Recherche fondamentale

Vaccinées par le nez sous anesthésie générale, une ou deux fois à deux semaines d'intervalle, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur réponse immunitaire. Elles peuvent aussi recevoir entre 13 et 30 injections quotidiennes dans l'abdomen sans anesthésie, trois prises de sang et une injection dans la veine, et subir sous anesthésie un lavage des poumons et une perfusion par le cœur avant le prélèvement du poumon. L'équipe cherche les mécanismes qui font apparaître, après une vaccination par le nez, des cellules immunitaires cytotoxiques résidant dans le poumon, en vue de vaccins contre le cancer du poumon. Une chirurgie de 20 minutes figure parmi les actes, sans que sa nature soit précisée, et ni le traitement injecté chaque jour ni le produit injecté dans la veine ne sont nommés.

Objectifs

Le but des vaccins anti-tumoraux est d’induire des cellules immunitaires capables d’éliminer les cellules tumorales. Des travaux ont montré que dans le cancer du poumon, il est important d’induire localement des cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans cet organe, car ces cellules résidentes sont connues pour avoir une protection plus rapide et plus efficace du fait de leur localisation. Ces cellules ne peuvent être générées que par une voie de vaccination intranasale et non systémique ( sous-cutanée ou intramusculaire). L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes qui favorisent la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes, après vaccination intra-nasale.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance dans la génération de ces cellules immunitaires cytotoxiques résidentes dans les poumons, permettra de développer et d’optimiser des vaccins anti-tumoraux pour traiter les cancers du poumons.

Procédures

Injection par voie intra-nasale : 1 ou 2 fois à 2 semaines d'intervalles, sur animaux sous anesthésie générale, durée: 30min. Injection par voie intra-péritonéale d’anesthésique sur souris vigiles: 1 ou 2 injections à 2 semaines d'intervalles,durée: 10secondes/injection. Injection par voie intrapéritonéale de traitement sur souris vigiles : entre 13 et 30 injections ( 1 injection/ jour sur une période de 13 à 30 jours),durée 10 secondes/ injection. Prélèvement de sang: x3 sur souris anesthésiées,durée 1-2 min. Injection intraveineuse de produit : 1 fois sur animaux sous anesthésie générale,durée: 30 secondes. Injection d'analgésique par voie sous-cutanée sur souris vigiles : x1 fois, durée 10 secondes/injection. Prélèvement du lavage broncho alvéolaire (x1fois), perfusion intracardiaque et prélévement du poumon (x1fois) sur animaux sous anesthésie générale,durée totale environ 30 min. Chirurgie sur animaux sous anesthésie,durée 20 min.

Impact sur les animaux

La vaccination par voie intranasale peut induire une gêne respiratoire transitoire de courte durée pendant la durée de l’administration. Les injections répétées par voie intrapéritonéale peuvent induire une douleur légère et transitoire ou une irritation au niveau du site d’injection. La chirurgie peut induire des douleurs post-opératoire (traitée par un analgésique) et risque d’infection et problème de cicatrisation ( traitée avec un antiseptique locale).

Devenir

mise à mort pour récupérer les organes en vue d’analyse de la réponse immunitaires

Remplacement

L’analyse des réponses immunitaires après vaccination, dans différents organes au cours du temps, ne peut être évaluée que dans des organismes entiers. Les modèles in vitro ne permettent pas de mimer fidèlement les réponses immunitaires ni le microenvironnement muqueux pulmonaire. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de conditions observées chez l’homme. Aucune méthode alternative n'existe.

Réduction

Les paramètres expérimentaux (doses, cinétiques) ont été déterminés selon des données déjà publiées. Basé sur des études déjà publiées et avec l’aide d’un logiciel de calcul d’effectifs, nous avons déterminé un nombre d’animaux minimum pour avoir assez de matériel et garantir une analyse statistique fiable. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les injections intranasales, les prélèvements de sang, les injections intraveineuses, et la chirurgie sont réalisés sous anesthésie pour le confort de l’animal. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant et surveillés jusqu’à leur réveil. Des analgésies pre et post-opératoires sont prévues ainsi que des solutions antiseptiques pour la cicatrisation. Tous les vaccins et traitements sont préparés dans des formulations validées pour des administrations chez l’animal et ne sont pas décrits comme toxiques aux doses utilisées. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteint d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée avec des souris, car nous avons des vaccins déjà utilisés et validés dans cette espèce pour induire une bonne réponse immunitaire dans les poumons ainsi que tous les outils et techniques d’analyse adéquats. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, car le système immunitaire est développé et mature.

Pour chercher un moyen de prévenir les douleurs neuropathiques provoquées par trois chimiothérapies anticancéreuses, 102 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse de leurs tissus. Pendant huit jours, elles reçoivent des injections intrapéritonéales de vincristine, de paclitaxel ou d'oxaliplatine, seules ou associées à un bloqueur. Trois tests d'évitement mesurent tous les trois jours leur sensibilité au toucher et à la chaleur, chaque animal restant jusqu'à quarante minutes isolé de ses congénères. Le porteur affirme qu'en dehors des tests ces souris se comportent comme les témoins, et précise qu'une valeur limite retire l'animal du stimulus même lorsqu'il ne montre aucun signe d'évitement.

Objectifs

Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent induits par les agents anticancéreux. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlure, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive efficace. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces NPIC constitue un enjeu de santé publique. Une analyse transcriptomique réalisée sur les ganglions spinaux de souris exposées à des agents anticancéreux neurotoxiques mettaient en évidence une très forte surexpression de l’urocortine. L’urocortine est une neurohormone qui agit sur deux types de récepteurs. Il a été montré que les activateurs naturels de ses récepteurs jouaient un rôle dans l’éxagération de la douleur en particulier viscérale et que le blocage de ces récepteurs pouvaient abolir cette hyperalgésie. Ces récepteurs pourraient constituer une cible thérapeutique potentielle intéressante pour prévenir et/ou traiter les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie. Notre objectif principal est d’étudier l’implication de l’urocortine 1 et de ses récepteurs, dans le développement de la neuropathie induite par la vincristine, par le paclitaxel et par l’oxaliplatine dans nos modèles murins. Pour cela, une étude pharmacologique évaluant les effets de bloqueurs sur le développement des neuropathies induites par la vincristine, le paclitaxel ou l’oxaliplatine sera réalisée.

Bénéfices attendus

Les récepteurs de l’urocortine sont présents à la fois au niveau du système nerveux central (cortex et moelle spinale) et au niveau du système nerveux périphérique (terminaisons nerveuses cutanées, ganglions spinaux). Il a été démontré que l’urocortine injecté dans la moelle spinale chez la souris induisait une éxagération de la douleur en réponse à un stimulus tactile, ce qui confirme le rôle important de l’urocortine et de ses récepteurs dans la modulation de la douleur neuropathique. De plus, un lien étroit existe entre l’exacerbation de la douleur et le stress. Le système urocortine/récepteurs participe à ce phénomène et se présente comme une cible intéressante pour la modulation de la douleur. Cette étude pharmacologique évaluant les effets de bloqueurs des récepteurs à l'urocortine sur le dévellopement des neuropathies induites par la vincristine, le paclitaxel ou l’oxaliplatine pourrait permettre de mettre en évidence une nouvelle cible d’intérêt pour la prise en charge d’un effet secondaire des chimiothérapies, lourd de conséquences sur la qualité de vie des patients et contre lequel il n’existe à ce jour aucun traitement préventif efficace.

Procédures

Au cours des procédures, les animaux recevront leurs traitements (véhicule, bloqueurs et /ou chimiothérapie) par des injections intrapéritonéales répétées tous les jours, tous les deux jours ou tous les jours selon l'agent anticancéreux et sur une période de 8 jours. L'ensemble des animaux sera soumis à trois test comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours.

Impact sur les animaux

L'administration des agents anticancéreux et des traitements par voie intrapéritonéale induira une douleur légère à modérée de courte durée (30 minutes max), pouvant générer un stress. L'administration des agents anticancéreux induira une hypersensibilité caractérisée par une gène observable au cours des tests comportementaux, et en réponse à un stimulus. Au cours des tests comportementaux, les animaux se retrouveront isolés de leurs congénères pendant une courte période (40 minutes max.) pouvant générer un stress. En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu de la vincristine, du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées à la vincristine, au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.

Remplacement

Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de la douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi trois modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet des bloqueurs des récepteurs de l'urocortine sur des neurones sensitifs humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensitifs, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.

Réduction

Le nombre de 6 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé à l'aide d'un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 78 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), distribués en 13 groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale et ainsi permettre d’augmenter le nombre d'animaux de l'étude principale.

Raffinement

Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet des bloqueurs des récepteurs de l'urocortine sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si le score pour au moins 1 souris est supérieur à 10 alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le blocage des récepteurs présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés aux traitements doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux contrôles pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.

Choix des espèces

Des modèles murins de neuropathies induites par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utiliserons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.

Anesthésiées pour une chirurgie de quarante minutes qui interrompt la circulation dans l'artère fémorale d'une patte, 1 380 souris passent ensuite par cinq à six imageries laser doppler et cinq imageries isotopiques pouvant durer deux heures, étalées sur 21 jours. Une partie reçoit en plus des injections abdominales ou des gavages, jusqu'à deux fois par jour pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur énumère les atteintes possibles : douleur, œdème douloureux du membre, infections, incapacité à se servir de la patte, irritations de l'œsophage liées au gavage. Celles qui vont au bout sont tuées pour prélever leurs tissus, et 88 souris qui n'auront pas perdu la vascularisation de leur patte pourront être réutilisées dans un autre projet.

Objectifs

La maladie artérielle périphérique (MAP) se définit comme un blocage partiel ou total d’une artère causé par une accumulation de lipides dans la paroi des vaisseaux artériels se situant en périphérie de l’aorte. Elle est généralement provoquée par un durcissement des artères (athérosclérose). La MAP représente un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Malgré les progrès réalisés dans la prévention des facteurs de risque (tabac, diabète, obésité…) et dans les techniques interventionnelles et chirurgicales (pontage, stents…) pour améliorer la perfusion des membres inférieurs, une partie importante des patients atteints sont considérés comme « non répondeurs » pour la revascularisation et ont un pronostic particulièrement défavorable avec des taux élevés de mortalité et d’amputation des membres. En conséquence, l’identification de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter cette complication invalidante est d’un intérêt critique. Le but de ce projet est d’évaluer soit de nouveaux radiotraceurs qui permettraient un meilleur suivi ou détection des processus de réperfusion (recrutement des petits vaisceaux autour ou créations de nouveaux vaisseaux permettant la revascularisation du membre inférieur), soit d’évaluer l’efficacité de nouveaux candidats-médicaments sur un modèle murin d’ischémie de la patte par arrêt de la circulation dans l'artère fémorale de la patte.

Bénéfices attendus

Le diagnostic et le traitement précoces, ainsi qu’un suivi rigoureux, contribuent à améliorer la qualité de vie des patients en réduisant les symptômes associés et en augmentant l’efficacité des traitements. L’utilisation de nouveaux traceurs permet de détecter le site d’ischémie et facilite la prise en charge rapide des traitements, en augmentant les chances de bon pronostic des patients. Les traceurs développés grâce à la recherche en imagerie médicale offrent une précision supérieure dans la détection du site ischémique. Cela permet aux médecins de cibler plus précisément les zones affectées, réduisant ainsi les dommages aux tissus sains environnants.

Procédures

Les animaux auront : une chirurgie (1 fois, durée 40 minutes max, sous anesthésie générale), des imageries laser doppler (5 à 6 fois sur 21 jours, durée :5 min ; sous anesthésie général), des imageries isotopiques (5 fois sur 21 jours, durée maximum 2h ; sous anesthésie). Une partie des animaux auront également des injections de médicaments soit par injections abdominal soit par gavage (maximum 2 fois pas jours pendant 21 jours , durée en moyenne 1 à 2 minutes, sur animal vigile en contention) et certain auront des prélèvements sanguins au niveau de la queue (2 fois maximum, sous anesthésie, 2min).

Impact sur les animaux

Pendant les procédures décrites dans cette saisine, les animaux sont passibles d’expérimenter ce qui suit : • Douleur et inconfort : la chirurgie pourra provoquer une douleur due au manque d'oxygène et de nutriments dans les tissus affectés. Cela peut aussi entraîner une diminution de l'appétit chez l'animal, conduisant à une perte de poids et à une augmentation du stress. Les traitements réalisés sur les animaux vigiles peuvent entrainer un stress dû aux contentions répétées de l’animal ainsi que des irritations de l’œsophage et des problèmes de déglutition dans les cas des gavages. Les traitements répétés par injections peuvent entrainer des petites plaies cutanées. • Problèmes circulatoires et œdème : le manque de circulation peut entraîner une accumulation de liquide dans les tissus, provoquant un gonflement douloureux et une altération de la fonction des membres affectés. • Infections : en raison de la chirurgie, les tissus ischémiques sont plus sujets aux infections en raison de la réduction de l'apport sanguin et de la réponse immunitaire locale ; ça peut entrainer aussi une dégradation de la peau et du pelage dans le cas des infections cutanées. • Difficulté de locomotion : les animaux dont la patte n'est plus correctement vascularisé peuvent présenter une difficulté ou une incapacité à utiliser leur patte. Cela peut réduire leur capacité à se déplacer librement ou à chercher de la nourriture. • Les anesthésies gazeuses répétées peuvent entrainer des difficultés respiratoires lors de l’anesthésie, ainsi que des difficultés d’endormissement et de réveille au cours du temps.

Devenir

Tous les animaux qui iront au bout des procédures seront mis à mort de afin de récupérer les tissus d'intérêts et de pouvoir compléter l’études avec des expérimentations ex vivo et in vitro. Les animaux qui n'auront pas développé de perte de la vascularisation de la patte et qui seront sortis du projet en bonne santé pourront être réutilisé dans un autre projet.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent l’utilisation de modèle complexe. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative in vitro ou in sillico qui permet d'avoir une vision complète des grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’Homme. L’ensemble des candidats radiotraceur et des candidats médicament, qui seront testés dans ce projet, auront été préalablement évalués pas des études in vitro pour leur ciblage spécifique et leur efficacité.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisé aux maximums tout en assurant des résultats statistiquement exploitables, nous avons calculé les effectifs à l’aide d'un logiciel de statistique G*Power. Pour l’évaluation de nouveaux traceur radioactif, le marquage spécifique dans la patte avec le blocage artériel sera comparé avec la patte en controlatérale (saine), chaque animal sera donc son propre contrôle. Pour la partie sur le développement de nouveaux candidat médicament, nous réaliseront sur 5 groupes distincts une série de 5 mesures répétées sur les mêmes animaux grâce aux imageries in vivo permettant de visualiser les traceur radioactif et permettant de faire des études longitudinales. Nous analyserons les données à l'aide de tests statistiques multiparamétriques.

Raffinement

Les chirurgies, les injections par voie veineuse et les séances d’imagerie se feront sous anesthésie générale gazeuse, ce qui permettra de minimiser le stress de l’animal et un réveil rapide. Les souris anesthésiées seront toujours placées sur un tapis ou lit chauffant avec contrôle de la température pour éviter tout risque d’hypothermie. Les expérimentations douloureuses seront toujours accompagnées, en plus de l’anesthésie générale, d’une analgésie locale et générale par injection sous cutanée de morphinique . Pendant une heure après la chirurgie, une surveillance accrue des animaux sera mise en place, pour éviter toutes complications post- opératoires. L’accès à la nourriture et à l’eau ne sera permis qu’une fois que l’animal sera parfaitement réveillé pour éviter les problèmes de fausse route. Les périodes de traitements sur animaux vigiles seront précédées d’une semaine d’habituation à la contention pour diminuer le stress lors des expérimentations. Les gavages se feront avec sonde de nutrition vétérinaire adaptée aux souris. L’embout est arrondi pour ne pas endommager les parois de l’œsophage et de l’estomac et l’on attend que la souris avale le bout de la sonde (sans forcer) pour éviter les fausses routes. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, ce qui nous permettra d’intervenir rapidement dès le moindre signe éventuel de souffrance pour les prendre en charge. Tout signe et/ou comportement anormal : difficultés à respirer, souris prostrée, en retrait, ou une perte de poids, sera signalé et pris en charge par des compléments alimentaires ou une médication adaptée. Si les signes cliniques ne s’améliorent pas ou que la perte de poids est supérieure à 20 % du poids initial, l’animal sera sorti du protocole et mis à mort sans délai pour éviter toute souffrance inutile. Les conditions d’hébergement classiques ; animaux hébergés en groupe (maximum 5 par cage), avec accès à la nourriture et à l’eau sans restriction et avec un cycle jour/nuit de 12/12 h ; seront enrichies en alternance par l’ajout de dôme, de tube, de bâtons ou boules en bois pour faire les dents, de matériel (fibre de coton) pour la nidification, afin d’enrichir l’environnement et d’éviter les comportements de stéréotypie.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. Le modèle d'ischémie des membres inférieurs chez la souris est bien documenté et a fait l'objet de plusieurs publications dans notre équipe. Notre modèle d’ischémie des membres inférieurs se fait chez le jeune adulte. Les animaux arriveront dans l’animalerie à 6 semaines (poids compris entre 25 et 35 g en fonction du sexe) et la chirurgie sera faite dans leur 8e semaine (poids compris entre 27 et 40 g). À la fin du protocole, les souris devraient peser entre 28 et 45 g.

Injectées à trois à six reprises avec de la doxorubicine ou son véhicule, puis anesthésiées pour deux échographies cardiaques de vingt minutes, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. 1 080 d'entre elles reçoivent en plus une greffe de cellules tumorales sous la peau, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le projet cherche à savoir si des gènes de la réponse immunitaire protègent le cœur des effets de cette chimiothérapie, dont la cardiomyopathie touche 29 % des patients dans les cinq premières années. Le porteur qualifie la cardiotoxicité induite d'asymptomatique, avec des altérations transitoires, tout en décrivant des tumeurs pouvant se nécroser, s'ulcérer ou saigner et, plus rarement, une tachycardie, une fibrillation ventriculaire et une insuffisance cardiaque aiguë.

Objectifs

La doxorubicine est un médicament anti-cancer puissant et largement utilisé pour le traitement de différents types de carcinome chez l’homme. Toutefois, il est connu qu'il peut provoquer des effets secondaires graves, parmi lesquels le développement d’une cardiomyopathie. Bien que plusieurs modèles aient été proposés pour expliquer ce phénomène singulier de toxicité cardiaque, il n'a pas encore été possible d'identifier un mécanisme moléculaire spécifique afin de développer une stratégie pharmacologique cardio-protectrice. L'objectif de ce projet est d'évaluer si nos gènes d’intêret, impliqués dans la réponse immunitaire, jouent un rôle protectif au niveau cardiaque lors d’un traitement à la doxorubicine. L’étude de ces gènes dans ce contexte permettra la mise en place d’une stratégie cardio-protectrice.

Bénéfices attendus

La doxorubicine peut provoquer des effets secondaires graves. Parmi ceux-ci, le développement de la cardiomyopathie est parmi les plus courants, affectant 29 pour cent des patients au cours des cinq premières années de traitement. Ce projet vise à identifier les mécanismes impliqués dans le développement des effets cardiotoxiques observés, afin d’améliorer la prise en charge des patients traités avec la doxorubicine. Nous préconisions que l’accomplissement de ce projet fournira des bases pour le développement de stratégies cardioprotectrices ciblées pour les patients atteints de cancer et traités avec doxorubicine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à: (i) l'injection de traitements intrapéritonéaux par contention de l'animal vigile (un minimum de 3 fois à un maximum de 6 fois au total/animal, 2 min/animal); (ii) 2 échographies cardiaques (20 min/animal) sur l'animal anesthésié par anesthésie gazeuse. 1080 animaux seront soumis à : (i) l’injection de cellules tumorales en sous cutané (1 fois, 5 min/animal) sur l’animal anesthésié par anesthésie gazeuse ; (ii) un suivi de la croissance tumorale par contention de l’animal vigile à l'aide d'un pied à coulisse 3 fois par semaine (5 min/animal). 360 animaux vigiles seront soumis à 2 prélèvements sanguins (4min/animal)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations peuvent entrainer du stress chez l’animal. La chimiothérapie et la croissance tumorale peuvent induire une perte de poids et de la diarrhée. Les tumeurs peuvent se nécroser et/ou ulcérer et/ou saigner. Les sites d’injections ainsi que les sites des prélèvements sanguins peuvent s’infecter. La cardiotoxicité qui est induite dans ce protocole est asymptomatique avec des altérations transitoires de la fonction systolique et des arythmies. Des manifestations symptomatiques graves mais rares (moins d’un pour cent) peuvent apparaître sous la forme d'une tachycardie et fibrillation ventriculaire, et d'une insuffisance cardiaque aigüe. Les risques liés à l’anesthésie peuvent être : l’hypothermie, difficultés de réveil et respiratoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaires pour répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Nous développons un maximum d’approches in vitro (développement de tumoroides et expériences in vitro avec coltures cellulaires humaines et murines ; mesures de paramètres biochimiques sur du sang de patients, extraction de cellules mononuclées du sang périphérique pour mise en culture puis stimulation/inhibition) dans le but de répondre à l’ensemble des questions posées dans notre projet de recherche. De plus, des études retrospectives sur coohortes de patients sont en cours. Toutefois, l’étude de la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie rend l’étude in vivo indispensable, car il n’est pas possible d’étudier la cardiotoxicité induite par la chimiothérapie seulement dans des systèmes in vitro ou ex vivo à cause de sa complexité.

Réduction

Nous souhaiterons effectuer cette étude sur un total de 1440 souris transgéniques ou normales pour permettre d’étudier le rôle de nos gènes d’interet dans le cadre de la cardiotoxicité en réponse à la chimiothérapie et ce dans le respect du bien-être animal. Les modèles choisis sont très bien documentés dans la littérature et les protocoles solidement établis au sein de notre laboratoire, permettant ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Notamment, les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements. Une veille bibliographique attentive et constante sera effectuée pour s’assurer que les expériences planifiées n’ont pas été déjà rapportées dans la littérature scientifique.

Raffinement

Nous utiliserons des souris transgéniques viables, fertiles, de taille normale et ne présentent pas d'anomalies physiques ou comportementales. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et tunnels en cartons). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur comportement et leur bien-être. Pour l’injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée et lors des échographies, les souris seront anesthésiées (anesthésie gazeuse). La mise en place d’un suivi des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par differentes raisons : - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis.

Des capsules contenant des tiques sont collées sur le dos de souris préalablement infectées par un parasite du sang, et y restent trois à quatre jours pendant que les tiques se gorgent. 20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection intraveineuse inocule Babesia divergens, suivie de prélèvements sanguins quotidiens pendant trois à cinq jours et d'une anémie légère attendue. Chaque souris est isolée en cage individuelle parce qu'elles retirent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques, et le porteur présente ce modèle comme un moyen d'éviter le recours aux bovins, "beaucoup plus contraignant".

Objectifs

La babésiose est une maladie parasitaire cosmopolite due à l'infection par des parasites sanguins du genre Babesia. De nombreuses espèces de vertébrés peuvent être affectées par cette maladie, transmise par les tiques, et certaines espèces de Babesia présentent un grand intérêt en tant que responsables des zoonoses émergentes. En Europe, des publications récentes montrent clairement que l'incidence annuelle de la babésiose augmente à la fois chez l'homme et chez l'animal. Le piroplasme bovin Babesia divergens est souvent associé à la babésiose humaine en Europe et est transmis lors d'une piqûre de la tique Ixodes ricinus. Chez la tique, le parasite doit envahir des cellules differents, se transformer et migrer à l'intérieur de la tique afin de réussir à atteindre les glandes salivaires, afin de pouvoir infecter un nouveau hôte vertebré. Pour se faire, certaines protéines produites par le parasite sont essentielles. Malheureusement, il y a très peu d’information disponible sur le développement de Babesia chez la tique, malgré le développement récent de modèles in vivo et in vitro qui permettent l’infection des tiques. Il est donc essentiel de décrypter ces mécanismes, ce qui permettra d'identifier des cibles potentielles pour contrôler cet agent pathogène dans le vecteur et ainsi bloquer la transmission. Notre objectif est de développer un système expérimental qui nous permettra d'observer l’interaction du parasite Babesia divergens pendant leur migration vers les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus, et de détecter la production des protéines facilitant l'invasion des cellules des glandes salivaires. Jusqu'à présent, les outils permettant l’infection des tiques et le suivi de l’infection sont très limités, et seule la collection des tiques gorgées chez des bovins infectés est disponible. La possibilité d’infecter des souris immunodéprimées avec Babesia a été démontré, nous voulons maintenant explorer le développement temporel et spatial de Babesia chez la tique en établissant un modèle murin in vivo de Babesia divergens.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle d’infection de Babesia divergens chez la souris permettra la caractérisation du développement du parasite pendant son développement et migration vers les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus, sans avoir besoin d’un modèle expérimental bovin, beaucoup plus contraignant. Des modèles similaires ont fait leurs preuves dans l’étude de Plasmodium falciparum, parasite responsable du paludisme chez l’Homme qui ne pouvait pas être entretenu hors son hôte humain avant l'utilisation des souris immunodéficientes. L’identification des cibles moléculaires chez le parasite permettra le développement des techniques pour le contrôle de l’infection, soit en bloquant la migration du parasite chez la tique, soit en inhibant leur capacité infectieuse lors de la piqure à l'hôte. Cependant, il n’y a pas d’information ou presque à propos des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’invasion des cellules des glandes salivaires. Les résultats obtenus ouvriront de nouvelles pistes pour le développement de stratégies visant à bloquer la transmission de la piroplasmose.

Procédures

Une seule injection intraveineuse (une minute) pour l'inoculation des parasites, ainsi que des prélèvements sanguins par la veine caudale ou saphène (1-2 minutes) seront faits une fois par jour pendant 3-5 jours afin de suivre la parasitémie chez les souris immunodéficientes infectées avec le parasite. Ensuite, les souris seront anesthesiées à l’aide de l’isoflurane par inhalation avant la pose de capsule contenant les tiques. La procédure de pose dure 5 minutes en moyenne. La capsule sera enlevée au bout de 3-4 jours.

Impact sur les animaux

La contention de la souris pendant 1-2 minutes lors du microprélèvement sanguin, peut être à l’origine d’une détresse chez l’animal. Le placement des capsules de contention (5-8 minutes), l'hebergement individuel, l’attachement et le gorgement des tiques sur l’animal (5 jours) peuvent aussi être source de stress. La réplication du parasite (parasitémie) peut être à l’origine d’une anémie legère sans autre signe clinique.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total.

Remplacement

Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris immunodéprimées préalablement infectées avec Babesia divergens, afin d'évaluer le développement du parasite chez la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer l’infection de la tique Ixodes ricinus par des parasites viables capables de migrer dans l’appareil digestif de la tique. Ce modèle permet d'assurer le meilleur suivi individualisé lors de l’inoculation de B. divergens chez la souris, avant le repas sanguin de la tique. Ils existent des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas un taux d’infection capable d’assurer la transmission du parasite lors de la transformation de la larve de tique en nymphe. La seule autre alternative efficace pour la transmission de B. divergens à la tique est avec l’utilisation des bovins ou des gerbils.

Réduction

Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le minimum nécessaire afin d’obtenir la quantité de tiques gorgées qui nous permettront de suive nos analyses. L'analyse statistique des résultats ne concerne que les tiques, ce qui permet réduire le nombre de souris. Pour assurer la collecte d'au moins 60-75 tiques gorgées au total, nous avons besoin de 3 souris immunodéprimées que seront utilisés pour le repas sanguin des larves, et 2 souris pour le repas sanguin des nymphes. Grace aux microprélèvements sanguins chez la souris, nous pourrons suivre la parasitémie sur un même individu, sans avoir besoin de multiplier le nombre des souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par lot de 2-3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Nous suivrons les animaux tous les jours, deux fois par jour, afin de surveiller leur état général, de contrôler l'apparition de symptômes éventuels, et d’arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de signes de detresse aiguë (comportement stéréotypé, abattemet sévère, incoordination). Lors du repas sanguin des tiques sur les souris, chaque souris sera hébergée en cage individuelle car elles sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Leurs cages seront particulièrement enrichies afin d’assurer leur bien-être en ajoutant des materiaux qui stimuleront leur comportement exploratoire (carrés de coton, nids, rouleau de carton), et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages voisines. Pour réduire le stress de l’animal, nous allons habituer les souris à être manipulées dès leur arrivée, une à deux fois par jour. Le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser le désagrément chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pour ceci, les souris seront anesthésiées pendant tout le temps de pose de la capsule. Aussi, nous allons appliquer une crème anesthesique locale (lidocaïne) 30 minutes avant du microprélèvement de sang.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée des souris immunodéficientes. Ces souris pourront être infectées par le parasite Babesia divergens, ceci sera capable de se multiplier dans leurs globules rouges. Après la transformation de la tique de larve à nymphe, nous repartirons les tiques sur deux nouvelles souris pour un nouveau repas sanguin afin de stimuler la migration des parasites vers les glandes salivaires de la tique. Pour ceci, nous utiliserons des souris immunocompétentes. Toutes les souris auront 7-8 semaines, avec l’adaptation des animaux à leur environnement pendant une semaine avant le début de l'expérimentation.

Trois prises de sang de 15 ml par semaine pendant trois semaines sous anesthésie générale, puis des injections sous-cutanées de cellules tumorales humaines, puis la surveillance de la pousse des tumeurs, puis un transport vers un second établissement pour deux anesthésies de deux heures et l'exérèse. 10 miniporcs vont être utilisés dans ce volet du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sous immunosuppresseur pendant tout le protocole. Le porteur situe la douleur à l'endroit de la tumeur jusqu'à son retrait, puis sur les cicatrices pendant les 24 heures qui suivent la chirurgie. Il annonce une étude qui "permettra de passer rapidement à des essais cliniques chez l'Homme", quand l'objet immédiat est de calibrer une sonde de détection déjà essayée sur cultures cellulaires et tissus isolés.

Objectifs

Le but de ce projet est de mettre au point/valider des protocoles qui seront utilisés lors d'études cliniques. D’après l’Organisation Mondiale de la Santé, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, 10 millions de décès en 2020. En moyenne, 20 à 50 % des patients opérés dans le cadre de résection tumorale subissent une récidive cancéreuse locale. Ces récidives locales sont principalement dues aux résidus tumoraux qui subsistent dans la plaie opératoire après la chirurgie. Détecter les cellules cancéreuses pendant la résection et garantir des marges nettes signifie assurer l'ablation complète des tissus tumoraux, tout en préservant les tissus sains environnants, afin de ne pas endommager les zones fonctionnelles. L'objectif de notre projet est de valider la détection des tumeurs avec une sonde peropératoire détectant les rayonnements bêta afin d’améliorer la résection tumorale. Plusieurs tumeurs seront implantées chez un même animal dans le but de pouvoir vérifier la précision chirurgicale du dispositif médical, tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le dispositif détecte des radiotraceurs bêta in situ précédemment injectés. Ces radiotraceurs, actuellement utilisés pour le diagnostic en imagerie TEP (Tomographie par Émission de Positons) et la thérapie (radiothérapie interne) permettent une détection très spécifique et sensible. Cette technique consiste à utiliser un noyau radioactif entouré d’une matrice et qui a la particularité d’être spécifique à chaque tumeur. Ce nouvel outil chirurgical, sonde de détection des particules β, indépendante du type de cancer, couplée à un outil d’exérèse, permet de guider en temps réel le geste des chirurgiens en localisant les résidus de cancer à extraire tout en préservant les tissus sains environnants. Pour vérifier l'efficacité et calibrer in vivo ce dispositif, nous devons travailler avec un modèle proche de l’homme en termes de tissus et de taille importante tel que le miniporc.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à améliorer le traitement chirurgical des cancers. Ces essais in vivo vont permettre de mieux calibrer et affiner l'utilisation d'un dispositif médical qui aide les chirurgiens oncologues à l'exérèse totale des tumeurs. Cette étude permettra de passer rapidement à des essais cliniques chez l'Homme.

Procédures

Etablissement 1 : Les porcs recevront un médicament immunosuppresseur pendant toute la durée du protocole. Trois prises de sang de 15ml chacune seront faite chaque semaine pendant 3 semaines, c'est une intervention rapide de moins de 3 minutes, sous anesthésie générale. Par la suite, ils recevront des injections sous cutanées de cellules tumorales, sous anesthésie, qui durent moins de 10 minutes. Dans les jours qui suivent la pousse des tumeurs est survéillée. Etablissement 2 : Les porcs subissent deux anesthésies générales de 2h chacune pour imagerie médicale et retrait des tumeurs.

Impact sur les animaux

Premier établissement : Les porcs subiront plusieurs anesthésies de courte durée (moins de 15 minutes) pour la réalisation de prises de sang et l’injection de cellules tumorales. Ceci peut provoquer une douleur passagère à l’injection et une confusion temporaire au moment du réveil. Ils seront implantés avec des cellules tumorales qui provoqueront la pousse d’une tumeur sans métastase ou effet paranéoplasique, ce qui va provoquer une gêne mécanique à l’endroit de la tumeur ou une douleur ou inflammation localisée qui durera tout le temps de la présence de la tumeur jusqu’à l’exérèse. Les porcs seront transportés entre les deux établissements, ce qui va provoquer un stress d’une durée maximale d’une heure. Deuxième établissement : : Les porcs subiront deux anesthésie de moyenne durée (environ deux heures pour l’imagerie médicale ). Ceci peut provoquer également une douleur à l’injection des produits anesthésique et une confusion mentale au moment du réveil. Ils subiront aussi une intervention chirurgicale rapide, d’exérèse des tumeurs au cours de la deuxième anesthésie. Ceci peut provoquer une légère douleur à l’induction de l’anesthésie, mais surtout une douleur sur les cicatrices au réveil et pendant le 24h qui suivent la chirurgie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux des tissus pour l'analyse histologique.

Remplacement

Le dispositif médical que nous testons a déjà été essayé sur des cultures cellulaires et des tissus isolés. Il a montré sa sensibilité et son efficacité, mais ll faut désormais sur des tumeurs d'animaux vivants, tel que le Règlement Européen sur les dispositifs médicaux le demande.

Réduction

Le nombre d'animaux est déterminé par le nombre de tumeurs à traiter. Le Règlement Européen 2017/745 demande un minimum de preuves d'efficacité en nombre de traitement. Le produit est considéré efficace s'il fonctionne 10 fois sur chaque tumeur. Nous avons déterminé qu'il est possible d'implanter 6 tumeurs par miniporc à raison de 2 tumeurs de chaque nature par porc. Il faut donc un minimum de 5 porcs pour obtenir les résultats. Au maximum, 10 animaux seront prévus à cause des aléas de mise en place du modèle (1 – étude pilote, 4 - étude expérimentale et 5 – deuxième étude sera réalisée si nécessaire pour confirmer les résultats ou pour évaluer l'efficacité sur d'autres types de cancer). Un nombre d'animaux se trouve réduit au minimum nécessaire pour l'obtention de données suffisamment fiables, afin d’évaluer une nouvelle sonde de détection peropératoire du rayonnement bêta pour la résection de tumeurs en "conditions réelles".

Raffinement

Etablissement utilisateur 1 : Les animaux bénéficient d’une période d’acclimatation de 8 jours avant le début du traitement immunosuppresseur. Tout au long de leur hébergement, ces miniporcs, qui sont assez jeunes à leur arrivée, sont hébergés en groupes, dans des boxes bien plus vastes que ce qui est recommandé par la règlementation, avec des possibilités de se cacher, de jouer, et de fouisser dans la litière pour rechercher leur nourriture, ce qui évite l’ennui. Ils sont suivi par un personnel qui connaît très bien les cochons et enregistre quotidiennement leurs progrès en matière de socialisation. Ils sont récompensés pour leur collaboration après chaque geste invasif et ont un entrainement médical. La ciclosporine est amère, elle est distribuée avec un masqueur de goût pour éviter l’aversion. Les prélèvements sanguins sont faits sous anesthésie. Le suivi des tumeurs est fait par du personnel formé et en cas de signe clinique des traitement antalgique et tout traitement symptômatique est accepté. Toutes les précautions sont prises, en matière d’hygiène pour empêcher les infections intercurrentes consécutives du traitement immunosuppresseur. Etablissement utilisateur 2 : les animaux sont suivis et hébergés dans les mêmes conditions. L’imagerie et la chirurgie d’exérèse sont réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Le suivi post-opératoire tout le lendemain et réalisé par du personnel formé dans un hébergement confortable et chauffé. A chaque phase du protocole, des points limites adaptés permettent d'exclure les animaux avant que des souffrance trop importantes n'apparaissent.

Choix des espèces

Pour ce projet nous avons besoin d’un animal chez qui il est possible de greffer des cellules de tumeur d’origine humaine, pour obtenir des tumeurs d’une taille comparable aux tumeurs des patients humains pour essayer notre dispositif dans des conditions comparables. Le porc a été choisi par qu’il est possible de réaliser ces greffes chez ce modèle et qu’il est de taille suffisante pour supporter la greffe de plusieurs tumeurs. Les porcs utilisés en étude sont les animaux jeunes adultes, leur poids (vers 40- 50kg à l’arrivée en étude) est proche d’un poids humain et permet de travailler avec des doses humaines. Enfin, ce poids est compatible avec une bonne manipulation des animaux par les opérateurs.

16 800 têtards de xénopes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 240 individus par molécule testée pour trente-cinq molécules. Ils baignent dans une eau contenant les perturbateurs endocriniens pendant trois jours ou jusqu'à trente jours, après dix jours d'exposition au métronidazole en incubateur opaque pour une partie d'entre eux, et sont anesthésiés jusqu'à quatre fois pour le comptage des cellules du nerf optique. Le porteur estime la mortalité liée à l'exposition à 10 % sur trois jours et 20 % sur un mois, à quoi s'ajoutent 10 % de morts prématurées pendant le développement. Il retient le xénope entre autres parce que l'espèce "génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d'animaux".

Objectifs

Au cours de ces 40 dernières années, des milliers de produits chimiques ont été introduits dans notre environnement. Connues sous le nom de perturbateurs endocriniens (PE), ces molécules ont des effets néfastes sur la santé en agissant sur le système endocrinien, en mimant l’action physiologique des hormones. Les PE agissent sur certaines hormones, qui agissent sur des cellules présentes dans le cerveau. En sachant que l’exposition chimique influence, dans le cerveau en développement et chez l’adulte, le destin des cellules, nous pensons que les PE auraient un impact sur des cellules spécifiques appelées les oligodendrocytes, qui forment une gaine isolante autour des axones (prolongement des cellules nerveuses) appelée la myéline. Ces cellules sont impliquées dans des mécanismes de myélinisation (processus de formation de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). L’objectif de notre projet est donc d’évaluer chez le têtard de Xenopus Laevis les effets des perturbateurs endocriniens sur la myélinisation et la remyélinisation et ainsi vérifier s’il existe une corrélation avec certaines maladies comme la sclérose en plaque, dont les cas ont augmenté depuis l’apparition de ces molécules.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre les effets des substances identifiées comme ayant des propriétés perturbatrices sur le système endocrinien, et les conséquences qu’elles peuvent avoir sur la myéline (membrane qui protège les axones de nos neurones) dans différentes conditions. Premièrement, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de myélinisation (processus de la formation de la myéline), permettrait de comprendre quelles molécules impactent ce processus et de voir s’il existe une corrélation avec les troubles neurodéveloppementaux observés chez les enfants ayant été exposés à ces molécules. Ensuite, étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte de remyélinisation (processus de régénération de la myéline) permettraient dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaque (où la myéline est détériorée, SEP), de comprendre s’il existe une corrélation entre l’augmentation du nombre de cas de SEP et celle de l’utilisation des PE. De plus, notre implication dans un projet international permet de répondre aux besoins réglementaires, scientifiques et sociétaux pour une meilleure évaluation des dangers et des risques chimiques des substances identifiées comme PE.

Procédures

Afin de procéder à un comptage des cellules d'intérêt dans les nerfs optiques, les animaux seront anesthésiés au maximum 4 fois pour une durée de 15 minutes maximum avec un minimum de 3 jours entre chaque anesthésie. Une partie des têtards sont mis en contact avec une molécule permettant de mettre en place le modèle pendant 10 jours, dans leur eau de balnéation. Puis ils seront exposés pendant 3 jours aux perturbateurs endocriniens pour étudier leur effet. Une autre partie des têtards sera mise en contact direct avec les perturbateurs endocriniens pendant 30 jours maximum pour étudier leur impact sur le développement. Les perturbateurs endocriniens sont aussi préparés dans l’eau de balnéation des têtards. Tous les têtards sont euthanasiés en fin de procédure par une méthode règlementaire pour la réalisation d’analyses sur leurs tissus.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines concentrations de perturbateurs endocriniens testées soient toxiques et entrainent la mort des têtards. Nous estimons cette perte liée à l’exposition aux perturbateurs endocriniens à 10 pour cent pour 3 jours et 20 pour cent pour 1 mois d’exposition. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent. Lors des différentes procédures, les animaux sont délicatement attrapés avec une pipette. Cette manipulation induit un léger stress. Lors des tests comportementaux, les têtards sont amenés dans la pièce agréée dans leur bac ce qui peut provoquer un léger stress chez nos animaux lors du déplacement (bacs sur un chariot).

Devenir

Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux perturbateurs endocriniens testés, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immuno-histologiques plus poussées sur leurs tissus pour compléter les observations faîtes du vivant de l’animal.

Remplacement

Les perturbateurs endocriniens sont connus pour avoir un effet toxique sur les cellules en culture, ce qui explique pourquoi ce modèle ne peut pas être utilisé dans notre cas. L ’intérêt est de comprendre les effets des perturbateurs endocriniens au sein d’un organisme vivant, et d’étudier leurs impacts sur le comportement et les processus physiologiques. Le recours à des têtards, qui ont un système nerveux comparable (présence et importance de la myéline dans le fonctionnement) à ce qui est retrouvé chez l’Homme, peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo, ce que les modèles cités précédemment ne permettent pas. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus Laevis repose donc sur les arguments suivants : -Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro -La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal sans euthanasie à des temps donnés pour prélever des échantillons -Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux pour leur interprétation -Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus Mammifères) pour transposer nos observations sur cette espèce à l’Homme.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules qui nous intéressent dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards. Nous estimons qu’il faudra environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée deux fois à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle, ce qui fait un total de 8 groupes, avec 15 têtards par condition, donc 240 têtards au total. Le nombre de 15 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée des têtards liée au développement et celle liée à l’exposition aux molécules (molécule qui permet la mise en place du modèle et celles à évaluer). 35 molécules sont à tester suivant ce modèle, soit au total environ 8 400 têtards pour la myélinisation, et 8400 pour la remyélinisation, ce qui fait un nombre total de têtards de 16 800 têtards pour ce projet.

Raffinement

Au cours de leur développement, les têtards sont placés dans un bac de 4L d’eau adaptée à leur physiologie (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à 23degrès Celsius avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée de façon hebdomadaire pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets (un changement d’eau trop fréquent entraine un stress avec une perte de nos têtards). Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les déchets liés au surplus de nourriture sont retirés de l’eau quotidiennement pour maintenir de bonnes conditions environnementales. De plus, des bûches flottantes artificielles sont placées dans les bacs, ce qui permet de complexifier leur milieu (enrichissements). Enfin, nous utilisons une alimentation, majoritairement composée de végétaux et d’algues, adaptée à leur développement. La profondeur de l'anesthésie est surveillée et est adaptée à nos besoins pour garantir une immobilisation et limiter le stress des animaux. Pour optimiser le réveil et la bonne récupération des animaux, nous favorisons une oxygénation de l'eau avec un bulleur et réintégrons les têtards auprès de leurs congénères pour limiter le stress Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pour les manipulations la préhension des animaux est faite délicatement avec une pipette, Pour le comportement, les têtards sont amenés dans leur bac jusqu’à la pièce dédiée, et attrapés par une pipette pour les placer dans une large boite de Pétri avec leur milieu de nage pour limiter le stress. Les têtards sont isolés très peu de temps (5 min) avant d’être replacés dans leur bac d’origine avec leurs congénères. Durant l’exposition au métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle), les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit ne semble pas leur être préjudiciable vue que cette espèce a une préférence naturelle pour les zones peu éclairées. Afin de déterminer les concentrations optimales non toxiques lors du passage au modèle animal, les effets des perturbateurs endocriniens sont d’abord étudiés, sur des tranches de cervelet de souris.

Choix des espèces

La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre 3 jours (stade 21) et 1 mois (stade 50) post-fertilisation. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des cellules d’intérêt (oligodendrocytes in vivo) et sans recours à l’euthanasie des animaux.