Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
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- Système cardiaque
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- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Entretien et génotypage invasif d’une lignée de souris avec une cardiomyopathie
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une partie des souris part vers un autre établissement pour intégrer des projets de recherche déjà autorisés, l'autre reste sur place pour faire tourner la colonie avant d'être tuée en fin de période de reproduction. 636 souris vont être utilisées de la sorte, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal juvénile, vigile, subit une biopsie de la queue pour le génotypage, geste dont le porteur reconnaît qu'il induit une douleur brève et un risque d'infection au point de prélèvement. La lignée porte une mutation responsable de cardiomyopathie dilatée, et le porteur écrit avoir développé cellules souches, pseudo-tissus contractiles et organoïdes humains sans pouvoir se passer d'un "organisme entier", les souris étant utilisées avant l'âge d'apparition des symptômes.
Objectifs
Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche : ces souris sont cardiomyopathiques, de forme dilatée. Cette maladie touche environ 1 personne sur 2500, soit des dizaines de milliers de cas en France. Les recherches ciblent le muscle cardiaque et ses caractéristiques structurelles et fonctionnelles. La lignée de souris cardiomyopathiques est essentielle pour pouvoir étudier la fonction cardiaque dans un contexte 'organisme entier' puisque de nombreuses régulations physiologiques et physiopathologiques participent à la pathologie. Comprendre la physiopathologie permet d'envisager des traitements qui pourront être évalués sur ce modèle. Une biopsie est nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc la génération de lots de souris porteuses d'une mutation dans un gène responsable de cardiomyopathie du bon génotype indispensables pour mener à bien les projets de recherche.
Bénéfices attendus
Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’études centrés sur la compréhension de la physiopathologie de la cardiomyopathie dilatée liée aux mutations du gène muté. La compréhension de la maladie ouvre la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant déborder sur des cas liés à ces seules mutations puisque le gène d’intérêt est un acteur central de l'homéostasie cellulaire du cardiomyocyte, une fonction probablement altérée dans un grand nombre de cas d'insuffisance cardiaque humaine.
Procédures
Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile vigilant. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourront induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Si un phénotype se déclare, les animaux pourront avoir une atteinte cardiaque légère pouvant induire une mobilité réduite, cependant les âges d’utilisation des animaux restent en deçà des âges d’apparition du phénotype connus pour cette lignée.
Devenir
Les animaux produits dans le cadre de ce projet seront : 1) transférés dans un autre établissement afin d’intégrer des projets de recherche préalablement autorisés (utilisation continue) ; 2) maintenu dans l’établissement pour assurer le maintien de la colonie puis euthanasiés en fin de période de reproduction (avant l’apparition d’un phénotype dommageable). Les euthanasies seront effectuées par une méthode règlementaire.
Remplacement
Le laboratoire met en place depuis plusieurs années les modèles de cellules souches pluripotentes induites-cardiomyocytes, de pseudo-tissus contractiles et d'organoides dérivés de ces cellules contractiles humaines pour limiter le recours aux animaux dans les expérimentations cellulaires. Cependant il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les mécanismes régulateurs participant à la fonction cardiaque et à la mise en place des pathologies comme la cardiomyopathie dilatée. Un modèle animal reste donc nécessaire pour étudier ces aspects fondamentaux, en particulier lors de la validation d'hypothèses thérapeutiques.
Réduction
Au total, 636 animaux seront nécessaires pour la reproduction et pour les projets autorisés. Les accouplements seront mis en place en fonction des projets autorisés. Dans la mesure du possible, (si les âge, sexe et génotypes correspondent) les animaux produits dans ce protocole de maintien de lignée seront intégrés dans les protocoles à venir sujet à des demandes d'autorisation de projet spécifiques. Enfin, si les protocoles expérimentaux à venir ne nécessitent pas de maintenir l’élevage en continu (absence de protocole pendant une durée de plusieurs mois par exemple), l’élevage sera Cryo préservé pour pouvoir être relancé par la suite. Compte-tenu de la nature du projet, il n’y aura pas d’analyse statistique ici mais les projets qui utiliseront ce modèle contiendront des analyses statistiques rigoureuses permettant de minimiser le nombre d'animaux tout en répondant aux objectifs scientifiques fixés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les animaux sont maintenus sous un statut sanitaire exempte de pathogènes et d'opportunistes. Tout le matériel est stérilisé par autoclavage (enrichissement, cages) et l'eau est osmosée. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La technique utilisée pour la réalisation des biopsies est la biopsie caudale, technique recommandée par les différents comités nationaux. Les biopsies sont réalisées avec du matériel propre et désinfecté, une compression avec de l'essuie-tout propre est effectuée pour stopper le micro-saignement. Les souriceaux sont sous surveillance jusqu'à ce que leur mère les reprenne en charge dans le nid. Les animaux ne devraient pas développer de phénotype aux âges utilisés dans ce projet. Si une déclaration précoce se présente, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.
Choix des espèces
Le modèle le plus commun utilisé avec succès dans les études physiopathologiques et préclinique dans le domaine cardiaque est la souris. La lignée est déjà établie et phénocopie la cardiomyopathie dilatée humaine pour l'effet dose de la mutation et le dimorphisme sexuel. Les animaux seront utilisés pendant la période de fertilité jusqu'à l’âge de 6 mois pour ceux retenus pour les accouplements de maintien de lignée. Les animaux inclus dans un projet de recherche autorisé seront utilisés avant 5 à 6 mois de vie.
Evaluation de l’effet antitumoral et de l’effet abscopal d’un immunomodulateur combiné à un traitement par radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées de deux tumeurs, injectées trois fois d'un immunomodulateur puis irradiées un quart d'heure sous contention, vigiles, 1 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever le sang et les tumeurs. Le projet cherche à savoir si cet immunomodulateur amplifie l'effet dit abscopal de la radiothérapie sur des métastases situées hors du champ d'irradiation, la retombée pour les patients étant renvoyée au long terme et à d'éventuels essais cliniques. Le porteur reconnaît que la tumeur, en grossissant ou en se nécrosant, peut faire souffrir la souris et gêner ses déplacements, et annonce des points limites "précoces" appliqués strictement, sans dire lesquels.
Objectifs
Notre projet consiste à évaluer l’impact de l’addition d’un immunomodulateur à un traitement par radiothérapie dans le cas de cancers multi-site. Cette voie de recherche est intéressante à explorer. En effet, elle peut contribuer à améliorer de façon significative l’efficacité des radiations ionisantes, sachant qu’aujourd’hui un traitement de radiothérapie est indiqué chez plus de la moitié des patients atteints d’un cancer. De plus, il a été montré que l’irradiation d’une tumeur pouvait engendrer des effets sur des métastases situées hors du champ d’irradiation. Cet effet, nommé « effet abscopal » provient du système immunitaire et serait très intéressant à amplifier grâce à des combinaisons thérapeutiques. Par ailleurs, des combinaisons thérapeutiques combinant irradiation et d’autres immunomodulateurs ont déjà montrées des effets en clinique soulignant le potentiel et l’intérêt de telles combinaison. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire de l’hôte. Suite à l’irradiation, la réponse interféron-gamma puis la sécrétion de cytokines et de médiateurs vont favoriser l’infiltration de cellules immunitaires pro tumorale ou anti tumorales par vagues successives. Certaines réactions vont promouvoir l’effet antitumoral, tandis que d’autres, comme l’infiltration intratumorale radio-induite des lymphocytes T régulateurs vont freiner l’efficacité de la radiothérapie. Ces cellules ont normalement pour rôle de réprimer les réponses immunitaires anormales ou excessives envers des antigènes du soi ou du non-soi pour maintenir l’homéostasie immunitaire. Dans les cancers, elles sont impliquées dans le développement et la progression tumorale car elles inhibent l’immunité antitumorale. Le but de notre projet est de combiner une molécule permettant d’éliminer ces cellules avec la radiothérapie et de voir si cela peut améliorer l’efficacité de la radiothérapie et/ou l’effet abscopal induit par l’irradiation. Il a également été montré que cette nouvelle molécule augmentait l’efficacité de certains traitements dans des modèles résistants . Nous testerons donc dans un second temps le triple traitement avec radiothérapie.
Bénéfices attendus
La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. 50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de miniiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostique de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet abscopal induit par l’irradiation qui est médié par le système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.
Procédures
Deux injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux, une fois, durée 1 minute, sous anesthésie locale. L’injection des médicaments durera 10 secondes, sous anesthésie locale (3 administrations au total pour chaque immunomodulateur, une injection tous les 4 jours). Les souris vigiles seront mises dans un système de contention pendant l’irradiation (maximum 15 minutes, une irradiation). Le prélèvement de sang sur les souris dédiées sera réalisé sous anesthésie générale, durée 2 minutes.
Impact sur les animaux
Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée de tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété, légers et transitoires. Par contre, l’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée, elle induit pas une perte de poids modérée et transitoire. L’administration des immonumodulateurs par voie intrapéritonéale peut engendrer de la douleur (un spray contenant de la lidocaïne sera appliquée avant chaque injection intrapéritonéale). La tumeur quand elle grossit ou quand elle commence à nécroser peut gêner la souris (douleur, difficulté à se déplacer,…). Les souris seront sacrifiées aux points limites pour éviter cela. Pour les prélèvements, les souris seront d’abord anesthésiées pour prélever le sang ce qui peut générer du stress mais ces souris seront sacrifiées juste après le prélèvement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures.
Remplacement
Il a clairement été mise en évidence ces dernières décennies que le système immunitaire et le microenvironnement tumoral jouent un rôle fondamental dans la progression tumorale ainsi que dans la réponse à la radiothérapie et aux traitements anticancéreux en général. Il n’existe actuellement pas d’alternatives permettant de récapituler aussi bien qu’un organisme vivant l’ensemble de ces interactions dans leur nombre et leur complexité.
Réduction
Une analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour détecter des différences significatives de croissance tumorale . L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité du traitement triple combinaison radothérapie avec des immunomodulateurs par rapport aux doubles combinaisons.
Raffinement
Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections en sous-cutanée et en intrapéritonéale, un anesthésique local sur la peau avant chaque injection. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà ce geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Du Diet Gel Hi Energy pourra être introduit en cas de perte de poids). De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines, jeunes adultes, ce qui correspond au meilleur âge pour les greffes et à la population de patients visées.
Rôle de la farine de krill dans la résistance au stress hypoxique chez la truite arc-en-ciel
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Nourries douze semaines avec quatre aliments expérimentaux contenant de la farine de krill, pesées cinq fois en lot, 720 truites arc-en-ciel passent de 30 à 200 grammes. La moitié est alors tuée dans un bain d'anesthésiant, sang, foie, muscle, fèces et carcasse prélevés. Les 360 restantes sont maintenues trois semaines de plus dans une eau appauvrie en oxygène, obtenue en baissant le niveau et le débit d'eau pour augmenter la densité, avant d'être tuées de la même façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur attend un pompage operculaire excessif, une nage désorientée et une remontée en surface avec tentatives de fuite, tout en écrivant qu'aucun signe de stress grave ne devrait apparaître, l'objet étant d'optimiser un aliment pour la première espèce piscicole produite en France.
Objectifs
Les salmonidés sont sensibles à un faible niveau d'oxygène dissous (OD), qui doit être supérieur à 7 mg/L dans les fermes piscicoles. Bien que les niveaux d'OD soient étroitement surveillés, des baisses soudaines et temporaires peuvent se produire pour de multiples raisons : hausse de la température de l'eau, de la densité de poissons dans les bassins mais également lors des manipulations des poissons. Une limite inférieure aiguë de 4,0 mg/L d'OD a été définie pour les systèmes de production de salmonidés. Ces baisses d’OD risquent de se produire plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique, ce qui peut poser des problèmes de bien-être et de performance. L’apport optimisé de micronutriments anti-oxydants tels que sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress dans les exploitations piscicoles. Des travaux ont montré qu’une supplémentation en sélénium, un anti-oxydant, dans un aliment à base de farines végétales améliorait la résistance au stress hypoxique des alevins de truite arc-en-ciel et des études ont suggéré une sensibilité au stress oxydant différente entre mâles et femelles. La farine de krill pourrait être un ingrédient fonctionnel intéressant du fait de sa richesse en anti-oxydants. Plusieurs études ont par ailleurs souligné les effets bénéfiques du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur la qualité de la chair, la croissance et la santé des poissons. Ce projet a donc trois objectifs : 1) étudier l'impact du remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill sur les performances des truites arc-en-ciel juvéniles nourries avec un aliment à base de protéines végétales, 2) étudier l'impact nutritionnel de la farine de krill sur les défenses anti-oxydantes des truites en situation d'hypoxie, 3) étudier l’impact du sexe des poissons sur les performances de croissance et le métabolisme du stress.
Bénéfices attendus
Il est difficile d’éviter des baisses soudaines et temporaires des niveaux d'OD qui peuvent rapidement entraîner des mortalités massives, événements qui risquent de se produire encore plus fréquemment dans les années à venir en raison des températures extrêmes associées au changement climatique. Comme les poissons capturés ne peuvent échapper à des conditions d'élevage sous-optimales, cela peut poser des problèmes de bien-être et de performance avec des croissances et des consommations alimentaires plus faibles ainsi qu'une augmentation des paramètres liés au stress oxydant. Les micronutriments tels que le sélénium, la vitamine C et l’astaxanthine interviennent dans le métabolisme anti-oxydant et leur apport optimisé peut faire partie d'une stratégie de gestion préventive du stress. Les besoins en anti-oxydants nutritionnels dans les aliments piscicoles modernes à base d’ingrédients végétaux ne sont pas clairement identifiés par rapport aux aliments traditionnels riches en ingrédients marins où les farines et huiles de poissons sont progressivement remplacées par des ingrédients plus durables. En effet, cette transition crée de nouveaux défis car les recommandations nutritionnelles pour la plupart des vitamines et minéraux sont largement basées sur les aliments traditionnels et peuvent désormais s’écarter considérablement dans les nouveaux aliments alternatifs. Les données issues de ce projet devraient permettre de mieux caractériser le rôle de la farine de krill dans le métabolisme du stress chez les mâles et femelles de truite arc-en-ciel, première espèce piscicole produite en France. Les niveaux de remplacement de la farine de poisson par de la farine de krill ont été sélectionnés car décrits comme bénéfiques pour la chair, la croissance et la santé des poissons mais leurs effets sur la résistance au stress hypoxique ne sont pas connus. Une meilleure résistance au stress hypoxique des poissons d’élevage par une alimentation optimisée devrait permettre d’améliorer le bien-être et les performances de poissons.
Procédures
-Un total de 720 truites de 30 g sera nourri pendant 12 semaines avec 4 aliments expérimentaux contenant différentes teneurs de farine de krill couvrant tous les besoins nutritionnels des truites avec pesée en lot des 12 bassins toutes les 3 semaines, soit 5 pesées en tout sur animaux vigiles (conformes aux pratiques d’élevage). -Parmi ces 720 truites de 30 g nourries pendant 12 semaines, 360 seront euthanasiées au bout des 12 semaines à un poids d’environ 200 g par euthanasie dans un bain de tricaïne à 150 mg/L avec prélèvement de sang (1 mL) et de tissus : nageoires, foie, muscle, carcasses entières ainsi que les fèces. -Les 360 truites restantes de 200 g seront alimentées pendant 3 semaines supplémentaires avec les 4 aliments expérimentaux et soumises à un stress hypoxique chronique avec une teneur en OD de 5 ppm. Elles seront ensuite anesthésiées et euthanasiées dans les mêmes conditions que précédemment à l’issue des 3 semaines en conditions d’élevage hypoxique et les mêmes prélèvements seront réalisés.
Impact sur les animaux
Lors de l'essai nutritionnel, aucune nuisance ou effet indésirable n'est attendu du fait de la structure d'élevage adaptée et de la formulation des aliments utilisée. Lors du stress hypoxique réalisé dans les mêmes conditions d’élevage que l’essai nutritionnel mais avec une faible concentration d’OD (5 mg d’oxygène par litre, obtenu sur les 3 premiers jours par diminution du niveau d’eau dans les bassins pour augmenter la densité et diminution du débit d’eau), peu d'effets indésirables sont attendus car le niveau et la durée ont été définies de telle sorte à minimiser le stress. Cependant nous pourrions observer les comportements suivants qui ont été décrits dans la littérature chez des truites en situation de stress hypoxique aigu : pompage operculaire excessif, comportement de nage anormal (par exemple, perte d’équilibre), respiration près de la surface de l’eau avec ou sans tentative de fuite. Il convient de noter qu’aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 4 ppm est considéré comme la limite inférieure aiguë. Un niveau d’oxygène de 5 ppm est considéré comme un facteur de stress modéré lorsqu’il est testé pendant de courtes périodes.
Devenir
Après élevage des truites dans des conditions classiques optimisées avec des aliments fonctionnels contenant de la farine de krill pendant 12 semaines, la moitié (360 poissons) sera euthanasiée et prélevée pour analyse et l'autre moitié (360 poissons) sera remis en élevage pour 3 semaines supplémentaires en conditions d'élevage hypoxique (OD = 5 mg/L) avant euthanasie et prélèvement pour analyse.
Remplacement
S’agissant d’un essai nutritionnel chez des truites juvéniles et dans le but d’étudier le rôle de la farine de krill sur le métabolisme du stress chez les poissons d’élevage mâles et femelles, l’étude ne peut donc pas être réalisée sur des lignées cellulaires ou par des calculs et des modélisations informatiques.
Réduction
La réduction est un objectif réel, le nombre de poissons prélevé est calculé à minima, compte-tenu de la variabilité individuelle observée dans les essais nutritionnels et les analyses antérieurs, tout en maintenant des conditions d’élevage optimales pour les poissons avec une densité adaptée tout au long de l’essai (30-50 kg/m3). Ainsi le nombre de poissons mis en essai nutritionnel est de 60 poissons par bassin avec 3 bassins par régime alimentaire qui est le nombre standard de réplicats utilisé dans le domaine des essais d’alimentation des poissons. Le nombre de poissons par bassin correspond au minimum requis pour observer un comportement alimentaire normal et permettre d’avoir des nombres représentatifs dans l’analyse prévue. Le plan expérimental est défini de telle sorte qu’un seul échantillon tissulaire permettra d’explorer différents niveaux biologiques : analyse génétique (expression de gènes) et analyses enzymatiques et métaboliques.
Raffinement
Des conditions d’élevage classiques et optimisées seront utilisées : photopériode naturelle, température stable à 17°C +/- 1°C, qualité d'eau optimale avec dégazage (afin d’éliminer l’azote dissous) et niveau d’OD compris entre 8,5 et 9,5 ppm avec un débit adapté de 0,3 litre par seconde permettant un renouvellement de 5 à 7 fois par heure, taille et type de bassins adaptée à la taille des poissons (bassins extérieurs de 80 cm de diamètre et de 50 cm de haut pouvant contenir 150 à 220 L d’eau munis d’un couvercle et demi-couvercle occultant assurant la sécurité des poissons vis-à-vis des nuisibles (oiseaux) et limitant les perturbations liées à l’activité des agents de la pisciculture), densité optimale des truites, nettoyage régulier des bassins lors de chaque pesée toutes les 3 semaines. Les animaux seront nourris manuellement à satiété visuelle. Un suivi quotidien du bien-être animal sera évalué à l’aide d’une fiche d’évaluation quantitative du point limite. Lors du stress hypoxique, le comportement des poissons sera étroitement surveillé et des points-limites définis pour éviter toute souffrance grave. Cependant, aucun signe de stress grave ne devrait être observé chez les poissons car un niveau de 5 ppm peut être considéré comme un niveau de stress modéré.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est la première espèce piscicole produite en France et a donc un poids agronomique et commercial important, ce qui en fait un choix privilégié pour cet essai, en plus de son intérêt scientifique pour l’étude du métabolisme du stress et des défenses anti-oxydantes avec un nombre très important de protéines anti-oxydantes. Animaux au stade juvénile. Le but est de se placer dans des conditions de croissance optimales où l’effet de l’aliment sera le plus visible chez le poisson mais aussi de pouvoir récupérer différents tissus en quantité importante, ce qui justifie cette période et le poids moyen initial de 30 grammes permettant d'atteindre un poids moyen final de 200 grammes.
Conception et évaluation de nouveaux stents actifs pour réduire la resténose intra-stent et la thrombose aigue de stent.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Lapins : 80
Incisés, cathétérisés, munis d'un stent posé dans une artère iliaque puis recousus, 240 rats et 80 lapins subissent chacun une intervention d'environ une heure. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, pour prélever les artères stentées et mesurer la resténose et l'inflammation. Il s'agit de comparer un nouveau stent actif à un stent nu, alors que les méta-analyses citées par le porteur n'ont pas mis en évidence de bénéfice des stents actifs existants. Le RNT annonce une douleur "légère à modérée" au motif que la paroi interne des vaisseaux n'a pas de récepteurs de la douleur, puis décrit hyperthermie, perte de poids, troubles de la cicatrisation, mobilité réduite et hébergement individuel de trois à sept jours après l'opération.
Objectifs
Le traitement endovasculaire est le traitement de choix des lésions athéromateuses peu évoluées des artères coronaires et périphériques. Au niveau des artères coronaires, plus de 80 % des procédures de revascularisation endovasculaires comportent la pose d’un stent. Cependant, un processus chronique de resténose après la mise en place du stent (resténose intra-stent, RIS) par prolifération cellulaire excessive survient dans 20 à 30 % des cas à 6 mois, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. Les stents actifs actuels ont permis une réduction de la RIS par libération d’agents cytotoxiques immunosuppresseurs qui inhibent le cycle cellulaire. Néanmoins, l’effet bénéfique de ces stents sur la limitation de la RIS est contrebalancé par un risque accru de thrombose aiguë tardive du stent, lié à la dé-endothélialisation et à l’absence de recouvrement des mailles par une néointima. Les méta-analyses réalisées jusqu’à présent n’ont donc pas mis en évidence de bénéfice lié à l’utilisation des stents actifs actuels. Plusieurs équipes de recherche tentent actuellement de mettre au point de nouveaux stents actifs libérant des drogues pro-cicatrisantes (drug-eluting stent, DES) afin de limiter et non d’inhiber la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires tout en permettant la ré-endothélialisation du stent, évitant ainsi les risques de thrombose aiguës. Malgré ces améliorations, un risque accru de thrombose tardive du stent a été observé avec la première génération de DES. Les travaux scientifiques dans ce domaine sont donc très demandés pour résoudre ces problèmes en optimisant les DES existants, tout en respectant la biocompatibilité avec le sang et les tissus. L'innovation et la recherche continuent pour améliorer tous les aspects de la technologie DES, tels que le matériau et la structure de la plate-forme, les polymères, la distribution de l'enrobage, l'enrobage supplémentaire et les médicaments antiprolifératifs, ce qui a conduit à des générations plus récentes et améliorées de DES. Pour cela, les différents axes de recherche exploités dans notre équipe sont : changer la plateforme du stent en elle-même, modifier la surface du stent et libérer localement des anticoagulants, des traitements antiplaquettaires ou antiprolifératifs pour inhiber la croissance néo-intimale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche préclinique sur les nouveaux stents actifs de nouvelle génération offre de nombreux avantages potentiels en termes de compréhension de sa sécurité et de l'efficacité, de réduction des risques pour les patients et de développement de nouvelles approches pour prévenir la resténose. Les bénéfices attendus sont les suivants : 1. Compréhension de la réponse artérielle et aperçu mécaniste des processus biologiques : La réponse artérielle à l'implantation d'un stent est complexe, et les études chez l'animal sont essentielles pour prédire les performances chez l'homme. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans la resténose et la thrombose, ce qui est crucial pour améliorer les traitements chez les patients. Les modèles animaux utilisés dans ce projet fourniront un aperçu mécaniste des processus biologiques fondamentaux, aidant ainsi à mieux comprendre ces mécanismes complexes. 2. Évaluation de la sécurité : L'évaluation préclinique des nouvelles technologies de stents est très importante pour comprendre leur sécurité potentielle. Il est essentiel de s'assurer que ces stents ne provoquent pas de complications ou de réactions indésirables chez les patients. 3. Potentiel d'efficacité : En plus de la sécurité, ces études peuvent également donner des indications sur l'efficacité potentielle des nouvelles technologies de stents actifs de nouvelle génération. Cela permettra d'identifier les stents les mieux adaptés à différentes situations cliniques. 4. Réduction des risques : Les stents actifs de nouvelle génération ont le potentiel de réduire les échecs de stent et les risques de thrombose aiguë en permettant la ré-endothélialisation du stent. Cela peut conduire à une forte réduction du risque de réintervention coronaire, améliorant ainsi la qualité de vie des patients. 5. Plate-forme d'essai préclinique bien définie : Les modèles animaux établis dans ce projet fournissent une plate-forme d'essai préclinique bien définie pour évaluer les cibles et les stratégies de prévention de la resténose. Cela permet de tester de nouvelles approches avant de les appliquer chez l'homme. 6. Bénéfices pour la recherche et l'industrie : Ces études profiteront à plusieurs communautés au sein de la chaîne de développement, d'essai et d'évaluation clinique. Les résultats de ces recherches peuvent être utilisés par les chercheurs, les cliniciens et l'industrie pour améliorer les dispositifs médicaux et les traitements.
Procédures
Les deux procédures seront réalisées sur les animaux (rats et lapins) sous anesthésie générale et avec une analgésie péri-opératoire. Les gestes techniques comprennent des incisions cutanées, l'implantation d'un stent par voie endovasculaire, et enfin, les sutures cutanées. Au total, 240 rats et 80 lapins seront utilisés pour ces procédures. Chaque intervention sur un animal prendra environ 1 heure et ne sera effectuée qu'une seule fois sur chaque animal. Les prélèvements de tissue vaisseau à la fin de procédure sont réalisé sur les animaux euthanasié, aucuns prélèvements sont prévus sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Le projet est attentif à plusieurs nuisances et effets indésirables qui pourraient survenir chez les animaux de l'étude. Les points suivants seront particulièrement analysés : 1. Douleur légère à modère : Étant donné qu'il s'agit d'une chirurgie cardiovasculaire standard, la mise en place réelle du stent à l'intérieur de l'artère ne provoque généralement pas de douleur, car la paroi interne des vaisseaux sanguins ne possède pas de récepteurs de la douleur. Donc animaux ne ressentent rien pendant cette partie de la procédure. Cependant, une légère gêne ou une sensation de pression lors de l'insertion du cathéter peut être ressenti, donc une anesthésie locale sera généralement administrée pour engourdir la zone où le cathéter est inséré. 2. Hyperthermie : La recherche de la température de l'animal sera effectuée pour détecter tout signe d'infection post-opératoire. Ce risque est présent au moins pendant les 15 premiers jours, pendant le temps de cicatrisation cutanée. 3. Perte de poids : La perte de poids peut être due à la difficulté de mobilisation causée par la chirurgie au niveau du membre de l'animal, entraînant une restriction alimentaire et hydrique. Cette diminution du poids est prévisible pendant environ 7 jours, les rats retrouvant leur mobilité habituelle après ce délai. 4. Anomalies de cicatrisation : Des problèmes tels que désunion, saignement, hématome, ou écoulement suspect (indiquant une infection) seront surveillés pendant les 15 premiers jours, pendant le temps de cicatrisation cutanée. 5. Limitation de la mobilité de l'animal : Bien que la chirurgie permette la déambulation, une diminution de la mobilité peut être observée chez les modèles similaires au cours de la première semaine post-opératoire. 6. Altération de l'état physiologique par stress post-opératoire : Des manifestations telles que des troubles de posture, de toilettage, de dépilation peuvent survenir chez l'animal en raison du stress post-opératoire. Cette altération est prévisible pour une durée de 7 jours après l'opération. Il est important de souligner que ces effets indésirables et nuisances sont surveillés de près dans le cadre de l'étude. Des mesures adéquates seront prises pour minimiser ces effets et assurer le bien-être et le suivi approprié des animaux pendant toute la durée de l'étude.
Devenir
À l'issue de l'étude en deux procédures, une euthanasie sera réalisée car il sera nécessaire de prélever les artères iliaques stentées pour les analyses comparatives. Ces prélèvements permettront de procéder à des analyses histologiques pour vérifier le degré de resténose, des analyses biochimiques pour évaluer l'inflammation et l'efficacité de la drogue libérée. Plus concrètement, une comparaison sera faite entre le degré de resténose, l'inflammation et la ré-endothélialisation entre le stent nu et le nouveau stent actif. Si le nouveau stent actif s'avère plus performant que le stent nu habituellement utilisé, cela signifierait qu'il pourrait prévenir la formation de resténose intra-stent et de thrombose, tout en favorisant une ré-endothélialisation adéquate et une durée optimale du régime antiplaquettaire. La méthode d'euthanasie employée sera le surdosage d'anesthésique, réalisé sur un animal préalablement sédaté avec de l'anesthésie gazeuse.
Remplacement
Les stents à élution médicamenteuse (DES) doivent démontrer des bénéfices cliniques en termes de sécurité et d'efficacité acceptables. La sécurité de ces dispositifs semble plus facilement prévisible à partir de modèles in vitro, même si l'efficacité des DES peut être difficile à établir à partir de ces études. Cependant, avec la complexité croissante de ces dispositifs, les données cliniques corrélatives ont été accumulées, ce qui souligne l'importance croissante des modèles précliniques. Actuellement, il n'existe aucun moyen d'étudier la resténose in vitro, ex vivo ou in silico, car cela met en jeu des mécanismes physiopathologiques complexes résultant d'une inflammation, d'une prolifération et d'une migration des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) du média vers la néointima, ainsi que d'une production excessive de matrice extracellulaire. Les modèles animaux de resténose sont donc essentiels pour comprendre ces processus physiopathologiques et évaluer la faisabilité, l'innocuité et l'efficacité des nouvelles cibles et des stratégies de prévention de la resténose. Il est donc nécessaire de développer des modèles précliniques simples, peu coûteux, rapides et précis pour étudier la resténose. Cependant, avant de réaliser des études sur des animaux, des analyses in vitro de cytotoxicité et de cytocompatibilité seront menées sur les matériaux sélectionnés pour remplacer la technique actuelle. Il est préférable d'avoir des données in vitro positives pour la ou les substances bioactives, en se concentrant sur des cibles cellulaires spécifiques, afin de prédire le succès biologique in vivo. Cela permettra de produire un équilibre favorable entre la croissance néointima, la couverture des cellules endothéliales, le remodelage des vaisseaux et le dépôt de thrombus, avec l'objectif de réduire au minimum le nombre d'animaux nécessaires pour les analyses in vivo. En somme, la recherche sur les stents à élution médicamenteuse nécessite des approches précliniques bien établies et appropriées pour comprendre la resténose et évaluer la sécurité et l'efficacité de nouvelles approches. Les modèles animaux jouent un rôle crucial dans cette évaluation, mais l'utilisation d'analyses in vitro pertinentes permet de limiter la nécessité d'expérimentations animales tout en garantissant des résultats prometteurs pour les futurs traitements.
Réduction
La détermination du nombre d'animaux pour l'étude est basée sur une analyse de la littérature portant sur le même modèle animal, à savoir 10 études sur rat et 14 études sur lapin, toutes traitant du même sujet d'étude. Le nombre moyen d'animaux par groupe analysé dans ces études est de 10. Une seule étude a réalisé une analyse de puissance basée sur les résultats histologiques, avec un niveau de puissance de 80%, et a trouvé un nombre minimal requis de 8 rats par groupe. En se basant sur ces différentes études et leurs résultats, un nombre de 10 animaux par groupe a été sélectionné pour cette étude. La stratégie de réduction du nombre d'animaux est également prise en compte dans le design de l'étude. Pour limiter au maximum le nombre d'animaux nécessaires, une première étape consistera à étudier la formation de néointima sur le modèle de rat. Cette première étape permettra de sélectionner les matériaux qui ont donné les meilleurs résultats à l'issue de ce premier modèle sur rat. Ainsi, la réalisation du deuxième modèle sur lapin se fera avec un nombre d'animaux réduit et ciblé, en se basant sur les résultats obtenus avec le modèle de rat. Cette approche permet d'optimiser l'utilisation des animaux et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires tout en obtenant des informations pertinentes sur les effets des matériaux étudiés. Elle s'inscrit dans une démarche éthique et responsable pour la recherche préclinique, en minimisant autant que possible l'impact sur les animaux tout en préservant la validité scientifique de l'étude.
Raffinement
Le principe de raffinement sera mis en œuvre par divers moyens afin d'assurer le bien-être des animaux tout au long de l'étude. Voici les mesures prévues : 1. Conditions de vie : Les animaux seront soumis à un cycle de 12 heures jour/nuit en alternance. Ils seront logés dans une salle avec un flux d'air contrôlé et une température maintenue à 21°C. Ils auront un accès libre à l'eau et à une alimentation standard, sans modification de leur régime habituel. 2. Enrichissement du milieu : Le milieu de vie des animaux sera enrichi pour leur permettre de manifester leur comportement naturel. Des éléments tels qu'un sol dur avec une litière, des moyens d'exploration et de cachettes (tunnels en carton, petits dômes en papier mâché, etc.) seront mis à leur disposition. Des éléments favorisant la nidification, comme des cylindres de coton, des carrés de cellulose et des rondelles de peuplier compressé, seront également présents. Des objets à ronger, tels que des morceaux de bois, seront fournis pour répondre à leurs besoins de mastication. 3. Vie sociale des rats : Avant l'intervention, les rats seront placés en cages comportant 3 à 4 rats, de manière à respecter leur comportement social. Cependant, après la chirurgie et compte tenu des conditions post-opératoires restreintes, ils seront logés individuellement pendant une période minimale de 3 jours, pouvant s'étendre jusqu'à 7 jours. Cela permettra de leur offrir un environnement optimal pour récupérer sans douleur après la procédure. 4. Surveillance du bien-être : Plusieurs éléments seront analysés pour contrôler le bien-être des animaux. Leur poids sera mesuré quotidiennement pendant les 7 jours suivant l'opération, puis une fois par semaine. La température sera surveillée pour détecter tout signe d'hyperthermie, qui pourrait indiquer une infection post-opératoire. Une évaluation quotidienne de la plaie post-opératoire sera effectuée pour détecter toute désunion, saignement ou hématome. La capacité de déambulation de l'animal sera évaluée quotidiennement et devrait revenir à la normale en 7 jours. Enfin, des analyses comportementales seront réalisées, notamment en observant la posture, la position des oreilles, l'enfoncement des yeux et en vérifiant si le toilettage est effectué normalement. Toutes ces mesures sont mises en place pour garantir le bien-être et le confort des animaux tout au long de l'étude, en conformité avec les principes éthiques de la recherche préclinique.
Choix des espèces
Le modèle rat de resténose intra-stent (RIS) est bien décrit et validé dans la littérature. Il permet d'observer un remodelage vasculaire suffisant pour étudier les variations du ratio entre l'épaisseur de la néo-intima et l'épaisseur du média formées après 28 jours d'implantation du stent, en réponse à un traitement pharmacologique. Ce modèle présente l'avantage d'être relativement peu coûteux et permet une analyse approfondie des mécanismes cellulaires impliqués grâce à une large gamme d'anticorps disponibles sur le marché, notamment pour des analyses par western blot. En ce qui concerne le modèle de RIS chez le lapin, il est considéré comme le meilleur modèle pour étudier la ré-endothélialisation des mailles du stent. Il permet également d'obtenir une resténose plus importante que chez le rat. Après avoir réalisé une première étude chez le modèle murin, la confirmation des résultats obtenus dans le modèle lapin est indispensable. Dans la littérature, l'implantation d'un stent dans les artères iliaques du lapin et les artères coronaires du porc sont les modèles animaux les plus couramment utilisés pour étudier la resténose. Cependant, ces modèles ne sont pas toujours idéaux pour mener une étude physiopathologique approfondie. Ils ont des limitations telles que le nombre limité d'anticorps disponibles pour l'analyse des protéines cellulaires, l'impossibilité de travailler avec des souches transgéniques ou knock-out, et des coûts élevés liés aux matériels radiologiques et chirurgicaux nécessaires pour les opérations. En revanche, le modèle de resténose chez le rat offre un large éventail d'outils de recherche expérimentaux et permet de tester différentes nouvelles thérapies contre la resténose. Ce modèle est donc un outil important pour mener des recherches approfondies sur la resténose et développer de futures thérapies pour lutter contre ce phénomène. De plus, il présente l'avantage d'être simple, peu coûteux, rapide et précis, ce qui en fait un modèle de dépistage utile dans l'étude de la RIS. Les rats utilisés seront de la souche wistar, âgés de 10 semaines, et les lapins seront de la race New Zealand white, âgés de 130 à 150 jours, présentant une hypercholestérolémie. Ces âges ont été choisis pour correspondre à un stade adulte de développement chez le rat et le lapin, ce qui les rend représentatifs de la population clinique des patients adultes qui sont pris en charge pour la mise en place d'un stent.
Etude de la réponse immunitaire induite après administration nasale d’un candidat vaccin anti-paludique en modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Vigiles et maintenues en contention, 350 souris reçoivent trois instillations nasales et subissent quatre prises de sang en six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le candidat vaccin nasal testé cible le paludisme, l'enjeu étant de mesurer la réponse immunitaire déclenchée dans la rate et le foie. Le porteur affirme qu'aucune vaccination ni aucune prise de sang n'a jamais produit d'effets indésirables au laboratoire, avant d'admettre dans la même rubrique que la contention peut stresser les souris et les prélèvements provoquer un hématome et une douleur. Toutes sont tuées au bout de six semaines pour prélever les organes où se joue cette réponse.
Objectifs
Le paludisme est une maladie parasitaire responsable de 241 millions de cas et de 627 000 décès estimés dans le monde en 2020. Les deux vaccins candidats recommandés par l'OMS, affichent une efficacité modérée et un calendrier de vaccination contraignant nécessitant le développement de nouveaux candidats vaccins affichants une efficacité protectrice d'au moins 75 % d'ici 2030 (OMS). Le paludisme a un cycle de vie complexe impliquant l'invasion et le développement à l'intérieur des hépatocytes et des érythrocytes de l'hôte mammifère. A chaque étape de son cycle de vie, le parasite à travers ses différentes formes exprime de nombreuses protéines qui peuvent être la cible de candidats vaccins contre le paludisme. Ces dernières années, l'équipe a développé un candidat vaccin sous-unitaire administré par voie nasale en utilisant des nanoparticules. Celui-ci induit des réponses immunitaires humorales et cellulaires aux niveaux systémique et muqueux assurant une protection. L’équipe souhaite sur la base de cette expertise développer un vaccin contre le paludisme qui induit des réponses humorales et cellulaires au niveau systémique, et hépatique. Des travaux récents, en modèle d’hépatite B, ont montré que seule la vaccination nasale avait la capacité d’induire une réponse cellulaire hépatique en comparaison d’une immunisation systémique renforçant l’intérêt de la voie nasale comme une solution pertinente. Pour ces raisons, nous proposons de développer un vaccin nasal contre le paludisme, et valider l’induction d’une réponse immunitaire protectrice systémique au niveau splénique et hépatique.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre le paludisme actuellement les plus avancés et recommandés par l'OMS montrent une efficacité d'environ 45 % et 66% respectivement qui reste insuffisante notamment pour protéger les enfants âgés de 5 à 17 mois au cours de la première année après la vaccination. Il est donc urgent de développer un vaccin plus efficace, éventuellement pour compléter ces deux vaccins. Dans ce but, nous proposons d'utiliser une nouvelle plateforme vaccinale qui a montré des résultats prometteurs. La capacité du candidat vaccin à induire une forte réponse immunitaire humorale et cellulaire systémique et hépatique forte spécifique de Plasmodium pourrait être d'un grand avantage pour un vaccin antipaludique. De plus, si notre calendrier vaccinal à trois immunisations par voie intranasale montre des réponses immunitaires robustes, ce sera une grande avancée dans la recherche sur le vaccin antipaludique. En effet, les vaccins dénommés RTS,S et R21/Matrix-M™ sont proposés sous la forme d'un schéma à quatre doses chez l'enfant à partir de 5 mois ce qui est une organisation difficile dans les pays endémiques (aiguille stérile, personnel médical). De plus, cibler différentes étapes du cycle de vie du parasite pourrait aider à compléter des candidats vaccins plus avancés et permettre d'augmenter la protection si peu de parasites parviennent à échapper à l'immunité hépatique.
Procédures
Les animaux subiront tous 4 prises de sang à J0, J14, J28 et J42. 3 instillations par voie nasale à J0, J14 et J28. Les prises de sang et les instillations/injections ne durent que quelques secondes sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
A ce jour dans le laboratoire, aucune des expériences de vaccinations utilisant des antigènes, ni aucune prise de sang n'a produit d'effets indésirables sur les animaux d'autant plus que les gestes sont très bien maitrisés. Cependant, il est possible que les contentions engendrent du stress, les prises de sang peuvent entrainer un hématome ainsi qu’une douleur légère au niveau du site de prélèvement.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à J42 de façon à pouvoir étudier les réponses immunitaires induites par les différents types de vaccination notamment les réponses immunitaires hépatiques.
Remplacement
Il n'existe actuellement aucun modèle de remplacement capable de reproduire la complexité du système immunitaire et d'étudier l'ensemble des réponses immunitaires suite à une vaccination.
Réduction
Les résultats obtenus précédemment avec un extrait total du parasite supporte la preuve de concept qu'une immunisation par voie nasale est capable d'établir une réponse immunitaire hépatique. Afin de poursuivre cette étude, dans une stratégie de vaccin sous-unitaire nous allons dans un premier temps tester plusieurs protéines du parasite pour savoir lesquelles sont les plus immunogènes. Pour chaque protéine utilisée nous constitueront un groupe de 10 souris (5 mâles + 5 femelles). Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données, notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Cette première expérimentation permettra de récolter assez de données notamment sur le choix des protéines à conserver et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés dans la suite de nos expérimentations. Des tests statistiques ainsi qu'une analyse de normalité seront effectués.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Une surveillance accrue sera effectuée à la suite de chaque procédure afin de détecter au plus tôt les points limites définis pour chaque procédure. Un enrichissement positif sera mis en place en introduisant un enrichissement permanent de type igloo dès la semaine d’adaptation des animaux. Un enrichissement positif ponctuel, à leur entrée dans la structure puis après chaque procédure, de type carré en kraft pendant 48h pouvant être dépouillé et permettant la confection d’un nid.
Choix des espèces
Le modèle d'étude d'un candidat vaccin administré par voie nasale est déjà établi chez la souris dans le laboratoire. De plus, l'espèce de souris retenue est décrite dans la littérature comme le modèle de référence permettant l'étude des réponses immunitaires hépatiques. Tous les outils immunologiques sont disponibles pour étudier la réponse immunitaire chez la souris. Des souris adultes sont utilisées car leur système immunitaire est complètement développé. Ce modèle murin permettra la preuve de concept de l’induction d’une réponse immunitaire systémique splénique et hépatique suite à une vaccination par notre candidat vaccin sous-unitaire par voie nasale avant de passer sur un modèle d’infection adapté.
Validation d’un candidat médicament dans un modèle murin exprimant le récepteur TREM-1 humain
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Chaque souris subit un unique prélèvement de sang par ponction intracardiaque, dix minutes sous anesthésie, sans jamais se réveiller. 15 souris génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain vont être utilisées ainsi, tuées avant tout réveil, la mise à mort servant à obtenir le volume de sang voulu. Deux expériences en laboratoire doivent vérifier que le gène humain fonctionne chez elles, l'objet réel étant de préparer des études réglementaires et une demande d'essai clinique. Le candidat médicament a déjà montré un effet sur du sang humain et du sang de singe, et le bénéfice avancé est de "limiter drastiquement" le recours aux primates non humains dans les tests de toxicité à venir.
Objectifs
Dans le contexte du développement d’un futur médicament pour le traitement de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (Maladie de Crohn et Rectocolite hémorragique), nous souhaiterions utiliser des souris génétiquement modifiées (souris exprimant un gène humain) afin d’évaluer la possibilité d’utiliser cette lignée de souris pour des futures études réglementaires. En effet, le futur médicament cible spécifiquement un gène humain et ne fonctionne pas avec ce même gène chez la souris, c'est pourquoi ces souris génétiquement modifiées ont été dévellopées. Le but de notre projet est de vérifier si le gène humain fonctionne correctement dans ces souris modifiées. Pour cela, nous avons besoin de récupérer le sang de ces souris pour isoler les cellules sanguines et réaliser des expériences au laboratoire. Les souris seront anesthésiées pour effectuer un prélèvement sanguin, un anti-douleur sera administré avant le prélèvement sanguin et le sang obtenu sera traité pour isoler les cellules sanguines (neutrophiles). Deux expériences seront realisées au laboratoire sur ces cellules sanguines pour démontrer que le gène humain fonctionne bien dans ces souris. L'objectif final de ce projet est de préparer la mise en place d'un essai clinique en Europe et aux Etats Unis pour montrer l'efficacité de notre futur médicament pour le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin .
Bénéfices attendus
En cas de résultats positifs avec ces souris génétiquement modifiées, nous pourrions les utiliser lors d’études réglementaires pour tester la tolérance et la toxicité de notre médicament dans le but de limiter drastiquement le recours à des singes (primates non humains).
Procédures
Injection en intrapéritonéale d'un analgésique, puis prélèvement sanguin sur animal anesthésié. Fréquence : 1 seul prélèvement sanguin par animal. Durée : 10min
Impact sur les animaux
Ces souris ne présenteront pas d'effets indésirables visibles à l'oeil. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous antalgie et anesthésie pour éviter les douleurs/souffrances aux animaux. Cependant, un analgésique sera administré en intra péritonéal aux souris 1h avant la ponction intra-cardiaque pouvant engendrer une nuisance aux souris mais la douleur sera légère et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin d'obtenir le volume sanguin nécessaire au projet.
Remplacement
L'efficacité du candidat médicament a été validé au préalable dans un modèle cellulaire humain ainsi que dans un modèle cellulaire chez le singe. En effet, des tests préliminaires ont été réalisés en utilisant du sang humain et du sang de singe montrant un effet thérapeutique. Dans le cadre de notre demande d'autorisation d'essai clinique, ces tests doivent être réitérés chez la souris.
Réduction
Le nombre de souris utilisé pour le projet principal (10 souris: 5 males et 5 femelles) a été défini en fonction du nombre de cellules pouvant être isolées par millilitre de sang et du nombre de conditions expérimentales nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. De plus, en mélangeant le sang des souris males et femelles, nous limitons les croisements et donc reduisons le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'une période d'acclimatation de 1 semaine dans l'établissement utilisateur avant le début du projet afin de réduire le stress dû au transport et au changement d'animalerie. Les souris seront réparties en deux groupes de 5 souris par cage en fonction de leur sexe. Les cages seront enrichies avec des buchettes, du coton et de la frisure de papier craft. Afin d’appliquer le principe de raffinement, un anti douleur sera administré aux souris 1h avant le prélèvement sanguin. De plus, un anesthésique local sera également appliqué au niveau de la cage thoracique pour limiter la douleur induite par le prélèvement sanguin qui sera effectué sur un animal vivant anesthésié.
Choix des espèces
Notre molécule thérapeutique est spécifique d'une protéine humaine et n’interagit pas avec la souris. Pour palier à cela, nous avons développé un modèle de souris qui exprime cette protéine humaine afin de réaliser des études nécessaires au développement pré-clinique de notre candidat médicament. Pour ce projet, des souris adultes de 8 semaines seront utilisées car cela représente l'âge adulte. De plus, cet âge est optimum car il permet d'obtenir le volume sanguin nécessaire à la réalisation du projet avec seulement 10 souris.
Cancer et Sénéscence
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Greffées sous la peau du flanc avec des cellules d'adénocarcinome du pancréas, des souris immunodéprimées reçoivent trois injections d'un inhibiteur d'enzyme puis une chimiothérapie. 1 648 souris sont utilisées au total dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour le prélèvement de tissus. Une partie n'entre dans le projet que pour une biopsie de deux à trois millimètres au bout de la queue, à 21 jours. Le porteur laisse croître les tumeurs jusqu'à un point limite de 2 000 mm3 et affirme que la perte de poids, qu'il utilise comme indicateur de douleur, n'est pas corrélée à la taille de la tumeur. Le second axe, la production d'organoïdes à partir de pancréas prélevés à six mois, reste décrit en deux phrases, sans que l'effectif annoncé soit expliqué.
Objectifs
Les objectifs de ce projet comportent deux axes (1) développer un modèle de sénéscence chimio-induite in vivo et tester l'effet d'inhibiteur d'enzyme de la 0-glcNACylation (OGT) et (2) produire des organoides à partir de différentes lignées de souris transgéniques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet seront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires du cancer et identifier à terme de proposer de nouveaux candidats médicaments dans une pathologie qui manque de traitement efficace.
Procédures
Nous réaliserons un modèle de xénogreffe sous cutanée de cellules d'adénocarcinome pancréatique (par injection sous cutanée sur le flanc des souris). Ces souris recevront 3 injections d'inhibiteurs OSMI (inhibiteur spécifique de l'enzyme OGT) puis bénéficieront d'un protocole de chimiothérapie. Les différerentes injections durent quelques secondes. Pour le génotypage des biopsies de l'extrémité de la queue sont nécessaires. prélevement unique d'un échantillon de queue (2-3mm) à 21jours pour génotypage. Le prélevement est unique et prend quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les xénogreffes consistent en une tumeur sur le flanc de la souris. Pour ces tumeurs, un point limite (2000mm3) sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée). La sévérité de la procédure est estimée modérée. Il est possible que la chimiothérapie induise une perte de poids. La biopsie de queue est un acte rapide ne provoquant qu’un faible inconfort à l’âge auquel il est pratiqué. Cependant, si l’animal présente des signes de stress intense (comme des vocalisations), il sera redéposé dans sa cage d’origine et le prélèvement sera retenté plus tard après éventuellement quelques jours d’habituation à la manipulation humaine.
Devenir
mise à mort pour prélevement des tissus d'intéret.
Remplacement
axe 1: Il s’agit de modèles physiopathologiques préclinique de progression carcinogénétique et de réponse aux thérapies dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro. L'effet de l'inhibiteur pharmacologique et l'inhibition seront au prélable caractérisées sur des modèles cellulaires d'adénocarcinomes coliques. L'un des intéret de l'axe 2 est de produire des organoïdes qui seront à terme des modèles alternatifs d'études de la cancérogenèse pancréatique
Réduction
AXE1: Pour l'impact de l'inhibiteur OSMI/chimiothérapie: Les effectifs ont été calculés avec l’outil biostatgv. Le nombre total de sujet est de 10 souris par groupe (8 conditions expérimentales). AXE2: Nous prévoyons de réaliser 10 prélevements de pancréas pour chaque génotype (n=8) qui permettra d'avoir un effectif suffisant pour analyser d'un point de vue qualitatif
Raffinement
Pour réduire la douleur et l'angoisse: (i) acclimatation des animaux pendant 7jours avant le début des expériences (ii) sacrifice des animaux à distance des autres animaux. Le nombre de cohorte a été optimisé pour réduire le ombre de souris. Une surveillance accrue est effectuée avec un suivi régulier de l'état général des souris. Nous serons particulièrement attentifs à la détection précoce de tout signe de douleur. Nous surveillerons les courbes de poids de souris et rechercherons les signes de stress et de douleur. La perte de poids ne doit pas dépasser 20 % du poids initial. La diminution du poids de la souris est utilisé comme un indicateur de la douleur et de la cachexie associée à la douleur et il n'est pas démontré de corrélation statistique à la taille de la tumeur. Une injection sous cutanée d'analgésique sera realisée en cas de douleur. Si les signes de douleur persistent, un sacrifice anticipé sera effectué. Pour les xénogreffes, un point limite sera appliqué (taille de la tumeur au-delà de laquelle, l’expérimentation est stoppée). Des enrichissements adaptés (cabanes, carrés de cotons, …) sont présents en permanence dans les cages.
Choix des espèces
Les modèles expérimentaux sont: -Modèle standard de xénogreffes en souris immunodéprimées permettant l’implantation de lignées cellulaires. - Modèle de souris transgénique référence pour l'apparition de lésions néoplasiques pancréatiques Axe1: Les xénogreffes sont réalisées sur des souris Scid de 8 semaines suivant les protocoles classiques de la littérature scientifique. Axe2: les pancréas de souris seront prélevés à 6 mois (ce qui permettra d'évaluer une différence de pourcentage de pancréas néoplasiques vs le pancréas normal)
THERAPIE GENIQUE DES CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Irradiées, puis greffées sous anesthésie avec des cellules souches sanguines de souris ou humaines, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour que soit quantifiée la proportion de cellules greffées dans leur moelle et leur sang, chacune ayant subi jusqu'à trois prises de sang au cours de sa vie. Le projet vise à améliorer des protocoles de thérapie génique destinés à la drépanocytose et à la bêta-thalassémie, en testant des gènes thérapeutiques, de sélection, "suicides" ou activateurs de prolifération. Le porteur écrit que l'irradiation non létale n'est pas censée provoquer de douleur, et décrit par ailleurs une irradiation létale des souris immunocompétentes dont seule la greffe assure la survie.
Objectifs
Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs thérapeutiques permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines pour optimiser les conditions de culture, de modification et de sélection des cellules « corrigées » qui seront injectées, afin d’améliorer les protocoles de thérapie génique chez l’humain dans le cadre de maladies génétiques. L’objectif de ce projet consiste à étudier l’effet de gènes thérapeutiques, de gènes de sélection, de gènes « suicides » ou de gènes activateurs de la prolifération cellulaire ayant un effet sur le processus physiopathologique des maladies de l’hémoglobine telles que la béta-thalassémie et la drépanocytose. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles murins de deux maladies (la drépanocytose et la béta-thalassémie), ainsi que dans un modèle murin immunodéficient (n’ayant pas de système immunitaire) qui permet la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont l’amélioration des protocoles de correction (des cellule souches sanguines défectueuses) et de transplantation des cellules souches sanguines corrigées pour des thérapies géniques qui pourront être appliqués à l’humain dans le cadre de maladies de l’hémoglobine ou de greffes de cellules souches sanguines.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques/sanguines (soit 3 min environ pour les souris immunodéficientes et 2 fois 5 min environ pour les souris immunocompétentes). Les animaux seront également transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques/sanguines murines ou humaines. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin une fois par mois et trois fois maximun durant la vie de l’animal. Ce geste ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’irradiation non létale de ces souris n’est pas censée provoquer de douleur ou d’altération majeure de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rares cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limitée au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique. L’irradiation létale des souris immunocompétentes nécessite une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour assurer leur survie. Suite à l’irradiation, une perte de poids peut être observée mais elle est transitoire (une semaine environ). Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier la proportion de cellules souches sanguines murines ou humaines présentes dans la moelle et le sang des souris et de les caractériser.
Remplacement
La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines/hématopoïétiques (CSHs) est un phénomène complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer les processus physiologiques de guidage, d’implantation, de survie et de différenciation de ces cellules. La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs cultivées et modifiées par des vecteurs thérapeutiques à se loger au niveau de la moelle osseuse et reconstituer l’hématopoïèse (processus physiologique de production des cellules sanguines) à long terme. Par ailleurs il n’existe pas de protocole in vitro permettant de différencier les cellules érythroïdes humaines ou murines en globules rouges parfaitement matures. Les souris sont donc utilisées à la fois pour déterminer si des CSHs ont été génétiquement modifiées par les vecteurs de transfert de gènes mais également à terme, par l’étude de l’effet des vecteurs de thérapie génique sur la fonction des globules rouges.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des conditions de culture et/ou protocoles de modification des cellules dans des systèmes de culture in vitro afin de vérifier qu’ils ne génèrent pas de toxicité cellulaire. Le recours à l’animal est ensuite indispensable à l’étude de l’effet des procédures de culture sur la capacité des cellules à reconstituer le système hématopoïétique (de production de toutes les cellules sanguines). Notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines dans le modèle murin ainsi que les résultats de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 animaux pour rendre des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce et qui est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (enrichissement) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, la greffe de cellules souches sanguines sera réalisée sous anesthésie grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Durant les 15 jours suivant la greffe cellulaire les souris seront examinées par le porteur du projet 3 fois par semaine et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des points limites ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Afin d’éviter toute infection, les souris seront traitées par antibiothérapie durant ces 30 jours. Au bout d’un mois, les souris seront observées par le porteur de projet une fois par semaine en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de cellules souches sanguines. Le projet porte sur quatre lignées murines. Deux lignées sont utilisées comme modèles de pathologies humaines du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. Une lignée est utilisée comme lignée receveuse de transplantations effectuées à partir de cellules souches sanguines murines. Une autre lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet l’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie géniques sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie. Dans ce projet les animaux sont utilisés à l’âge de 10-12 semaines, moment où la prise de greffe est optimale.
Evaluation de la distribution sanguine et tissulaire ainsi que l’élimination d’un candidat médicament dans des modèles de tumeurs sous cutanées chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
7 200 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant passer jusqu'à 96 heures seule en cage à métabolisme. Après une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc ou de l'omoplate, elles reçoivent des molécules radiomarquées, avant deux prélèvements de sang derrière l'œil et une saignée terminale par ponction cardiaque. Le porteur décrit un projet répétitif, mené selon un même schéma pour les entreprises clientes, dont il retient les composés qui passeront ensuite en études d'efficacité. Le nombre d'animaux par groupe est fixé par le client, à quatre souris aux tumeurs jugées homogènes et exploitables, ce qui laisse sans explication l'effectif total de 7 200.
Objectifs
Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles murins sont encore aujourd’hui indispensables en oncologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapeutiques innovantes et évaluer leur efficacité. Les études de pharmacocinétique sanguine, de distribution tissulaire et d’élimination de candidats médicaments biologiques représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit dans un but diagnostic ou thérapeutique. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour objectif l’étude pharmacologique d'une sélection de candidats médicaments. Les variations peuvent porter sur la souche de souris sélectionnée, le modèle tumoral sous cutanée utilisé, le mode d’administration du candidat, le nombre d’animaux par groupe et le nombre de groupes (différentes doses et/ou différents temps d’euthanasie à analyser). Ces études in vivo sont menées à partir de la greffe des tumeurs sous cutanées puis par l’administration de candidats médicaments préalablement marqués par un isotope radioactif non toxique aux doses utilisées afin de tracer et de quantifier ces candidats dans les différents tissus dont le tissu tumoral et les fluides biologiques d’intérêt. Les candidats médicaments ont été testés au préalable chez nos clients et sont connus pour ne pas présenter d’effets délétères. Ce sont des protéines, des peptides et/ou des anticorps dilués dans des tampons respectant la physiologie de l’animal.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme (tissus cibles, notamment tumeurs et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études d'efficacité dans le cadre d'autres projets.
Procédures
Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Tonte du flanc en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1 à 3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (1 injections, 15 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 15 s) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (2 fois maximum, 30 s) ; Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; hébergement individuel en cage à métabolisme (maximum 1 fois pendant 96 heures maximum)
Impact sur les animaux
Stress et douleur légère liés à l’administration des cellules tumorales en sous cutanées ; Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intra péritonéale, intramusculaire ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; stress modéré lors du placement en cage à métabolisme.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur en cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animal ; Fin de l’étude
Remplacement
Les canddats médicaments de nos clients ont fait l’objet d’études d’efficacité préliminaires in vitro et/ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autres de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé par groupe est déterminé par le client par des méthodes classiques statistiques en fonction des résultats préalables qu'il a obtenus avec le modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs). Ce nombre est réduit au minimum afin d’avoir 4 animaux par groupe dont les tumeurs seront homogènes et exploitables. En effet, la méthode de quantification par mesure radioactive est très précise et répétable. Néanmoins, dans certains cas et lorsque c’est possible, ce nombre pourra être diminué.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 à 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.
Etude des mécanismes protecteurs de l’inhibition du translocon dans la dysfonction adipocytaire dans le contexte de l’obésité chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Deux chirurgies d'implantation de pastilles à diffusion lente, six prises de sang à la queue et trois épreuves de gavage au glucose suivies d'insuline : 48 souris rendues obèses par un régime gras vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont toutes tuées à la fin, pour prélever les organes destinés aux analyses lipidiques, protéiques et d'expression génique. L'objectif déclaré est de savoir si bloquer une protéine du stress cellulaire, le translocon, limite le diabète et le foie gras associés à l'obésité. Le porteur retient la souris comme modèle intégré, seul moyen selon lui d'observer les communications entre organes, et fait débuter le régime gras à huit semaines d'âge pour écarter les effets du développement.
Objectifs
Le but de notre projet est de déterminer l’implication d’une protéine connue pour être jouer un rôle dans le stress cellulaire, le tranlocon, dans la dysfonction du tissu adipeux, un évènement se déroulant au cours de l’obésité et qui est central dans l’apparition des complications de l’obésité (diabète, maladies cardiovasculaires, foie gras). A l’aide de souries rendues obèses avec un régime gras et qui présentent une dysfonction adipocytaire, nous allons déterminer si l’inhibition du translocon avec un inhibiteur pharmacologique améliore la bonne santé du tissu adipeux et limite les complications de l’obésité (diabète et foie gras). Notre approche va nous permettre d’éclairer les mécanismes conduisant aux complications métaboliques de l’obésité et de développer des stratégies thérapeutiques afin d’en limiter les conséquences.
Bénéfices attendus
Compte tenu des enjeux médicaux, sociaux et économiques liés aux complications métaboliques de l’obésité, la dysfonction adipocytaire qui est un mécanisme physiopathologique clé du développement de ces complications a été largement étudiée dans une multitude de contextes. Cependant, les mécanismes initiateurs de la dysfonction adipocytaires demeurent encore mal connus. Le rôle du translocon dans cette dysfonction n’a, a notre connaissance, jamais été étudiée à ce jour. Ceci reflète un vaste champ de connaissances fondamentales à explorer. Nos résultats préliminaires obtenus dans des modèles cellulaires montrent que le translocon induit l’augmentation de marqueurs de la dysfonction adipocytaire. A court terme, ce projet permettra de déterminer quels sont les mécanismes fondamentaux en jeux et éventuellement d'identifier des leviers à actionner sur ceux-ci. A moyen terme, en démontrant la possibilité de moduler l’activité du translocon pharmacologiquement ce projet favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour diminuer les complications métaboliques chez les patients obèses.
Procédures
Dans ce projet, les animaux subissent deux procédures chirurgicales pour implanter et renouveler au bout de trois mois des pastilles permettant de délivrer l’inhibiteur pharmacologique ou le placébo. Tous les mois, à six reprises au cours de cette période, du sang sera prélevé en vigil au niveau de l’extrémité de la queue. Tous les deux mois, à trois reprises au cours de cette période et a une semaine d'intervalle, du glucose sera administré par gavage et de l'insuline en intrapéritonéale, puis du sang sera prélevé au niveau de l’extrémité de la queue, le tout sur animal vigile.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : sédentarité due au régime obésogène, potentielle sensibilité au niveau des point de délivrance (injection intrapéritonéale, gavage oral) ou de prélèvements (sang à la veine caudale) (qui devrait être très limité au regard de la fréquence espacée dans le temps).
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour prélever les organes d'intérêt pour les analyses de contenu lipidique, de contenu protéique et de mesure d'expression génique.
Remplacement
Le projet global dans lequel la présente demande s'applique repose sur d'autres modèles expérimentaux qui permettent de remplacer un certain nombre d’animaux : nous utilisons notamment des adipocytes en culture. Ce modèle cellulaire permet de remplacer les modèles animaux dans l’affinage de la détermination du rôle du translocon dans la dysfonction adipocytaire. L’utilisation de modèle animal reste indispensable car il permet d’étudier une pathologie qui résulte d’une communication interorgane ne pouvant être étudié que dans un modèle intégré.
Réduction
Le projet préconise l’utilisation d’un nombre de 48 animaux, ce qui, dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs. Nous avons précédemment défini la cinétique de la mise en place de la dysfonction adipocytaire chez les souris nourries avec un régime gras et donc de déterminer le temps traitement le plus approprié et de réduire le nombre d’animaux et le temps de l’expérimentation.
Raffinement
Nous avons pris en compte le bien-être animal, la définition de points limites adaptés (signes cliniques notables ou spécifiques) couplé à un examen clinique quotidien des animaux par du personnel formé permettra de prévenir les risques de stress et de souffrances. Nous avons intégré la gestion de la souffrance animale en utilisant des procédures adaptées en prêtant une attention particulière à la délivrance de l’inhibiteur pharmacologique (utilisation de pastilles à diffusion lente pour éviter toute injection quotidienne) et à la délivrance d’anesthétiques et d’antalgiques. Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et des enrichissements (frisottis et un tube tunnel en polycarbonate ) et les animaux sont hébergés en groupes sociaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux sont des modèles intégrés et sont l'unique moyen d’observer les effets systémiques des modèles pathologiques utilisés (obésité, diabète de type 2 et hépatopathie dysmétabolique pour ce projet) ainsi que la réponse physiologique intégrée et les communications inter-organes (conséquence systémiques d’une dysfonction adipocytaire à l’origine des complications de type diabétique et hépatique en ce qui concerne ce projet). Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé de longue date pour caractériser les différentes complications cardiaques associées aux dérégulations métaboliques. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires importants pour mieux comprendre les effets bénéfiques de l’inhibition du translocon. Pour tous les animaux débuterons l’administration de l’inhibiteur et du régime à 8 semaines d’âge de façon à travailler sur des animaux adultes. Le but de ce travail n’étant pas de déterminer l’effet de cette inhibition au cours du développement de l’organisme.
Etude de biodistribution de molécules marquées par des approches non invasives d’imagerie optique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 180
Anesthésiés une fois pour être dépilés, une fois pour recevoir la molécule testée, puis à chaque séance d'imagerie optique, jusqu'à trois par jour, 270 souris et 180 rats, soit 450 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque anesthésie dure dix minutes au plus, et une prise de sang en cours d'étude puis une prise terminale peuvent s'y ajouter. Les molécules, des anticorps ou fragments d'anticorps par exemple, viennent de clients, et l'entreprise déclare ne pas en connaître la nature, d'où des effets indésirables "difficiles à anticiper". Le nombre de jours d'imagerie n'est pas précisé. Tous sont mis à mort en fin de procédure, pour des prélèvements de tissus et de sang.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont multiples. En effet, il s'agit d'évaluer le comportement de molécules ou biomolécules (anticorps, fragments d'anticorps...) après administration chez l'animal vivant, par des approches d'imagerie non invasive. Cela permettra d'analyser la distribution au sein de l'organisme (tissulaire, organes d'élimination,...), l'évolution dans le temps, la durée avant disparition du signal (élimination).
Bénéfices attendus
En évaluant la biodistribution de nouvelles molécules potentiellement thérapeutiques, ce projet permettra d'apporter des informations précieuses et cruciales sur leur devenir suite à leur administratrion chez l'animal vivant, et aidera à la sélection des meilleurs candidats médicaments avant essais chez l'Homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à des anesthésies gazeuses : lors de la dépilation (1 fois), lors de l'administration de la molécule à tester (1 fois), puis une par session d'imagerie (maximum 3 par jour). Chaque anesthésie n'excèdera pas 10 minutes. Des prélèvements sanguins inférieurs à 1 minute (1 au cours de l'étude et 1 terminal) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
La manipulation, les administrations, les anesthésies et prélèvements peuvent provoquer du stress chez les animaux. Des effets indésirables liés à l'administration des molécules thérapeutiques (mauvaise tolérance...) peuvent être observés mais sont difficiles à anticiper car nous ne connaissons pas la nature des molécules de nos clients.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés. Des prélèvements de sang total pourront également être réalisés.
Remplacement
La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la distribution des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe. L'approche en imagerie non invasive permet de réduire et de raffiner le modèle d'étude : la stratégie d'expérimentation permet d'appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d'avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle (étude longitudinale). Des analyses post mortem (imagerie ex vivo et analyse des tissus) seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possible relatives aux molécules administrées.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal,...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Les procédures d'imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, dans une enceinte avec lit chauffé. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : -Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication au niveau du site d’injection de la molécule. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris/rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. En effet, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entre ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêtes pratiques décisifs: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont aussi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Validation en modèle murin de l’effet thérapeutique d’un vaccin muqueux anti-SARS-CoV2 contre les symptômes du covid-long
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Les souris qui perdent 15 % de leur poids ou présentent des difficultés respiratoires après l'infection par le SARS-CoV-2 sont mises à mort sans délai, l'infection pouvant les tuer en huit jours. 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs poumons, de leur cerveau et de leur tête. Chacune reçoit une puce sous la peau du dos, subit huit prises de sang à raison d'une par semaine, trois ou quatre vaccinations par le nez sous anesthésie générale et une inoculation du virus par la même voie. Toute médication susceptible d'interférer avec la réponse immunitaire est exclue. Les résultats doivent alimenter une publication et une éventuelle demande d'essai clinique pour le candidat vaccin LVT-001, contre les symptômes du covid long.
Objectifs
Le COVID-19, causé par le virus SARS-CoV-2, a affecté des millions de personnes dans le monde, entraînant non seulement des problèmes respiratoires mais aussi des symptômes neurologiques graves, y compris des atteintes cérébrales. Des recherches récentes ont montré que ces complications persistent chez certains patients, formant ce qu'on appelle le 'covid-long'. La vaccination a démontré son efficacité à la fois dans la prévention et le traitement du covid-long. Nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique de notre vaccin dans un modèle murin, qui reproduisent les symptômes du covid-long, y compris les atteintes cérébrales. Ce modèle animal nous permettra d'étudier comment notre vaccin peut moduler les symptômes persistants du COVID-19, en particulier ceux affectant le système nerveux central. Ce vaccin, conçu pour cibler plusieurs variants du virus, pourrait offrir des perspectives prometteuses pour le traitement de ces formes graves de la maladie.
Bénéfices attendus
Les resultats de ce projet feraient l’objet d’une publication scientifique mais pourraient également servir de données preclinique à une demande d’essais clinique thérapeutique chez l’homme pour le traitement des symptomes liés au covid-long avec le candidat vaccin LVT-001 qui sera déjà évalué en clinque fin 2024 en prophylactique.
Procédures
Tous les animaux, soit 96 souris. Des puces d’identification dorsales en voie sous-cutanée (12 minutes par animal, 1 fois). Des prises de sang à la veine submandibulaire (5 minutes par animal, 8 fois soit une fois par semaine). Inoculation du vaccin par voie nasale sous anesthésie générale. (10 minutes par animal, entre 3 et 4 fois selon les lots). Challenge infectieux par voie nasale sous anesthésie générale (10 min par animal, 1 fois). Prélèvement d'urine (20 seconde maximum par animal, 1 fois).
Impact sur les animaux
Pour le challenge viral par voie nasale, une perte de poids moyen de 15% est observée en premier lieu entre 3 et 5 jours post infection et suivie très rapidement par une léthargie, des difficultés respiratoires pouvant entrainer la mort 8 jours post infection. Pour éviter toute souffrance aux animaux, une perte de poids moyen de 15% et/ou l’apparition de difficultés respiratoires entrainera la mise à mort sans délai. Une variabilité pouvant être liée à la souche virale, les points limites seront ajustés selon nos observations bi/quotidiennes pour éviter toute souffrance aux animaux. Les administrations en voie intra-péritonéale pour les anesthésies générales peuvent entrainer une légère douleur au niveau du site d’injection. Une légère douleur locale peut-être observée au site d’implantations de la puce télémétrique. Les prises de sang peuvent également entrainer une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. Les différentes contentions effectuées peuvent engendrer du stress pour l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole et les organes (poumons, cerveau, tête, sang) sont prélevés post mortem pour les analyses de charge virale, pur le recrutement cellulaire et sécrétion de médiateurs biochimiques.
Remplacement
Pour ce projet, il n’existe pas de méthode de substitution qui pourrait restituer fidèlement un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques en s’appuyant sur les données de la littérature et l’expérience des différents partenaires de ce projet. L’étude statistique sera faite sur la base d’un test non paramétrique, déjà éprouvé notamment pour l’étude de la réponse immunitaire humorale et cellulaire. Ce nombre d’animaux repose également sur notre experience precedente d’utilisation du même modèle animal dans le cadre d’essais de protection prophylactique avec le même candidat vaccin.
Raffinement
Les souris sont hébergées en accord avec les directives européennes et bénéficient d'un enrichissement social et physique (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger) dans la zone d'hébergement défini par la structure chargée du bien-être animal de l’établissement. Les souris sont hébergées, avant infection, en animalerie sur des portoirs ventilés puis en isolateur après infection expérimentale (environnement confiné). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique de points limites. Tout type de médication pouvant interférer avec la réponse immunitaire est proscrit. Des critères d’arrêt sont prévus dans le projet afin de prendre en compte d’éventuels effets inattendus. Les procédures sont réalisées par du personnel déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire.
Choix des espèces
Aucune méthode de substitution n’est envisageable au modèle animal qui est un système de régulation complexe permettant d’évaluer la réponse thérapeutique induite par la vaccination post-infection dans l’étude du covid long. Le modèle murin est à présent bien décrit dans la littérature et représente le modèle de référence pour l’étude des challenges infectieux Covid. Il a été récemment étendu à l’étude des symptômes et pathologies liées au Covid long avec notamment sa propension à reproduire l’infection du SNC par le virus. Ainsi ce modèle est le plus relevant pour l’étude de thérapie contre le covid long. Adulte et immunocompétent : afin d’être représentatif en préclinique de la cible clinique du protocole, le modèle le plus pertinent repose sur des adultes immunocompétents.