Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude des médiateurs de la communication os-muscle et de l’influence du système nerveux sympathique dans un modèle de perte osseuse par immobilisation chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une injection de toxine botulique dans le quadriceps paralyse la patte de chaque souris, une paralysie dont le porteur indique lui-même que la mobilité ne revient qu'après cinquante-six jours et la masse osseuse après quatre-vingt-dix. 312 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus léger, une partie recevant en plus une injection intrapéritonéale quotidienne pendant vingt et un jours. Le porteur décrit une "légère boiterie" qui n'empêche pas l'animal de se nourrir, et affirme que la procédure "n'est pas douloureuse", l'analgésie n'étant appliquée que "si nécessaire". Toutes sont tuées entre le premier et le quatre-vingt-dixième jour, sous anesthésie, pour un prélèvement de sang par ponction intracardiaque et la collecte des os et des muscles.
Objectifs
L’ostéoporose est caractérisée par une fragilité osseuse et donc un risque accru des fractures. L’ostéoporose d’immobilisation résulte d’une diminution de contraintes mécaniques sur le squelette. La perte osseuse consécutive est associée à une fonte musculaire du fait de la relation étroite entre le muscle squelettique et l’os. Notre équipe a développé un modèle d’ostéoporose d’immobilisation par paralysie localisée à la toxine botulique (BTX) chez le rat. Ce modèle, reproductible chez la souris, a été utilisé pour caractériser la perte osseuse liée à l’immobilisation, étudier les interactions musculo-squelettiques et tester l’efficacité de molécules thérapeutiques ciblant l’os et/ou le muscle. Ce modèle ne nécessite aucune procédure chirurgicale par rapport aux méthodes classiques de dénervation. Une anesthésie à l’isoflurane suffit pour effectuer l’injection dans le muscle à paralyser. Après l’injection dans le quadriceps fémoral, l’animal présente en 2 à 3 jours une légère boiterie mais peut se mouvoir et accéder à la nourriture et l’eau. L’absence de chirurgie évite le biais lié au traumatisme chirurgical qui augmente la résorption osseuse. Nous avons étudié la cinétique de la perte osseuse chez la souris : des modifications du profil d’expression des gènes du remodelage osseux ont été observées dès 7 jours avec une perte osseuse maximale entre 21 et 28 jours dans le fémur et le tibia. Au niveau musculaire, l’effet de la BTX est mesurable dès 7 jours et la fonte musculaire est maximale à 21 jours. De plus, le muscle recouvre un niveau normal de mobilité après 56 jours, avant le recouvrement d’une masse osseuse normale après 90 jours. Ces résultats confortent l’hypothèse que le muscle est impliqué dans la restauration osseuse et le modèle BTX est adapté pour étudier les molécules impliquées dans ce processus.
Bénéfices attendus
Les prinicpaux bénéfices attendus du projet sont d'une part d'identifier des marqueurs clés des tissus muculaires et osseux impliqués dans la communication os-muscle. Cela permettra de déceler des molécules candidates de l'os et/ou du muscle pour à plus long terme mieux comprende la fragilité osseuse et la prévenir plus efficacement en tenant compte des deux entités anatomiques os et muscle. D'autre par, les bénéfices attendus sont également une meilleure cmprehesion du rôle du système nerveux symopathique dans la communication os-muscle et son implication dans la fragilité osseuse liée à l'immobilisation.
Procédures
Chaque animal recevra une injection intra-musculaire de toxine botulique (excepté les animaux contrôles) sous anesthésie légère (5 minutes par souris). La mise à mort aura lieu à différents temps de 0 à 90 jours sous anesthésie générale afin de collecter du sang par la voie intracardiaque (15 minutes par souris). Cette dernière intervention sera sans réveil pour l’animal. Une partie des animaux qui auront reçu une injection de toxine botulique par la voie intra-musculaire recevront également un traitement par la voie intrapéritonéale tous les jours pendant 21 jours (sur animaux vigiles).
Impact sur les animaux
Le modèle d'immobilisation localisée par injection intramusculaire de toxine botulique est un modèle bien décrit au laboratoire et utilisé depuis de nombreuses années par notre équipe. La paralyisie localisée induite par la toxine botulique induit une boîterie légère du côté immobilisée mais qui n'empêche pas l'animal de se nourrir ni de s'hydrater. L’administration quotidienne de traitements par injection intrapéritonéale peut induire un stress et une douleur légère qui sera minimisée par un faible volume injecté par jour.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour les analyses biomécaniques, histologiques et moléculares sur les échantillons osseux et/ou musculaires.
Remplacement
Les études des interactions os-muscle ne peuvent être réalisées que chez l’animal car elles nécessitent d’isoler des pièces entières du squelette soumises aux contraintes mécaniques de même que les muscles qui leur sont rattachés. Dans ce projet, le facteur mécanique est au premier plan et seule une étude animale permet de reproduire la perte osseuse, la fonte musculaire et les effets sur l’os et le muscle de molécules bloquant ou activant une des voies de communication du système nerveux autonome sympathique.
Réduction
L'effectif de chaque lot est celui minimal pour obtenir des informations valides et des tests statistiques performants. D'autre part, le modèle de paralysie sur un seul membre, outre le fait de s'affranchir d'une technique chirurgicale, permet qu'un même animal soit son propre témoin (côté paralysé versus côté non paralysé) et ainsi d'éviter des lots supplémentaires témoins.
Raffinement
Le raffinement sera appliqué en effectuant l'administration intramusculaire de toxine botulique sous anesthésie générale. Cette procédure n'étant pas douloureuse, une analgésie légère sera appliquée si nécessaire. La gestion du bien-être animal sera assurée par un hébergement des animaux selon les standards prévus par la réglementation, en groupe sociaux, dans un environnement adapté et enrichi. Les animaux seront surveillés tous les jours et seront pesés une fois par semaine. Une liste de points limites adaptés et une grille d’évaluation de la sévérité des réactions non-désirées préalablement établies permettra de s’assurer du bien-être des animaux. Un arbre décisionnel en lien avec les points limites adaptés et la grille d’évaluation des réactions non désirées permettra de disposer de critères préétablis pour un placement sous surveillance accrue et un arrêt des souffrances pour l’animal le cas échéant.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal reconnu pour l’évaluation de la perte osseuse reflétant les différents types d’ostéoporose humaine comme l’ostéoporose de l’immobilisation. De plus, la souris est l’espèce la plus adaptée à l’étude de l’expression des gènes à partir d’échantillons d’os. Nous avons également développé et validé depuis plus de 10 ans tous les outils technologiques nécessaires à l'étude de la qualité osseuse dans des modèles murins. Enfin, les temps d’étude choisis dans le projet ont été déterminés à partir de nos études précédentes dans le modèle de perte osseuse par immobilisation chez la souris. Le projet utilisera des animaux adultes (âge > 15 semaines) afin de mettre en évidence les modifications du tissu osseux mature induites par injection de BTX.
Effets métaboliques et cognitifs des variations d’apport en tryptophane et des fibres alimentaires dans l’alimentation (Multisite 1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système gastrointestinal
650 rats vont être utilisés, chacun logé seul en cage pour que sa consommation alimentaire soit mesurée, quatre jours par semaine pendant six semaines, avec deux heures de retrouvailles quotidiennes ou un week-end en binôme. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et tous sont tués à l'issue. Jeûne de quinze heures, privation d'eau de six heures, sept passages au maximum dans des tests d'activité locomotrice, d'anxiété et d'apprentissage, jusqu'à cinq prises de sang, quarante-huit heures en cage de collecte d'urines et de fèces, et pour quarante rates deux traites manuelles sous anesthésie après trois heures de séparation de leurs petits. L'enjeu déclaré est d'évaluer les effets de la végétalisation de l'alimentation humaine sur le métabolisme et le comportement, les résultats devant alimenter une collection de données utile aux pouvoirs publics.
Objectifs
La période néonatale est critique pour le développement du cerveau et des perturbations pendant cette période peuvent avoir des répercussions profondes sur les fonctions cérébrales tout au long de la vie. Les molécules produites par le microbiote intestinal pourraient participer au contrôle de la maturation cérébrale durant cette période et notamment les métabolites bactériens, produits à partir du tryptophane, un acide aminé apporté par l’alimentation. Les enfants nés par césarienne présentent un microbiote moins diversifié que les enfants nés par les voies naturelles. Les enfants nés par césarienne présentent également plus de troubles et déficiences du système nerveux central, et une plus faible production de dérivés du tryptophane. Or parmi les métabolites bactériens, certains ont des effets dans le cerveau (par ex, neuroprotecteur et médiateur). En outre, la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens peuvent moduler le poids corporel et la santé métabolique chez le rongeur. Le projet vise ainsi à évaluer l’impact des modifications du métabolisme bactérien du tryptophane, notamment via l’alimentation, sur la santé métabolique et comportementale. L’alimentation conditionne en effet le métabolisme du tryptophane par le microbiote de plusieurs manières. La présence du tryptophane dans le colon dépend de la quantité et de la digestibilité des protéines ingérées et son utilisation dépend de la présence d’autres substrats nutritifs, par exemple ceux apportés par les fibres. La végétalisation de l’alimentation, peut entrainer une diminution d’apport en tryptophane et une augmentation d’apport en fibres et donc conduire à des variations du métabolisme du tryptophane par le microbiote intestinal. Ainsi l’objectif de nos travaux est d’évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur la biodisponibilité du tryptophane et la production des métabolites bactériens par le microbiote et d’en caractériser les effets comportementaux, métaboliques et neurophysiologiques chez le rat à 2 stades de son développement : la période post-natale avant sevrage et le jeune en croissance.
Bénéfices attendus
Le projet produit des connaissances scientifiques originales en comparant les effets de régimes de protéines animales riches en tryptophane à ceux de protéines végétales pauvres en tryptophane sur le comportement alimentaire, émotionnel et cognitif et sur le métabolisme de jeunes adultes et sur la transmission de ces effets de la mère aux premiers petits issus de la reproduction. Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal. Ces expérimentations fourniront des opportunités uniques pour évaluer l’impact de la végétalisation du régime sur l’utilisation du tryptophane par le microbiote intestinal, sa métabolisation en métabolites bactériens et la répercussion éventuelle sur la santé métabolique et cérébrale des jeunes rats (pré- et post-sevrage). De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les conséquences de la végétalisation de l’alimentation sur la santé. Les résultats participent à la construction d’une collection de données utiles aux pouvoirs publics dans le cadre de leur politique de santé humaine.
Procédures
Ce projet se déroulera sur 2 sites : L’ensemble du projet sera réalisé sur le site 1 et quelques mesures seront réalisées sur le site 2. La dépense énergétique de 100 animaux sera mesurée 1 fois pour chaque rat grâce à des cages mesurant les échanges respiratoires durant 72h sur le site 2. La composition en masse grasse de 100 rats sera évaluée par un appareil d’imagerie sur animaux vigiles sur le site 2 pendant 10 minutes par rat. Sur le site 1, les 200 rats seront hébergés en cages individuelles pour la mesure de la consommation alimentaire durant toute la durée de la période expérimentale, avec remise en cage par binôme durant le week-end ou 2 heures par jours 5 jours/semaine. Les 50 rates gestantes seront placées en cages individuelles pendant toute la période de gestation pour les mesures de consommation alimentaire et seront avec leurs petits pendant la période de lactation. Des tests de de choix alimentaire et hydrique (1h) seront réalisés deux fois à une semaine d’intervalle, après une période de mise à jeun ou de privation hydrique. Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer leur activité locomotrice, leur anxiété, et leur capacité d'apprentissage, 7 fois au maximum (= nombre de passages dans les différents tests). Des prélèvements des urines et fèces seront réalisés durant 48h sur 100 rats dans des cages spécialement conçues à cet effet. Des prises de sang seront effectuées 5 fois maximum à une semaine d’intervalle pour 100 rats ou 1 fois pour 100 rats pendant 5 minutes. Le lait de 40 rates sera prélevé 2 fois pendant 15 minutes. Une injection d’un traceur permettant d’évaluer la synthèse protéique sera réalisée avant la mise à mort de 100 rats 1 fois pendant 2 minutes au moment de la mise à mort.
Impact sur les animaux
Durant l’expérimentation, les rats seront hébergés en cages individuelles pour les mesures de la consommation. L’hébergement individuel (4 jours par semaine durant 6 semaines avec remise en cage par binôme durant le week-end ; ou hébergement individuel et remise en cage collective 2 heures par jours 5 jours/semaine) peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. La mise à jeun (durant 15 heures maximum) et la privation d’eau (6 heures maximum) lors des tests de préférences alimentaires et de choix de biberons, peuvent représenter un stress léger pour les rats. Les tests comportementaux peuvent représenter un stress léger, dû à la nouveauté de l’environnement et à l’éclairage vif qui fait partie du principe de ces tests. La dépense énergétique sur 24h sera mesurée 1 à 2 fois pour chaque rat pendant 3jours. En outre, la collecte des fèces et des urines d’un rat sera réalisée 1 à 2 fois par rat pendant 48h. La prise de de sang peut provoquer un stress modéré lié à la contention et une petite douleur de courte durée. Les mères seront séparées de leurs petits 3h avant la traite (deux traites en tout dans la procédure), anesthésiées par voie gazeuse, puis l’hormone déclenchant la production de lait leur sera injectée et la traite sera faite manuellement. Après le réveil total de l’anesthésie, la mère sera remise avec sa portée (au maximum 3h30 de séparation). Une injection de traceur sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort pour 100 rats, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. Les organes et contenu digestif seront prélevés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes associés (foie, muscle, tissu adipeux), ainsi que du sang et du cerveau.
Remplacement
L’objectif du projet est d’étudier l’impact de la teneur en tryptophane du régime sur la santé cérébrale et métabolique des jeunes rats adultes et des ratons issus de la première génération Plusieurs variables sont mesurées chez chaque animal, notamment la croissance, la consommation alimentaire, le comportement, la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines, la physiologie digestive, l’utilisation du tryptophane par le microbiote, la formation des métabolites bactériens et des marqueurs de l’activité cérébrale. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle in vitro ou in silico n’est à même aujourd’hui d’intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin, le cerveau et les organes associés.
Réduction
A partir de données obtenues d'une précédente étude, l'effectif minimal requis a été estimé pour mettre en évidence l’effet du régime sur les différents paramètres mesurés. Ainsi, 10 animaux par groupe et par sexe est le nombre minimal de rats pour pallier à la variabilité interindividuelle tout en préservant une puissance statistique correcte. Le nombre d’animaux nécessaire est de 650 rats. Pour les études au cours de la croissance : 5 régimes x 20 rats (10 mâles et 10 femelles) x 2 études = 200 rats. Pour l’étude sur les mères au cours de la gestation et de la lactation, 450 rats sont nécessaires : 8 petits + leur mère x 10 mères par régime x 5 régime.
Raffinement
Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les rats seront placés dans des cages en plexiglas transparentes qui permettent les interactions visuelles. Les rats demeureront dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif, visuel et auditif (vocalises). Les cages seront enrichies au moyen de tunnel, d’une tasse renversée, de support, de gamelle vide ou de billes. Une rotation des objets d’enrichissement est prévue afin de minimiser l’habituation des animaux à ces objets. Un enrichissement social est également prévu. Les rats seront regroupés dans des cages collectives durant 2h/jour tous les jours de la semaine ou durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettront aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang seront réalisées par un manipulateur expérimenté. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu, un geste utilisé pour des pesées régulières, afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Le transport des animaux sur le site 2 sera réalisé en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport 3 jours avant d’effectuer les mesures de dépense énergétique. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : les animaux seront placés avec les animaux avec lesquels ils sont habituellement regroupés dans les boîtes de transport. De l’eau en gelée et de la nourriture seront à disposition dans la boîte. La mise à mort sera réalisée chez des animaux préalablement anesthésiés. Pour les prélèvements de lait, les mères seront séparées de leur petits le temps de la traite. Après réveil, la mère sera remise en cage avec ses petits. La réaction de chaque mère sera surveillée pour s’assurer que la réintégration se passe au mieux après la traite. La manipulation quotidienne des animaux permettra de faciliter cette réintégration. Pendant la traite, la cage contenant les ratons de la mère sera placée sur un tapis chauffant pour maintenir les petits au chaud. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permettra de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.
Choix des espèces
Comme l’être humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organisation of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’humain, le porc ou le rat pour évaluer la digestibilité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Des rats mâles et femelles prépubères (0-4 semaines) et en croissance (jeunes adultes, 5-9 semaines) sont inclus car nous étudions l’effet des régimes sur la première génération et la croissance.
Etude préclinique de transplants de microbiotes fécaux humains : tests d’efficacité d’implantation de différentes formulations de transplants chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Des formulations de transplants de microbiote fécal humain, mises au point par un partenaire industriel, sont testées sur 120 souris dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit un gavage puis cinq prélèvements de fèces, obtenus en le maintenant jusqu'à cinq minutes dans un pot en plastique. Toutes sont tuées à l'issue pour le prélèvement des organes et des analyses histologiques. Le porteur détaille son calcul, quatre à six souris par groupe suffiraient selon la littérature, il en prévoit huit, puis ajoute par précaution un groupe entier de huit animaux par série en cas de contamination accidentelle, ce qui porte l'effectif à 120.
Objectifs
Le partenaire industriel de ce projet développe des thérapies de restauration du microbiote à écosystème complet pour des patients atteints de cancer. Il cherche à traiter les dysbioses (déséquilibre des relations entre le microbiote et l’organisme) modérées à sévères afin d’améliorer les chances de survie. Pour cela, il a déjà conçu plusieurs produits et voudrait développer d’autres formulations afin de cibler une plus large gamme de pathologies. Il souhaite également tester plusieurs méthodes de conservation de produits déjà existants. L’objectif de ce projet est de tester plusieurs produits en les inoculant à des souris pour étudier (i) l’efficacité de l’implantation de ces microbiotes complexes humains, (ii) les répercussions sur l’organisme.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’améliorer les performances des thérapies de restauration du microbiote chez les patients atteints de cancer ou d’autres pathologies. En améliorant le traitement des dysbioses dont ils souffrent, leurs chances de survie pourront être augmentées.
Procédures
Les 120 animaux (nombre maximum) subiront un seul gavage (durée < 1min), ainsi que 5 prélèvements de fèces à plusieurs jours d’intervalle, pour une durée de 5 minutes chacun, le temps que les souris émettent spontanément des fèces.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lors des gavages et lors des prélèvements de fèces (5 minutes de séjour au plus dans un grand pot en plastique transparent).
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.
Remplacement
Actuellement, aucun autre modèle que l’animal n’existe pour caractériser l’implantation de microbiote complexe dans le tractus intestinal et en évaluer les effets sur différents organes.
Réduction
Les nombreuses analyses de composition du microbiote intestinal par biologie moléculaire publiées dans la littérature scientifique indiquent qu’un nombre réduit de souris par groupe et par sexe, de l’ordre de 4-6, est suffisant. Dans notre projet, nous utiliserons 8 souris/groupe (4 mâles et 4 femelles), ce qui conduit à 32 souris/série. Cependant, nous ajoutons par précaution un groupe de 8 animaux à chaque série, en cas de contamination accidentelle d’un groupe par d’autres micro-organismes que ceux étudiés (ce groupe serait alors à refaire). Cette précaution porte l’effectif à 40 souris/série, soit 120 souris au total (nombre maximal). Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques.
Raffinement
L’expérience commencera après une semaine d’acclimatation aux nouveaux groupes sociaux et aux nouvelles conditions environnementales (passage des élevages des fournisseurs à l’animalerie d’expérimentation, constitution des groupes étudiés). Il y aura une observation quotidienne des animaux depuis l’extérieur des cages, une observation individuelle et une pesée hebdomadaire à l’occasion des prélèvements fécaux, ainsi qu’une observation accrue dans les heures qui suivront les inoculations orales. Dans la semaine qui précède ces inoculations, les souris seront prises en main quotidiennement pour les habituer à être manipulées et ainsi diminuer le stress le jour de l’inoculation. Les animaux seront hébergés dans des cages standards par groupe de 4 souris du même sexe. Du papier absorbant ou des nids de papier kraft à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. En cas d’accident ou de maladie, les points limites définis pour cette étude seront appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle établi pour la recherche sur le microbiote intestinal avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 6 à 8 semaines car les produits étudiés sont pour l’instant destinés à des adultes, il est donc logique d’utiliser des animaux adultes pendant la phase d’étude préclinique.
Etude de l’implication des neurones sensoriels dans le cancer du côlon et immunité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Laparotomie pour injecter des produits dans la paroi intestinale ou directement dans des adénomes, injections entre les vertèbres, dépôt de cellules tumorales dans le rectum, biopsie de queue : 458 souris subissent ces gestes, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Le porteur indique que les tumeurs intestinales peuvent provoquer douleur et prolapsus rectal, et que les chirurgies peuvent entraîner des délabrements. L'objet déclaré est de comprendre le rôle des neurones sensoriels dans la croissance des tumeurs du côlon, une étape amont dont les retombées thérapeutiques restent à l'état d'hypothèse. Une grille de score doit repérer les 16 % d'animaux susceptibles de perdre du poids et de développer une anémie, sans que le RNT dise d'où vient cette proportion.
Objectifs
Les tumeurs solides sont souvent infiltrées par des fibres nerveuses, qui peuvent participer dans l'initiation et/ou la progression tumorale. Par exemple, dans les cancer de la peau, les cellules cancéreuses interagissent avec les terminaisons nerveuses sensorielles en produisant des neuropeptides, qui influencent la croissance tumorale par divers mécanismes incluant le contrôle de l'activité des cellules immunitaires infiltrées. Par ailleurs, l'absence des fibres nerveuses sensorielles dans des modèles animaux de colites exacerbe l'inflammation et la pathologie, et l'inflammation chronique intestinale est établie comme un facteur de risque du cancer colorectal. Néanmoins, le rôle des neurones sensoriels reste à identifier précisément dans le cadre du cancer colorectal, et des intéractions entre ces neurones et les cellules immunitaires restent à examiner dans le cadre de cette pathologie. Nous avons donc proposé d'étudier le rôle des neurones sensoriels dans la croissance tumorale et la surveillance immunitaire au cours du cancer colorectal. La présente saisine couvre donc des aspects initiaux de notre projet, incluant la création de modèles animaux de carcinogénèse intestinale et de co-cultures cellulaires in vitro.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental, le rôle du systeme nerveux sensoriel dans la croissance tumorale intestinale sera comprise chez la souris. Sur le plan translationnel, les résultats permettront d'envisager d'utiliser l'activité nerveuse, pour modifier la croissance tumorale au cours du cancer colorectal. Parmi les hypothèses, l'identification des neuropeptides sécrétés par les neurones sensoriels pourraient suggérer des traitements afin d'agir sur le système immunitaire, sur les tumeurs, ou potentialiser des traitements déjà connus.
Procédures
Nous réaliserons les gestes suivants: Traitement pour l'induction des tumeurs intestinales : durée 3 minutes incluant la prise en main (1x/jour pendant 5 jours). Injections inter-vertebrales: durée 10 minutes par souris ; Injections dans le parois intestinale ou dans des adénomes intestinaux: durée 30 minutes comprenant la laparotomie (1/souris) ; Injections de cellules tumorales dans le rectum : durée 20-25 minutes incluant le positionnement sur le masque d'anesthésie (1/souris). Biopsie de queue à 14j pour génotypage: durée 30sec/souris (1/souris)
Impact sur les animaux
Le modèle animal que nous utiliserons développent des tumeurs dans l'intestin qui peuvent provoquer de l'inconfort et/ou de la douleur lorqu'elles sont trop nombreuses et/ou trop grosses, voire induire un prolapsus rectal. De même, l'implantation dans le rectum de cellules tumorales de stade plus avancé peut provoquer de la douleur dûe à la croissance de la tumeur, voire un prolapsus rectal. Les chirurgies nécessaires à la réalisation des injections intra-tumorales ou dans la paroi intestinale ou intrathécales, peuvent induire des délabrements et/ou des douleurs post-chirurgicales. Les différents traitements en i.p. peuvent générer un stress et une douleur légère transitoire. Les biopsies de queues pour le génotypage peuvent générer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort
Remplacement
Les expériences in vitro ont permis d'identifier des intéractions de terminaisons nerveuses avec des cellules tumorales et/ou immunitaires, et nous exploitons ces données. Nous reprendrons cette approche pour une partie de notre projet, ce qui limitera le nombre d'animaux requis et le caractère invasif de certaines experiences in vivo (susceptibles de générer des informations équivalentes). Des analyses de bases de données publiques in silico permettront de sélectionner des candidats moléculaires. Néanmoins, certaines observations ne peuvent être réalisées en dehors du contexte de l'animal, telles que les études des intéractions multicellulaires, de la morphologie des structures. Enfin, le contrôle sélectif des neurones sensoriels in vitro requiert au préalable la manipulation génétique des neurones sensoriels matures, in vivo, afin d'obtenir des phénotypes les plus fidèles à la physiologie.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser pour chaque obejctif a été rigoureusement calculé pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée qui permettra de conclure sur les résultats. Pour ce projet nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées avec un enrichissement (frizottis, rouleaux de coton, lambeaux de papier, abri en carton ou en plastique rouge) qui sera modifié qualitativement après chaque change. Afin de lutter contre l'isolement de mâles, notre première mesure est de conserver un frère pour compagnie. Quand cela n'est pas possible (un mâle sans frère), notre animalerie propose un hébergement avec une femelle de compagnie n'étant plus en âge de mettre bas. Pour la chirurgie abdominale, les animaux seront habitués au chirurgien pendant quelques jours avant la chirurgie et des conditions d'asepties seront rigoureusement appliquées pour éviter la perte d'animaux dûe à des infections post-chirurgicales et pour éviter d'utiliser plus d'animaux afin d'obtenir un résultat significatif. Les prises en charge avant les chirurgies sont une analgésie locale, une analgésie générale et un traitement anti-inflammatoire. Après la chirurgie abdominale, les animaux recevront pendant 5j consécutifs d'un anti-inflammatoire et un analgésique contre la douleur. Une grille de score sera également utilisée. Le raffinement spécifique au phénotype dommageable consiste à étudier les animaux avant qu'ils développent les signes d 'inconfort. De plus, une grille de score sera utilisée pour identifier les 16% d'animaux qui pourraient développer des signes de mal être tels que perte de poids et anémie et ces animaux seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les souris présentent plusieurs avantages pour l'étude. Certaines lignées récapituleront la tumorigenèse précoce observée chez l'homme et seront utilisées lorsque les tumeurs sont développées (120-150j). Le contrôle de la génétique de la souris permet d'identifier des types cellulaires précis (dans cette saisine les neurones sensoriels) et ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés. Elles seront utilisées à l'âge adulte, entre 7 et 15 semaines afin que l'intestin soit mature totalement.
Etude de l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus de remyélinisation du système nerveux périphérique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à une lésion chirurgicale du nerf sciatique de 45 minutes sous anesthésie, 912 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs nerfs sciatiques. 304 d'entre elles sont d'abord prélevées vers six jours pour génotypage, et toutes passent ensuite des tests de démarche, de récupération motrice et de récupération sensitive de dix minutes chacun. L'objectif déclaré est de confirmer le rôle de l'activateur tissulaire du plasminogène dans la remyélinisation du nerf après lésion. Le porteur classe le projet en souffrance sévère et décrit un simple affaiblissement de la patte arrière gauche qui disparaît en quelques jours, tout en indiquant que le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse selon "l'aisance des expérimentateurs".
Objectifs
Des études préliminaires ont montré que l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) était une molécule impliquée dans les processus de myélinisation, c'est à dire la formation de la gaine de myéline entourant les neurones du système nerveux central. De plus, des études de la littérature ont mis en évidence une implication de cette molécule (tPA) dans la myélinisation périphérique puisqu'elle est exprimée dans les cellules responsables de la myélinisation (cellules de Schwann) et qu'elle joue un rôle dans la récupération fonctionnelle (motrice et sensitive) après lésion du nerf sciatique chez la souris. Ainsi, le tPA est impliqué dans les processus de myélinisation centraux et périphériques, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. C'est pourquoi l'objectif de ce projet est d'étudier l'implication du tPA dans les processus de myélinisation induite après lésion du nerf sciatique chez la souris, ainsi que d'étudier le rôle et les mécanismes impliquant le tPA exprimé par les cellules de Schwann en contexte de remyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra alors de confirmer l'implication du tPA en contexte de remyélinisation dans le système nerveux périphérique et de pouvoir définir les mécanismes l'impliquant dans cette remyélinisation en contexte de lésion du nerf sciatique.
Procédures
Tous les animaux à génotyper seront prélevés (vers 6 jours) pour génotypage (n=304) et peuvent présenter une légère douleur de courte durée. Chaque animal fera l'objet d’une lésion du nerf sciatique (n=912, durée de la procédure : 45min) grâce à une chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à des tests fonctionnels qui permettront l'évaluation de la démarche, l'évaluation de la récupération motrice et l'évaluation de la récupération sensitive (n=912, durée de chaque test : 10min). Tous les animaux (n=912) seront mis à mort à l'issue du projet afin de récupérer et étudier les nerfs sciatiques.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement de la patte arrière gauche (correspondant à la zone du nerf sciatique lésée) qui disparaît dans les premiers jours/semaines après lésion du nerf sciatique. Certains animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou de légère douleur (courte durée) au moment des tests permettant l'évaluation de la démarche, de la récupération motrice et de la récupération sensitive.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, ce qui permettra de prélever leurs nerfs sciatiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l'étude de l'expression des protéines dans le nerf sciatique, l'étude de l'ultrastructure des cellules myélinisantes ainsi que la récupération fonctionnelle sont des paramètres qui ne peuvent être étudiés via l'utilisation de méthodes alternatives.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux, déterminé par l'utilisation d'outils statistiques, afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Des points limites seront mis en place afin de réduire ou arrêter toute souffrance occasionnée chez l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèces animale la plus étudiée dans le cas des modèles de lésion du nerf sciatique. Les techniques employées concernant ce modèle animal sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait de ce modèle utilisé dans ce projet une approche expérimentale fiable. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour cette étude. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 10 semaines concernant la cohorte corerspondant aux "jeunes adultes" et entre 26 et 30 semaines concernant la cohorte correspondant aux "adultes âgés". L'étude sera réalisé chez le "jeune adulte" et chez "l'adulte âgé" afin de pouvoir comparer la différence de récupération fonctionnelle ainsi que les paramètres histologiques pouvant potentiellement différer entre ces deux stades de développement chez la souris. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles de lésion du nerf sciatique.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Identifiées par ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, 1 320 souris subissent ensuite jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de leur vie, sur animal vigile sous contention. 880 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Le porteur qualifie la biopsie de phalange de non douloureuse au motif que les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées à cet âge, et écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", tout en listant les signes qui déclenchent une mise à mort immédiate : posture inhabituelle, poil hérissé, dos voûté, retrait des congénères. Les souris dont le gène est inactivé dans l'intestin peuvent développer des diarrhées et des troubles de la croissance, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée, ces animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
MI-LYMPH-SIGN : impact et rôles des voies de co-signalisation immunitaires et de la lymphangiogenèse lors de l’infarctus du myocarde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
Ligaturées définitivement au niveau de l'artère coronaire descendante gauche pour provoquer un infarctus, 490 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Elles subissent ensuite des prélèvements de sang à la veine mandibulaire, des échocardiographies, une IRM de 40 minutes, une lymphangiographie et une analyse hémodynamique terminale. Le porteur annonce des douleurs dans la phase aiguë, une insuffisance cardiaque vers trois mois et un œdème pulmonaire transitoire chez 10 à 20 % des animaux, et note que la buprénorphine soulage la douleur sans rendre l'appétit. Il indique limiter à 30 % la mortalité liée au modèle, et annonce des injections de traitements sur animal vigile sans préciser lesquels.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque (IC) est une maladie sévère touchant en Europe environ 15 millions de patients et dont les traitements actuels demeurent insuffisants. L’objectif de ce projet est de déterminer le rôle des cellules immunitaires et des vaisseaux lymphatiques pendant l’inflammation cardiaque aigue ou chronique après un infarctus du myocarde (IDM) afin d’identifier de nouveaux traitements pour prévenir ou traiter l’IC. D’une part, nous avons montré que la lymphangiogenèse pourrait constituer une option thérapeutique après un IDM. D’autre part, l’inflammation cardiaque étant prépondérante dans cette pathologie, il est intéressant d’étudier les molécules de co-signalisation, véritable moyen de communication entre les cellules immunitaires, afin de moduler la réponse immunitaire et donc la symptomatologie. En caractérisant la communication entre les cellules immunitaires infiltrant le cœur et les vaisseaux lymphatiques dans ce modèle, nous souhaitons identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de limiter l’inflammation et la dysfonction cardiaques. Ce modèle va permettre d’améliorer notre compréhension de la réponse immunitaire cardiaque lors de maladies cardiovasculaires.
Bénéfices attendus
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde et les traitements de l’insuffisance cardiaque (IC) aigue ou chronique suite à un IDM demeurent insuffisants. Par conséquent, notre étude adresse cette catégorie de patient. Nous espérons dans nos études expérimentales identifier des nouveaux traitements afin de limiter la dysfonction cardiaque et lymphatique permettant ainsi, à terme, d’améliorer la qualité de vie de patients. De plus, l’immuno-modulation étant un domaine en plein essor, nous espérons que cette étude nous permettra de guider des essais cliniques, dans le futur, chez les patients atteint d’IC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale invasive avec une ligature définitive de la coronaire descente gauche afin de provoquer un infarctus du myocarde (IDM) (durée de la procédure 30 min). Les animaux subiront ensuite pendant les semaines post-IDM, des prélèvements de sang à la veine mandibulaire sous anesthésie associé à une analyse par échocardiographie (durée 10 minutes). De plus certains groupes seront confrontés à des injections vigiles en i.p (26G) ou i.m (30G) afin d'administrer des traitements qui, nous l’espérons, pourraient améliorer leur fonction cardiaque post-IDM. Leur fonction cardiaque sera évaluée également par IRM (durée 40 minutes) et par lymphangiographie (durée moins de 20 min) en fin d’étude, ou encore par analyse hémodynamique terminale (durée moins de 10 minutes). Tous ces évaluations seront réalisées sous couverture anesthétique et analgésique adéquates.
Impact sur les animaux
Dans la phase aigüe post-IDM, il est probable que les animaux aient des douleurs liées au geste chirurgicale, ce qui se traduiront dans une perte d'appétit. Nos stratégies de couverture analgésique, avec de la buprénorphine, soulagera la douleur mais n’augmente pas l'appétit. Généralement, sous 24h après l'opération, 80-90% des animaux récupérer. Un autre point de souffrance pendant l’étude pourrait être une infection sur les points de sutures. Finalement, en fin du protocole, vers 3 mois post-IDM, nous nous attendons au développement d’une IC à fraction d’éjection réduite. Nous espérons que nos traitements permettront de limiter le développement de la dysfonction cardiaque. Il est possible qu’à ce stade, chez 10-20% des individus, un œdème pulmonaire transitoire (maladie) peut apparaitre. Ceci pourrait influencer la respiration des souris (rythme de respiration accéléré, peu d’activité de locomotion). Ceci est liée au développement de l’insuffisance cardiaque, la pathologie que nous étudions avec ce modèle.
Devenir
L’ensemble des animaux sont mis à mort pour les différentes procédures expérimentales afind 'avoir des données utilisables .
Remplacement
Dans l’objectif de remplacer l’expérimentation animale, nous mettrons en place certaines expériences par des études in vitro (prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant l’utilisation des animaux est rendue nécessaire car il n’existe pas à ce jour de modèle d’infarctus du myocarde in vitro
Réduction
Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque (échographie, IRM) puis des mesures invasives (hémodynamique et lymphangiographie). Nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex-vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de souris . En effet, nos expériences dans le laboratoire ont démontré que des groupes de n=15 étaient nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie. C'est pourquoi dans ce projet nous utiliserons 490 souris qui à etait determiné par des mesures statistique. Par ailleurs, un meilleur suivi post-opératoire permet également de limiter le nombre d'animaux par groupe dans le modèle IDM limitant le taux de mortalité à 30%.
Raffinement
Les souris seront suivies quotidiennement la première semaine post-chirurgie. Une couverture analgésique, sous forme de morphinique par injection et dans l’eau de boisson, sera proposée avant, pendant et après la chirugie avec une évaluation individuelle quotidienne de la douleur basée sur la grimace scale de Langford et sur un tableau permettant une évaluation du bien-être animal. Couplé à un suivi de poids, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite. Pour des scores entre 5 et 9, des granulés humidifiés et de la nourriture gélifiée seront ajoutés dans les cages et l’état de santé global des animaux sera observé (e.g. apathie, état de refroidissement, lésions de la peau et du pelage, respiration, comportement social, etc..). Sans évolution, une hydratation (solution saline en i.p, 26G) sera proposée ainsi qu’une évaluation de la couverture antalgique et si besoin une adaptation du traitement. Tout animal dont le score dépasse 19 sera considéré comme au point limite et sera mis à mort. Afin de limiter le risque de déshydratation et de dénutrition en postopératoire, des gels nutritifs de support seront proposés sur le sol de chaque cage pendant 48h post-IDM. Les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par l’expérience du laboratoire avec les modèles de cardiomyopathies chez celle-ci. La souris à également l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des outils biologiques, comme certains anticorps monoclonaux qui sont parfois inaccessibles chez le rat. De plus, dans notre laboratoire, nous avons depuis de nombreuses années une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques in vivo ainsi que ex vivo chez la souris. Nous allons inclure uniquement des souris adultes de 20-24g pour ces études. La taille des souris à cet âge (de 8 à 12 semaines) permet une réalisation facilitée des chirurgies et correspond à un âge habituel dans la littérature pour l’induction du modèle
Génotypage de poissons zèbres, sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire , l’habituation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À deux mois, chaque poisson est anesthésié à la tricaïne par balnéation, puis une extrémité de sa nageoire caudale est coupée sur une surface inférieure à 0,25 mm², en moins de deux minutes. L'objectif déclaré est de repérer les poissons hétérozygotes pour organiser les croisements, les expériences sur la mémoire portant ensuite sur des larves de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire. Seuls les hétérozygotes sont gardés vivants pour la reproduction, tous les autres génotypes sont tués, et tout poisson présentant un trouble de la flottabilité, une immobilité, une scoliose ou, pour les femelles, un ventre rempli d'œufs est tué immédiatement.
Objectifs
Le projet est une caractérisation génétique de 8 lignées de poissons âgés de 2 mois, génétiquement modifiés. Ces poissons seront ensuite élevés puis croisés entre eux afin d'obtenir des larves âgées de moins de 5 jous, non soumis à l'expérimenation animale, pour les études afin de comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin d'étudier cette habituation, nous disposons de 8 lignées de poisson zèbre portant des mutations, non dommageables, sur différentes protéines. Ces poissons seront croisés entre eux pour étudier le comportement de leur descendance, âgèe de moins de 5 jours et donc non soumise à l'expérimentation animale. L'étude du comportement des poissons correspondra à l'étude de leur habituation suite à l'extinction de la lumière.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages est nécessaire car l'étude de l'habituation chez le poisson zèbre âgé de moins de 5 jours, nécessite d'avoir tous les génotypes possibles analysés en simultanée dans la même expérience. Par exemple pour un simple mutation, en croisant deux poisson +/-, nous aurons des larves âgées de moins de 5 jours ayant les généotypes +/+;+/- et -/-. Le fait de garder, après génotypage, les parents sous forme +/- est le seul moyen, le plus rationnel, d'avoir les larves âgées de moins de 5 jours avec les 3 génotypes voulus.
Procédures
Les poissons agès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d 'une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus hétérozygotes. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson à la Tricaine; un bout de la nageoire caudale sera coupée . Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d'eau avant d'être transféré dans son aquarium. Cette procédure concerne tous les poissons de cette demande mais seuls le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffre donnés sont donc des maximums et le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons se fera par découpe d'une extrémité de la nageoire caudale d'une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables, extrêment rares avec ce protocole établi et utilisé en routine, seront visibles au moment de l'endormissement, du réveil (trop long ou visualisé par une nage inhabituelle), des lésions suite à la biopsie ou de la non repousse, dans des cas exceptionneles, de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype inhabituel entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Devenir
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons hétérozygotes seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d'habituation sur leurs descendants âgès de moins de 5 jours (non sousmis à une demande) et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante. Les poissons ayant tous les autres génotypes possibles seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sous forme hétérozygote. En effet, ce n'est que par croisement de poissons hétérozygotes entre eux que nosu obtiendrons des larves (non soumis à une dap) ayant tous les génotypes souhaités.
Remplacement
Au niveau du génotypage aucun remplacement n'est possible pour la biopsie de la nageoire caudale. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l'habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l'action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude.
Réduction
Nous faisons une nouvelle génération que les 8 à 10 mois (au lieu de tous les 6 mois) ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Un nombre minium de 20 individus est élevé pour maintenir la lignée et obtenir des alevins. Ce chiffre permet d'avoir suffisament de mâles et femelles pour les accouplements. Seul le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffres donnés sont donc des maxima. Nous ne gardons que les poissons hétérozygotes (au lieu de garder des +/+ et -/-) car en le croisant entre eux nous obtenons tous les génotypes voulus pour vos expériences sur des larves de moins de 5 jours. Les études sur la mémoire se font sur des larves âgées de moins de 5 jours, non soumises à une DAP. Les poissons possèdent deux ou trois mutations, nous permettant ainsi de ne pas maintenir des lignées avec une seule mutation. Les lignées non utilisées dans le futur seront cryoconservées.
Raffinement
Tout poisson, quel de soit sont stade de développement, qui présente un comportement anormal, ou un signe de mal être a ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité, mouvements anormaux, scoliose, siphose, femelle avec ventre rempli d'oeufs, sera mis à mort immédiatement. Les poissons sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Le prélèvement pour le génotypage sera le seul geste invasif fait sur les animaux et une seule fois dans leur vie. Lors du processus de génotypage, les poissons sont maintenus par deux par bac de 700 ml un minimum de temps ne dépassant pas 48h. Durant ces 48h, les poissons sont maintenus deux par deux dans les bacs avec un séparateur entre les deux afin de pouvori les identifier suite au génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal modèle facile à élever (animal petit, robuste, possédant d'excellentes capacités de reproduction). De plus, 70% des gènes du poisson zèbre ont un équivalent chez l'homme. Enfin, ce génome s'est montré facilement manipulable, ce qui a conduit à la création de milliers de mutants dont ceux utilisés dans ce projet. Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit et l'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre comme modèle vertébré un modèle idéal. Du plus il s'agit d'un modèle dont le cerveau est relativement simple comparativement à d'autres modèles et il est donc plus facile d'obtenir des résultats interprétables Les lignées sont déjà établies. Les génotypages des adultes pour chaque génération se feront au stade 2 mois. A ce stade les poissons sont assez grands pour que le génotypage de la nageoire caudale se fasse sans séquelle, celle-ci étant assez développée
Role de Foxk1 dans le développement de la leucémie aigüe à cellules T
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Faire développer une leucémie aiguë lymphoblastique à des souris pour observer des étapes pré-leucémiques inaccessibles chez l'être humain : 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Les souris mutantes développent la leucémie vers 10 ou 11 semaines et en meurent à 20 semaines, avec perte d'appétit, perte de poids et perte de sociabilité. Une partie est tuée dès 10 ou 11 semaines, une autre est maintenue en vie au-delà pour une étude de survie, sous analgésiques. D'autres souris dépourvues de système immunitaire reçoivent une xénogreffe de cellules leucémiques humaines par injection rétro-orbitaire, et le porteur ramène ses groupes à six animaux pour répondre aux "exigences des tests statistiques nécessaires pour pouvoir soumettre à publication dans des journaux internationaux réputés".
Objectifs
Les leucémies aiguës lymphoblastiques T sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération anormale et incontrôlée de cellules immatures à l’origine des lymphocytes T. Malgré l’amélioration de la prise en charge de ces leucémies, le pronostic de ces patients reste péjoratif avec environ 30% de rechute dans les deux ans suivant le diagnostic. Un des défis dans ce domaine est donc d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients et cela passe notamment par une recherche fondamentale qui vise à mieux définir les circuits moléculaires à l’origine de ce développement cancéreux. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mieux comprendre l’oncogénèse des leucémies aiguës lymphoblastiques T chez la souris en identifiant les réseaux activateurs de tumeur. Pour cela nous utiliserons des souris génétiquement modifiées au niveau d’un gène suppresseur de tumeur, qui est inactivé dans ~20% des leucémies aiguës lymphoblastiques T humaines et évaluerons le rôle d’un facteur de transcription identifié comme étant le régulateur majeur du métabolisme des lymphocytes T agissant sur la même voie de signalisation que ce gène suppresseur de tumeur.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de suivre les mécanismes responsables de la transformation d'une cellule sanguine normale en cellule leucémique. Nous pourrons analyser des souris aux étapes pré-leucémiques (absence de signe clinique), ces étapes sont impossibles à étudier chez l’homme. Le modèle murin de LAL-T permettra d’évaluer la fonction de Foxk1 dans ce type de leucémie et identifier dans quelle mesure ce facteur de transcription pourrait être une cible pour le développement de nouvelles thérapies.
Procédures
Les premiers modèles utilisés consistent en des souris déficientes soit uniquement pour un gène suppresseur de tumeur soit pour le gène suppresseur de tumeur et le facteur de transcription d’intérêt dans les lymphocytes T. Ces modèles générés par croisement à phénotype dommageable sont viables mais développent une leucémie aigüe lymphoblastique environ 10-11 semaines après leur naissance dont elles succombent à 20 semaines. Nous nous attendons dans ce modèle double mutant à un phénotype atténué par rapport à la lignée simple mutant et à un ralentissement voire une absence du développement de la leucémie aigüe lymphoblastique et une amélioration de la survie des souris ainsi générées. Le développement de la leucémie pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. Un deuxième modèle consistera en une xénogreffe de cellules humaines leucémiques dans des souris dépourvues de système immunitaire réalisée par injection unique par voie rétro-orbitaire réalisée sous anesthésie gazeuse ne générant pas de stress supplémentaire et de courte durée (quelques minutes).
Impact sur les animaux
Le développement de la leucémie pourra entraîner une perte d’appétit, une perte de poids et une perte de sociabilité vis-à-vis de ses congénères. Les injections intraveineuses en rétro-orbitaire réalisées pour le transfert adoptif seront réalisées sous anesthésie gazeuse ne générant aucun stress. Les injections sont des piqures qui entrainent une douleur légère.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, les infiltrats cellulaires aux seins des organes lymphoïdes seront analysés. De manière générale, le suivie de la leucémie nécessite l'euthanasie des animaux à l'issue des procédures.
Remplacement
L’étude de processus complexes de développement de la réponse immunitaire dans un contexte leucémie ne peut être réalisée à ce jour qu’à l’aide de modèles in vivo. Afin d’étudier de nouvelles approches d’immunothérapie, l’utilisation de modèles murins est indispensable.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits le plus possible. Nous travaillerons avec des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de réduire la taille des groupes expérimentaux à 6 souris, tout en répondant aux exigences des tests statistiques nécessaires pour pouvoir soumettre à publication dans des journaux internationaux réputés. Nous répéterons chaque expérience de façon indépendante 3 fois.
Raffinement
Les souris mutantes uniquement pour le gène suppresseur de tumeur à phénotype dommageable sont viables mais développent une leucémie aiguë lymphoblastique environ 10 à 11 semaines après leur naissance dont elles succombent à 20 semaines. Elles seront mises à mort dans la plupart des cas dès 10 à 11 semaines pendant les phases précoces de la leucémie sans atteinte particulière. Pour une petite portion d’entre elles impliquées dans une étude de survie, nous traiterons ces animaux avec des analgésiques dès l’âge de 10 semaines pour atténuer les douleurs, et souffrances éventuelles dues au développement de la maladie. Les souris double mutantes pour le gène suppresseur de tumeur et le facteur de transcription d’intérêt dans les lymphocytes T devraient présenter un phénotype atténué par rapport à la lignée simple mutant et à un ralentissement voire une absence du développement de la leucémie aiguë lymphoblastique et une amélioration de la survie de ces souris. Elles seront néanmoins lorsqu’elles seront impliquées dans l’étude de survie (au-delà de 10 semaines) traitées avec des analgésiques dès l’apparition de signes éventuels de souffrance.
Choix des espèces
Mus musculus, mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide, bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. Le système immunitaire adaptatif caractérisé par la présence de différentes populations de lymphocytes en interaction avec les cellules dendritiques est issu de l’hématopoïèse laquelle est observée chez les vertébrés uniquement et sur le plan immunitaire, il existe de nombreuses similarités entre l’homme et le modèle souris. Les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour les études physiopathologiques de gènes. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées Dans les modèles de souris doublement déficitaire pour les gènes impliqués dans la leucémie, nous utiliserons des souris entre 4 et 20 semaines. Notre but est d’analyser des souris à différents stades de la transformation d’une cellule sanguine en une cellule leucémique (de pré-leucémique à leucémique). Les souris génétiquement modifiées et injectées seront adultes (8-12 semaines).
Tests précliniques sur un modèle de fibrose pulmonaire
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris reçoivent d'abord jusqu'à deux injections intraveineuses destinées à humaniser leur système immunitaire, puis, douze semaines plus tard, une injection intratrachéale de dix minutes sous anesthésie qui déclenche une fibrose pulmonaire. Les expérimentateurs administrent ensuite des candidats médicaments par voie pulmonaire, digestive ou injectable, avec des prises de sang répétées et un score clinique quotidien portant sur le pelage, les mouvements, les muqueuses et la respiration. 1 500 souris vont être utilisées sur cinq ans dans 50 études, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, un score égal ou supérieur à 7 ou une perte de poids de plus de 25 % déclenchant la mise à mort. Aucune réutilisation n'est prévue, la fibrose étant décrite comme progressive et incurable, l'animal ne pouvant plus recouvrer son état de santé.
Objectifs
La fibrose respiratoire est une affection pulmonaire impliquant le système immunitaire qui touche près de 5 millions de personnes dans le monde. Cette pathologie peut être causée par l’inhalation de produits toxiques, par une infection, par des traitements médicamenteux, des suites d’une réaction auto-immune ou de cause inconnue (idiopathique). L’âge (>50 ans) ainsi que des facteurs génétiques et environnementaux jouent également un rôle dans le développement de cette maladie. Cette pathologie est souvent mal diagnostiquée et les traitements disponibles à ce jour sont extrêmement couteux et permettent seulement d'en ralentir la progression. Ainsi, la fibrose pulmonaire dite idiopathique est associée à une survie médiane de seulement 3.8 ans parmi les plus de 65 ans. Par ce projet, nous souhaitons développer un modèle d’étude de la fibrose pulmonaire sur souris au système immunitaire humanisé afin d’en étudier le développement, d’en améliorer son diagnostic et de tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier la fibrose pulmonaire et des potentiels traitements pour cette pathologie avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. 1 injection intratrachéale de maximum 10 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ.
Impact sur les animaux
La fibrose pulmonaire se manifeste par une inflammation des poumons menant à l'apparition de fibrose pouvant induire une gêne respiratoire (dyspnée). Des nuisances peuvent être induites par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
La fibrose est une maladie progressive et incurable, l'échelle de score doit permettre une euthanasie avant que l'impact ne soit jugé sévère sur les animaux. Une réutillisation n'est donc pas envisagé puisque l'animal ne pourra pas recouvrir complètement son état de santé en fin d'étude.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec le système respiratoire pour étudier le développement et le traitement de la fibrose pulmonaire. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement de thérapies innovantes permettant de soigner cette pathologie.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.
Raffinement
Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Des morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposés. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, l’état de santé sera évalué par une échelle cumulative de scores prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses, le score corporel et la respiration. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score ≥7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera mesuré au moins trois fois par semaine. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de poids de plus de 25% par rapport au poids initial sera considérée comme une raison de mise à mort. Toute anormalité non objectivable par l'échelle de score devra immédiatement être rapportée au vétérinaire qui aura pleine autorité pour envisager un traitement ou imposer une euthanasie pour raison éthique. Le vétérinaire est présent sur site tous les jours et joignable les week-ends et jours fériés. L'injection intratrachéale sera réalisée sous anesthésie générale volatile à l'isoflurane ou fixe à l’alfaxolone (dose à déterminer).
Choix des espèces
Le projet vise à étudier le développement de la fibrose pulmonaire en se basant sur un système immunitaire humanisé afin d'obtenir le développement d'une pathologie la plus proche possible de celle qui se développe chez l'Homme. Nous maîtrisons l’humanisation du système immunitaire sur les souris, il est donc essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de l'age de 16 semaines pour les animaux humanisés, ceci prenant en compte une période d'humansiation de 12 semaines (minimum) qui peut être réalisée à partir de l'age de 3 à 4 semaines. Les animaux non humanisés seront utilisés à partir de l'age de 6 à 8 semaines afin d'utiliser des animaux adultes. Les études seront réalisées sur des groupes d'âges homogènes.
Étude de la variabilité génétique et phénotypique au sein d’une colonie de ouistitis d’élevage.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Issus de deux colonies d'élevage que les établissements font grandir pour atteindre l'effectif visé, 150 ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun n'étant tué et tous réintroduits dans leur groupe. Chaque animal est mis à jeun, capturé à la main, au filet ou par conditionnement à entrer dans une boîte, puis anesthésié pour une heure environ de prélèvements et de mesures. Les expérimentateurs lui prélèvent un millilitre de sang, une biopsie cutanée refermée par un point de suture et une quarantaine de poils, avant des examens ophtalmologiques avec collyre, blépharostat maintenant chaque œil ouvert et pose de lentilles. Le porteur écrit que "le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte", l'objectif étant de caractériser toute la colonie, et l'expansion de celle-ci sur cinq ans doit fournir les 150 individus.
Objectifs
Ce projet est un projet transversal réalisé dans deux EU qui hébergent chacun une colonie de ouistiti qui leur est propre. Les résultats seront mis en commun et analysés de façon globale. Ce projet a pour objectif d'étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de ces colonies. Cette variabilité au sein d’une espèce est un élément clé pour sa survie en milieu naturel. En captivité, les possibilités d’accouplement au sein d’une colonie sont limitées et le brassage avec des individus non apparentés (et donc suffisamment éloignés du point de vue génétique) n'est pas toujours possible. Au fils des années, des effets négatifs sur la fertilité et la santé (e.g. susceptibilité accrue aux infections) peuvent apparaitre et différentes études ont mis en évidence l'apparition de déficits chez des animaux hébergés en captivité. De même les conditions d’élevage peuvent influer sur la variabilité phénotypique (taille, poids, acuité visuelle..). Étudier la variabilité génétique et phénotypique au sein de colonies d'élevage est donc important pour mieux caractériser et contrôler génétiquement la diversité dans ces populations, raffiner la gestion et le bien-être des animaux et améliorer les études scientifiques futures. Pour atteindre les objectifs de ce projet, des prélèvements de sang et de poils ainsi que des biopsies cutanées seront effectuées chez tous les individus. En parallèle, des examens ophtalmologiques non-invasifs en imagerie multimodale permettant d'évaluer les caractéristiques anatomo-fonctionnelles de la rétine (mesure de la forme de l'oeil, de l'épaisseur de la choroïde, de la correction optique, du diamètre de la pupille, etc.) seront également réalisés.
Bénéfices attendus
Les données collectées dans le cadre de ce projet contribueront à caractériser la diversité génétique et phénotypique au sein de nos colonies de ouistitis. D'autre part, elles pourraient contribuer à affiner l'arbre décisionnel permettant de sélectionner les animaux qui seront mis en contact à des fins de reproduction. Enfin, la caractérisation phénotypique et fonctionnelle de l'oeil pourrait permettre la mise en place de mesures de raffinement complémentaires pour améliorer l’environnement des animaux.
Procédures
Conditionnement à la capture et à l’entrée volontaire dans une boite de capture. Mise à jeun des animaux (retrait de la nourriture et de l’eau respectivement 2h et 1h avant la capture et l’anesthésie). Capture des animaux (à la main/filet ou par entrée volontaire dans une boite de capture) et transport des animaux de leur espace d’hébergement vers la pièce d’anesthésie (au sein du même bâtiment). Anesthésie des animaux (protocole d’anesthésie gazeuse ou anesthésie fixe avec un relai en anesthésie gazeuse). Sous anesthésie, réalisation de différents prélèvements : un échantillon de sang total (environ 1 ml par animal), une biopsie cutanée de quelques millimètres de surface avec mise en place d’un point de suture (un échantillon par animal), et un prélèvement de poils (une quarantaine par animal). [Durée total de la phase de prélèvement des échantillons : environ 30 minutes]. Réalisation de mesures ophtalmologiques (dans le cadre de la même anesthésie que celle décrite précédemment lorsque ce sera possible) : application d’un collyre permettant une anesthésie locale de la cornée, mise en place d’un blépharostat pour maintenir chaque œil ouvert, application d’un collyre dans chaque œil pour induire une dilatation de la pupille, mise en place d’une lentille non corrigée sur chaque œil pour prévenir tout dessèchement de l’œil, puis réalisation d’une série de mesures non invasives sans contact direct avec les yeux. [Durée total de la phase de tests ophtalmologiques : environ 30-40 minutes]. Fin de l’anesthésie avec maintien de l’animal sur tapis chauffant et sous surveillance jusqu’au réveil. Retour de l’animal dans la zone de stabulation en boite de capture et ré-introduction de l’animal dans son groupe sous surveillance le jour de la session et le jour suivant.
Impact sur les animaux
Stress potentiel durant la phase de conditionnement et lié à la capture des animaux et à leur transport de la zone de stabulation vers la pièce de prélèvements/tests. Inconfort lié à l’anesthésie mise en place pour effectuer les prélèvements et les tests ophtalmologiques, complications potentielles au niveau local des suites de la biopsie cutanée (inflammation, infections), conséquences du prélèvement sanguin (hématome localisé), de la pause et du retrait du blepharostat utilisé pour maintenir les paupières ouvertes lors des examens ophtalmologiques, inconfort associée à l'instillation de collyre et à la pose de lentilles non corrigées sur la cornée au cours de l'anesthésie, stress potentiel lié au retour de l'animal dans le groupe.
Devenir
Le projet ne prévoit pas de mise à mort et tous les animaux seront maintenus en vie. A l'issue du projet les animaux seront ré-introduits dans leur groupe.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de méthodes in vitro permettant d’étudier les comportements sociaux et les effets de médicaments neurologiques/psychiatriques sur ces fonctions.
Réduction
Il s'agit ici de caractériser d'un point de vue phénotypique et génétique l'ensemble de notre colonie de ouistitis. Le principe de réduction est donc difficilement applicable dans ce contexte. La colonie de ouistitis actuellement hébergées compte une centaine d'individus. L'expansion de cette colonie, durant la durée d'autorisation du projet de 5 ans, permettra de produire un nombre d'animaux compatible avec l'objectif d’échantillonnage fixé à 150 individus
Raffinement
Captures et manipulations représentent des stress importants. Les captures seront effectuées par les personnes régulièrement en contact avec les animaux (personnel de zootechnie ou en charge du suivi de la colonie). Si d'autres personnes devaient effectuer des captures, des visites seront préalablement organisées pour que les animaux s'y habituent. Deux protocoles pourront être utilisés pour la capture selon la tolérance des animaux au contact humain et le type d'hébergement dont ils seront issus : capture à la main/filet ou conditionnement à entrer dans une boite de transport. La seconde option sera privilégiée dès que possible et fera l’objet de séances d’habituation (entraînement à entrer dans la boite avec récompense (gomme arabique)). S’ils sont capturés à la main/filet, de la gomme arabique leur sera proposée immédiatement après capture lors de l'entrainement. Durant les transports un tissu opaque sera placé sur la boite pour limiter le stress. Si possible, les collectes d’échantillons et les mesures ophtalmologiques seront réalisées dans le cadre d’une anesthésie unique. Le protocole d'anesthésie utilisé permet de raccourcir les phases d’endormissement et de réveil et évite le stress associé à la contention et à l’administration. Pour ce faire, nous utiliserons une boite de capture spécifique, de faible volume et ajourée, qui sera placée dans une boite d’induction thermostatée. Une fois l’anesthésie induite, l’animal sera maintenu au masque sous anesthésie gazeuse pendant toute l’intervention. Lors des mesures ophtalmologiques, les animaux seront placés sur un coussin de contention. La réalisation des biopsies s’effectuera sous anesthésie avec analgésie locale préalable. Un petit échantillon de peau sera collecté et un traitement analgésique et anti-inflammatoire sera administré. La plaie, d’éventuelles irritations des yeux seront suivies jusqu’à la cicatrisation. Les interactions sociales seront monitorées attentivement dans les heures et les jours suivants l’intervention pour s’assurer qu’aucun conflit ne survienne ; dans le cas contraire une surveillance accrue sera mise en place.
Choix des espèces
Les modèles rongeurs ont largement montré leurs limites quant à la modélisation des troubles psychiatriques. Le ouistiti, en raison de ses caractéristiques comportementales et sociales et de la présence de variations génétiques identifiées chez l’Homme en lien avec les pathologies psychiatriques, est un modèle de choix. Tous les individus de notre colonie de plus de 1 an seront étudiés. Cette limite d'âge a été fixée car, bien que dès la naissance les yeux aient quasiment atteints leur taille définitive chez tous les primates, au niveau fonctionnel (au niveau des aires visuelles supérieures notamment) il faut dépasser un an pour que les neurones figent la vision binoculaire, après ce laps de temps on peux considérer le système visuel comme entièrement développé.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.