Recherche fondamentale
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EU2/2 Évaluation de l’intérêt dans le diagnostic et le suivi thérapeutique d’anticorps radiomarqués dans des modèles murins tumoraux
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées dans la peau avec des cellules cancéreuses, puis anesthésiées pour recevoir des anticorps radiomarqués par voie intraveineuse, 1 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La prise de sang finale se fait dans le thorax, sur animal anesthésié et sans réveil, et les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et des troubles fonctionnels qui figurent parmi les points limites. Il s'agit de mesurer où se fixent des anticorps radioactifs dans l'organisme, pour développer un outil de diagnostic du mélanome par imagerie TEP. Le porteur annonce que tous les animaux seront tués à l'issue de chaque procédure, puis écrit quelques lignes plus loin que les souris saines seront conservées, si possible, pour d'autres manipulations.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic et le suivi de pathologies tumorales, telles que le mélanome. L’arrivée des nouveaux anticorps thérapeutiques sur le marché, tels que les inhibiteurs de checkpoint immunitaire (ICI), notamment les anti-PD-1 et anti-CTLA_4, nécessite de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer. En effet, les anticorps, de par leur spécificité, peuvent être utilisés en thérapie et en diagnostic ce qui en fait des candidats prometteurs pour la théragnostic. La variabilité de la réponse des patients à l’immunothérapie, malgré une analyse préalable de leur marqueur sanguin ou de leur biopsie, démontre la nécessité de développer ces outils théragnostiques. Nous proposons de développer et valider des radiotraceurs permettant un diagnostic précoce et un suivi de la réponse thérapeutique par imagerie nucléaire.Des études de biodistribution après administration intraveineuse seront réalisées sur les radiotraceurs d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques d’intérêt. Les études précliniques se dérouleront en 2 phases : études par imagerie de Tomographie par Emission de Positons (TEP) et études post-mortem sur les organes d’intérêt. Ces études seront réalisées avec l'aide des modèles de cancers pertinents. Face à l’hétérogénéité des cancers et des mécanismes immunitaires, il est nécessaire de travailler sur plusieurs modèles murins pour ce projet. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les études précliniques par imagerie TEP et par études post-mortem permettront d’étudier la biodistribution des anticorps thérapeutiques radiomarqués d’intérêt afin d'observer la distribution du traceur au sein de l'organisme et dans les sites antigéniques. Ainsi nous pourrons évaluer l’intérêt de l’utilisation des anticorps radiomarqués dans le diagnostic de pathologies tumorales, telles que le mélanome. Cette étude préclinique permettra de pouvoir évaluer par la suite nos anticorps radiomarqués chez l’homme afin de développer de nouveaux outils diagnostiques qui permettront d’identifier les biomarqueurs et ainsi, déterminer le meilleur traitement à employer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une induction des tumeurs par injection intradermique de cellules cancéreuses et à des injections intrapéritonéales de traitement, basé sur des anticorps. Quel que soit le modèle, l’administration du radiotraceur, sous anesthésie à l’isoflurane, par voie intraveineuse. Prélèvement sanguin transthoracique terminal réalisé sur l’animal anesthésié sans réveil. L’établissement des tumeurs avant immunoTEP sera réalisé dans l’EU1. Toutes les sessions d’ImmunoTEP seront réalisés dans l'EU2.
Impact sur les animaux
L’injection d’anticorps radiomarqués n’influera pas sur l’état de l’animal. Les quantités injectées d’anticorps sont à doses traceuses, c’est-à-dire inférieure à la dose nécessaire à un possible effet thérapeutique. Quant au radioélément, il n’influera pas sur l’état de santé de l’animal car les activités administrées restent faibles et il s’agit de radioéléments émetteurs béta+ à usage diagnostic. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les conditions d’hébergement seront optimisées par ajout d’enrichissement adapté pour assurer le bien-être des animaux. L’induction de modèles tumoraux peut entrainer une perte de poids de l’animal qui sera surveillée et qui fait partie des points limites. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal (points limites). Une observation visuelle quotidienne des animaux pour l’apparition des signes de douleurs sera faite par l’expérimentateur et le personnel animalier. Tout animal présentant des signes de souffrance ou de léthargie, décrit dans les points limites des procédures, sera exclu de l’étude et mis à mort.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu de chaque procédure. La procédure d’étude de biodistribution des anticorps radiomarqués permettra de sélectionner les temps pertinents pour l’étude post mortem. Le protocole sera optimisé afin coïncider l’euthanasie des animaux avec l’étude post mortem. Les animaux malades ne peuvent pas être gardés et l’euthanasie est nécessaire au vu des modèles de maladie induits. Pour les animaux sains, si cela est possible, ils seront conservés pour d’autres manipulations afin de réduire au maximum le nombre d’individus nécessaires.
Remplacement
Une étude préalable in vitro des anticorps radiomarqués a été préalablement effectué pour vérifier l’intérêt des anticorps avant l’injection chez l’animal. Il a été testé la stabilité in vitro, l’affinité et l’immunoréactivité des anticorps radiomarqués sur un modèle cellulaire adapté. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.
Réduction
Une étude complète de la littérature a été effectuée pour ne pas reproduire des expériences. Nous utiliserons des tests statistiques afin de valider nos résultats et limiter le nombre d’expériences. Par ailleurs, le suivi longitudinal des animaux sur 24 à 170h permis par l’imagerie non invasive TEP permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux impliqués dans l’études par comparaison avec la méthode plus classique de biodistribution ex vivo qui nécessiterait la mise à mort de lots d’animaux à chaque temps d’observation.
Raffinement
Nous porterons une attention particulière à la souffrance et au stress des animaux ainsi qu’à anticiper l’atteinte des points limites. Le suivi de l’état général des souris sera effectué quotidiennement par le porteur de projet et le personnel. Pour diminuer la souffrance liée au procédures expérimentales et au développement du cancer, un traitement analgésique en locale (lidocaïne). L’angoisse et la souffrance seront évaluées par des observations comportementales. Si un changement chez l’animal traduit un point limite, l’animal sera mis à mort, en accord avec le vétérinaire désigné. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool).
Choix des espèces
L’utilisation de modèles animaux de cancer est incontournable si nous voulons préciser les mécanismes sous- jacents à son développement. L’utilisation de modèles murins déjà établis dans la littérature et décris pour leur pertinence dans ce domaine de la recherche biomédicale est une étape nécessaire pour valider l’efficacité thérapeutique et la tolérance de nouvelles molécules ou thérapies candidates en clinique humaine. Les expériences seront réalisées sur des jeunes adultes (6-16 semaines). Avant le système immunitaire est immature et après il est affaibli, de plus la croissance tumorale n'est pas la même sur des souris jeunes adultes que sur des souris âgées.
BaThuGut : Étude de l’impact de la consommation chronique de Bacillus thuringiensis et des toxines qu’elle produit sur l’inflammation intestinale et le métabolisme en modèles murins.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Vérifier si un bio-insecticide épandu en agriculture déclenche une inflammation intestinale chronique chez un mammifère conduit à faire ingérer Bacillus thuringiensis et ses toxines à 420 souris pendant douze semaines. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune subit quatre prises de sang rapides, trois séries de prélèvements étalées sur deux heures, et un dernier prélèvement sous anesthésie. Aucun antidouleur ni anti-inflammatoire ne leur sera administré, le porteur indiquant que ces molécules fausseraient ses mesures, et la seule réponse prévue en cas de colite très sévère avec plus de 15 % de perte de poids reste la mise à mort.
Objectifs
Ces expérimentations ont pour objectif d’évaluer si l’ingestion à long-terme de bio-insecticides particuliers favorise le développement d’inflammation intestinale chronique et/ou de dérégulations métaboliques.
Bénéfices attendus
À cours termes, ce projet permettra de caractériser la sensibilité d’un organisme non-cible en particulier, la souris, à un produit et ses toxines contenues dans des produits utilisés en agriculture contre les insectes ravageurs. De plus, ce projet permettra également de faire avancer les connaissances sur les effets induits par la consommation chronique de produit sur la composition et les fonctions du microbiote intestinal, ainsi que l’induction de mécanismes inflammatoires.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements de sang par prélèvement sur animaux vigiles. Au total, les animaux subiront - 4 prélèvements uniques de sang pour une durée < 1 minute - 3 prélèvements multiples de sang sur une durée de 2h, chacun de ces prélèvements multiples seront séparés d’au moins une semaine Les animaux subiront un prélèvement unique de sang sous anesthésie en fin de protocole
Impact sur les animaux
Les phénotypes attendus sont l’apparition d’inflammation intestinale chronique chez certaines souris et de légères dérégulations métaboliques chez d’autres souris. Les agents bio-insecticides étudiés, via leurs effets sur le microbiote intestinal, pourront en effet favoriser la dysbiose intestinale de manière à promouvoir une inflammation intestinale chronique et/ou certaines dérégulations métaboliques légères. Ces nuisances attendues sont de sévérité modérée.
Devenir
A l’issue de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes nécessaires à des analyses approfondies dans le but de répondre aux objectifs du projet.
Remplacement
Des modèles in vitro de culture de microbiote intestinal (Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME), Mini BioReactor Array (MBRA)) ainsi que des modèles cellulaires permettant de mimer la barrière intestinale existent. Cependant le recours au modèle murin est indispensable dans le cadre de ce projet afin de comprendre les interactions hôte / microbiote et notamment intestin/microbiote en présence de biopesticides chez les individus non-cibles tels que les mammifères, en santé et en pathologie.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux suffisant pour assurer la reproductibilité de l’expérience et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions sera inclus dans chaque groupe. Des études précédentes ont montré que dans le même type de procédure, l’utilisation de 25 souris par condition et par sexe devait être utilisé afin d’atteindre des résultats interprétables et garantir l’utilisation de tests statistiques appropriés. Les effets attendus concernant une ingestion chronique de produit sont en effet modestes.
Raffinement
Dans un souci de raffinement, un suivi quotidien des animaux et des points limites précoces et adaptés seront mis en place tout au long des expérimentations. De plus, toutes les cages seront enrichies en cocoon afin de favoriser le bien-être animal. En se basant sur notre utilisation passée de ce modèle, une possible légère inflammation intestinale chronique est attendue, mais n’engendrant pas de douleur sévère. Aucune molécule antidouleur ou anti-inflammatoire ne pourra être utilisée car notre projet se concentre sur l’étude de l’inflammation et l’utilisation d’analgésique impacterait les mesures réalisées. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place, avec la mise à mort par dislocation cervicale, seule alternative au cas où un point limite serrait atteint. La seule anesthésie réalisée sera gazeuse. En cas de perte de poids de plus de 10%, de la nourriture humidifiée sera placée dans une coupelle au sein même de la cage afin d’éviter toute malnutrition due à un accès restreint à la nourriture. L’apparition et la sévérité de la colite sera également largement surveillée, en cas de colite très sévère accompagnée d’une perte de poids de plus de 15%, les animaux seront placés en procédure terminale immédiate.
Choix des espèces
L’exploration de l’interaction du système immunitaire avec le microbiote nécessite un modèle flexible qui permette de manipuler chacun de ces domaines, de tester les causalités et de mesurer les paramètres moléculaires et cellulaires. En ce sens, le modèle souris est le plus adapté, car les outils permettant de manipuler et d’analyser le système immunitaire chez la souris sont les mieux développés parmi les mammifères. De plus, les connaissances acquises chez la souris permettent un transfert chez l’homme, du moins conceptuellement, et bien souvent en l’état. Les souris utilisées seront âgées de 4-8 semaines (après sevrage) lors du démarrage des procédures. Le microbiote intestinal se met en place dès les périodes précoces de la vie, et il est nécessaire pour nous d’utiliser des animaux relativement jeunes afin d’étudier les facteurs environnementaux impactant la mise en place du microbiote. Les traitements seront de 12 semaines afin de tester l’impact de la présence des toxines de Bacillus thuringiensis et auront donc, jusqu’à 20 semaines lors du passage en procédure terminale.
Etude de la neurogenèse embryonnaire dans le cortex cérébral sur des souris gestantes génétiquement modifiées impliquant une injection d’EdU
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
Une injection unique de marqueur dans l'abdomen, puis l'anesthésie et la mise à mort pour prélever les embryons : 45 souris gestantes génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des nouveau-nés sont également tués quatre jours après leur naissance pour analyse histologique du cortex, et chaque future femelle reproductrice subit une biopsie de queue entre le septième et le dixième jour de vie pour génotypage. L'objet du travail est de préciser le rôle d'un gène dans la production des neurones du cortex embryonnaire, sur deux années de prolongation d'un projet arrivé à échéance. Le gène en question n'est jamais nommé, et les 45 femelles forment le seul effectif annoncé, les embryons et les souriceaux tués n'étant comptés nulle part.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre le rôle d'un gène dans le contrôle de la neurogenèse dans le cortex cérébral chez l’embryon. Le développement du cortex est un processus complexe encore très mal compris dont les dérèglements sont à l’origine de pathologies graves chez l’humain (épilepsie, retards mentaux, troubles comportementaux et cognitifs). Il implique de nombreux partenaires moléculaires dont beaucoup restent à découvrir. Nous disposons d’un modèle de souris génétiquement modifiée dans lequel notre gène d’intérêt est inactivé spécifiquement dans les cellules à l’origine des neurones du système nerveux central. Des résultats préliminaires nous ont montré que l’inactivation de ce gène modifiait le nombre de neurones produits dans le cortex de l’embryon à des stades précoces. Afin de préciser ces défauts de neurogenèse, nous souhaitons pouvoir analyser les conséquences de l’inactivation de ce gène à plus long terme, à différents stades embryonnaires et après la naissance, sur l’organisation anatomique du cortex cérébral et le nombre de neurones générés. Pour cela nous effectuerons une injection intrapéritonéale unique à des souris génétiquement modifiées gestantes à un stade donné d’une solution d’une molécule qui permet de repérer les neurones en cours de génération. Un à sept jours embryonnaires plus tard, la mère gestante sera anesthésiée et euthanasiée selon les procédures réglementaires pour prélever les embryons pour des analyses histologiques. Des nouveaux-nés seront aussi euthanasiés 4 jours après leur naissance pour des analyses histologiques. La présente DAP est une demande de prolongation de 2 ans d'une DAP arrivant à échéance fin 2024.
Bénéfices attendus
La prolongation de ce projet permettra de finaliser l'étude visant à comprendre le rôle de notre gène d'intérêt dans le développement du cortex cérébral. Chez l'homme, des formes mutées de ce gène conduisent à plusieurs pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, dépression et schizophrénie) chez l'adulte et des retards mentaux chez l'enfant. Cette étude permettra de proposer de nouvelles hypothèses sur les processus physiopathologies générés par ces mutations.
Procédures
Les 45 femelles gestantes vigiles sont soumises à une seule injection intrapéritonéale durant 2 secondes d'un composé de marquage non douloureux. Elles sont anesthésiées avant euthanasie. Chaque animal voué à devenir une femelle transgénique gestante fait par ailleurs l’objet d’une biopsie de queue entre J+7 et J+10 pour génotypage.
Impact sur les animaux
La présente demande est de classe légère. L’injection intrapéritonéale du composé en solution physiologique provoque une douleur légère et de courte durée. Le produit injecté n’a pas de conséquence délétère sur la santé de la mère et des embryons ou jeunes souriceaux. Le phénotype des embryons et des jeunes souriceaux génétiquement modifiés « mutants » n’est pas dommageable. Le phénotype des individus génétiquement modifiés contrôles n’est pas dommageable. Cette étude nécessite le maintien d’une lignée transgénique pour générer les parents impliqués dans l’étude. Le phénotype des parents n’est pas dommageable.
Devenir
Les souris gestantes ayant subi l'injection intrapéritonéale du composé de marquage, seront anesthésiées et euthanasiées pour le prélèvement des embryons. Elles ne peuvent être réintroduites en animalerie, ni réutilisée du fait de la présence du composé de marquage dans les tissus. Les embryons et nouveaux-nés sont euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Le cortex cérébral étant caractéristique des mammifères et les protocoles de culture in vitro ne permettant pas de reconstruire un cortex typique, nous sommes contraints de travailler sur des souris à différents stades embryonnaires et post-natals. Compte-tenu des similitudes entre les processus de développement du cortex chez les primates et la souris, le modèle souris permettra d'obtenir des résultats vraisemblablement utiles à la connaissance des processus humains.
Réduction
Pour limiter le nombre de souris gestantes, tous les individus de la portée qu’ils soient mutés ou non mutés seront utilisés pour les analyses, les animaux non mutés servant de contrôles. De plus, nous combinerons plusieurs types de marquages histologiques sur les mêmes individus. Nous prélèverons et archiverons un maximum de tissus à partir d’un même individu, et ce, en prévision de futures expériences.
Raffinement
Pour raffiner les conditions d’utilisation des animaux, les souris gestantes sont élevées dans un environnement enrichi. Préalablement à l’injection, les souris gestantes seront habituées à une contention manuelle. L’injection sera effectuée en respectant la stérilité et les volumes autorisés. Une surveillance journalière des souris gestantes sera effectuée pour vérifier le non dépassement des points limites adaptés et précoces jugés à travers le comportement, l’absence de souffrance, d’hémorragie ou d’infections.
Choix des espèces
Le cortex cérébral étant une structure très complexe, il n’est pas possible de le reconstruire en culture in vitro pour l’étudier. De plus, le cortex cérébral est une structure typique des mammifères. Le recours à des souris est donc nécessaire. De plus, l’invalidation d’un gène est nécessaire pour en comprendre le rôle chez le modèle souris. Nous avons choisi une stratégie invalidant de manière conditionnelle notre gène d’intérêt de manière restreinte dans le système nerveux central pour éviter une atteinte d’autres organes et ainsi avoir un phénotype le moins dommageable possible.
Etude des mécanismes responsables du syndrome cardiorénal chez des modèles rongeurs
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Rats : 500
Un rein retiré par chirurgie, un second passage sur la table dix jours plus tard, une échocardiographie sous anesthésie, vingt-quatre heures seul en cage à métabolisme, cinq mesures de pression artérielle sur cinq jours consécutifs, un électrocardiogramme, une prise de sang après un mois d'insuffisance rénale : 500 rats et 540 souris vont subir cet enchaînement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La maladie rénale ainsi provoquée entraîne perte de poids, perte d'appétit et augmentation de la diurèse, auxquelles s'ajoute un régime alimentaire spécial qui peut modifier la mobilité et le comportement. Le projet cherche des cibles thérapeutiques contre le syndrome cardiorénal, en partant de l'hypothèse que l'inflammation y joue un rôle central. Tous sont tués en fin de procédure, le porteur jugeant "obligatoires" les analyses de sang et d'organes prélevés.
Objectifs
Les comorbidités cardiovasculaires de l’insuffisance rénale chronique , ce qu’on appelle le syndrome cardiorénal, sont dramatiques et impactent la survie des patients. La prévalence de l’insuffisance rénale chronique en Europe est pres de dix pour cent. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre rein et coeur par exemple ou rein et microbiote, mais également d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’inflammation (infiltration de monocytes et macrophages, augmentation de l’expression de molécules pro-inflammatoires) joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l’aldostérone. La modulation de l’inflammation dans les organes affectés (rein, cœur) peut également jouer un rôle critique dans l'instauration et/ou le maintien du remodelage rénal et cardiaque. Les anomalies du microbiote intestinal associées à l’insuffisance rénale chronique peuvent contribuer à ces altérations. Les objectifs du projet sont de comprendre les mécanismes et éventuelles nouvelles cibles thérapeutiques du syndrome cardiorenal. Notre hypothèse est que l’inflammation joue un rôle central dans le syndrome cardiorénal, soit directement au niveau de l’organe cible, soit indirectement en affectant le microbiote intestinal.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de comprendre les conditions et mécanismes par lesquels un récepteur hormonal et sa cible aval sont impliqués dans le syndrome cardiorénal présent lors d’une insuffisance rénale chronique dont la prévalence en Europe est d’environ dix pour cent. Pour cela, l’efficacité des antagonistes de ce récepteur hormonal et de sa cible aval seront étudiés ainsi que le rôle de la dysbiose induite par l’insuffisance rénale chronique dans ce processus. Le rôle des cellules intestinales (épithéliales, cellules musculaires lisses) ou inflammatoires/macrophages dans ces processus seront identifiés. Ces résultats permettront de proposer des alternatives diagnostiques et thérapeutiques aux patients souffrant de syndrome cardiorénal
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Pour induire une insuffisance rénale chronique, l’ablation d’un rein est réalisée par chirurgie sous anesthésie et avec une prise en charge analgésique avant/pendant et après l’opération (20 min, 2 fois à 10 jours d’intervalle). L exploration de la maladie cardiaque comporte une échocardiographie sous anesthésie gazeuse (15 min, 1 fois). Pour recueil des urines (une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Un électrocardiograme (une fois, durée 15 min) est réalisé (animal vigile). Des prélèvements sanguins sont effectués une fois après 1 mois d'insuffisance rénale chronique (1 minute) chez l’animal vigile. L’euthanasie est réalisée en fin de période expérimentale après analgésie et anesthésie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (chirurgie rénale, échocardiographie) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de la maladie rénale chronique (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial peut entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle ou l’installation des gilets pour l’électrocardiograme 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, cytokine, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris et le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde et de la signalisation sous-jacente dans le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
1040 animaux (500 rats et 540 souris) seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft et batonnet en bois. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. Lors des anesthésies, la température interne est suivie et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. La douleur post-opératoire sera prise en charge par une analgésie et des croquettes hydratées seront déposées au fond de la cage pour faciliter l’alimentation. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, les analyses cardiovasculaires seront réalisées sous anesthésie afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis.
Choix des espèces
Les espèces rat et souris ont été choisies car ce sont des modèles établis pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons de deux modèles de rats génétiquement modifiés permettant de surexprimer le récepteur minéralocorticoïde (RM) dans ses territoires naturels d‘expression (rat) et d’inactiver l’expression d'un gène d'intérêt, ainsi que de modèles souris génétiquement modifiées permettant de moduler l’expression du RM de façon conditionnelle uniquement dans les types cellulaires d’intérêt. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Évaluation de l’effet anti-inflammatoire de métabolites produits par le microbiote intestinal dans un modèle pré-clinique de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Aucun antalgique ne sera donné aux souris rendues colitiques, le porteur indiquant que ces molécules interféreraient avec l'inflammation qu'il étudie. 932 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va du léger au sévère. 464 d'entre elles reçoivent pendant une ou deux périodes de sept jours une eau de boisson additionnée de dextran sulfate de sodium, qui déclenche la colite avec ses douleurs et sa perte de poids, 388 sont gavées quotidiennement avec des bactéries, et toutes sont pesées chaque jour, une contention manuelle venant au besoin stimuler l'émission de fèces. L'enjeu affiché reste la "preuve de concept" de métabolites bactériens anti-inflammatoires, qui justifierait plus tard des essais cliniques chez l'humain.
Objectifs
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin se caractérisent par des inflammations fortes et répétées au niveau intestinal. La répétition de ces épisodes d'inflammation conduit à des complications telles que des des diarrhées, des saignements, des douleurs abdominales, une perte de poids et d’autres symptômes sévères. Ces symptômes diminuent de façon très significative la qualité de vie des patients. Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin constituent un enjeu majeur de santé publique dans de nombreux pays. Il n’existe pas, actuellement, de traitement permettant de soigner définitivement ces maladies. Différents traitements médicaux sont utilisés pour traiter les patients mais, malheureusement, un certain nombre de patients ne répondent pas à ces traitements. Il existe donc une forte demande pour trouver de nouveaux médicaments contre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Certaines molécules, produites par des bactéries vivant dans le tube digestif, possèdent des propriétés anti-inflammatoires. Les objectifs de ce projet de recherche sont d’évaluer l’effet de ces molécules sur l’inflammation intestinale chez la souris. Pour cela, l’effet de l’ajout de ces molécules dans l’eau de boisson des animaux, ou l’effet de l'administration de bactéries productrices de ces molécules sur l’inflammation sera évalué. Les résultats obtenus par ce projet constitueront des données essentielles pour valider et poursuivre le développement de nouveaux médicaments basés sur ces molécules.
Bénéfices attendus
L’ensemble des procédures expérimentales présentées dans ce projet permettront de déterminer si les métabolites peuvent constituer des outils thérapeutiques innovants dans le traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. Le potentiel anti-inflammatoire de diverses espèces bactériennes sera déterminé. Elles pourront constituer des probiotiques d’intérêt dans le traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin. L’ensemble des données précliniques obtenues dans ce projet seront essentielles pour valider la « preuve de concept » de l’utilisation de ces métabolites et pour justifier d’initier des essais cliniques chez l’Homme basés sur ces molécules.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront hébergés dans des cages et bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Une période d’habituation de 3 jours à la manipulation/contention par les expérimentateurs (une fois par jour), sera réalisée avant le début des expérimentations. Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront pesés (animaux vigiles) une fois par jour sur une période de 10 à 15 jours. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. Une partie des animaux (388 souris) seront gavés oralement avec des bactéries, une fois par jour pendant 5 à 15 jours consécutifs. 832 souris recevront un gavage oral de dextran couplé à de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC-dextran) le dernier jour du protocole. Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. Il y aura un délai de 4 heures entre l’administration de l’isothiocyanate de fluorescéine et la mise à mort. Tous les animaux de ce projet (932 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques. Une partie des animaux (464 animaux) auront accès uniquement à de l’eau de boisson supplémentée en Dextran Sulfate Sodium, qui génère les symptômes attendus de la colite, sur une ou deux périodes de 7 jours. Pour chaque souris (932 souris), une collecte de fèces sera réalisée une fois par jour sur une période de 10 à 15 jours, lors de la pesée. Si aucune fèces n’est récupérée, une contention manuelle de quelques secondes sera réalisée afin de stimuler l’émission de fèces.
Impact sur les animaux
- Des administrations par gavage seront réalisées au cours de ce projet. La réalisation de ces gavages oral (et la prise des animaux en contention) peut engendrer un stress de quelques secondes (nuisance légère). - L’induction de la colite peut être associée à une perte de poids et à des douleurs chez les animaux. Ces effets indésirables surviennent après environ 3 jours de traitement au Dextran Sulfate Sodium et peuvent durer jusqu’à la fin du traitement au Dextran Sulfate Sodium soit une durée totale d’environ 7 jours (nuisance sévère).
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Ce projet de recherche vise à étudier les interactions entre le microbiote intestinal, l’épithélium intestinal et le système immunitaire dans un modèle de colite sévère. Ce projet se focalise donc sur une réponse intégrée de l’organisme faisant appel à plusieurs grands systèmes, et ne pouvant être modélisée par des procédures moléculaires et cellulaires simples. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs facteurs ont été combinés. L’utilisation d’une lignée de souris congénique, présentant une faible variation génétique, permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. L’effectif de chaque groupe a été limité au maximum de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats. Un maximum de tissus sera collecté après la mise à mort des animaux et stocké de façon à maximiser les données obtenues et permettre de réaliser des analyses complémentaires ultérieurement, sans avoir à renouveler les expérimentations chez l’animal.
Raffinement
Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. Une période d’habituation à la manipulation de 3 jours sera réalisée à la suite de la période d’acclimatation. Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Une grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal sera utilisée. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule Structure chargée du Bien Etre des Animaux. Un suivi quotidien de la consommation hydrique sera réalisé pour prévenir une éventuelle déshydratation des animaux. Une augmentation de la quantité de matériaux de nidification sera réalisée. L'usage est de ne pas utiliser d’antalgiques pour limiter la douleur des animaux avec colite en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire qui est l'élément central étudié dans ce projet.
Choix des espèces
Les souris sont très régulièrement utilisées dans la littérature pour l'étude des mécanismes pathologiques associés aux colites aigües ou chroniques. Il est donc pertinent d'utiliser cette espèce dans ce projet de recherche centré sur l'inflammation intestinale. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées (stade jeune adulte).En effet, ce stade correspond à la période d'apparition des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin chez l'homme.
Etude de l’effet d’une infection bactérienne sur une voie de l’immunité innée chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une sonde de température est implantée sous la peau de chaque souris, qui reçoit ensuite dans la veine de la queue une injection de bactéries pathogènes. 176 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les quatorze jours d'infection sont résumés à une "variation de température", alors que le raffinement prévoit d'administrer des analgésiques en cas de baisse trop forte de la température corporelle. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur donnant pour seule raison qu'elles auront été infectées par des bactéries pathogènes.
Objectifs
La pyrine est un composant de l'immunité. La pyrine est activée lors de certaines infections bactériennes et déclenche une réaction inflammatoire (variation de température) qui permet de lutter contre ces infections. A ce jour, les mécanismes d'activation et de régulation de la pyrine lors d'infections est peu compris. Le but de ce projet est de mieux décrire les mécanismes d'activation et de régulation de pyrine lors d'infections bactériennes dans un modèle murin.
Bénéfices attendus
Nous attendons des bénéfices scientifiques de ce projet : progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de pyrine et sur l’utilisation d’un modèle murin pour modéliser l’activation de pyrine lors d’une infection. L'inflammasome pyrine étant associé à des maladies génétiques chez l'homme (la fièvre méditerranéenne familiale entre autres), l'utilisation d'un modèle murin humanisé pourra nous permettre de développer de nouveaux traitements pour ces maladies génétiques.
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse qui durera 30secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée qui durera 30 secondes d'une sonde de température, certains animaux pourront recevoir une injection sous cutanée de qui durera 30secondes d'analgésique.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles, mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Pendant les 14 jours d’infection, les souris pourront ressentir les effets de l’infection (variation de température).
Devenir
Les animaux auront été infectés par des bactéries pathogènes, ils seront donc euthanasiés
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaire déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. Les modèles in vitro étudient la réplication de bactéries dans un seul type cellulaire dans un contexte non-inflammatoire et ne peuvent pas mimer la complexité des interactions hôtes-pathogènes rencontrées lors d’une infection.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Nous prévoyons 5 animaux par lot de génotype et de souche d’infection, 3 animaux par lot contrôle pour les analyses post-mortem. Les nombres d’animaux sont calculés au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Utilisation d’implants pour prendre la température (la pose de l’implant est plus invasive mais cela permettra de rendre les prises de température moins intrusive) 3) Anesthésie gazeuse lors de la pose de l'implant de température 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) L'utilisation d'analgésiques en cas de trop forte baisse de température corporelle des animaux suite à l'infection. Les points limites sont définis spécifiquement pour le projet afin de limiter au maximum la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées humanisées, KO (délétion de gènes) et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Par ailleurs, les animaux portant un gène humanisé nous permettront de savoir si les réponses observées in vitro sont transposable à l’échelle de l’organisme. Les expériences débuteront à l’âge de 6 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature.
Circuits à deux cellules stroma-macrophage
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Six mois d'antibactérien dans l'eau de boisson pour les souris mises à la reproduction, et de la conception jusqu'à six semaines d'âge pour leur descendance : 945 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit sous anesthésie une injection de cellules tumorales, et la tumeur est laissée croître jusqu'à 12 mm avant la mise à mort, avec un risque d'ulcération que le porteur reconnaît douloureux. Toutes finissent tuées pour le prélèvement d'organes ou de tumeurs, les reproducteurs étant retirés de l'élevage à six mois d'âge pour une "raison éthique" invoquée sans autre précision. L'ensemble sert à cartographier les niches de macrophages dans les tissus, et le porteur indique que le projet repose exclusivement sur des souris génétiquement modifiées.
Objectifs
Cellules immunitaires vitales présentes dans tout le corps, les macrophages contribuent à la santé et au fonctionnement de nos tissus. Leur absence entraîne des changements biologiques significatifs, soulignant leur importance. Les macrophages remplissent divers rôles dans différents organes, de la promotion de la croissance des neurones dans le cerveau à la régulation du développement osseux. Ils sont également impliqués dans différentes pathologies telles que le cancer. Ils peuvent donc être considérés comme des régulateurs fonctionnels de nombreux processus clé de notre organisme. Malgré leur importance, nous ne savons que peu de choses sur la façon dont ces régulateurs biologiques sont eux-mêmes régulés. Le concept de « niche des macrophages » suggère qu'un environnement local spécifique appelé « niche » régule le développement, l’instruction et le comportement de ces cellules immunitaires. Les cellules de soutien dites « stromales », connues pour agir comme des niches pour les cellules immunitaires dans les organes lymphoïdes, jouent probablement un rôle similaire dans le soutien des macrophages dans divers tissus. Ce projet de recherche propose d’étudier les relations complexes existant entre les cellules immunitaires et leurs environnements, offrant ainsi des perspectives sur leurs échanges qui assurent l'harmonie et la stabilité des tissus, et sur les traitements potentiels pour les maladies impliquant une dysfonction des macrophages (des maladies infectieuses au cancer). Il vise à accomplir deux objectifs cruciaux : (1) construire un atlas complet détaillant la distribution des niches de macrophages à travers différents tissus, (2) élucider les mécanismes moléculaires régissant la communication réciproque entre les cellules niches et les macrophages.
Bénéfices attendus
Les macrophages jouent un rôle vital dans le maintien de l'équilibre physiologique et la réparation des tissus. Cependant, dans de nombreux contextes pathologiques tels que cancers et maladies infectieuses, la diversité des macrophages et leur capacité d'adaptation peuvent avoir des effets bénéfiques et/ou néfastes. Par exemple, une présence accrue de macrophages dans les tumeurs est souvent associée à des résultats défavorables dans différents types de cancer. Étant donné les rôles doubles des macrophages dans divers tissus, les approches thérapeutiques efficaces devraient idéalement cibler les macrophages "défavorables" tout en préservant les "bénéfiques". Pour y parvenir, il est nécessaire de manipuler individuellement les différents sous-ensembles de macrophages in vivo. Ce projet vise à cibler les macrophages via la manipulation de l'environnement nutritif qui les entoure pour à terme en comprendre leurs fonctions. Cette approche innovante permettra non seulement de révéler de nouvelles fonctions de ces cellules immunitairess, mais aussi d’infirmer ou confirmer les rôles qui leur ont été précédemment attribués. Elle nous permettra également d'identifier les niches des macrophages à travers les tissus, d'explorer la réponse fonctionnelle fournie par les macrophages à leurs niches, et de découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents. En résumé, ce projet éclairera de nouveaux aspects des fonctions des macrophages tout en fournissant un niveau de détail sans précédent de la compréhension du concept de la niche de ces cellules immunitaires. Les résultats de notre recherche pourraient servir de cadre pour comprendre les rôles polyvalents des macrophages, guidant ainsi potentiellement les stratégies thérapeutiques futures pour diverses maladies où ils sont impliqués.
Procédures
Notre demande de projet comporte 2 types d’interventions : nos animaux recevront soit un antibactérien à large spectre, soit une injection en sous-cutanée de cellules tumorales. Les animaux vigiles recevront un antibactérien à large spectre administré dans l'eau de boisson : depuis la saillie jusqu'à la fin de l'accouplement pour les animaux en accouplement soit durant 6 mois ; de la conception (embryon) jusqu'à l'âge adulte pour les individus issus de ces accouplements soit durant 6 semaines. Les animaux anesthésiés recevront une injection de cellules tumorales en sous cutanée, et seront mis à mort dès que la tumeur atteindra la taille de 12mm (longueur ou largeur) soit avant la semaine 4 post-injection tumorale.
Impact sur les animaux
Les systèmes de régulation dépendants d’antibactériens sont couramment utilisés chez les souris génétiquement modifiées depuis le milieu des années 1990, et cette procédure ne devrait engendrer aucune douleur, souffrance ou angoisse. La pousse de la tumeur peut induire une perte de poids, et interférer avec les besoins / comportements normaux de la souris. La tumeur peut évoluer en ulcération et causer une souffrance à l’animal.
Devenir
Les animaux de nos groupes d'étude seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem de multiples organes. Les animaux reproducteurs seront gardés en vie jusqu'à l'âge limite de mise en reproduction (= 6 mois d'âge) pour raison éthique. Les animaux seront mis à mort pour prélèvement post-mortem de tumeur.
Remplacement
La complexité et la dynamique des interactions entre les macrophages et leur microenvironnement ne peuvent être étudiées efficacement à l'aide de modèles in vitro : les macrophages présentent en effet une plasticité remarquable, et peuvent modifier leur physiologie en réponse à des stimuli environnementaux. Pour obtenir une compréhension de leurs fonctions ils doivent donc être considérés dans leur environnement et, à ce titre, seuls les modèles in vivo permettront de décrypter les contacts cellulaires authentiques sous-jacents aux interactions macrophage-niche. Enfin, les modèles expérimentaux permettant de répondre aux questions posées reposent exclusivement sur l'utilisation de souris génétiquement modifiées.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés et de garantir des résultats exploitables, le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé à l’aide d’un logiciel statistique. Des tests statistiques appropriés seront utilisés pour les analyses des données.
Raffinement
Le statut EOPS (= Exempt d'Organisme Pathogène Spécifique) de notre animalerie permet de minimiser les variabilités dues aux infections. Les animaux utilisés dans cette étude sont traités conformément aux règles éthiques édictées par la directive 2010/63/UE, ainsi que par le décret n°2013-118 et ses 5 arrêtés : - Les cages utilisées dans les zones d’hébergement ont une surface de 530 cm2. Il est possible d'y héberger 5 souris adultes d'un poids >= à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Les souris sont donc élevées en groupes sociaux afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et de limiter l’agressivité. - Les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi : du matériel de nidification ainsi que des dômes seront introduits dans chaque cage pour confectionner des nids. - Les animaleries bénéficient d'une température régulée, d'un taux d'humidité dans l'air contrôlé, ainsi que d'une exposition à la lumière contrôlée. - Les animaleries sont calmes. Les animaux seront examinés quotidiennement afin de vérifier l’apparition éventuelle de douleur/souffrance. Tout au long de la vie de l’animal, nous mettrons en place des points limites prédictifs et adaptés à chaque procédure afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress. Bien que nous ne nous attendions pas à des nuisances liées au traitement ou à l’arrêt du traitement antibactérien, nous effectuerons des surveillances quotidiennes pendant la première semaine de traitement et la première semaine d’arrêt du traitement afin de garantir le bien-être de nos animaux. Si l’ajout d’antibactérien dans l’eau de boisson impacte la quantité d’eau bue par les souris, nous rajouterons du sucrose pour augmenter son appétence. Si l’ajout / l’arrêt du traitement antibactérien ou la pousse de tumeur entraine une perte de poids, les animaux recevrons de la nourriture sous forme de gelée. Si une posture anormale ou une blessure est détectée l'animal sera isolé, et un médicament pour soulager la douleur sera mélangé à du nutella et ajouté dans la cage pendant 5 jours maximum. Sans amélioration de la condition de l’animal pour l’ensemble des points limites décrits, celui sera mis à mort par inhalation progressive de CO2.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés et ce projet est entièrement basé sur l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les souris mises en accouplement recevront un traitement antibactérien de la saillie jusqu’au retrait de la mise en reproduction (6 mois d’âge). Les souris issues des accouplements recevront un traitement antibactérien de la gestation à 6 semaines d’âge. Elles seront euthanasiées et prélevées à partir de 10 semaines d’âge puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement. Des animaux âgés de 6 semaines seront utilisés, puisque nous nous intéressons au rôle des macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.
Deuxième évaluation de l’effet d’un probiotique chez le chien adulte sain
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Faire reconnaître une souche bactérienne comme additif alimentaire pour chiens conduit ici à utiliser 16 chiens adultes de 4 ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous remis ensuite à disposition pour d'autres études après accord du vétérinaire. Ils subissent quatre prises de sang réparties sur treize semaines et sont placés seuls en box de 4 m2 quatre fois six jours, avec deux sorties de quinze minutes par paires. Le porteur décrit cet hébergement comme une individualisation sans isolement, les contacts visuels, sonores et olfactifs restant maintenus. Le remplacement est écarté d'une phrase, le chien étant l'espèce cible, et l'enjeu final reste l'évaluation du dossier d'efficacité par l'autorité européenne de sécurité des aliments.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d'évaluer l'efficacité d'une souche bactérienne sur la digestibilité des protéines et des lipides chez le chien sain et l'impact sur le microbiote canin : démontrer le rôle en tant qu'agent améliorant la digestibilité et éventuel régulateur de l'immunité.
Bénéfices attendus
A l'instar des études en cours sur le microbiote humain (étude du French Gut) l'évaluation du microbiote chez les carnivores domestiques présente un intérêt croissant. Pouvoir limiter l'inflammation intestinale en agissant sur la composition du microbiote est une piste d'intérêt. Cette étude permettra de vérifier l'aspect anti-inflammatoire potentiel de cette souche bactérienne. L'évaluation du dossier d'efficacité par l'autorité européenne de sécurité des aliments permettra à cette souche d'être éventuellement reconnue comme agent améliorant le bien-être chez le chien.
Procédures
Les animaux vigiles auront 4 prises de sang (intervention de moins de 10 minutes chacune) réparties sur 13 semaines et ils seront isolés 4 fois une semaine avec un intervalle entre ces périodes de 4 semaines, 2 semaines puis à nouveau 4 semaines en boxes collectifs.
Impact sur les animaux
Les prises de sang constituent une nuisance attendue à cause du stress éventuel de la contention mais les animaux sont habitués à cette procédure ce qui permet la réalisation de celles-ci dans les meilleures conditions de rapidité et de bien-être de l'animal. Le prélèvement sanguin est, lui, considéré comme une procédure légère constituée d'une piqûre unique et rapide ne justifiant pas l’administration d'analgésiques. Cependant, afin de préserver le bien-être des animaux, tout prélèvement sera interrompu si l’animal montre un quelconque signe de détresse. Les animaux seront individualisés, mais non isolés, 4 fois 6 jours (7 maximum) dans des boxes de 4 m2. Les contacts visuels, sonores et olfactifs seront pleinement maintenus avec leurs congénères. Tous les chiens bénéficieront durant les périodes d'individualisation de deux périodes de "récréation" par groupe de deux animaux dans un box de 20 m2. Cette sortie de 15 min sera contrôlée et suivie par le responsable de l'étude. Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement et de près afin de mettre en évidence rapidement tout signe éventuel de détresse.
Devenir
Tous les animaux pourront être réutilisés et inclus dans une nouvelle étude après acceptation de la demande et accord du vétérinaire référent.
Remplacement
Aucun remplacement n'est envisageable dans la mesure où le chien est l'espèce cible de cet additif alimentaire.
Réduction
La taille des groupes proposée est celle minimale basée sur notre expérience, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et d’assurer la robustesse des analyses statistiques (T-test apparié sous l'hypothèse de normalité vérifiée ou test de Wilcoxon). L'étude en cross-over et le fait que chaque animal soit son propre témoin permet d'apporter de la puissance à cette étude.
Raffinement
Cette étude ne limite pas les sorties des animaux en laisse dans les cours extérieures afin de maintenir le processus de sociabilisation. Ils peuvent de plus continuer à vivre en groupe (3 à 4 chiens dans un box de 18 m2 avec présence de niches et de jeux type kong ou ballon) en période d'absence de collecte de selles. Ils ont accès à l’eau à volonté. Ils sont amenés, en laisse, de leur box jusqu’à la salle de prélèvement se trouvant dans le même bâtiment. Un accompagnement par la voix est réalisé lors de la prise de sang. Des caresses sont prodiguées à l'animal à la fin de l'acte. Un suivi quotidien du comportement des chiens est réalisé afin de mettre en place, si besoin était, des mesures adéquates (changement de place dans le chenil, apport de nouveaux jeux dans les boxes) pour maintenir un bien-être optimal à ces animaux durant toute l'étude.
Choix des espèces
Le chien est l'espèce cible de la souche testée. Les animaux sont des chiens adultes de 4 ans en bonne santé, n'ayant pas reçu de traitement antibiotique ou tout autre traitement pouvant modifier le microbiote, depuis au moins 3 mois. L'utilisation de probiotiques peut s'avérer necessaire chez un chien adulte à tous les âges. Nous considérons que des chiens de 4 ans sont un bon modèle pour représenter au mieux la population de chiens adultes de 2 à 7 ans.
Etude du métabolisme d’un acide aminé, le tryptophane, par microdialyse cérébrale dans un modèle de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Infectées par gavage avec un milliard de bactéries, puis trépanées pour recevoir un guide de microdialyse cimenté dans le crâne, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Chacune est manipulée 46 fois sur quatre mois, en plus des pesées quotidiennes, et subit deux fois par semaine pendant trois mois une perfusion cérébrale de deux heures, éveillée. L'objectif déclaré consiste à relier un dérèglement du métabolisme du tryptophane à l'hypersensibilité colique et aux troubles anxieux du syndrome de l'intestin irritable, pour identifier de futures cibles pharmacologiques. Le guide qui dépasse de cinq millimètres du crâne est décrit comme une "légère gêne" pouvant occasionner des grattages, alors que le même texte annonce une hypersensibilité colique et un comportement anxieux installés jusqu'à la fin des expériences.
Objectifs
L’hypersensibilité colique et les douleurs abdominales sont les principaux symptômes du syndrôme de l'intestin irritable (SII) mais s’accompagnent très fréquemment de comorbidités psychologiques. La prise en charge de ces symptômes en clinique est actuellement limitée. En effet, le manque d’efficacité des traitements disponibles rend le développement de nouveaux outils pharmacologiques nécessaire. Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de ces symptômes afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, puis de tester de nouveaux médicaments agissant sur ces nouvelles cibles. La complexité de cette pathologie faisant intervenir plusieurs organes rend impossible l’utilisation in vitro d’un modèle cellulaire. Ainsi, afin de tester de nouvelles molécules dans des conditions mimant ces pathologies, il est indispensable de développer un modèle animal présentant des origines communes à ce qui est observé chez le patient et permettant donc de reproduire ces pathologies douloureuses. Le protocole s’orientera sur les mécanismes centraux impliqués dans l’initiation, le développement et le maintien d’une hypersensibilité viscérale d’origine colique (HSVC) ainsi que des comorbidités psychologiques (anxiété, dépression, troubles de la cognition) sur des modèles animaux de syndrome de l’intestin irritable post-infectieux (SII-PI). En effet, parmi les différents facteurs étiologiques suspectés dans la physiopathologie de ces atteintes intestinales, il a été observé, chez des patients présentant de sévères douleurs abdominales, des facteurs communs tels qu’un dérèglement du métabolisme du tryptophane pouvant être l’origine d’une HSVC ainsi que de comorbidités psychologiques. L’objectif de ce projet sera donc de clarifier le lien entre un désordre du métabolisme du tryptophane et le développement d’une HSVC et des comorbidités psychologiques afin de proposer de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement des symptômes.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes associés au SII afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettrait d’envisager une étude clinique. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs et des comorbidités psychologiques chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.
Procédures
Les groupes "infectés" seront infectés une fois par un gavage de 0,2ml de suspension de bactérie dans du PBS à une concentration de 10E9 bactéries/souris. Les groupes "non-infectés" seront traités une fois par un gavage de 0,2mL de PBS pour ne pas induire un biais. Un prélèvement de fèces sera effectué à J3, 7, 10 et 16 post infection sur chaque souris pour évaluer l’état de colonisation du tractus digestif nécessitant une contention de 5 minutes maximum. Les souris recevront un traitement par gavage oral deux fois par jour à base de métabolites dérivés du métabolisme du tryptophane entre J16 et J23. Chaque gavage prendra au maximum 30 secondes. A la suite de la période post-infectieuse (J16) les animaux subiront une procédure chirurgicale prenant une heure environ permettant l’implantation du guide de microdialyse au niveau cérébral. Après 48h de récupération suite à la chirurgie, les animaux subiront des perfusions de liquide céphalorachidien artificiel d’environ 2h à travers une sonde de microdialyse permettant de récupérer 200µL de liquide céphalorachidien sur animaux vigiles de façon bihebdomadaire sur une période pouvant s’étendre jusqu’à 3 mois. De plus, les animaux seront pesés quotidiennement pour vérifier leur bien-être. Au total, les animaux seront manipulés 46 fois en plus des pesées quotidiennes sur une période de 4 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux seront pris en en contention lors de l’infection à J0 et lors de la récupération de fèces à J3, J7, J10 et J16 induisant un stress léger. L’infection par C. rodentium induira des symptômes associés au syndrome de l’intestin irritable post-infectieux tels qu’une hypersensibilité colique et un comportement anxieux en phase post-infectieuse et jusqu’à la fin des expérimentations. L’administration d’un traitement curatif par gavage intragastrique deux fois par jour sur 8 jours lors de la phase post-infectieuse nécessitera une contention quotidienne rapide des animaux. Pour la chirurgie stéréotaxique, les animaux seront pris en contention pour être anesthésiés par injection sous-cutanée de kétamine/xylazine, plus un mélange de lidocaine et buvipacaine en analgésique. Le crâne des animaux sera percé permettant l’implantation du guide en conditions stériles, la zone sera refermée par un ciment dentaire laissant dépasser le guide. Celui-ci dépasse d’environ 5mm du crâne des animaux et pourrait donc occasionner une légère gêne et des grattages. A la suite, les animaux seront stabulés individuellement permettant leur récupération optimale et minimisant le risque de déplacer le guide. Une douleur au niveau du site chirurgical pourra être observée chez les animaux mais ce phénomène sera étroitement surveillé et la douleur sera traitée par des injections de lidocaïne et buvipacaine pendant 2 jours minimum après la chirurgie. Si un animal montre des signes d’infection post opératoire, il sera traité ou retiré de l’expérimentation. Pour la microdialyse, les animaux seront habitués 30min dans des cages de microdialyse, permettant leur libre déplacement, équipé d’eau et de nourriture à volonté, ensuite, les animaux seront rapidement anesthésiés par anesthésie gazeuse pour l’introduction de la sonde de microdialyse au travers du guide implanté, habitués à nouveau 30min puis perfusés (2h environ). A la fin, une nouvelle anesthésie gazeuse aura lieu pour retirer la sonde de microdialyse du guide et les animaux seront remis dans leur cage d’origine. Cette perfusion de microdialyse sera répétée de façon bihebdomadaire sur une période de 3 mois pouvant entrainer un stress lié à la manipulation. Durant la phase infectieuse et suivant la chirurgie, une perte de poids (maximum 5% du poids initial) pourra être observée chez certains animaux. Un suivi quotidien du poids et de l'état général des animaux sera effectué.
Devenir
A l'issu de la procédures, les animaux seront mises à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes.
Remplacement
Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur les variations du métabolisme du tryptophane au niveau cérébral. De plus, une étude comparant des données de métabolomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Ce nombre d'animaux a été determiné par une approche statistique.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (week-end et jours fériés compris) voir deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20% sur 3 jours, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par sa pertinence pour l’étude des pathologies intestinales in vivo ainsi que par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. De plus, la spécificité d’espèce de la souche bactérienne pathogène utilisée rend ce modèle encore plus approprié. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Etude de la cicatrisation cutanée au cours du diabète et de l’effet de l’application d’un substitut cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une partie des souris utilisées est immunodéprimée, donc plus exposée aux infections, alors que le protocole leur inflige des plaies ouvertes. 1 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles suivent un régime gras et sucré pour devenir prédiabétiques, subissent une plaie d'excision ou deux plaies de pression de trois heures chacune sous anesthésie, un débridement, la greffe d'un substitut cutané humain et des tests répétés de tolérance au glucose avec incision de la queue, chacune finissant isolée en cage individuelle pour que ses plaies ne soient pas aggravées. Le porteur attend de cette durée d'expérimentation des signes excessifs d'agressivité, des griffures, de l'apathie ou de la prostration, et la mise à mort intervient pour prélever la peau totale du dos.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension de l’intégration de cellules humaines dans la problématique des plaies chroniques non cicatrisantes afin de déterminer la contribution des cellules du donneur versus hôte dans la régénération tissulaire. Les plaies chroniques sont des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques, qui persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque pouvant entraîner de graves complications voire un décès. La thérapie locale des ulcères du pied repose principalement sur le débridement de la plaie et la protection des plaies à l’aide de pansements mais la cicatrisation reste longue et peut échouer. Il y a une urgente nécessité à trouver de nouveaux traitements et augmenter la compréhension du défaut de cicatrisation. Les études d’efficacités des pansements et peaux artificielles incluant des cellules sont principalement effectuées sur des animaux sains avec quelques études sur des animaux pathologiques et exclusivement réalisées sur des plaies aigues de type coupure. Toutefois, la peau d’un patient diabétique ou d’un sujet sain sont différentes, de même qu’une plaie liée à la gravité par application de la pression du corps est très différente d’une coupure. L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle d’une peau artificielle humaine dans l’amélioration significative de la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après coupure et application de pression chez des souris non et pré- diabétiques, mâles et femelles.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de contribution des cellules du donneur versus hôte dans la formation du nouveau tissu permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de cicatrisation qui peuvent affecter les patients diabétiques et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime hypercalorique riche en graisse et sucre, associé ou non à des injections (x5, 3sec/injection – 20 sec/ contention) afin d’induire un pré-diabète. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à une plaie d’excision (1 en 1 min) ou deux plaies de pression (2x 3h), associé ou non à la greffe d’un substitut cutané. Il existe une répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de pression, le débridement des plaies (10min) et le suivi des plaies par photo (5min). La détermination du temps de régime hypercalorique nécessaire pour induire un prédiabète nécessite la répétition de tests de tolérance au glucose et de tests de sensibilité à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline nécessitent une seule incision (2 sec) de la queue pour chaque test. Pour les souris poilues, une crème dépilatoire VEET sera utilisée (appliquez 30 sec et bien rincé à l’eau claire avec compresse stérile)
Impact sur les animaux
Les souris immunodéprimées sont sujettes à plus d’infection. La génération de la plaie et le débridement peuvent engendrer une douleur. La durée des expérimentations peut engendrer des signes excessifs d’agressivité et l’apparition d’irritations ou de griffures cutanées ou l’apparition d’apathie, de prostration ou d’immobilité. La mise en cage isolée des souris pour préserver les plaies induites et ne pas avoir de sur-blessure peut engendrer une perte d’interaction, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Une douleur transitoire peut être associé aux injections répétées.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus. MODIFICATION du 16/04/2024 : mises à mort par la méthode réglementaire pour prélèvements de peau totale du dos. Pour les souris avec plaie, mise à mort par injection d’euthasol ou induction en cage à CO².
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime enrichi en sucre/gras), et l’effet de la pose d’un substitut cutané sur les blessures, notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1592 incluant les 2 sexes, la réalisation d’expérimentation se fera par salves. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Les animaux ayant été utilisés pour la première partie du projet et répondant à nos attentes pourront être réutilisés pour la suite du projet, dans un objectif de réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Des croquettes mouillées au sol et/ ou gel nutritifs pourront être ajouté à la cage si les souris présentent une difficulté à se déplacer et/ ou se mettre debout ou si il n’y a pas de prise de poids. Toutes les anesthésies seront gazeuses Des analgésiques seront administrés 30 min avant l’acte chirurgical, puis 6-8h après et enfin 24h après l’acte chirurgical. L’hébergement et les instruments utilisés sont stériles, et les cages sont chauffées après les chirurgies via des pads chauffants disposés sous les cages, pour aider le réveil des animaux. Une fois les animaux isolés seul par cage, il y a l’ajout d’une maison carton comme nouvel enrichissement.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie et une organisation cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier l’induction des plaies et les processus de cicatrisation, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 3 semaines pour débuter les régimes hypercaloriques et pour que les souris soient sexuellement matures au moment de l’induction des plaies. Excepté pour les souris NSG qui auront 6 semaines d’âge au moment de la greffe de peau humaine.
Évaluation d’innocuité et de l’efficacité des ultrasons focalisés non thermiques pour l’occlusion veineuse de la veine saphène chez ovins.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Traitées sous anesthésie générale par des ultrasons focalisés de haute intensité pour obstruer leurs deux veines saphènes, puis suivies par échographie à quatre ou six reprises, parfois sous sédation, 10 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque étude pour le prélèvement de leurs veines saphènes. Une étude de dose puis une étude réglementaire doivent démontrer la sécurité et la faisabilité de cette technique contre les varices, après des essais préalables sur des veines d'oreille de lapin et sur trois brebis. Le porteur parle d'ultrasons "non thermiques", rapporte des brûlures aux sites traités lors d'essais précédents, problème qu'il dit résolu par un refroidissement de la peau, et signale qu'"un léger échauffement peut être observé".
Objectifs
L'insuffisance veineuse superficielle est l'une des maladies majeures dans le monde, actuellement traitée par ablation thermique ou sclérothérapie. La technologie d'ultrasons focalisés de haute intensité utilisant une modalité thermique peut être utilisée pour obtenir l'oblitération des varices, avec certaines limitations : un temps de traitement long et douloureux. La méthode utilisant des ultrasons de haute intensité traite les varices de manière plus rapide et indolore. Jusqu'à présent, les études montrent que pour le traitement, il est nécessaire d'injecter un agent de contraste. Cette étude préclinique sur des animaux vise à démontrer la sécurité et la faisabilité de cette nouvelle approche thérapeutique.
Bénéfices attendus
Les varices sont présentes chez 25% de la population des pays industrialisés et représentent un coût sociétal de ressources médicales pour ces pays. Les techniques mini-invasives développées ces dernières années permettent de traiter avec efficacité et peu de récidives cette maladie. La technique nouvellement développée et étudiée dans ce projet pourrait permettre d'obtenir d'aussi bons résultats que les autres techniques tout en diminuant les risques associés. Elle permettrait donc de continuer à améliorer le traitement de cette maladie.
Procédures
Les animaux seront traitées sous anesthésie générale. Un suivi échographique aura lieu à temps différents (procédure n° 1 – 4 temps et procédure n°2 – 6 temps). Si nécessaire, les animaux seront sédatés pour cet examen. De plus, un suivi post-traitement de la zone traitée sera réalisé à temps différents (procédure n° 1 – 4 temps et procédure n°2 – 6 temps) afin de détecter d’éventuelles lésions dues au traitement.
Impact sur les animaux
La principale nuisance attendue chez les animaux est le léger stress et la douleur modérée lors de réalisation des tranquillisations des animaux. De plus, dans les essais précédents, des brûlures ont pu être observées au niveau des sites traités. Ce problème a été résolu par l'ajout d'un système déjà validé de refroidissement de la peau au niveau de la sonde. Ce risque est donc très faible, mais nous devons mentionner qu'un léger échauffement peut être observé.
Devenir
Les dix brebis du projet seront mises à mort à la fin de chaque étude afin de prélever leurs veines saphènes pour les analyser.
Remplacement
Il n'existe pas de modèle in vitro validés ou de modèle simulé par ordinateur qui puissent imiter les points finaux de ce projet. Il est donc nécessaire de travailler sur animal vivant. Le modèle ovin est recommandé dans la norme ISO 10993, partie 6 (2016) comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires.
Réduction
Une étude de preuve de concept sur des veines d'oreilles de lapin, ainsi qu'une étude de faisabilité sur trois brebis a déjà été réalisée. Elles ont permis de déterminer les meilleures conditions d'utilisation des ultrasons focalisés de haute intensité ce qui permet de réduire à 10 (deux études : validation de la dose puis une étude réglementaire) le nombre d'animaux utilisés dans la présente étude. De plus, le traitement est appliqué sur les deux veines saphènes des animaux, ce qui permet d'utiliser deux fois moins d'animaux pour obtenir le même nombre d'échantillons. Les résultats seront analysés par les tests statistiques.
Raffinement
Afin de permettre aux animaux de s’adapter à leur environnement et de s’assurer de leur bon état de santé, une période d’acclimatation adaptée à l’espèce et au stade physiologique sera dispensée avant début de traitement. Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d'hébergement adaptées et optimales. Les paramètres d'ambiance, l'aliment, l'abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les animaux seront hébergés collectivement en groupes harmonieux. Un programme spécifique d’habituation à la manipulation par l’homme est en place. Les ovins disposeront d'un environnement enrichi (exemples : objets à manipuler de type ballon) permettant à l'animal de jouer. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement par un personnel habilité et habitué à travailler avec des brebis. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s'il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d'un traitement thérapeutique. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. Un renforcement positif sera également réalisé pour obtenir leur coopération lors des opérations courantes ou de soins. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes. De plus, les points limites généraux suffisamment prédictifs sont définis dans ce projet.
Choix des espèces
La brebis est recommandée dans la norme ISO 10993-6 comme un animal approprié pour évaluer la performance et les effets tissulaires locaux des traitements vasculaires. En effet, la morphologie et la taille des veines saphènes du mouton sont similaires à celles de l'homme et ce modèle a été décrit dans la littérature comme un modèle approprié pour évaluer l'occlusion veineuse. Une fois rasés, ces animaux possèdent également une peau proche de celle de l'Homme ce qui permettra aux ultrasons d'atteindre la veine sans une trop forte absorption de ceux-ci. En outre, la faisabilité a été évaluée par le promoteur qui a pris les mesures des veines saphènes de l’animal. Les animaux sont adultes afin d'avoir une structure comparable à l'homme.
Etude des conséquences du diabète sur la réactivité vasculaire chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris engagées dans la procédure sont gavées et pesées chaque jour pendant 42 jours, après une biopsie de la queue et un transfert entre deux établissements. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le modèle repose sur des animaux rendus diabétiques et obèses, qui peuvent développer une cardiopathie et des irritations cutanées, et qui urinent assez pour imposer de limiter les cages à deux individus et de les changer plus souvent. Quarante souris seulement entrent dans la procédure et voient leurs organes prélevés, les autres, dépourvues de la mutation recherchée, étant tuées sans y avoir été soumises.
Objectifs
Le diabète est la quatrième cause de décès dans la majorité des pays développés, notamment par suite de maladies cardiaques et d'accident vasculaire cérébral. Dans ces pays, le diabète est aussi la principale cause de cécité, d'amputation des membres inférieurs et d'insuffisance rénale. La dysfonction endothéliale est un marqueur précoce du développement de la pathologie métabolique et du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction doit par conséquent être évaluée tôt dans l’histoire naturelle du diabète. Les stimuli à l’origine des lésions des vaisseaux sanguins induites au cours du diabète ne sont pas complètement connus. L'objectif principal est d'identifier si la modulation pharmacologique de certains mécanismes d'atteinte délétère des vaisseaux sanguins permettrait de limiter les lésions des vaisseaux sanguins au cours du diabète. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs, EU1 qui élèvera les animaux et EU2 qui fera les analyses fonctionnelles sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la dysfonction endothéliale dans le diabète et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des complications vasculaires du diabète.
Procédures
Biopsie à la queue (EU1, 1 fois 10 secondes), préhensions quotidiennes et gavage (EU1 et EU2, 42 fois 1 minute), pesées quotidiennes (EU1 et EU2, 42 fois 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effet indésirable lié au modèle de diabète et d'obésité: cardiopathie, irritation cutanée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort. Les 40 utilisés dans la procédure verront leurs organes prélevés pour analyse. Les animaux qui n'ont pas la mutation d'intérêt seront également mis à mort.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). Ici nous étudions les propriétés de vasoconstriction et vasodilatation des artères en réponse à différents signaux moléculaires et mécaniques. Ces propriétés des vaisseaux sont essentielles pour assurer le bon fonctionnement des organes. Elles dépendent des différents types cellulaires qui composent les artères et également des molécules sécrétées par différets organes de l'organisme. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur un logiciel en ligne et donnait 8 animaux par groupe requis. 2 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental et des analyses post-mortem. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. animaux utilisés du sevrage (identification) à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.