces douleurs seront temporaires et se résorbent sous 48h. Pour les procédures pour lesquelles la douleur est plus importante, nous utiliserons un morphinique en injection sous-cutanée. Enfin, pour les procédures où la chirurgie est estimée la plus sévère, comme la laparo-thoracotomie, sur conseil du vétérinaire affilié à notre laboratoire, un morphinique fort est préconisé. Un morphinique pourrait être utilisé en intra-péritonéal. Le choix se porte sur ce morphinique car il agit en 3-5 minutes et est effectif sur une durée de 20-25 minutes chez la souris, temps suffisant pour effectuer la mise à mort par perfusion intra-cardiaque. Les procédures relatives aux évaluations comportementales ou d’imagerie sont indolores, mais peuvent engendrer un léger stress qui ne perdure pas dans le temps, dû soit à un nouvel environnement soit à l’isolement social. Les animaux retournent à un état basal dès qu’ils sont de retour dans leur cage et leur boxe de stabulation.
Devenir
Le sort prévu de tous les animaux de toutes les procédures de cette demande d'autorisation de projet est la mise à mort et tissus récupérés.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'informations. Nous avons sélectionné les modèles présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En amont de l'expérimentation animale, des méthodes alternatives in vitro existantes répondant au mécanisme d'action de la molécule d'étude ont déjà été employées, nous permettant de justifier le passage de l'in vitro à l'in vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Conformément à la règle des 3Rs, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, selon nos précédents travaux publiés et la littérature. De plus, n’ayant pas d’intérêt pour une étude de l’impact du sexe des animaux dans le contexte proposé et afin de réduire le nombre d’animaux dans ce projet, uniquement des souris du sexe mâle seront utilisés. 1600 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, comprenant la réalisation de tests comportementaux et d’outils d’imagerie permettant d'évaluer la récupération fonctionnelle et anatomique in vivo du système nerveux central des animaux. Tous les animaux seront sujets à ces explorations complètes dans le but de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Bien que chaque animal sera surveillé de près, pendant et après les procédures, peut arriver d’observer une mortalité non attendue ou une l’exclusion d’animaux pour diverses raisons, telles qu’un problème à l’exposition aux agents anesthésiques, une perte de poids trop importante et manque d’appétit de l’animal, d’évènements de dépression respiratoire. Concernant l’approche statistique, nous prévoyons d’employer des tests paramétriques puisque nos échantillons sont indépendants et que nous comparerons, dans la plupart des cas, des groupes entre eux et ce, en fonction de différents temps.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement sont utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux, notamment par l'hébergement en groupes sociaux de 5 ou 6 animaux, l'enrichissement de leur environnement (maison, paillettes coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié et cela pendant toute la durée du projet afin de veiller à leur bien-être. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable tels qu'une perte de poids maximale de 15%, un arrêt de prise alimentaire et de boisson, une absence de réaction aux stimuli extérieurs, une échelle de douleur importante, des signes de douleurs extérieurs et une réduction importante de l'activité motrice. Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique adaptée au niveau de sévérité du geste, durant chaque procédure. Enfin, tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son et ne présentent aucun trouble du comportement lié aux protocoles.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des pathologies neurologiques. L’anatomie du système nerveux ainsi que la physiologie de la souris sont également documentées et relativement proches de ceux de l’Homme. C’est donc via l’utilisation d’approches expérimentales fiables et maitrisées, que la souris représente un bon modèle pour ce projet de recherche. En effet, l’ensemble des connaissances dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement adéquate à cette étude. Tous les animaux utilisés pour les expériences de cette demande de projet seront âgés entre 8 et 12 semaines. Ces âges ont été retenus car considérés comme âge « jeunes adultes », l’âge le plus couramment utilisé dans la littérature.
Étude des propriétés nucléaire dans la physiologie du muscle squelettique
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les souris utilisées portent une invalidation génétique conditionnelle d'un gène musculaire, activée par cinq administrations orales de tamoxifène. Elles sont 420, dont 84 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 168 modéré et 168 sévère, toutes tuées à l'issue. 168 reçoivent une injection de cardiotoxine qui détruit le muscle de la patte, et toutes passent une épreuve de course d'environ une heure trente d'endurance ainsi qu'une mesure de force par électrostimulation sous anesthésie. Le cumul de l'électrostimulation et de la course peut induire un stress et de la douleur, reconnaît le porteur, et la mise à mort sert à prélever les muscles pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Près de la moitié de la masse du corps humain est composé de muscles striés squelettiques. Ceux-ci sont composés de milliers de cellules géantes (les fibres musculaires), pouvant atteindre des 10aines de centimètre de long. Nos travaux ont montré que l’intégrité fonctionnelle des fibres musculaires est contrôlée par le positionnement des noyaux le long de la fibre. Les travaux de notre équipe ont permis l’identification d’une protéine impliquée dans le positionnement des noyaux dans les fibres musculaires formées in vitro. Notre étude cherchera à quantifier l’impact de l’absence de cette protéine dans les fibres musculaires sur (1) la fonctionnalité musculaire et (2) au cours de la régénération musculaire chez des souris jeunes et âgées grâce à un modèle de souris invalidé pour notre gène d’intérêt spécifiquement dans les fibres musculaires. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels la mécano-transduction nucléaire contrôle la physiologie du tissu musculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise la compréhension du contrôle de la fonctionnalité du muscle squelettique dependant d'une protéine nucléaire, qui conditionne les performances musculaires. Les résultats qui découleront de ce projet nous permettront de comprendre le rôle de notre protéine d'interêt dans le tissu musculaire mais également lors de la régénération musculaire. A terme, ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels le noyau contrôle la physiologie du tissu musculaire et d’identifier ainsi une nouvelle cible thérapeutique dans les maladies musculaires associées.
Procédures
- une injection intramusculaire dans le muscle releveur de la patte sera réalisée sur certains animaux (168/420). Elle dure moins de 5 secondes et sera réalisée sur animaux anesthésiés. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après la lésion musculaire. - administration par voie oral de souris avec un mélange d'huile de maïs contenant du tamoxifène ; il dure moins de 20 secondes et est répété 5 fois (108/420). - Épreuves de course, 1 fois dans leur vie. L’habituation dure de 10 min à 15 min au fil des 4 jours ; la mesure de la vitesse maximale aérobie environ 30 min, l’endurance environ 1h30 (toutes les souris). - Mesure de force musculaire par stimulation musculaire sous anesthésie générale, 1 fois dans leur vie : chaque intervention durera au maximum 30 minutes. Deux injections d’analgésique (anti-douleur) seront également réalisées avant et après mesure de force (toutes les souris).
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé n’ont pas montré de problèmes détectables sur le comportement, l’activité et ou la prise de poids des souris. L’administration de tamoxifène dans les souris par voie oral pourra causer une douleur légère et brève aux animaux. Aucune faiblesse musculaire, reflétée par des problèmes de locomotion ou activité ne sont observables suite à cette procédure. L’injection de cardiotoxine dans le Tibialis Anterior entraine la destruction du tissu musculaire. Suite à cette injection, le processus de régénération musculaire va se mettre en place instantanément après la blessure et entrainer une régénération complète du muscle en moins de 7 jours. L’injection étant localisée sur un seul des muscles composant la patte, les conséquences fonctionnelles sur la locomotion de la souris sont limitées et ne sont présentes que pendant les premières 24h. En effet, après le réveil, les souris circulent normalement dans la cage. Certaines présentent parfois une rétractation des pattes traitées, qui disparaît en quelques heures, sans modification de la mobilité ni signe de souffrance. Dans tous les cas elles accèdent à la nourriture et à la boisson sans difficulté apparente. Les animaux sont surveillés quotidiennement. En cas de toute anomalie visible locale (gonflement anormal de la patte, infection au niveau du point d’injection, non utilisation de la patte, hémorragie visible) ou générale (prostration de l'animal, démangeaison, lésion, poil hirsute etc..), de mobilité réduite ou d'inconfort visible, l'animal est mis à mort. Des nuisances modérées sont attendues du fait d’un cumul d’actes (électrostimulation et course sur tapis) qui peuvent induire un stress et de la douleur chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses histologiques, biochimiques et moléculaires.
Remplacement
Des études in vitro à partir de cellules primaires murines permettant la formation de myotubes et de myofibres ont été réalisées en présence ou en absence de notre protéine d'interêt. Cette méthode nous a permis de mettre en évidence ses premiers rôles dans la formation des fibres et l’homéostasie musculaire. Il est désormais nécessaire d’utiliser un nouveau modèle murin in vivo afin de confirmer nos résultats précédents. En effet, l’homéostasie musculaire regroupe plusieurs mécanismes complexes d’interaction entre différents acteurs que nous ne pouvons reproduire dans notre système de culture de cellules primaires in vitro précédemment utilisé. De plus, la régénération musculaire repose sur un ensemble d’interactions complexes entre les tissus lésés, le système immunitaire et vasculaire ainsi que sur la coordination efficace de nombreux types cellulaires.
Réduction
Grâce à nos connaissances accumulées sur les tests d’effort chez les souris et les études ex vivo réalisées, nous pourrons optimiser le nombre de lots et le nombre d’animaux par lot pour les réduire autant que possible, tout en gardant des effectifs permettant d’atteindre une pertinence statistique. La taille de l’échantillon (7 souris pour chaque analyse et 12 pour les tests fonctionnel (course, force) a été déterminée par des outils d' analyses statistiques. Pour la mesure de force, nous utilisons un dispositif expérimental utilisable in vivo qui permet de réaliser des protocoles de mesure de force musculaire de manière longitudinale sur les mêmes animaux sur l’ensemble du protocole (force, course, force). Cette innovation réduit également la variabilité expérimentale inter-animale.
Raffinement
Avant le début de chacune des procédures, les animaux suivront une période d’acclimatation à leur environnement d’au moins 1 semaine, nécessaire à l’adaptation de leur comportement et à la réduction du stress. La procédure 2 consiste en une injection intramusculaire simple. C’est la procédure la moins invasive et douloureuse pour étudier la régénération musculaire, ne nécessitant aucune chirurgie. Un analgésique sera administré aux animaux avant le début de cette procédure et l’injection de cardiotoxine sera réalisée sous anesthésie dans le but de réduire au maximum un état de stress et de souffrance chez les animaux. Les animaux seront hébergés en groupe, et des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition : coton et cabanes. Comme la locomotion des animaux sera limitée pendant les premières 24h, des croquettes mouillées seront ajoutées au sein des cages pour leur permettre une alimentation et hydratation constante. De l’eau en gel sera également ajoutée au sein des cages. L’analgésie sera poursuivie les jours suivants autant que de besoin. Une analgésie avant et après le test de mesure de force musculaire sera également effectuée. Enfin, pour chaque procédure, des points limites ont éte établis, prenant en compte des critères refletant la souffrance des animaux et permettant ainsi de mettre fin précocément à la procédure.
Choix des espèces
La composition et le fonctionnement du tissu musculaire murin est proche de celui de l’être humain, faisant du modèle murin un modèle pertinent pour l’analyse de gènes impliqués dans l’homéostasie cellulaire. De plus, les modèles transgéniques proposés dans cette étude sont conditionnels et l’un d’eux est inductible, permettant la délétion de notre gène d’intérêt dans un type cellulaire spécifique et à un moment voulu. Des souris jeunes, âgées de 8 à 12 semaines (2 mois) et de 12 mois seront utilisées. Entre 8 et 12 semaines, les souris ont fini leur croissance et atteignent l’âge adulte dit « mature », ce qui permet d’observer la régénération et les performances physiques dans un contexte de muscle squelettique adulte jeune. Un deuxième temps à 12 mois est utilisé car nos données montrent qu’après 12 mois, une nouvelle voie de signalisation contrôle le fonctionnement musculaire en lien avec le postionnement nucléaire.
Mesure de l’activité de composé pharmacologique dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë (ALI) chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Des composants de paroi bactérienne administrés dans les voies aériennes provoquent chez les souris un bronchospasme et une chute de température pendant cinq à huit heures. 880 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par exsanguination intracardiaque sous anesthésie, plus de 60 % du volume sanguin étant prélevé. Elles reçoivent les candidats médicaments une à deux fois par jour pendant un à trois jours et subissent jusqu'à cinq prélèvements de sang à la queue. Le chiffre de 880 correspond à 20 candidats médicaments évalués sur cinq ans "selon l'hypothèse la plus défavorable", sans que le RNT précise de quelles molécules ni de quel commanditaire il s'agit.
Objectifs
Les lésions pulmonaires aigues surviennent chez les patients atteint d’une pneumonie et est l’une des causes de décès les plus fréquentes au monde. Une inflammation excessive en réponse à l’infection provoque une atteinte sévère des poumons (lésions vasculaires et bronchiques), qui peut se manifester sous forme d’un syndrome de détresse respiratoire identifié comme une dyspnée, habituellement accompagnée d’une respiration accélérée et superficielle. Des traitements préventifs et curatifs contre les origines des pneumonies (bactérienne, virale, fongiques…) sont disponibles, de même que des soins palliatifs (ventilation mécanique, oxygène) mais il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de promouvoir une résolution efficace et rapide de l’inflammation dans le but de limiter les atteintes et le remodelage du tissu pulmonaire. Les anti-inflammatoires disponibles actuellement ont pour la plupart des effets immunosuppresseurs qui présentent un danger pour le traitement de l’infection. Il apparaît donc nécessaire de mettre au point des traitements capables de maintenir une immunité spécifique active tout en favorisant un contrôle local et une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires. Notre objectif est d’évaluer l’activité de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par l’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (lipopolysaccharides) chez la souris.
Bénéfices attendus
La mesure de l'activité de composé pharmacologique dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë (ALI) permettra de sélectionner les plus efficaces, capables de contrôler l’inflammation locale et promouvoir une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires sans perturber l’immunité spécifique. Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients atteint de pneumonie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections pour d'administrer les candidat-médicaments étudiés. Ces composés pourront être administrées sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 3 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres inflammatoires (cellules, cytokines…) au cours du temps, un maximum de 5 micro-prélèvements de sang (35µl, sur animaux vigiles et non contraints), sur une durée minimum de 48h, seront réalisés à l’extrémité de la queue. A la fin de l’expérience, lorsque des prélèvements doivent être effectués, les animaux seront mis à mort par exsanguination par le prélèvement du sang par voie intracardiaque transthoracique (>60% du volume circulant) sous anesthésie. La combinaison entre la forte surdose d’anesthésique et la chute de la pression sanguine et l'hypovolémie extrême résultant du prélèvement précipite la mort de l'animal dans les secondes qui suivent le prélèvement.
Impact sur les animaux
Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. L’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (LPS, lipopolysaccharides) induit une baisse de l’activité de l’animal au réveil de l’anesthésie et est accompagnée d’un bronchospasme (ayant pour effet une baisse visible de la fréquence respiratoire) et une baisse de la température dans les 5 à 8 premières heures.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses
Remplacement
Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament. Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur activité.
Réduction
La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 (groupes contrôles) à 6 animaux par groupe. Ce nombre d'animaux permet une analyse statistique efficace des résultats pour la mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire ≥30% avec une incertitude inférieure à 5%. Pour les études qui requiert la mesure du bronchospasme et/ou le suivi des populations leucocytaires dans le sang, 6 à 8 animaux pour chaque groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des variations généralement plus faible. D’après notre expérience, nous estimons que 20 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 880 souris selon l’hypothèse la plus défavorable.
Raffinement
La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les animaux seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur a compter de la récéption des animaux puis plusieurs fois par jour après le début de la procédure expérimentale. Les souris seront anesthésiées pour permettre les administrations intranasales et intratrachéales. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont des expérimentations et la séléction des candidats-médicaments ayant le meilleur rapport benefice/risque, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue. Tout signes de douleur ne pourra être suivi de mesure corrective et les animaux seront mis à mort dès l’atteinte de l’un des points limites. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des réactions inflammatoires, avec de multiple modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires et respiratoires sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines afin que le système immunitaire des animaux soit mature.
Thrombolyse et inflammation : Impact des traitements thrombolytiques sur la réponse inflammatoire et les transformations hémorragiques lors des accidents vasculaires cérébraux ischémiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit 70 minutes de chirurgie sous anesthésie pour la pose d'un cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie, avec dissociation du muscle masséter, puis deux passages en IRM de 34 minutes au total. L'objectif est de mesurer l'effet de traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale après un AVC provoqué, les tissus étant récupérés après la mise à mort pour analyse immunohistochimique. Le porteur indique avoir retenu "le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce", la souris étant selon lui l'espèce la plus étudiée dans ce domaine.
Objectifs
Cette étude vise à comprendre l'implication de traitements thrombolytiques dans les processus inflammatoires qui surviennent lors d'un accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, et notamment sur l'infiltration des neutrophiles du compartiment vasculaire vers le tissu cérébral ainsi que sur l’apparition des transformations hémorragiques. Des études précédentes montrent que l'utilisation de rtPA (Actilyse), le traitement actuel de la phase aigue des AVC ischémiques, pour permettre la lyse du caillot sanguin et induire une reperfusion du tissu cérébral peut également moduler l'infiltration des neutrophiles dans le tissu cérébral ainsi qu’une augmentation des transformations hémorragiques. La contribution du rtPA dans ces mécanismes inflammatoires reste à déterminer. Dans ce projet, nous allons également nous intéresser à l’impact d'autres traitements thrombolytiques. L'objectif de notre projet est de comprendre les effets des traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale et les transformations hémorragiques à la suite des AVC ischémiques. Afin de représenter les différentes situations qui se produisent en clinique, nous étudierons les effets de ces traitements thrombolytiques sur deux modèles murins d'AVC ischémique : un modèle thromboembolique où l'injection i.v. de traitements thrombolytiques permet la reperfusion du tissu cérébrale et un modèle thrombotique où l'injection de traitements thrombolytiques est inefficace sur la reperfusion. De plus nous allons étudier l'impact de ces traitements sur la réponse inflammatoire dans le contexte d'une thrombolyse précoce et tardive afin de mimer les différents contextes possibles en clinique.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'apporter de nouvelles connaissances sur l'impact des traitements thrombolytiques sur l'inflammation cérébrale et ainsi nous permettra de proposer de nouvelles pistes pour de potentielles stratégies thérapeutiques en pour améliorer la thrombolyse lors des AVC ischémiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h et à 5 jours après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale pour une durée totale de 34 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient des douleurs postopératoires après l’induction de l’AVC ischémique, notamment dû à la dissociation du muscle masséter pour procéder à la craniotomie. Les animaux sont susceptibles de perdent de la masse corporelle et de ressentir un stress après les anesthésies et l'induction du modèle d’AVC. Des déficits fonctionnels pourraient également survenir suite à l’AVC.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours de ce projet (480 animaux) seront mis à mort. Les tissus récupérés seront necessaires pour les futures analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 480 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrale et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total :480) a été évalué via un test statistique.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le reveil des animaux à l'issu de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est controlée et adaptée au bien être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence comme d’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la thrombolyse, la neuroprotection et la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude. Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature dans l'étude de la neuroinflammation et des AVC.