Recherche fondamentale

120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour les prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux examens d'imagerie de l'œil sous anesthésie gazeuse, un électrorétinogramme de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, et pour une partie d'entre elles une exposition à une lumière forte pendant trois heures, éveillées. L'objectif est de mesurer ce que devient la rétine quand une protéine protectrice manque, dans une lignée dont le porteur précise qu'elle ne développe pas de maladie grave. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit un trajet optique complet et conclut qu'il n'y a "pas d'alternative" in vitro.

Objectifs

Les Rétinopathies Pigmentaires (RP) touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, les photorécepteurs à bâtonnets puis à cônes, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. Les études menées antérieurement par l’équipe sur les RP ont mis en évidence un gène qui code pour des facteurs ayant une fonction protectrice sur les cellules touchées. Une des deux protéines est sécrétée par un type de photorécepteurs, les batônnets et a une activité protectrice sur le 2ème type de photorécepteurs, les cônes. Le second produit du gène, joue un rôle protecteur contre l'oxydation. Pour ce faire, nous avons étudié les conséquences de l’absence d'un des produits du gène à l'aide d'un modèle de souris transgénique sur la fonctionnalité des photorécepteurs lié au stress oxydatif en comparaison avec des animaux contrôles.

Bénéfices attendus

Les rétinites pigmentaires (RP), sont les formes les plus communes des dégénérescences rétiniennes congénitales. Elles touchent environ une personne sur 4 000 dans les pays occidentaux, et se caractérisent par une perte progressive des cellules de la rétine, entraînant une perte progressive de la vision allant jusqu'à la cécité. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer. La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de comprendre le rôle des différentes molécules dans le maintien de la vision afin de pouvoir trouver des cibles thérapeutiques efficaces permettant de ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer.

Procédures

- L’imagerie oculaire: examens réalisés sous anesthésie gazeuse sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée : 20 minutes par animal et par passage. Examen réalisé 2 fois par animal, espacé de 2 semaines. - Electrorétinogramme: examen réalisé sous anesthésie générale sur des animaux agés entre 2 et 6 mois. Durée 45 minutes. Examen réalisé une seule fois par animal. - Surexposition lumineuse pendant 3 heures sur animal vigile avec une seule mesure tout au long de l'expérience. Les animaux testés pour la surexposition lumineuse, auront avant le test, une injection sous-cutanée de sérum physiologique puis une pesée avant et après le test de surexposition lumineuse pour évaluer l'effet de cette surexposition sur une déshydratation éventuelle.

Impact sur les animaux

L'anesthésie générale peut entrainer chez la souris une hypothermie avec un possible arrêt cardio-respiratoire. La contention légère de l'animal pour les injections intra-péritonéales et les examens phénotypiques de l'œil peuvent entrainer un léger stress des animaux. Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées peuvent être considérées comme une nuisance de douleur légère et de courte durée dû à l'introduction de l'aiguille Le changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) peut aussi générer un léger stress chez ces derniers. L'exposition des animaux à une lumière forte peut entrainer une déshydratation se traduisant par un poil hérissé dû au positionnement de la cage, placée en dessous des néons et séparés par une plaque en plexiglass.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure expérimentale pour les analyses post-mortem. L’euthanasie est requise afin de procéder aux différents prélèvements nécessaires en vue des analyses à mettre en œuvre pour répondre à la question scientifique

Remplacement

L’étude de la fonctionnalité de la rétine ne peut être réalisée sur des modèles de cellules en culture. Il y a nécessité d'avoir la rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Dans ce projet, le modèle animal développé s'inscrit dans certaines caractéristiques de pathologies. Il n’y a donc pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement en fonction des naissances. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant pour assurer la robustesse de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel adapté. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque groupe a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe, en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe) et des contraintes techniques (rentabilité technique). Ce projet impliquera au maximum 120 souris.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée. Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant les expérimentations. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure chargée du bien-être de l'animal. L’application de cette échelle adaptée à nos expérimentations pourra nous amener à décaler dans le temps les actes prévus dans la séquence expérimentale. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale adaptée. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien-être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées avec un logiciel adapté. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Le raffinement réside aussi dans le fait de concevoir les expériences en limitant au maximum l'utilisation de groupes contrôles surnuméraires. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés.

Choix des espèces

Nous utilisons un modèle de souris transgénique permettant d'étudier le rôle de notre protéine d'intérêt. Cette souris ne présente pas de phénotype dommageable car elle n'entraine pas le développement d'une maladie grave. Nous avons sélectionné cette espèce car la rétine de la souris est semblable en plusieurs points à celle de l’Homme (organisation des couches neuronales, les membranes, la vascularisation, les circuits). Nous voulons commencer les études juste avant l’apparition de modification de la structure de la rétine (du fait du modèle animal). Les animaux auront environ deux mois à leur entrée dans les procédures expérimentales.

48 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque femelle retenue passant dix fois deux heures sous anesthésie, intubée et sous myorelaxant, à raison d'une acquisition IRM par semaine pendant dix semaines. Vingt-quatre femelles gestantes sont d'abord anesthésiées pour dater leur gestation, avec un prélèvement de 12 mL de sang. Aucune n'est tuée, elles sont sorties de leur groupe social le temps des acquisitions puis réintroduites, et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Le porteur écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de façon répétée pendant plus de dix semaines, et applique précisément ce protocole à des babouines gestantes.

Objectifs

Ce projet inter-disciplinaire rassemble des spécialistes en anatomie corticale, analyse de données, physique de l'IRM, primates-non-humains, neuroradiologie foetale, et anesthésie. Il doit etre effectué sur 2 EUs. Le sujet est l'étude du développement cortical pré-natal en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Notre objectif est de construire et partager une base de données longitudinale d’images du cerveau foetal en développement chez des primates non-humains (babouins, Papio Anubis), avec une très bonne résolution temporelle. Cette base de données unique en son genre permettra d’observer le cerveau en développement à raison d’une image IRM par semaine entre les 14eme et 24eme semaines de gestation, période pendant laquelle le plissement cortical se forme et change de manière très importante. Aucune base de données de ce type n’existe à l’heure actuelle, alors qu'une telle ressource est cruciale pour l’étude et la compréhension du développement cérébral pré-natal et des pathologies associées. La base de données constituée sera mise à disposition librement auprès de la communauté de neuro-imagerie. Une étude pilote a déjà été effectuée en 2019, approuvée par le comité d'éthique local, et a permis de démontrer la faisabilité du projet et d’en préparer la réalisation en développant et optimisant les aspects les plus critiques de telles acquisitions IRM : anesthésie, prise en charge des animaux, séquences d’acquisition, et pré-traitement des données. Une saisine déposée en 2020 pour 4 ans a permis l'acquisition de 2 sujets après le pilote, il s’agit maintenant de mettre en oeuvre notre démarche expérimentale sur 8 femelles gestantes afin de constituer une vraie base de données. Nous réaliserons 10 acquisitions avec une semaine d’intervalle entres chacune d’entre elles, sur chacune des dix femelles (et donc leur foetus). Le pilote a permis d'optimiser et calibrer 3 éléments : le protocole d’anesthésie, maintenant la mère dans des conditions physiologiques stables et sans neuro-toxicité pour le foetus ; les séquences d’acquisition IRM, pour imager de manière optimale un volume d’intérêt très petit dans des conditions difficiles; et la reconstruction des données, spécifique à ce genre d'acquisitions. Ce projet innovant et difficile à réaliser aura des conséquences à court et à long terme sur l’imagerie foetale clinique, la compréhension du développement cérébral, et les pathologies neurologiques associées.

Bénéfices attendus

Les mécanismes sous-tendant le développement cérébral humain restent encore trop largement inconnus. En particulier, la gyrification, c’est-à-dire la manière dont le cortex cérébral se plisse pendant le développement in-utero, et ses liens avec la connectivité cérébrale, ne sont pas encore compris. Pourtant, la gyrification est un marqueur important du développement et des défauts de gyrification sont associés avec nombre de pathologies neurodéveloppementales ou de pathologies neuropsychiatriques. Comprendre et caractériser le développement in-utero permettra donc d’améliorer la compréhension de ces pathologies, et parfois de permettre leur détection précoce pour une prise en charge le plus tôt possible.

Procédures

Pour chaque femelle : anesthésie pour la datation de la gestation (EU2) avec prélèvement sanguin de 12 mL (1h d'anesthésie maximale) . Une fois pour chacune des 24 femelles au maximum. Pour les femelles incluses dans l'acquisition de données IRM : transport (EU2, durée de 1h à 1h30), séparation du groupe social (EU2), puis dans l'EU1: anesthésie, intubation / ventilation, mise sous myorelaxant, et acquisition IRM pour une durée totale de deux heures. 10 fois (une fois par semaine pendant 10 semaines). Reintroduction dans le groupe social (EU2).

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets n'ont pas besoin d'être mis à mort pour les objectifs scientifiques du projet et seront maintenus en vie. Ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

La législation française ne permet pas d’acquérir de données IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines. Cependant, proximité phylogénétique entre primates non-humains et humains, modèles développementaux existants, et connaissances en anatomie comparée, permettent d’affirmer qu’observer le cortex d’un primate non-humain gyrifié (dont le cortex est plissé) permettra d’inférer des informations extrapolables à l’humain.

Réduction

Pour chacune des femelles, 10 images seront acquises pour observer le cerveau du foetus longitudinalement pendant 10 semaines consécutives. Nous disposons déjà de données pour 2 femelles. Nous en incluons donc 8 pour obtenir une base de données de 100 images. La variabilité inter- sujets chez l’humain est telle qu’on estime qu’il faut au moins 50 sujets pour la caractériser. Cette variabilité est plus limitée chez le babouin, nous avons réduit le nombre de sujets à 10, un minimum pour observer des motifs de plissement variables et être capables de produire des statistiques descriptives suffisamment robustes et généralisables. Pour acquérir des données avec 8 femelles et leur foetus, nous sommes amenés à prévoir 12 femelles et leur foetus pour anticiper des exclusions portentielles, et donc à procéder à une datation de gestation sur 24 femelles et leur foetus pour garantir d'en retenir 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EU2 dans les zones d’hébergement expérimentales (en dehors de leurs groupes sociaux d’origine) avec au moins un congénère. Cette décision est une mesure de raffinement car la capture à répétition du même individu dans son groupe d’origine implique la manipulation de tous ses congénères ce qui induit un stress supplémentaire pour eux ainsi qu’une augmentation significative du temps de capture de l’animal. Tous les animaux feront partie d’un programme d’enrichissement lié au nourrissage quotidien impliquant au moins 4 moments par jour avec accès à fruits, légumes et graines, ainsi qu’au moins deux enrichissements à manipuler par jour. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien par l'équipe de zootechnie et vétérinaire selon les procédures mises en place par la Structure du bien-être animal de l'EU2. Lors de la capture et transfert hebdomadaire de l'EU2 à l'EU1, une méthode sans contention est privilégiée, consistant d’abord à isoler l’animal et le transférer dans une boite de transport accolée à la cage d’hébergement pour remise en cage de transport. Pendant le transport, les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport. Le compartiment du véhicule agrée est climatisé si besoin. Chaque animal (mère) sera mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec le maintien d’un accès à de l’eau (sucrée) tel que le prévoient les procédures de routine de l'EU2. Les acquisitions IRM sont réalisées sous anesthésie, pendant lesquelles les animauxseront surveillés et monitorés. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. A l'issue de la dernière acquisition, la femelle et son congénère seront réintroduits dans leur groupe social d'origine. La femelle sera alors surveillée quotidiennement jusqu'à la mise bas. Une fois le bébé né, celui-ci sera surveillé quotidiennement par l'équipe de zootechnie et vétérinaire pendant 6 mois, pour s’assurer de son développement normal.

Choix des espèces

Parmi les espèces sur lesquelles une expérimentation est possible, les babouins sont l’espèce phylogénétiquement la plus proche de l’humain et celle offrant l’indice de gyrification le plus proche de l’humain (la gyrification étant le phénomène qui nous intéresse ici). Il s’agit aussi de l’espèce la plus grosse que nous puissions utiliser dans une IRM, ce qui est critique pour faire des acquisitions sur un cerveau de foetus, donc de très petite taille. Femelles gestantes et foetus entre la 8eme et la 24eme semaine de gestation. La 10ème semaine est celle à laquelle la datation de gestation par échographioe sera faite. Puis pour les foetus inclus, il seront scannés par IRM entre la 14eme et la 24eme semaine de gestation. Cet intervalle de gestation correspond à la période pendant laquelle la gyrification du cortex se met en place. Les 3 dernières semaines de gestation (25-27.5) ne peuvent être utilisées car le déplacement des femelles représente un risque d'avortement spontané.

Nées avec une croissance dentaire anormale, des dents trop longues et incontrôlées pour certaines, rabougries pour d'autres, 2700 souris génétiquement modifiées sont élevées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À dix jours, chacune se voit couper un morceau de queue pour vérifier son génotype. Le porteur indique que la douleur y serait alors faible, voire nulle, l'ossification de la queue n'ayant pas commencé, et prévoit de la nourriture en gelée et des bâtonnets à ronger pour compenser les difficultés à s'alimenter. Cet élevage ne répond par lui-même à aucune question scientifique, il alimente de futures demandes d'autorisation sur les macrophages, et les animaux conservés à l'issue rejoignent d'autres projets.

Objectifs

Nous élevons une lignée de souris génétiquement modifiées qui présente un phénotype spécifique, impliquant des altérations physiologiques et comportementales. Ces souris, en raison de modifications précises de leur génome, affichent une croissance anormale des dents. Cette anomalie dentaire peut entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui, à son tour, peut causer un retard de croissance et une diminution de leur poids corporel. Pour atténuer ces effets néfastes, nous mettons en place une prise en charge adaptée, incluant une alimentation spécifique qui compense les limitations dues à la croissance dentaire. Ces souris sont produites dans le but de répondre à des objectifs scientifiques variés. En raison de leur modification génétique, elles sont un modèle précieux pour étudier les rôles spécifiques de certaines cellules immunitaires, comme les macrophages, qui jouent un rôle crucial dans divers tissus du corps. La suppression de certaines populations cellulaires permet d'examiner en profondeur les conséquences de leur absence, ce qui est pertinent pour la recherche sur le développement et la régulation immunitaire. De plus, ces souris modifiées sont utilisées pour modéliser diverses pathologies comme le cancer ou l’étude des rôles homéostasiques des macrophages. Permettant ainsi dans l’avenir des applications biomédicales.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, la recherche sur les macrophages a émergé comme un domaine clé en immunologie. Ceci est dû à notre compréhension croissante du rôle vital de ces cellules dans l'homéostasie des tissus et leurs divers rôles significatifs dans différentes maladies tels que le cancer, les infections ou encore maladies auto-immunes. Le premier Conseil Scientifique Présidentiel réuni en avril 2024 a spécifiquement souligné les macrophages comme un "axe majeur et émergent" pour les années à venir. Ce modèle de souris va permettre d'étudier le rôle de plusieurs populations de macrophages dans divers tissus très localisés. Les différentes caractéristiques observées après génération des souris confirment d'ailleurs la nécessité de comprendre leurs fonctions et l'utilité de ce modèle pour y répondre.

Procédures

2700 souris se verront prélever un morceau de queue 10 jours après leur naissance.

Impact sur les animaux

Après la première génération de souris, nous avons observé que certaines étaient plus petites que leurs congénères du même groupe. Nous avons également constaté une croissance anormale des dents : certaines souris présentaient des dents nettement plus petites et plus fines, tandis que d'autres avaient des dents beaucoup plus longues avec une croissance non contrôlée. Ces deux problèmes pourraient être liés, la croissance anormale des dents pouvant entraîner des difficultés à s'alimenter, ce qui diminuerait la prise de poids. Un prélèvement de la queue sera réalisé sur les animaux 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le système nerveux de cette partie est encore immature et l’ossification de la queue inexistante.

Devenir

Les animaux qui sont conservés après la fin de cette étude seront utilisés dans le cadre d’autres projets de recherche. Cette utilisation continue permet de maximiser les données obtenues à partir des animaux tout en respectant les principes d'éthique de réduction du nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Ce projet décrit l’élevage de souris génétiquement modifiées en condition de maintien pour une lignée à phénotype dommageable. Ces souris seront utilisées pour de futures demande d’autorisation de projet interrogeant la fonction des macrophages ciblés. Les données de la littérature ont montré que chaque type de macrophage exprime un profil d’expression de gènes unique lui permettant de réaliser des fonctions propres à ce sous-type. Ce profil est induit par un ensemble de signaux fournis par son microenvironnement direct. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre le macrophage et son microenvironnement puisque nous ne connaissons pas l’ensemble des signaux.

Réduction

Nous maintiendrons un élevage à minima sur la base de 5 accouplements avec 1 mâle et 3 femelles par accouplement car cette lignée semble avoir des portées de petites tailles. Ces derniers seront renouvelés toutes les 26 semaines. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les descendants des accouplements précédents.

Raffinement

- de la nourriture en gelée sera ajoutée à chaque cage pour surmonter toutes les difficultés d'alimentation des souris. - Des bâtonnets de bois seront également ajoutés pour permettre le limage naturel des dents, qui seront contrôlées de manière hebdomadaire et coupées lorsque cela sera nécessaire. - Le statut de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux seront surveillés pendant cette période d’accouplement et d’élevage et des mesures adéquates prises en cas de comportement agressif allant de l’enrichissement de la cage en dômes, de mesures d’isolement temporaire en cas de comportement agressif, en l’’administration de crème par voie cutanée sur de possibles blessures pourront être mises en place si nécessaire.

Choix des espèces

L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est nécessaire pour de futures recherches. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement en fonction des projets dans lesquels ils seront impliqués. Par exemple, si nous nous intéressons au développement dentaire qui est altéré dans ce modèle, nous analyserons des souris durant les premières semaines après la naissance. Pour les projets étudiant le rôle des macrophages de la tête et du cou dans diverses pathologies (cancer, infection), des animaux adultes seront utilisés. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les individus âgés de 6 à 10 semaines au moment du début de l'accouplement.

48 babouins sont comptés dans ce projet, 24 femelles gestantes et leurs fœtus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué : les mères sont replacées dans leur groupe social et pourront être réutilisées dans d'autres projets. Chaque femelle retenue est capturée puis séparée de son groupe, transportée une heure à une heure trente vers un second établissement, anesthésiée, intubée, ventilée, mise sous myorelaxant et maintenue deux heures dans un aimant d'IRM, dix fois de suite à une semaine d'intervalle, le porteur reconnaissant un risque d'avortement lié au stress et aux anesthésies. Il écrit que la loi française interdit d'acquérir des images IRM chez une femme enceinte sans justification médicale, "encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines", et fonde sur cette interdiction le recours au babouin, l'espèce disponible dont le cortex se plisse le plus comme celui de l'humain.

Objectifs

Ce projet inter-disciplinaire rassemble des spécialistes en anatomie corticale, analyse de données, physique de l'IRM, primates-non-humains, neuroradiologie foetale, et anesthésie. Il doit etre effectué sur 2 EUs. Le sujet est l'étude du développement cortical pré-natal en utilisant l'imagerie par résonance magnétique (IRM). Notre objectif est de construire et partager une base de données longitudinale d’images du cerveau foetal en développement chez des primates non-humains (babouins, Papio Anubis), avec une très bonne résolution temporelle. Cette base de données unique en son genre permettra d’observer le cerveau en développement à raison d’une image IRM par semaine entre les 14eme et 24eme semaines de gestation, période pendant laquelle le plissement cortical se forme et change de manière très importante. Aucune base de données de ce type n’existe à l’heure actuelle, alors qu'une telle ressource est cruciale pour l’étude et la compréhension du développement cérébral pré-natal et des pathologies associées. La base de données constituée sera mise à disposition librement auprès de la communauté de neuro-imagerie. Une étude pilote a déjà été effectuée en 2019, approuvée par le comité d'éthique local, et a permis de démontrer la faisabilité du projet et d’en préparer la réalisation en développant et optimisant les aspects les plus critiques de telles acquisitions IRM : anesthésie, prise en charge des animaux, séquences d’acquisition, et pré-traitement des données. Une saisine déposée en 2020 pour 4 ans a permis l'acquisition de 2 sujets après le pilote, il s’agit maintenant de mettre en oeuvre notre démarche expérimentale sur 8 femelles gestantes afin de constituer une vraie base de données. Nous réaliserons 10 acquisitions avec une semaine d’intervalle entres chacune d’entre elles, sur chacune des dix femelles (et donc leur foetus). Le pilote a permis d'optimiser et calibrer 3 éléments : le protocole d’anesthésie, maintenant la mère dans des conditions physiologiques stables et sans neuro-toxicité pour le foetus ; les séquences d’acquisition IRM, pour imager de manière optimale un volume d’intérêt très petit dans des conditions difficiles; et la reconstruction des données, spécifique à ce genre d'acquisitions. Ce projet innovant et difficile à réaliser aura des conséquences à court et à long terme sur l’imagerie foetale clinique, la compréhension du développement cérébral, et les pathologies neurologiques associées.

Bénéfices attendus

Les mécanismes sous-tendant le développement cérébral humain restent encore trop largement inconnus. En particulier, la gyrification, c’est-à-dire la manière dont le cortex cérébral se plisse pendant le développement in-utero, et ses liens avec la connectivité cérébrale, ne sont pas encore compris. Pourtant, la gyrification est un marqueur important du développement et des défauts de gyrification sont associés avec nombre de pathologies neurodéveloppementales ou de pathologies neuropsychiatriques. Comprendre et caractériser le développement in-utero permettra donc d’améliorer la compréhension de ces pathologies, et parfois de permettre leur détection précoce pour une prise en charge le plus tôt possible.

Procédures

Pour chaque femelle : anesthésie pour la datation de la gestation (EU2) avec prélèvement sanguin de 12 mL (1h d'anesthésie maximale) . Une fois pour chacune des 24 femelles au maximum. Pour les femelles incluses dans l'acquisition de données IRM : transport (EU2, durée de 1h à 1h30), séparation du groupe social (EU2), puis dans l'EU1: anesthésie, intubation / ventilation, mise sous myorelaxant, et acquisition IRM pour une durée totale de deux heures. 10 fois (une fois par semaine pendant 10 semaines). Reintroduction dans le groupe social (EU2).

Impact sur les animaux

Stress lors des captures. Transport (entre 1h et 1h30). Anesthésies. Risque d’avortement lié au stress et aux anesthésies. Nuisances liées au prélèvement sanguin.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les sujets n'ont pas besoin d'être mis à mort pour les objectifs scientifiques du projet et seront maintenus en vie. Ils seront donc replacés dans leurs groupes sociaux respectifs. Ils pourront potentiellement être réutilisés dans d'autres projets en prenant en compte l'effet cumulatif.

Remplacement

La législation française ne permet pas d’acquérir de données IRM sur une femme enceinte sans justification médicale, encore moins de manière répétée pendant plus de dix semaines. Cependant, proximité phylogénétique entre primates non-humains et humains, modèles développementaux existants, et connaissances en anatomie comparée, permettent d’affirmer qu’observer le cortex d’un primate non-humain gyrifié (dont le cortex est plissé) permettra d’inférer des informations extrapolables à l’humain.

Réduction

Pour chacune des femelles, 10 images seront acquises pour observer le cerveau du foetus longitudinalement pendant 10 semaines consécutives. Nous disposons déjà de données pour 2 femelles. Nous en incluons donc 8 pour obtenir une base de données de 100 images. La variabilité inter- sujets chez l’humain est telle qu’on estime qu’il faut au moins 50 sujets pour la caractériser. Cette variabilité est plus limitée chez le babouin, nous avons réduit le nombre de sujets à 10, un minimum pour observer des motifs de plissement variables et être capables de produire des statistiques descriptives suffisamment robustes et généralisables. Pour acquérir des données avec 8 femelles et leur foetus, nous sommes amenés à prévoir 12 femelles et leur foetus pour anticiper des exclusions portentielles, et donc à procéder à une datation de gestation sur 24 femelles et leur foetus pour garantir d'en retenir 12.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans l'EU2 dans les zones d’hébergement expérimentales (en dehors de leurs groupes sociaux d’origine) avec au moins un congénère. Cette décision est une mesure de raffinement car la capture à répétition du même individu dans son groupe d’origine implique la manipulation de tous ses congénères ce qui induit un stress supplémentaire pour eux ainsi qu’une augmentation significative du temps de capture de l’animal. Tous les animaux feront partie d’un programme d’enrichissement lié au nourrissage quotidien impliquant au moins 4 moments par jour avec accès à fruits, légumes et graines, ainsi qu’au moins deux enrichissements à manipuler par jour. Tous les animaux font l’objet d’un suivi quotidien par l'équipe de zootechnie et vétérinaire selon les procédures mises en place par la Structure du bien-être animal de l'EU2. Lors de la capture et transfert hebdomadaire de l'EU2 à l'EU1, une méthode sans contention est privilégiée, consistant d’abord à isoler l’animal et le transférer dans une boite de transport accolée à la cage d’hébergement pour remise en cage de transport. Pendant le transport, les animaux sont maintenus dans le noir (effet calmant) par un cache sur la cage de transport. Le compartiment du véhicule agrée est climatisé si besoin. Chaque animal (mère) sera mis à jeun 12 heures avant l’anesthésie avec le maintien d’un accès à de l’eau (sucrée) tel que le prévoient les procédures de routine de l'EU2. Les acquisitions IRM sont réalisées sous anesthésie, pendant lesquelles les animauxseront surveillés et monitorés. Chaque anesthésie devrait durer entre 1h30 et 2h30 maximum. A l'issue de la dernière acquisition, la femelle et son congénère seront réintroduits dans leur groupe social d'origine. La femelle sera alors surveillée quotidiennement jusqu'à la mise bas. Une fois le bébé né, celui-ci sera surveillé quotidiennement par l'équipe de zootechnie et vétérinaire pendant 6 mois, pour s’assurer de son développement normal.

Choix des espèces

Parmi les espèces sur lesquelles une expérimentation est possible, les babouins sont l’espèce phylogénétiquement la plus proche de l’humain et celle offrant l’indice de gyrification le plus proche de l’humain (la gyrification étant le phénomène qui nous intéresse ici). Il s’agit aussi de l’espèce la plus grosse que nous puissions utiliser dans une IRM, ce qui est critique pour faire des acquisitions sur un cerveau de foetus, donc de très petite taille. Femelles gestantes et foetus entre la 8eme et la 24eme semaine de gestation. La 10ème semaine est celle à laquelle la datation de gestation par échographioe sera faite. Puis pour les foetus inclus, il seront scannés par IRM entre la 14eme et la 24eme semaine de gestation. Cet intervalle de gestation correspond à la période pendant laquelle la gyrification du cortex se met en place. Les 3 dernières semaines de gestation (25-27.5) ne peuvent être utilisées car le déplacement des femelles représente un risque d'avortement spontané.

90 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales prostatiques humaines, passent un scanner puis une séance de radiothérapie FLASH sous anesthésie gazeuse, et sont suivies deux semaines pendant que la tumeur grossit, ce qui peut selon le porteur atteindre leur mobilité et les fatiguer. Les bénéfices annoncés restent en amont de la clinique : établir si les vaisseaux tumoraux répondent à cette radiothérapie ultra-rapide comme à la radiothérapie conventionnelle, et apporter des connaissances utiles à la communauté scientifique. Sur le remplacement, le porteur affirme que "tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait" et que l'oxygénation d'un tissu ne s'étudie que dans un organisme perfusé.

Objectifs

La radiothérapie est un traitement contre le cancer utilisé chez plus de la moitié des patients. Une méthode récente ultra-rapide, dite "FLASH", a montré une toxicité inférieure sur les tissus sains tout en maintenant la même efficacité anti-tumorale dans difféerents modèles animaux. Le niveau d'oxygénation tissulaire semble être un paramètre qui influe sur le ratio bénéfice/risque de cette radiothérapie. De nombreuses études attestent du rôle de l'O2 dans les tissus sains mais aucune ne s'est intéressée aux tissus tumoraux dans ce contexte. Pourtant, le niveau d'O2 tumoral est un facteur qui est bien connu pour jouer sur l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie. Le projet a donc pour but d'étudier la réponse des vaisseaux sanguins tumoraux à la radiothérapie FLASH, et la conséquence en terme d'oxygénation du tissu tumoral. Cette connaissance est essentielle pour appréhender la réponse clinique globale et envisager les étapes ultérieures d'application de la méthode FLASH chez l'homme. Pour des raisons techniques, le projet se déroulera dans deux établissements.

Bénéfices attendus

La réoxygénation du tissu tumoral entre plusieurs séances de radiothérapie constitue l'un des piliers théoriques des procotoles cliniques actuels de radiothérapie. Il est en effet très important d'augmenter l'oxygénation de la tumeur, habituellement défectueuse, car la quantité d'oxygène dicte une grande partie des effets physico-chimiques de la radiothérapie et donc son efficacité. Il est donc crucial d'établir si les vaisseaux sanguins tumoraux répondent à la radiothérapie FLASH de la même manière qu'à la radiothérapie conventionnelle. Les données sur la réponse des vaisseaux ainsi que l'oxygénation tumorale permettront d'établir la pertinence des protocoles cliniques fractionnés actuels, ou dans le cas inverse de proposer de nouveaux protocoles de traitement. Les données permettront d'évaluer la performance globale de la radiothérapie FLASH sur la tumeur. Elles pourront permettre également d'envisager des combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies anti-angiogéniques ou immuno-modulatrices. Enfin, elles apporteront des connaissances fondamentales sur les cellules du microenvironnement vasculaire, utiles à la communauté scientifique de la radiothérapie FLASH.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 procédures: 1- injection (seringue insuline) sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse (2 min) 2- imagerie scanner CT-scan sous anesthésie gazeuse (15 min max) 3- radiothérapie sous anesthésie gazeuse (15 min) 4- suivi tumoral pendant 2 semaines puis injections ip et rétroorbitale (2 min) sous anesthésie gazeuse avant sacrifice endormi. Les actes 1-2-4 se déroulent dans l'Etablisssement 1. L'acte 3 dans l'établissement 2.

Impact sur les animaux

Lors des phases de transport et d'acclimatation, de préhension, contention ou anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La greffe tumorale sous-cutanée produira une douleur légère et passagère (quelques minutes). La radiothérapie est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. La croissance tumorale, en particulier lors des deux dernières semaines, peut engendrer une détresse telle que: atteinte de la mobilité, fatigue. Ces signes sont cependant facilement détectables en amont et interviennent peu dans ce modèle. De plus, le modèle n'est pas métastatique et n'engendre pas d'autre risque.

Devenir

Les animaux suivent tous les même parcours: greffe tumorale, imagerie, radiothérapie, suivi. Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation, le but étant de prélever les tissus tumoraux pour analyse.

Remplacement

Les premières phases du projet scientifique global se sont déroulées sur des cellules, notamment endothéliales, constituants des vaisseaux sanguins. Tout ce qui a pu être étudié sans expérimentation animale a été fait. Néanmoins l'oxygénation tissulaire ne peut être étudié que dans un tissu perfusé et régulé physiologiquement.

Réduction

La stratégie en trois expériences indépendantes successives permettra de n'utiliser que la quantité d'animaux nécessaire à l'atteinte de la significativité statistique en fonction de la taille d'effet réellement observé: dès la significativité atteinte, les lots d'animaux suivants seront annulés.

Raffinement

Pour le bien-être des animaux, la socialisation et l'environnement seront optimisés: groupes de 5 invariables, maintient des cages et litières penant les transports, cycle jour-nuit adapté, eau-alimentation à volonté et sans changement de régime entre les établissements, frisottis en quantité pour nidification. Les dômes seront exclus car ils ont tendance à créer des comportements de domination chez la souris nude mâle. Une habituation à la manipulation et en creux de main sera réalisée progressivement. Pour éviter le stress, l'injection tumorale sous-cutanée, l'imagerie et l'irradiation seront réalisées sous anesthésie générale. Une stabulation sur tapis chauffant permettra à l'animal un réveil plus rapide et une meilleure stabilité physiologique pendant les procédures. Enfin, les animaux seront observés périodiquement selon un barème décisionnel qui évaluera le stress et la douleur, avec des critères d'arrêt d'expérimentation.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus décrit en tumorigenèse. Les phénotypes des lignées et leurs particularités génétiques sont répertoriés ("mouse phenome database"). Le génome de la souris (différentes souches), entièrement séquencé, et sa physiologie sont similaires à l'homme: 23 000 gènes codants contre 30 000 chez l'homme, avec une bonne conservation des gènes et des fonctions. La souris tolère l'homozygotie, ce qui permet de travailler sur des lignées et d'obtenir des résultats scientifiques très reproductibles. Le modèle immunodéprimé utilisé ici permet la greffe de cellules tumorales humaines. Plus précisément pour ce projet, la souris représente le plus petit animal répertorié sur lequel la radiothérapie FLASH fonctionne et permettant la greffe tumorale avec un suivi suffisamment long (2 semaines post-radiothérapie). L'efficacité du faisceau de particules particulier que nous utilisons a été montrée chez la souris préalablement, ce qui rend ce modèle fiable. Le cancer de prostate est un cancer de l'adulte et les animaux utilisés seront donc adultes (>8 semaines).