Recherche fondamentale

Anesthésiées, les souris reçoivent une instillation de toxine bactérienne directement dans la trachée, puis des injections répétées dans la veine de la queue, avant une heure d'exploration respiratoire sur animal éveillé. 2 028 souris vont être utilisées, dont 1 740 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que le développement des lésions pulmonaires est indolore faute d'innervation sensitive du poumon, tout en prévoyant une insuffisance respiratoire sévère, une mortalité accrue, et une grille de score allant de l'immobilité aux vocalisations et à l'automutilation. Vingt-quatre, quarante-huit ou soixante-douze heures après l'induction, elles sont tuées pour prélever poumons, sang et liquide de lavage broncho-alvéolaire.

Objectifs

Ce projet vise à développer une thérapie régénérative pour le traitement des lésions pulmonaires tels que celles observées dans le syndrome de détresse respiratoire aigue, les exacerbations aigues de maladies pulmonaires fibrosante ou dans les pneumopathies sévères. Nous envisageons l'utilisation de mimétiques de polysaccharides pulmonaires afin d'améliorer la réparation du tissu pulmonaire et de permettre une récupération fonctionnelle après une agression pulmonaire aigue. Les effets bénéfiques seraient principalement liés à la régénération du tissu lésé en restructurant le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire et en limitant la fibrose. Le projet explorera la capacité de notre molécule à réduire l'inflammation, les altérations des mécanismes de formation de nouveaux vaisseaux et la fibrose. Cette thérapie a pour objectif d'éviter les séquelles de lésions pulmonaires aigues caractéristiques des dommages alvéolaires diffus.

Bénéfices attendus

La survenue de dommage alvéolaire diffus (DAD) est une véritable problématique dans l'évolution des maladies pulmonaires. La DAD est une réaction aiguë non spécifique du poumon commune au syndrome de détresse respiratoire aiguë chez au moins 50 pourcents des patients, mais aussi dans les exacerbations aiguës des maladies pulmonaires interstitielles fibrotiques, dans les pneumopathies sévères du COVID-19 ou dans d'autres conditions diverses, dues à une multitude d'agents nocifs (infections, médicaments, etc..). L'évolution clinique de la DAD peut être aiguë, définissant des formes sévères potentiellement mortelles de pneumonie interstitielle aiguë, ou subaiguë-chronique, qui, après un schéma histologique initial de DAD, évolue vers des pneumopathies interstitielles fibrosantes (PIF) ou une fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) avec une fibrose interstitielle étendue et une hypertension pulmonaire. Au cours de ces phases, des enzymes sont libérées et vont dégrader des protéines impliquées dans l’architecture du tissu. L'hypothèse de recherche de ce projet est que la molécule administrée par voie intra-veineuse chez la souris présenterait un potentiel thérapeutique pour lutter contre les lésions pulmonaires aigues en permettant une cicatrisation de l’épithélium pulmonaire. Ainsi cet agent (1) remplacera le réseau de molécule formant l’architecture pulmonaire remodelée suite à l'induction des lésions (2) améliorera la formation de nouveaux vaisseaux et la récupération alvéolaire, et (3) diminuera significativement le processus inflammatoire.

Procédures

La réalisation de ce projet nécessite l'induction de lésion pulmonaire aigue (72h). Dans un premier temps nous déterminons la dose optimale de toxine bactérienne nécessaire pour induire des lésions pulmonaires. Pour cela les animaux anesthésiés recevront 1 instillation intratrachéale (durée 3 minutes) de cet toxine ou de sérum physiologique. Suite à cela nous déterminerons les effets d'injections intraveineuses unique ou multiple d'agent thérapeutiques (Animaux vigiles, durée quelques secondes). Le groupe contrôle (animaux vigiles) recevra une injection intrapéritonéale d'anti-inflammatoire (durée quelques secondes). Après une exploration fonctionnelle respiratoire (animaux vigiles, durée 1h) les animaux seront euthanasiés pour prélèvement d'organes (durée 10 minutes) afin de déterminer les mécanismes d'action de cet agent thérapeutique à 24h, 48h et 72h après induction des lésions pulmonaires. Enfin une étude du devenir de l’agent thérapeutique dans l’organisme (distribution dans les différents organes-10 minutes) sera réalisée à différents temps (5 min, 30min, 3h, 6h, 12h et 24h) après son administration par voie intra-veineuse.

Impact sur les animaux

L'administration de toxine bactérienne via la trachée est l'un des modèles de rongeurs les plus couramment utilisés pour induire des les lésions pulmonaires aigues. Dans ce modèle expérimental, le tissu pulmonaire est endommagé en 48 à 72h. Le modèle présente une réponse inflammatoire conduisant à des lésions au niveau des vaisseaux sanguins et alvéoles. Ces éléments sont des caractéristiques des patients atteints de lésions pulmonaires aigues. L'instillation par la trachée n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Le développement de lésions pulmonaires est également indolore du fait de l'absence d'innervation sensitive à la douleur dans le tissu pulmonaire. Elle peut néanmoins entraîner une insuffisance respiratoire sévère et une mortalité plus importante. L’évaluation de la respiration de l’animal peut entrainer un stress. La contention lors des injections intrapériotnéales et intraveineuses peuvent induire un stress. Les injections IV répétées dans la queue des souris peuvent entrainer des blessures à la queue, des irritations, des saignements, une sensibilisation, des hématomes. Les injections intrapéritonéales peuvent entrainer des réactions au site d’injection et des lésions viscérales. Les anesthésies par voie intra-péritonéale sont suivies par l'euthanasie de l’animal (sans réveil). Lors de l’anesthésie gazeuse, les niveaux seront ajustés en temps réels afin d’éviter les risques anesthésiques.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasié pour prélèvement d'organes, du sang et du liquide de lavage broncho-alvéolaire. tous les prélèvements sont nécessaires pour répondre à la question scientifique.

Remplacement

La réalisation de ce projet nécessite l'induction de lésions pulmonaires in vivo. De fait, il n'existe pas de méthode alternative à l'expérimentation animale in vivo à ce jour. D'autre part, l'étude des mécanismes d'action d'un mimétique de l'héparane sulfate dans le cadre d'une thérapie matricielle peut-être plus facilement entreprise chez la souris du fait de l'existence d'outils permettant une approche mécanistique plus poussée.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqué est de 2028. Le nombre d’animaux par groupe a été choisi sur la base de données, publiées ou non, et des calculs statistiques afin de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif. Cela permet également de déterminer les points d'arrêt d'expérimentation les plus précoces et compatibles avec les objectifs du projet. Pour cela nous nous sommes basé sur la littérature existante ainsi que des tests de puissance et des statistiques issues de séries expérimentales précédentes prenant en compte les effets du lipopolysaccharide et la potentielle variabilité de nos paramètres physiologiques entre les différents individus.

Raffinement

Toutes les procédures seront réalisées dans le respect total des règles du raffinement. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi par groupes sociaux de 4 animaux par cage. La température de l’animalerie et l’humidité relative sont contrôlés en permanence. La nourriture sera fournie ad libitum et la photopériode sera de 12h/12h. L'enrichissement du milieu sera composé de matériel de nidification (bandes de papier naturel compacté) et d'abri en cellulose. Concernant l'insitllation intra-trachéale, celle-ci sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Ce type d’anesthésie est de courte durée et l'instillation n'entraîne aucune lésion trachéale ni de douleur particulière au réveil de l'animal. Les souris seront ensuite surveillées jusqu'a leur réveil complet. Afin d’améliorer le confort de l’animal suite à l’instillation intra-trachéale et afin de prévenir une perte de poids trop importante, un gel hydraté enrichi pourra être proposé au animaux afin de faciliter l’alimentation et la récupération des animaux dans les premières heures suivant la procédure. En fin de procédure, lors de l'anesthésie précédent l’euthanasie, la profondeur d'anesthésie sera vérifiées via l’observation des signes suivants: le relâchement des muscles, la perte du réflexe de retrait sur les deux pattes et la queue, la perte du réflexe de fermeture des paupiéres, une respiration calme. Durant toute la procédure, les conditions de soins et les méthodes utilisées ont été choisies pour réduire le plus possible toute souffrance qu’auraient pu ressentir les animaux. Les points limites seront basés sur l'examen visuel des signes suivant: immobilité, difficultés respiratoires (râle, respiration rapide..), position anormale (dos vouté, couché sur le coté..), réduction de la mobilité (faiblesse musculaire, manque de coordination, tremblements, paralysie..), perte de poids rapide ou progressive, mauvais état du pelage (poil ébouriffé, mal entretenu..), vocalisation, pâleur des yeux ou des extrémités, automutilation. Pour cela, une échelle d'évaluation avec score est utilisée.

Choix des espèces

Ce projet nécessite d'induire des lésions pulmonaires aigues, de réaliser des explorations fonctionnelles respiratoires et de prélever des tissus. Il n'existe donc pas d'alternative à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques dans notre contexte. Le modèle murins de lésions pulmonaires induits par une toxine bactérienne permet d'explorer les mécanismes de plusieurs pathologies respiratoires aigues. C’est un modéle validé dans la littérature et courament utilisé. Il est parfaitement décrit et fournit des informations utiles pour la découverte de nouveaux biomarqueurs et de nouvelles cibles médicamenteuses. Pour réaliser notre étude nous avons besoin que le système ventilatoire soit mature et fonctionnel. De plus, Le vieillissement augmente l'incidence et la mortalité du syndrome de détresse respiratoire aigu chez l'homme et les modèles animaux vont dans le même sens, les souris âgées présentant une augmentation de l'infiltration neutrophile et de la perméabilité alvéolo-capillaire après une exposition aux toxines bactériennes. Compte tenu de ces éléments et de la littérature existante sur le sujet, nous avons décidé d’utiliser des souris âgées de 8 semaines.

Chaque souris subit une chirurgie cérébrale de trente minutes sous anesthésie générale, puis reçoit des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant deux semaines. 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau, dont 412 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif déclaré est de comprendre comment la L-Dopa s'intègre au squelette interne des neurones et provoque les mouvements involontaires des patients parkinsoniens traités au long cours. Le porteur ramène les atteintes à une perte de poids et à une perte d'autonomie pour boire et manger, compensées selon lui par les soins, et annonce des tests comportementaux moteurs tous les deux jours sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une affection cérébrale qui perturbe les mouvements et peut avoir un impact considérable sur la vie quotidienne. La L-Dopa, le médicament le plus couramment utilisé, aide à gérer les symptômes de la maladie de Parkinson, mais après un traitement prolongé, elle peut provoquer des effets secondaires très gênants tels que des mouvements involontaires anormaux nommés dyskinésies. Il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme en cause afin d’identifier un moyen de limiter ces effets indésirables. Nous avons découvert que la L-Dopa peut s'intégrer directement dans les structures qui composent le squelette interne des neurones, appelées microtubules. Ces microtubules sont importants pour la transmission d'informations d'un neurone à l'autre. Notre projet vise à comprendre le rôle des microtubules contenant de la L-Dopa dans le développement de la dyskinésie et à contribuer à mieux comprendre les défauts neurologiques chez les patients en traitement prolongé à la L-Dopa.

Bénéfices attendus

Étant donné que la L-Dopa est le traitement standard de la maladie de Parkinson et que son utilisation à long terme peut entraîner des effets secondaires tels que les mouvements involontaires (dyskinésie), il est très important de comprendre son impact sur le fonctionnement normal du squelette neuronal dans la communication entre les neurones. En étudiant les protéines impliquées dans la modification de ce squelette neuronal par la L-Dopa, nous pourrions trouver de nouvelles façons de minimiser les effets secondaires de ce traitement.

Procédures

Les souris subissent des procédures chirurgicales sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes. Nous administrons quotidiennement des substances par injections dans l'abdomen pendant deux semaines. Les souris participeront également à des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités motrices impactées par l'administration du traitement contre la maladie de Parkinson. Ces tests dureront de 1 à 30 minutes et se feront durant deux semaines, avec un test tous les deux jours. Les souris peuvent subir une injection intraveineuse sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le projet implique la mise en place d'un état pathologique chez le rongeur affectant l'autonomie des souris à s'hydrater et se nourrir et donc une perte de poids, n'impactant pas leur taux de survie grâce aux soins apportés.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour l'étude de l'anatomie du cerveau.

Remplacement

Une première partie des expériences a été faite in vitro et sur des neurones en culture. Pour la suite du projet, il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau et les mouvements anormaux.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Des études préliminaires permettent la mise au point des expériences. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Pour permettre l'acclimatation, un minimum d'une semaine sera alloué lorsque les animaux seront transférés d'autres installations. Afin de donner la priorité au bien-être des animaux et de minimiser la douleur, la détresse ou la souffrance potentielles pendant les expériences, nous surveillons l'état de santé et de stress des souris tout au long de l'étude. Pendant les semaines de convalescence suivant l'opération, les souris seront surveillées et recevront de la nourriture supplémentaire. En cas de douleur ou d'inconfort, un analgésique sera administré. Nous utilisons des points limites adaptés permettant d’intervenir rapidement pour limiter la souffrance de l’animal. Étant donné que la procédure chirurgicale pour l'induction de la lésion qui générerait la maladie de Parkinson peut entraîner des problèmes d'alimentation et de déshydratation, les souris recevront une injection sous-cutanée d'une solution de glucose et de sérum physiologique immédiatement après l'opération et une fois par jour pendant la première semaine postopératoire. Compte tenu de la possibilité de complications postopératoires, un dossier complet d'évaluation de la santé sera tenu pour chaque souris pendant les 14 premiers jours suivant l'opération. Des tests comportementaux seront effectués après une période d'entraînement pour limiter le stress de la nouveauté.

Choix des espèces

La souris est un mammifère génétiquement modifiable, dont l'anatomie et la physiologie sont comparables à celles de l'homme, de sorte que les connaissances acquises peuvent également être appliquées à l'homme. En outre, l'élevage des souris et les conditions de leur utilisation expérimentale sont bien établis. Des modèles génétiquement modifiés d'intérêt existent déjà dans notre laboratoire et les échelles de dyskinésie pour les souris sont maintenant bien validées et largement utilisées. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines.

Pour comprendre le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux, 3 120 poissons zèbres vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 180 d'entre eux. Une partie subit un prélèvement de nageoire caudale pour génotypage et un prélèvement de gamètes sous anesthésie, gestes dont le porteur reconnaît qu'ils peuvent être douloureux au réveil. D'autres sont exposés trente minutes à des molécules odorantes dont certaines sont connues pour leur effet répulsif, ou immobilisés une heure pour l'imagerie de l'activité neuronale, l'isolement lié au génotypage et à l'analyse de nage étant lui aussi compté comme une nuisance. Les poissons sont tués par excès d'anesthésiant ou par refroidissement rapide, faute de porter le génotype voulu, à la limite d'âge de 24 mois fixée par l'animalerie ou en fin d'expérience, à l'exception de 360 gardés en vie pour des projets ultérieurs.

Objectifs

Nous étudions le rôle des forces mécaniques dans la construction du système nerveux. Les mouvements cellulaires sont omniprésents dans le développement des circuits neuronaux : dans l’embryon, les neurones migrent vers leur destination finale et forment de longues protrusions qui s'allongent avant de se connecter au niveau des synapses. L'étude de ces processus s'est jusqu'ici focalisée sur les signaux chimiques qui guident la migration neuronale et la navigation des axones. Or les mouvements des neurones et de leurs protrusions sont aussi influencés par des forces mécaniques, dont la fonction reste largement inconnue in vivo. Disséquer le rôle des forces mécaniques dans l'assemblage des circuits neuronaux représente donc un défi majeur pour les neurosciences modernes.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances inédites sur la construction du système nerveux en mettant en lumière l'importance des signaux mécaniques, contribuant ainsi à une meilleure compréhension du développement neuronal. Au-delà de son impact fondamental en neurosciences, ce projet a des implications biomédicales dans l'étude de l'origine des maladies du système nerveux et la bioingénierie des tissus. Ici, nous nous concentrons sur la contribution des forces mécaniques dans la migration neuronale et la croissance des axones, deux événements clés de la construction des circuits neuronaux. Si l'un de ces deux processus ne se produit pas correctement, la fonction du système nerveux est affectée, comme en témoignent les troubles neurodéveloppementaux graves résultant de défauts de migration neuronale et de formation des axones, tels que les lissencéphalies, le retard mental, les épilepsies et le syndrome de Kallmann. La contribution des forces mécaniques dans l'origine de ces maladies est loin d'être comprise et nécessite plus d'attention. De plus, décrypter la réponse des neurones aux signaux mécaniques in vivo fournira des informations précieuses pour la conception de systèmes de culture neuronale et d'échafaudages 3D associés dédiés à la réparation du cerveau et de la moelle épinière. Nos travaux alimenteront ainsi potentiellement les développements futurs en ingénierie biomédicale pour aider à traiter à long terme les lésions du cerveau et de la moelle épinière.

Procédures

Une partie des animaux sera soumise à des prélèvements de fragments de nageoire pour identification génétique (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 3 minutes), à des prélèvements de gamètes pour préservation des lignées (sur animaux anesthésiés, 1 prélèvement par poisson, durée du prélèvement : 10 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse du comportement de nage sur animaux vigiles (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes et analyse de l'activité des neurones par microscopie sur animaux immobilisés (durée de l'immobilisation : 60 minutes, durée de l'imagerie pendant la stimulation avec des molécules odorantes : 30 minutes), à une stimulation avec des molécules odorantes sur animaux vigiles suivie d'une euthanasie par refroidissement rapide (1 stimulation par poisson, durée de la stimulation : 5 minutes), à une euthanasie par excès d'anesthésiant (1/poisson).

Impact sur les animaux

La substance appliquée aux poissons pour l'anesthésie et l’euthanasie provoque un comportement d'aversion et/ou de stress. De plus, même s’il se fait sous anesthésie, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale (fin clip) peut générer une douleur après le réveil, ainsi que le prélèvement du sperme et des ovocytes. L’isolement des poissons au moment du génotypage par fin clip ou de l’analyse de la nage représente également une nuisance. Enfin, certains stimulis odorants que nous allons utiliser sont connus pour avoir un effet répulsif sur les poissons, ce qui peut stresser les animaux. L’immobilisation des animaux pour l’imagerie de l’activité neuronale peut également stresser ou générer un inconfort chez les larves analysées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures décrites dans ce projet, exceptés pour 360 d’entre eux qui seront gardés en vie et réutilisés pour des projets ultérieurs dédiés à de nouvelles études du développement de la fonction olfactive chez le poisson-zèbre. Les poissons seront euthanasiés parce qu'ils ne portent pas le génotype d'intérêt, parce qu'ils ont atteint la limite d'âge imposée dans l'animalerie (24 mois), ou en fin de procédure expérimentale (après stimulation olfactive et analyse du comportement de nage ou de l'activité des neurones - il est impossible de les ré-utiliser car ils seront sortis physiquement du système d'élevage, et après stimulation olfactive pour prélèvement/analyse du cerveau sur échantillons fixés).

Remplacement

L’expérimentation sur le poisson-zèbre est essentielle pour répondre à notre question scientifique, afin d’étudier sur un organisme vertébré les processus complexes qui sous-tendent le développement du système nerveux et la contribution des forces mécaniques. L'utilisation du poisson-zèbre comme modèle est notamment essentielle pour étudier les interactions mécaniques entre les neurones en développement et les tissus environnants, car de telles interactions sont encore très difficiles à reproduire in vitro.

Réduction

Le développement externe des embryons nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. En effet une même femelle peut être accouplée toutes les semaines pendant au moins un an pour produire des œufs fécondés pour les expériences, sans dommage pour elle. Lorsque c’est possible, nous utilisons les œufs produits (jusqu’à 200 par ponte) pour plusieurs expériences simultanément. Dès qu’un animal n’est plus utile pour les expériences il est euthanasié. Enfin, afin d’identifier le plus tôt possible les animaux qu’il faut garder et ceux qu’il faut supprimer, nous avons mis en place, lorsque c’est compatible avec le protocole expérimental, le génotypage des embryons à des stades précoces (avant 5 jours). Pour chaque expérience, le nombre d’animaux est limité au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement significatifs, grâce à un calcul de puissance. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le nombre total d'animaux employés dans le projet est de 3120.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et d’élevage des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont élevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure) à 26-28 degrés, en eau douce, à une densité maximale de 5 poissons par litre. Les poissons aimant être en groupe, les périodes d’isolement (nécessaires au moment du génotypage des poissons pour identification d’une mutation) sont réduites à 10 jours maximum (en général 2 ou 3 jours). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères, de la nourriture vivante, ce qui leur permet d’exprimer leur comportement de chasse/prédation. Les étagères pour les bacs de croisements sont recouvertes de posters figurant des galets, de manière à diminuer le stress généré par le changement d’environnement/d’étagères pendant les croisements. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Nous avons établi une grille de scoring des animaux qui permet de répertorier tout aspect ou comportement anormal et de lui attribuer un score. Un animal est euthanasié dès qu’il atteint un score égal ou supérieur à 4. Nous allons mettre en place la congélation de sperme pour conserver les lignées qui sont transitoirement inutilisées. Outre le gain de place, ceci évite de renouveler les lignées et de procéder à des expériences de génotypage qui produiraient des animaux sauvages qu’il faudrait ensuite euthanasier. Les animaux sont anesthésiés pendant les procédures expérimentales pouvant générer une douleur.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle reconnu pour l’étude du développement embryonnaire. Son développement rapide et externe, le grand nombre d’embryons synchronisés par ponte, la transparence des embryons, les possibilités de modification du génome en font un modèle de choix pour la recherche. Les possibilités d’imagerie sur embryon vivant font du poisson zèbre un excellent modèle vertébré pour étudier la dynamique des processus de morphogenèse (comprendre comment les organes acquièrent leur forme et leur fonction) et de développement du système nerveux. Pour produire des animaux mutants, nous réalisons une micro-injection dans l’embryon au stade 1-4 cellules. Nous suivons les animaux aux stades larvaires, juvéniles et adultes sur plusieurs générations (sur 5 ans : 3 générations) pour détecter toute anomalie potentiellement nuisible dans les poissons injectés ou porteurs d’une mutation. Quand cela est nécessaire nous génotyperons (génotyper signifie analyser l'ADN) les poissons adultes de nos lignées par prélèvement d’un fragment de nageoire. En effet, il n’est pas toujours possible de réaliser le génotypage aux stades précoces c’est à dire avant 5 jours (incompatibilité avec le calendrier et/ou les expériences) et nous devons dans ce cas effectuer le génotypage à partir de 3 mois. Les prélèvements de sperme et d’ovocytes se font à l’âge adulte. Les tests comportementaux consistant à exposer les poissons à des odeurs puis analyser leur nage seront réalisés aux stades juvénile et adulte. En effet, c’est à partir du stade larvaire que le système olfactif commence à être fonctionnel et en état de répondre aux odeurs. L’analyse de l’activité des neurones par imagerie sera réalisée au stade larvaire. C’est à partir de ce stade que le système olfactif commence à être fonctionnel. Nous exposerons des poissons juvénile et adulte à des stimuli odorants puis nous les euthanasierons par choc thermique avant de réaliser des analyses sur leurs cerveaux fixés.

Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées avant la fin du protocole. 135 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever les organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 90 d'entre elles et sévère pour 45. Chacune reçoit sept injections intrapéritonéales sous contention, subit une chirurgie de vingt minutes destinée à provoquer une thrombose, une mesure de flux au doppler carotidien, puis un prélèvement terminal dans la veine cave. Il s'agit de tester chez la souris un inhibiteur de l'héparanase-1 déjà évalué sur cellules endothéliales humaines, le porteur indiquant projeter ensuite d'étudier cette inhibition chez l'être humain.

Objectifs

Le syndrome des antiphospholipides est une thrombophilie acquise par des anticorps anti-phospholipides. Les manifestations cliniques associent des thromboses artérielles, veineuses et microcirculatoires ainsi que des complications obstétricales dont le traitement est symptomatique et repose actuellement exclusivement sur les antivitamines k . Les antivitamines K sont la première cause d’hospitalisation et de mortalité en France, de plus malgré ce traitement le taux de récidive reste de l’odre 16 %. Notre équipe a précédemment montré que les patients atteints de cette maladie avaient une dysfonction endothéliale, un stress oxydant accru et une altération du glycocalyx . Par ailleurs, nous avons montré que l’inhibition spécifique de l’héparanase-1 par SiRNA et par un inhibiteur pharmacologique permettait d’améliorer la dysfonction endothéliale induite par les anticorps antiphospholipides sur les cellules endothéliales humaines en cultures. Nous souhaitons montrer que l’inhibition pharmacolique de l’héparanase-1 permet de réduire l’état prothrombotique par l’admnistration de ce traitement à des souris C57/BL6J.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence le rôle de l'heparanase-1 dans l'induction d'une thrombose veineuse, artérielle et dans la dysfonction endothéliale artérielle mésentérique induit pas l'administration anticorps anti-phospholipides. Cela ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie pour lequel nous ne disposons actuelement que de traitements symptomatiques.

Procédures

Les animaux sont soumis à des injections intrapéritonéal d'une durée de quelque seconde avec une contention de l'animal vigile (7 fois par animal). Les Animaux auront subi des chirurgies pour induire une thrombose artérielle ou carotidienne cela sera sous anesthésie / Analgésie et d'une durée de 20 minutes (1 fois par animal et une chirurgie par animal). Etude du flux par dopplor carotiene durée 20 minutes sous anesthésie / Analgésie (une fois par animal). Prélèvement de sang par la veine cave en manipulation terminal sous anesthésie générale et analgésie durée 3 minutes (1 fois par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances principales sont principalement sont une injection quotidienne pendant 7 jours pour un groupe qui peut crée un stress chez l'animal . Les animaux de la procédure subiront une anesthésie gazeuse et une anesthésie par voie intrapéritonéale pour la chirugie de la ligature de la veine cave qui peut entraine une leger perte de poids chez l'animal . Une fatigue des animaux après ligature est observable sur une durée de 12h . La procédure chirugical de classe modérée pouvant occasionner une douleur modérée post-opératoire et une gêne au niveau des zones d'incision .Les animaux des trois procédure subiront une anesthésie par voie intrapéritonéale en phase terminal pour l'analyse de l'artere mesentérique en artériographie et prélèvements d’organes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issu de toutes les procédures pour récuperation des organes et analyse histologiques.

Remplacement

Nous travaillons dans le labortaoire sur des modèles in vitro de SAPL avec des cellules endothéliales en culture, ,nos avons déjà montré de facçon indirecte que l'inhibition de l'HPSE pouvait avoir un intérêt. Cependant l'étude de la thrombo formation implique l'interface entre les cellules endothéliales, les éléments figurés du sang, les composés de la cascade de la coagulation et le flux sanguin. Ces interactions ne peuvent pas être reproduite dans leur complexite in vitro à l'heure actuelle. Enfin nous projetons d'étudier l'inhibition de l'PHSE chez l'homme.

Réduction

Nous utiliserons un nombre minimal d'animaux, afin que l'étude sur différents plans (histologique et statistique) puisse se dérouler sans encombre et une analyse des résultats sera effectuée à mi-parcours, afin de déterminer si le nombre d’animaux est suffisant pour l'analyse statistique. La fonction endothéliale, la vitesse d’apparition du thrombus intra carotidien et le pourcentage de thrombose cave inférieure seront les critères de jugement principaux, alors que les paramètres biologiques et histologiques d’hémostases, d’inflammation, et d’activation endothéliale seront des critères de jugements secondaires. Sur la base des données historiques obtenues avec d’autres modèles murins , nous avons effectué une simulation pour chaque paramètre obtenu chez des animaux non traités .

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé . Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant le début du protocole. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé plusieurs fois par jour durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres du bien être animal (cf. : grille de points limites). Les souris perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés. En post- opératoire une injection de glucose à 5% en IP est réalisée en ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Un traitement analgésique en préopératoire et pré et post-opératoire, soit immédiatement après la chirurgie est réalisé suivi d'une injection toutes les 8h pendant 24h qui suivent l’opération. Nous allons dans ce projet utiliser des souris mâles, ce qui diminuera les variations et permettra une meilleure comparaison entre nos groupes.

Choix des espèces

Il est nécessaire d’utiliser la souris comme modèle expérimental pour la comparabilité des résultats avec études antérieurs, faites uniquement sur modèle murin. De plus le modèle de SAPL chez la souris est proche de la physiopathologie humaine et les protéines cibles de la pathologie étudiée ont une homologie de séquence à celle de l’homme ce qui implique que les anticorps humains sont capables de reproduire la pathologie chez la souris. Par ailleurs, le système cardio-vasculaire murin se rapproche de l'être humain. Nous allons utiliser des souris males adultes de 12 semaines (22/24g) comme précédemment publié dans notre laboratoire. L’âge de ces souris permet un actes de chirurgie plus optimal .

30 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, dans environ 600 études de 50 souris destinées à tester des candidats médicaments contre le cancer. Selon les études, elles reçoivent des tumeurs humaines ou murines par chirurgie ou par injection, et peuvent subir d'autres chirurgies jusqu'à 30 minutes, castration ou interventions sur le fémur, le foie ou le poumon, ainsi que des traitements par toutes les voies, des séances d'imagerie jusqu'à 45 minutes et des prises de sang. Certaines sont immunodéficientes, d'autres dotées d'un système immunitaire humain à partir de cellules de cordon ombilical ou de sang humain. Le porteur justifie leur mise à mort par l'implantation de tumeurs, sans rien dire du sort des souris sans tumeur prévues pour des études pilotes, de biodistribution et de toxicité. Il indique avoir fixé l'effectif d'après les études des années antérieures, en anticipant une croissance annuelle "en accord avec le plan commercial".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme), immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection) ou humanisées à l’aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux humains ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique (PBMC). Différentes stratégies d’implantations des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.

Procédures

Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Chirurgie avec implantation de fragments de tumeurs : moins de 5 minutes. Injection de cellules tumorales : moins de 5 minutes. Autres chirurgies (castration, fémur, foie, poumon, …) : entre 5 à 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par les injections, les chirurgies, le développement de tumeurs et des éventuelles métastases, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques injectés et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou des fragments de tumeurs dérivées de patients ou auront développé une tumeur. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 30128 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 600 études précliniques de 50 souris et 2 études précliniques de 64 souris chacune pour la castration des souris R26-p53PC. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction du type d’étude. Des études pilotes pourront être réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir un résultat interprétable.

Raffinement

En début d’étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En plus de ces conditions minimums légales, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées régulièrement à la présence humaine. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, de la perte de poids, et le cas échéant du volume tumoral ou de l’apparition d’une ulcération tumorale.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang. La castration pourra être réalisée à partir de 10 semaines d’âge.