Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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Étude fonctionnelle de protéines associées à l’ADN au cours de la reproduction
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale est immédiatement mise à mort, comme tout animal dont le score de bien-être ne s'améliore pas après 48 heures ou qui perd plus de 20 % de son poids. 476 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. 120 femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales espacées de 48 heures pour déclencher une sur-ovulation, puis sont mises à mort entre 12 heures et 4 jours plus tard, dans une étude sur des variantes d'histones propres aux cellules reproductrices. Les autres sont tuées au titre de l'entretien de la colonie, parce que leur génotype ne sert pas au projet ou qu'elles ont dépassé douze mois, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de leur éviter les complications de santé liées à l'âge.
Objectifs
L’information génétique transmise par les gamètes est compactée en fibre de chromatine dont l’unité de base se compose de protéines appelées histones. Les cellules reproductrices présentent la particularité́ d’utiliser des variantes d’histones qui ne sont pas trouvées dans les tissus somatiques et sont uniques à chaque espèce. Ces variantes sont parfois induites de manière aberrante dans des cancers humains. Que ce soit au cours de la reproduction ou dans un contexte pathologique, les fonctions de ces histones restent, à ce jour, peu connues. Ces histones se trouvant exclusivement sur le chromosome X des mammifères, l’étude de leurs fonctions in vivo nécessite une approche en modèles murins. Il existe des modèles de souris mutantes déficitaires pour ces histones et des travaux antérieurs ont montré que les mâles mutants présentaient une sous-fertilité et que 10 % des embryons succombaient in utero post-implantation. Ce projet, a pour but d’identifier les conséquences de la perte de ces histones sur la structure de la chromatine des cellules reproductrices ainsi que leurs rôles au cours du développement embryonnaire précoce. Enfin, il n’existe pas d’anticorps permettant de purifier ces histones dans leurs contextes natifs, et ce projet propose de produire de nouveaux modèles de souris permettant de les identifier in vivo. Dans son ensemble, ce projet permettra de comprendre de nouveaux mécanismes mis en jeu lors de la reproduction. L’identification des fonctions de ces variantes d’histones ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques aussi bien ciblant certains cancers que combattant des infertilités.
Bénéfices attendus
Les modèles murins de ce projet ont pour but d’identifier de nouveaux processus contribuant à l’hérédité durant la reproduction. Ils présentent donc un bénéfice pour la compréhension fondamentale de ce processus. Les histones étudiées étant aussi présentes chez l’homme, ce projet contribuera à notre compréhension de la fertilité humaine. Enfin, ces variantes étaient induites de manière ectopique dans de nombreux cancers, leur caractérisation fonctionnelle ouvrira la voie vers de nouvelles routes thérapeutiques.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à deux injections intra-péritonéales durant chacune moins de 5 secondes et espacées de 48h afin de stimuler l’ovulation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont : du stress et de l’angoisse de courte durée (moins de 2 minutes), et une douleur légère et transitoire, de quelques secondes, lors des injections intrapéritonéales. Bien qu'aucun phénotype dommageable n’ait été observé sur les lignées existantes, l'établissement des nouvelles lignées pourrait entrainer une baisse transitoire des performances reproductives chez les mâles.
Devenir
Pour la collecte de tissus, les procédures s’effectuent post-mortem. Pour le maintien de la colonie, le sort prévu est l'euthanasie pour les génotypes non-utilisés ainsi que pour les animaux au-delà de 12 mois. Ceci permet de minimiser le stress dû à l'élevage et d'éviter les complications de santé pouvant apparaître avec l’âge. Les 120 femelles soumises à la sur-ovulation sont euthanasiées entre 12h et 4 jours suivant les injections.
Remplacement
L’expression des gènes étudiés est limitée aux cellules reproductrices, y compris chez l’Homme. Actuellement, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire de remplacement. Les effets de ces gènes sont mesurables sur l’embryon avant l’implantation, le recours à un mammifère placentaire est donc nécessaire. La souris présente une bonne traçabilité génétique et il existe des approches génétiques déjà établies. Date de recherche de méthodes de remplacement sur base de données : 01/01/2024.
Réduction
La stratégie expérimentale choisie afin de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet est la suivante : 1) Minimisation de l’élevage par des schémas de croisements qui permettent de générer une partie des animaux contrôles et tests dans la même portée. Les estimations du nombre de cages de croisement prennent aussi en compte une portée moyenne de 8 animaux tous les mois 2) La stratégie expérimentale de collecte de tissus post-mortem permet de prélever plusieurs tissus sur un même individu. Les estimations prennent aussi en compte le fait que plusieurs types de mesures (protéines, ARN, ADN…) peuvent être effectués sur 3 à 5 échantillons de tissus (testicules, épididymes, foie…), ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
La stratégie mise en œuvre pour réduire l’angoisse et la douleur induite est la suivante : 1) Utilisation du fond génétique qui présente peu de maladies spontanées et est bien adapté à l’élevage en laboratoire dans un contexte de recherche scientifique. Toutes les souris (maintenance et groupes expérimentaux) seront maintenues dans des cages avec milieu enrichi (matériel de nidification et tunnel de carton). Les lignées mutantes pour les histones étudiées présentent une légère diminution de fertilité, mais pas d’autres phénotypes dommageables à la survie et au confort des animaux en laboratoire. Ces animaux sont suivis de manière journalière. Les phénotypes des animaux produits dans ce projet n’ont pas encore été caractérisés et leur bien-être suivra une procédure d’évaluation accrue (grille d’évaluation sur deux générations) afin de déterminer s’ils présentent un phénotype dommageable. 2) Tous les tests s’effectuent post-mortem sur tissus, cellules ou embryons pré-implantatoires. 3) Afin de minimiser l’angoisse, l’ensemble de nos animaux sera surveillé chaque jour pour détecter tout signe de mal-être. Quatre indicateurs sont utilisés : - Posture et activité exploratoire dans la cage - Comportement naturel - Réponse à des stimuli extérieurs - Anomalie liée à la mise-bas chez les femelles gestantes. Tout individu présentant un signe de mal-être lors de ces surveillances fera l’objet d’une surveillance renforcée pendant 48h (voir point suivant). 4) La surveillance renforcée consiste en un suivi par grille d’évaluation du bien-être pendant 48h. Pour chacun de ces indicateurs, un score est déterminé par vérification visuelle et par manipulation. Un animal présentant un score entre 5 et 9 sera pesé. L’animal sera euthanasié si aucune amélioration du score n’est observée ou s’il présente une perte de poids supérieure à 20 % après 48h. Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale sera immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser la souris répond aux critères de fertilité́ et de temps de génération requis pour une étude expérimentale en laboratoire. De plus, ces études nécessitent un modèle placentaire possédant tout le complément de gènes présents chez l’homme. Enfin, nous disposons d’outils génétiques chez la souris qui ne sont pas disponibles pour d’autres organismes modèles Pour les croisements ainsi que la collecte de tissus reproductifs matures post-mortem des animaux à maturité sexuelle sont utilisés – c’est à dire après leur sevrage et jusqu'à un an d’âge. Pour les études préimplantatoires, des stades de développement précédant et suivant l’activation du génome zygotique de 0,5 à 4,5 jours post-fécondation sont étudiés.
Effets d’une absence de microbiote maternel sur le pic de néoglucogenèse intestinale du nouveau-né
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Réformées de l'élevage, 32 souris femelles vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un traitement antibiotique pendant 36 jours, par gavage les trois premiers jours puis dans l'eau de boisson, pour supprimer leur microbiote intestinal, et 28 d'entre elles subissent deux prélèvements de sang à la queue. Le porteur annonce seize portées par condition, d'environ sept souriceaux chacune, dont les organes seront prélevés à huit points de mesure répartis sur les vingt et un premiers jours de vie. Ces souriceaux sont mis à mort sans figurer dans l'effectif déclaré de 32, tandis que les mâles reproducteurs sont réutilisés dans l'établissement.
Objectifs
La forte prévalence de l'obésité et du diabète, en particulier chez les enfants, souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces pathologies. L'appétit et la dépense énergétique sont régulés par une région particulière du cerveau. Des études antérieures ont montré qu’une modification de l’environnement maternel de façon délétère (régimes déséquilibrés, stress) modifie le développement de cette région du cerveau et contribue aux maladies métaboliques tout au long de la vie. Le microbiote intestinal constitue une communauté complexe et dynamique de bactéries vivant dans le système digestif. Des changements dans la composition ou la fonction du microbiote intestinal ont été associés au développement de maladies métaboliques. Des données récentes suggèrent que le microbiote intestinal maternel influence le métabolisme, le comportement, le développement du cerveau chez la progéniture. Cependant, il reste à déterminer comment le microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Le microbiote intestinal exerce ses effets en produisant des acides gras à courtes chaines. Chez l’individu adulte, la production des acides gras à courtes chaines par le microbiote exerce des effets anti-obésité et anti-diabète en activant une fonction de l’intestin : la production intestinale de glucose. De façon intéressante, la production intestinale de glucose double au cours des deux premières semaines de vie chez les rongeurs et nos données préliminaires montrent que cette augmentation spécifiquement dans cette période influence le développement du cerveau et protège des maladies métaboliques. L’objectif de cette étude pilote est d’évaluer si l’absence du microbiote maternel perturbe le pic d’induction de la production intestinale de glucose pendant la période périnatale et contribue à un mauvais développement du cerveau et aux maladies métaboliques.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de déterminer si l’absence de microbiote intestinal maternel (induit par un traitement antibiotique) altère le profil périnatal de la production intestinale de glucose. Ces résultats seront une première étape pour comprendre comment l’absence de microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Si notre hypothèse est vérifiée, un projet plus important nous permettra d’étudier si l’induction constitutive de la production intestinale de glucose peut restaurer les défauts induits par l’altération du microbiote intestinal maternel. Dans l’affirmative, ces résultats offrent des perspectives intéressantes pour améliorer l’alimentation des nourrissons de manière à induire la production intestinale de glucose périnatale.
Procédures
Les 32 femelles suivront un traitement antibiotique de 36 jours par gavage les trois premiers jours (30 secondes) puis via une administration dans l’eau de boisson. Un groupe de 2 femelles subiront un prélèvement de sang à la queue (30 secondes) et 28 femelles subiront deux prélèvement de sang (30 secondes chacun).
Impact sur les animaux
Le traitement aux antibiotiques n’entraine pas de modification du comportement maternel, de perte de poids et de mal-être. Le gavage journalier pourrait présenter une légère irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une légère douleur de très courte durée au moment de la piqure.
Devenir
Les femelles et les souriceaux issus des croisements seront mises à mort pour prélèvements d’organes. Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l’EU.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou organoïdes car elle concerne l’influence de l’environnement maternel sur un paramètre d’un descendant. Les connaissances actuelles ne permettent pas de reproduire la complexité de l’environnement maternel sur un modèle cellulaire représentant l’organe du descendant.
Réduction
Le nombre de descendants nécessaires pour observer une variation de la production intestinale de glucose est le paramètre pris en compte pour calculer le nombre d’individus nécessaires. Ce nombre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des résultats d’études précédentes : soit un maximum de 14 par point de mesure. L’analyse précise de la production intestinale de glucose nécessite d’étudier 8 points de mesure dans les 21 premiers jours. Le nombre de souriceaux par portée est de 7 descendants en moyenne. Il faut donc 2 portées par point de mesure soit 16 portées par condition. Dans cette étude, 2 conditions seront étudiées : mères traitées aux antibiotiques - mères non traitées. Condition traitement : 16 portées = 16 femelles Condition non-traitée : 16 portées = 16 femelles TOTAL 32 femelles Les femelles et les mâles utilisés pour l’obtention des portées sont des souris de réforme d’élevage.
Raffinement
Les femelles du protocole seront acclimatées à l’animalerie avant la mise en place de la procédure. Pour favoriser l’accouplement, le soir précédent l’accouplement, de la litière des mâles sera introduite dans la cage des femelles et vice et versa. Les portées seront équilibrées à 7 bébés par portées en réalisant des adoptions de souriceaux issus de grandes portées par des mères de petites portées. Pour limiter le stress de séparation des nouveau-nés de leur mère en cas d’adoption, l’expérimentateur se frottera les mains avec la litière et les souriceaux à adopter seront déplacés avec de la litière et une partie du nid. Afin d’induire un renforcement positif, la sonde de gavage sera préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple. Les comportements anormaux qui doivent nous alerter sont : une souris prostrée, ayant les yeux fermés, n’ayant pas fait sa toilette, ayant une perte de poids suggérant une perte de la portée, une impossibilité à mettre bas. En cas d’observation de ces comportements anormaux et si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, l’animal en question est écarté du protocole et mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par l’intestin pendant la période néonatale a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Nous étudions l’importance du microbiote intestinal maternel sur la descendance donc cette étude ne concerne que des femelles adultes âgées de 12 semaines.
Identité moléculaire des synapses des cellules de Purkinje en développement et adultes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Anesthésiés puis injectés dans le crâne entre zéro et sept jours de vie, les souriceaux sont remis auprès de leur mère roulés dans la sciure souillée, pour limiter le risque qu'elle les rejette. 1 696 souris, souriceaux et adultes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'injection intracérébrale durant vingt à trente minutes selon l'âge. Le porteur indique que la manipulation des souriceaux amène parfois les femelles à rejeter leurs petits, qui sont en général mangés par leur mère sans qu'aucune intervention soit possible. Toutes les souris injectées sont tuées en fin de procédure pour l'électrophysiologie, la biochimie ou l'histologie, et 70 mères sont gardées vivantes pour de nouveaux accouplements.
Objectifs
Dans le système olivo-cérébelleux, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit deux types différents de connexions excitatrices. L’activité neuronale régule la formation et le maintien d'un seul de ces deux types de connexions, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.
Procédures
Injection transcranienne de 0 à 2 jours ou intracérébrale de 3 à 7 jours sur souriceau anesthésié. La durée totale de l'injection est de 20 min. Injection intracérébrale sur souris adulte anesthésiée. La durée totale de l'injection est d'environ 30 min.
Impact sur les animaux
La manipulation des souriceaux peut parfois amener les femelles à rejeter leurs petits qui sont en général mangés par leur mère sans qu'aucune intervention ne soit possible. D'éventuelles douleurs post-opératoires peuvent apparaitre au niveau de la petite incision de la peau réalisée au niveau du crâne. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 1696 animaux injectés (souriceaux et adultes) seront euthanasiés en fin de procédures.
Remplacement
Il est important d’étudier le réseau olivo-cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont notamment le tronc cérébral mais aussi le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude nécessite donc d’avoir recourt à des animaux vivants. En effet, il ne serait pas possible d'étudier la connectivité entre différentes régions du cerveau in vitro en culture cellulaire ni même dans des « assembloïdes » associant des organoïdes simulant différentes régions cérébrales grâce à la diversité des cellules qui les composent, les activités cellulaires observées dans ces cultures ou organoïdes cérébraux ne pouvant être assimilées aux processus cognitifs, sensoriels ou moteurs propres au cerveau. Des études in silico sont possibles lorsque l'on étudie des molécules dont les propriétés sont bien décrites dans la littérature scientifique mais ne sont pas possibles dans notre étude qui concerne de nouvelles molécules dont les rôles et mécanismes d'action sont pour l'heure inconnus.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. Lors des injections, les souriceaux sont séparés de la mère pendant maximum 1 heure afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux et les souriceaux sont réchauffés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajoutée dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection. Les souris reçoivent également une injection intrapéritonéale d'analgésique au début de l'anesthésie pour prévenir toute douleur post-opératoire. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. Notre projet concerne non seulement l’étude du développement du système olivo-cérébelleux, qui se déroule principalement après la naissance et nécessite donc de travailler chez le nouveau-né, mais aussi l’étude de son maintien chez l’adulte. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques chez le souriceau agé de 0 à 7 jours, moment de la formation des synapses d‘intérêt, ou chez l’adulte de 2 mois, moment où le réseau est mature. Les souris seront ensuite euthanasiées environ 3 semaines après injection, soit environ 30 jours après leur naissance pour les souriceaux (stades auquels la connectivité du réseau est finalisée) et avant leur 3 mois pour les adultes. En effet, 3 semaines sont nécessaires et suffisantes au bon fonctionnement de nos outils moléculaires et à la production d’effets morphologiques ou fonctionnels quantifiables sur les synapses.
Etude de l’interaction entre P53 et Hif1a dans le développement de lésions précancéreuses prostatiques.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
220 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent pendant cinq jours des injections abdominales destinées à faire apparaître des lésions précancéreuses de la prostate, 40 d'entre elles subissent ensuite deux semaines d'injections quotidiennes d'une molécule, et 120 sont castrées chirurgicalement sous anesthésie, une opération de vingt minutes suivie d'un mois de surveillance. Les prostates sont prélevées après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire en jeu, ce qui rend selon lui "nécessaire" le recours à l'animal.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements. Notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de progréssion des lésions précancéreuses indolores et benignes vers les tumeurs invasives et agressives. Nous avons auparavant identifié un facteur moléculaire qui promeut la plasticité de cellules épithéliales de lésions précancéreuses prostatiques en les protégeant contre la mort cellulaire. En parallèle, nous avons démontré le rôle protecteur d'une autre protéine contre la plasticité de ces cellules. Par ailleurs, les intéractions entre ces deux facteurs ont été décrites dans les systèmes cellulaires dans la littérature et indiquent que les deux facteurs pourraient intéragir pour contrôler l'agressivité des cellules cancéreuses, mais aucune étude in vivo n'a été conduite dans le cas du cancer de la prostate. Dans ce projet, nous voudrions évaluer l'impact de l'inhibition simultanée de ces deux facteurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les intéractions entre les facteurs clefs contrôlant la survie, la sénescence et éventuellement l'agressivité des cellules précancéreuses prostatiques, ainsi que leur résistance aux traitements actuels par hormonothérapie. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la tumorigénèse ouvre des perspectives thérapeutiques et diagnostiques et ainsi, une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (220) seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition de lésions précancéreuses prostatiques. Cette procédure prend 10 secondes comprenant la préhension de la souris et l'injection en elle-même. Une partie d'animaux sera soumise à un traitement pharmacologique (40) soit avec la molécule active, soit avec son adjuvant. Ces solutions seront également administrées par des injections au niveau de l'abdomen, le traitement durera deux semaines avec les injections quotidiennes. La procédure prendra 10 secondes. Une partie d'animaux subira une intervention chirurgicale (120) - castration, sous une anesthésie accompagnée d'une analgésie efficace. La durée de la chirurgie est estimée à environ 20 minutes par animal, et sera surveillée pendant un mois après chirurgie.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Les lésions précancéreuses restent indolores jusqu'à 5 mois après injection du premier composé, nous ne nous attendons donc pas à une agressivité et donc une douleur. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables suite au second traitement, car le composé a été décrit comme bien toléré dans la littérature et a été utilisé pour des traitements plus longs que ceux prévus dans notre étude. Des effets indésirables liés à l'intervention chirurgicalex sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas.
Devenir
Une fois les procédures terminées, les prostates des animaux seront prélevées pour les analyses ultérieures.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire impliquée dans l'évolution des lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences dans les modèles animaux pour comprendre ce phénomène et en disséquer les méchanismes moléculaires.
Réduction
Etant donné la variablité inter-individuelle observée dans nos études précédentes, nous avons estimé par une approche statistique que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement. Ainsi, nous avons prévu les groupes de souris de sorte à avoir 10 souris par analyse effectué pour le groupe expérimental donné. Nous allons profiter des données obtenues précédemment dans le laboratoire sur d'autres modèles murins pour effectuer les comparaisons et reduire le nombre de nouvelles souris utilisées. Amendement: Pour le groupe d'animaux qui subiront une chirurgie, cette intervention peut générer plus de variabilité entre les animaux, nous avons donc estimé que 15 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet entre les groupes comparés.
Raffinement
Tout le long des traitements par injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les irritations ou l'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Les souris seront surveillées quotidiennement, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Elles seront également pésées quotidiennement pendant les traitements. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l'animalerie et/ou les chercheurs. Un enrichissement sera ajouté systématiquement dans les cages. Amendement: Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables.
Choix des espèces
Nos modèles de souris récapitulent de manière fidèle l'apparition et l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'effet d'un traitement et que le microenvironnement tumoral joue le rôle clé dans l'évolution des lésions, nous sommes dans l'impossibilité d'utiliser les systèmes cellulaires qui ne récapitulent pas la complexité d'un tissu. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.
Etude de la toxicité et efficacité de la radiothérapie et de la radiorésistance dans les tumeurs cérébrales pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à quinze séances de tests comportementaux par semaine et cinq irradiations du crâne par expérience : 9 143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des cellules ou des fragments de tumeurs cérébrales pédiatriques leur sont greffés sous la peau ou injectés directement dans le cerveau sous anesthésie, avec un suivi par imagerie chaque semaine et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur décrit des tests portant sur la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale, sans préciser lesquels sont employés. Il justifie l'emploi de souriceaux de dix jours par le fait que leur cerveau est alors en plein développement, comme celui des jeunes enfants atteints des cancers étudiés.
Objectifs
Les cancers sont la seconde cause de mortalité chez les enfants âgés de 1 à 15 ans dans les pays industrialisés. Parmi eux, les cancers cérébraux sont la deuxième cause de cancers pédiatriques et la cause majeure de mortalité liée au cancer. La radiothérapie est nécessaire et souvent curative pour traiter les tumeurs cérébrales pédiatriques. Cependant, elle est associée à une forte toxicité sur le cerveau en développement entraînant des effets secondaires dramatiques chez les enfants (défauts neurocognitifs sévères, etc). Chez certains patients, la radiothérapie échoue et des récidives tumorales apparaissent suggérant une forme de radiorésistance de ces tumeurs. Chez les très jeunes enfants, le médulloblastome (MB) et les tumeurs rhabdoïdes et tératoïdes atypiques (AT/RT) sont parmi les cancers cérébraux les plus agressifs. En outre, ils sont souvent associés à une rechute et ce malgré d’intensifs traitements classiques associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Ce projet a pour but d’améliorer les connaissances scientifiques en permettant de mieux comprendre les mécanismes de radiorésistance et de toxicité sur le tissu normal. L’objectif est d’identifier de nouvelles cibles ou modalités thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie et de diminuer ses effets secondaires indésirables. De plus, l’étude de l’infiltrat des cellules immunitaire c’est-à-dire l’accumulation de cellules du système immunitaire dans les tumeurs permettra d’identifier les meilleurs traitements d’immunothérapie à combiner à la radiothérapie pour améliorer le contrôle de la tumeur.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la réponse tumorale dans 2 types de cancer pédiatrique permettra de mieux comprendre les mécanismes associés à la rechute et de diminuer les effets secondaires indésirables. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles modalités thérapeutiques telles que la combinaison de traitements d’irradiation avec de l’immunothérapie ou un traitement par thérapie ciblée. La finalité est donc d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets délétères. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres, l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et de toxicité et le second, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront également avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.
Procédures
Des fragments de tumeurs seront placés soit en sous-cutanée soit en interscapulaire sous anesthésie gazeuse (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris), Des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience/ 2 minutes/souris) ou des fragments de tumeurs seront greffés aux animaux sous anesthésie (1 fois par expérience/ 10 minutes/souris), Les tumeurs de ces animaux seront ensuite irradiées (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minutes/souris). Les animaux vigiles recevront un ou plusieurs traitements soit par injection intrapéritonéale, soit par voie orale. (Environ 1 minutes/souris). Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau sous anesthésie gazeuse (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris) puis suivi à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Le cerveau de ces animaux sera ensuite irradié en préservant les bulbes olfoactifs et la gorge (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal) – acte réalisé sous anesthésie). Afin d'évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de moins de 10 minutes par animal). Enfin, des animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau en veillant à préserver les bulbes olfactifs (1 irradiation - durée de l'anesthésie environ 10 minutes). Puis pour évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de 10 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Des cellules ou des fragments de tumeurs seront implantées chez des souris. Ces souris développeront des tumeurs et pourront recevoir des traitements tel qu’un protocole d’irradiation, un traitement ciblé et/ou une immunothérapie. Suite à la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Suite à l’irradiation d’une partie du corps de l’animal, une perte de poids pourrait être observée durant 15 jours post-irradiation. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé . Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liés au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles : des progéniteurs neuronaux (= progéniteurs des cellules granulaires (GCP)) dissociés et purifiées à partir de cervelet de souriceaux âgées de 3 à 8 jours, des lignées cellulaires sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales sont toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblés seront testés in vitro, seul ou en combinaison à l’irradiation et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales . Concernant les traitements d’immunothérapie, ils ne peuvent être testés qu’in vivo du fait de la nécessité d’avoir un système immunitaire complet au sein d’un organisme. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ou modalités ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur le tissu sain par des tests de comportement à plus ou moins long terme qui permettent d’étudier les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients après radiothérapie. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (cultures in vitro) l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
1-Pour minimiser le nombre d’animaux tout en cherchant à répondre aux objectifs scientifiques, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études pilotes pourront être réalisés pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. L’utilisation des patient derived xenograft qui sont des fragments de tumeurs obtenus chez des patients fraichement opérés (PDX) et qui sont maintenues sur animaux vivants est mutualisée avec les autres projets au sein de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce présent projet est un nombre maximum, mais il sera sans doute réduit. 2- Le nombre d’animaux à utiliser a été défini à l’aide d’outils statistiques
Raffinement
Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Lorsque cela est possible scientifiquement, nous choisissons la méthode la moins invasive comme par exemple le choix du site d’implantation en sous cutané pour le maintien des PDX contrairement à un maintien qui aurait également pu être fait en orthotopique. L’injection de cellules dans le cerveau exprimant un marqueur permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive d’imagerie. L’imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie. Une procédure d’entrainement du personnel permettra de transmettre les gestes techniques de manière sûre aux nouveaux personnels en diminuant ainsi le stress et l’angoisse chez la souris. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Dès atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes ainsi que l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. La majorité des animaux seront utilisés au stade adulte soit à 7 semaines Greffées à l’âge adulte, ce modèle de génération de tumeur est communément utilisé et bien maîtrisé (reproductible). La bonne connaissance de nos modèles sur les souris adultes nous ont conduit à réaliser ces expériences sur adultes pour garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser. Concernant les greffes en sous-cutanés, les tumeurs seraient rapidement trop volumineuses par rapport à la taille de l’animal si nous la réalisions chez le souriceau. Nous utiliserons également des jeunes souriceaux non sevrés à 2 jours et 9 jours pour comparer l’infiltrat immun en fonction du stade de développement. Pour les tests comportementaux, des jeunes souris de 10 jours seront utilisés car à cette période, le cerveau est en plein développement (prolifération des progéniteurs neuronaux) tout comme l’est celui des jeunes enfants atteints des cancers pédiatriques étudiés.
Etude de l’efficacité de molécules pharmaceutiques dans un modèle d’induction de lésion pulmonaire aiguë par injection intranasale de lipopolysaccharides chez la souris et le rat.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Rats : 513
847 souris et 513 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une endotoxine bactérienne leur est instillée dans le nez sous anesthésie gazeuse pour provoquer une lésion pulmonaire aiguë avec œdème, puis ils reçoivent par voie orale, une à deux fois par jour, les composés d'une société pharmaceutique, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort pour analyse histologique des poumons. Le porteur annonce vingt-cinq études sur ce modèle. Il présente le choix de la voie nasale plutôt que trachéale comme "un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire", la dégradation de la fonction respiratoire provoquée restant selon lui "limitée" parce que ces études durent 24 heures.
Objectifs
La lésion pulmonaire aiguë (ou ALI pour acute lung injury) est une forme d'insuffisance respiratoire, caractérisée par une atteinte pulmonaire inflammatoire diffuse aiguë qui entraîne une augmentation de la perméabilité des capillaires alvéolaires et un œdème pulmonaire non hydrostatique. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), forme la plus invalidante d’insuffisance respiratoire, représente encore une cause importante de mortalité chez les patients. Nous souhaitons développer un modèle in vivo d’inflammation pulmonaire aigue pour une évaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques développés par notre société. Les modèles murins d’infection intranasale par le LPS (une endotoxine) constituent des modèles de choix pour cette pathologie. Cette endotoxine d’origine bactérienne provoque une réponse inflammatoire importante chez les animaux et chez l’Homme. L'administration intranasale du LPS provoque une réponse inflammatoire pulmonaire rapide et locale à court terme. Ce modèle aigu nous permettra de relier l’efficacité à l’exposition pulmonaire de nos composés (pharmacodynamique). La voie d’administration intranasale est également moins invasive que l’injection par voie intratrachéale (avec ou sans chirurgie). Selon la littérature scientifique, la reproductibilité et l’impact sur l’inflammation et les lésions du tissu pulmonaire semblent être comparables entre les deux voies d’administration. Ainsi, le modèle LPS intranasal offre un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire. Ce modèle de lésion pulmonaire aigue se rapproche fortement du phénomène inflammatoire observé chez l’Homme lors d’atteintes pulmonaires aiguës. En termes de mécanisme d’action, la production excessive de molécules du stress oxydatif, induite par l’administration de LPS, joue un rôle déterminant dans le déclenchement et le maintien de la réponse inflammatoire aigüe. Ce modèle constitue donc un modèle de choix pour évaluer nos composés pharmacologiques ciblant le stress oxydatif.
Bénéfices attendus
La lésion pulmonaire aiguë, par son stade aggravé (le syndrome de détresse respiratoire aiguë - SDRA), est un syndrome clinique sévère courant en unité de soins intensifs, qui conduit à une forme d'insuffisance respiratoire, entraînant une mortalité jusqu’à 30 à 40 %. Les résultats attendus dans ce modèle nous permettront d’identifier rapidement les molécules avec le meilleur potentiel thérapeutique. Par ailleurs, les mécanismes inflammatoires impliqués correspondent parfaitement au mode d’action de nos molécules. Cela nous permettra de valider leur action dans ces processus inflammatoires. Ces molécules pourront par la suite être incluses dans le processus de développement pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
L’administration intranasale de LPS se fera sous anesthésie gazeuse en moins d'une minute. Une contention légère permettra le traitement par voie orale en 20 secondes, 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie gazeuse (moins de 1 minute) avant euthanasie (sans réveil entre les 2 actes).
Impact sur les animaux
Le LPS a pour effet une dégradation de la fonction pulmonaire, malgré tout limitée pour ces études de 24h. La légère contention nécessaire pour le traitement par voie orale, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prelever les tissus pulmonaires afin d'analyser l'évolution de la maladie en histologie.
Remplacement
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leur mécanisme d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Pour évaluer l’activité des composés in vivo, il est indispensable de recourir ensuite à l’utilisation de modèles animaux intégrant au mieux la physiopathologie humaine (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammation…). Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro et c’est pour cela que ce modèle in vivo est nécessaire. De plus, ce modèle vivo est décrit dans la littérature scientifique et a été validé avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été utilisé par le passé pour développer des molécules au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux maximum nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront utilisés. Nous optimiserons les études pour utiliser le moins de groupes contrôle possible. Ainsi, 25 études seront réalisées dans ce porjet.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. La voie d’administration intranasale est privilégiée par rapport à l’infection intratrachéale pour éviter une contention forte (injection par otoscope et sonde) ou de la chirurgie. Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. La formation du personnel, la taille de la sonde et l’adaptation des volumes administrés permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Après réception, un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager le comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces dont les manifestations inflammatoires sont les plus connues et se rapprochent le plus de celles de l’Homme dans ce modèle. Comme décrit dans la littérature, la souris est le modèle animal le plus utilisé pour ce modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par le LPS. Il est approprié car plusieurs signes physiopathologiques caractéristiques de cette atteinte inflammatoire ont été rapportés dans la littérature scientifique. Nous établirons également le modèle chez le rat si nécessaire, dans le cas de composés ayant une pharmacocinétique plus favorable chez le rat par rapport à la souris. L’implication du stress oxydatif dans ce type de pathologie a été rapporté dans la littérature scientifique via des études in vivo. Basé sur la littérature scientifique et sur notre expérience antérieure sur le modèle, les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines d’âge à l’induction de l’inflammation.
Rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’homéostasie, l’inflammation colique et le cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Une colite est provoquée chimiquement chez 1 962 souris, qui peuvent alors perdre du poids, saigner dans les selles et par le rectum, et développer un prolapsus anal. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Le porteur qualifie pourtant les produits administrés de "non toxiques et non irritants" et annonce comme seule nuisance attendue une gêne de courte durée au point d'injection, avant de décrire une inflammation de l'ensemble du tractus intestinal. Les souris sont mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour des analyses portant sur le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes du côlon.
Objectifs
Le côlon est un organe formé d’une monocouche de cellules dites épithéliales qui s’invaginent de façon à former des cryptes. Ces cryptes participent à l’absorption et à la digestion. Cette barrière physique (les cellules épithéliales) est constamment en contact avec des agents extérieurs : microorganismes provenant du microbiote ou du bol alimentaire par exemple. Ainsi, le côlon est protégé par de nombreuses structures lymphoïdes : ce sont des agrégats de cellules immunitaires situés entre les cryptes du côlon. Ces cellules immunitaires, principalement des lymphocytes (d’où le terme de structure lymphoïde), sont présentes pour à la fois tolérer le microbiote mais également déclencher la défense immunitaire en cas d’infection par un agent pathogène par exemple. Au niveau architectural, les structures lymphoïdes sont formées d’un réseau de cellules hautement contractiles appelées fibroblastes, entre lesquelles naviguent les cellules immunitaires. Lors d’une réaction immunitaire, les structures lymphoïdes augmentent leur volume afin de recruter plus de cellules immunitaires et augmenter la puissance et la vitesse de réponse à l’inflammation. Ce phénomène est régulé par le réseau de fibroblastes de la structure lymphoïde, qui se contracte ou se relaxe pour modifier le volume de la structure. Les fibroblastes jouent donc un rôle important dans le fonctionnement de la réponse immunitaire locale via les structures lymphoïdes. Cependant, aucune étude n’a été réalisée au niveau des structures lymphoïdes du côlon, alors que cet organe est constamment mis à l’épreuve par l’environnement extérieur (via le microbiote notamment). Dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI), le côlon est dans un état inflammatoire important. Cette inflammation chronique du tissu peut être due à une dérégulation du système immunitaire dans le côlon. Chez les patients atteints de MICI, il existe un risque plus élevé de développer un cancer colorectal. Notre projet vise à caractériser le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’homéostasie (c'est-à-dire en conditions physiologiques, en l'absence d'inflammation), l’inflammation du côlon, et le cancer colorectal
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre à court terme d’étudier le rôle de la contractilité des fibroblastes dans la régulation des structures lymphoïdes décrites ici dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.
Procédures
Dans un premier lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera administré aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un deuxième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Ces animaux seront ensuite répartis en 3 groupes, un premier groupe reçevra un second traitement sur 8 jours en continu puis auront une période convalescence de 0 à 60 jours. Le deuxième groupe recevra le même second traitement mais sur 3 cycles de 5 à 8 jours avec 7 jours de repos entre chaque cycle puis une convalescence de 7 à 60 jours. Enfin le troisième groupe recevra un autre traitement à raison d’une fois par semaine sur 4 semaines (durée du geste inf à 10 sec). 2h avant la mise à mort, une partie de chacun des groupes, recevra un dernier traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un troisième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Les animaux auront un second traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). De plus, un autre traitement sur 4 jours à 3 cycles (repos de 4 à 17 jours entre chaque cycle) sera réalisé. Les animaux seront suivis par coloscopie sous aneshtésie (durée du geste 5 min). Enfin, 2h avant la mise à mort, tous les animaux recevront un autre traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Finalement, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min).
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection. L’administration de nos traitements peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal. Les animaux utilisés lors des procédures peuvent présenter une perte de poids, des saignements dans les selles et rectaux. Ces effets pourront être observés en cours de traitement et jusqu’à 1 semaine après l’arrêt du traitement. La coloscopie peut engendrer une irritation transitoire du côlon.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) le cancer colorectal ainsi que (iii) les interactions entre les différentes populations immunitaires, les fibroblastes et les cellules épithéliales adjacentes. Dans l’état actuel de notre projet, les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon et le cancer colorectal (interactions cellulaires multiples et complexes). Il est difficile de reproduire la complexité du système immunitaire et de son interaction avec les cellules épithéliales à l’aide des organoïdes. Cependant, nous envisageons, dans une étape ultérieure, d’utiliser des organoïdes de côlon en co-culture avec des cellules immunitaires afin de répondre à des questionnements plus spécifiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, les croisements de souris seront optimisés pour produire le nombre d'animaux souhaité de génotype d’intérêt. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique. Tous les animaux seront utilisés pour des analyses post-mortem.
Raffinement
Les animaux seront suivis attentivement : mesure du poids cinq fois par semaine voire quotidienne (week-end inclus) à partir de 20% de perte de poids, surveillance du rectum (présence de prolapsus anal) et des selles (présence de diarrhées), aspect et comportement (signes de détresse), afin de détecter tout signe de souffrance. De plus, de précédentes études ont permis de déterminer les doses optimales de nos traitements afin d’optimiser les résultats obtenus tout en minimisant l’impact sur les animaux. Les gestes douloureux ou invasifs seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Une grille de score adaptée aux procédures réalisées est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas de perte de poids, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite spontanée ou chimio-induite. En cas de déshydratation, une injection de soluté réhydratant chaud sera administrée. Le gel nutritif peut être proposé en complément de l’injection. Enfin, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive grâce à la recherche de marqueur de l’inflammation dans les selles.
Choix des espèces
La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage qui permet l’obtention rapide de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude des maladies chroniques du tractus intestinal et du cancer colorectal. De plus, cela nous permet d’étudier le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’inflammation colique et le cancer colorectal. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire mature.
Identification de marqueurs d’inflammation dans des cellules cérébrales humaines greffées chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour chercher des marqueurs d'inflammation dans des cellules cérébrales issues de patients atteints de troubles psychiatriques, 480 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection intracrânienne de cellules humaines sous anesthésie, puis, adultes, une substance inflammatoire qui provoque un état fébrile et une baisse d'activité, avant une chirurgie terminale. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé. Aucun calcul n'est donné pour justifier ce nombre de 480, le porteur indiquant seulement que les effectifs ont été déterminés et que des tests statistiques adaptés seront utilisés.
Objectifs
Les traitements actuels des maladies psychiatriques sont peu efficaces et ont des effets secondaires lourds pour la majorité des patients donc de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires. Une augmentation de l’inflammation est observée chez les patients et semble impliquée dans l’apparition de certains symptômes, comme le suicide. Néanmoins, le rôle de l’inflammation dans le cerveau est encore peu étudié dans le cadre de ces pathologies. Dans ce contexte, ce projet vise à une meilleure connaissance de la réponse à l’inflammation des cellules dérivées de patients greffées chez la souris pour la recherche de marqueurs et de nouvelles approches thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Une meilleure connaissance des processus inflammatoires des cellules du cerveau humaines dans le cadre de pathologies psychiatriques avec l’objectif de trouver de nouvelles cibles et approches thérapeutiques pour les malades.
Procédures
Injection intracrânienne sous analgésie et anesthésie, une fois, 5-10 minutes ; injection intrapéritonéale : une ou deux fois, 30 secondes ; injection sous-cutanée : une fois, 30 secondes ; administration d’une substance inflammatoire : une fois, 24 heures; chirurgie terminale sous analgésie et anesthésie profonde, une fois, 5 minutes.
Impact sur les animaux
Injection intracrânienne : douleur modérée et stress ; injections intrapéritonéale et sous-cutanée: douleur légère et stress de courte durée ; administration de substance inflammatoire : état fébrile et baisse d’activité de courte durée
Devenir
A la fin de la Procédure tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement et analyse du cerveau.
Remplacement
Des études in vitro ont été effectués et ont montré que les cellules des patients sont dans un état inflammatoire. Néanmoins, il manque encore une technologie capable de remplacer l’environnement cérébrale dans sa globalité, qui est nécessaire pour le développement à maturité de certains types cellulaires, dont celles utilisées dans ce projet. Pour cette raison, l’utilisation du modèle animal est nécessaire.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad libitum. Les procédures chirurgicales sont de courte durée et effectuées sous analgésie et anesthésie. Une grille est mise en place avec des points limite stricts et spécifiques au projet.
Choix des espèces
La souris a été choisie car des modèles immunodéficientes permettant la survie et intégration des cellules humaines dans le cerveau existent. Les animaux seront utilisés pour les greffes au stade nouveau-né pour permettre la maturation des cellules greffés et analysés au stade adulte (3 mois).
Étude de la fonction cardiaque de souris surexprimant des lamines mutantes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées ici portent une mutation qui leur fait développer une cardiomyopathie vers trois à quatre mois de vie. 240 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent une injection intraveineuse à un mois puis passent une échocardiographie sous anesthésie chaque mois pendant six mois, l'anesthésie pouvant provoquer un stress thermique et, plus rarement, un arrêt cardio-respiratoire. Leur mise à mort sert à prélever les organes pour analyser l'effet des modifications de phosphorylation des lamines sur le muscle cardiaque.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre comment certains changements spécifiques (appelés phosphorylations) sur les lamines affectent le cœur. Les lamines sont des protéines essentielles qui aident à organiser l'ADN à l'intérieur des cellules. Jusqu'à présent, l'effet de ces changements lorsqu'ils se produisent sur les lamines n'est pas connu. Bien que ces protéines soient présentes dans tout le corps, des modifications dans leur structure peuvent conduire à des maladies du cœur, comme la cardiomyopathie. L'objectif de ce projet est de déterminer l'impact de ces modifications des lamines sur les cardiomyocytes.
Bénéfices attendus
Ce projet peut aboutir à la première démonstration du rôle des lamines (protéines) phosphorylées sur l'atteinte cardiaque dans la cardiomyopathie due à des mutations d'un gêne spécifique. Ces travaux pourraient permettre d'identifier de nouvelles approches therapeutiques, en bloquant certaines phosphorylations qui auraient un rôle déletère sur la fonction cardiaque.
Procédures
Les animaux seront soumis à : -une injection intraveineuse unique dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention et injection), le geste s'effectue rapidement en quelques secondes -une echocardiographie tous les mois, pendant 6 mois, sous anesthésie (6 fois par animal). La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris. -une euthanasie en fin de protocole par méthode réglementaire en vue des prélevements tissulaire pour analyse.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dus à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée qui développe une pathologie cardiaque induisant une insuffisance cardiaque (10 mois pour les mâles et 12 mois pour les femelles). L’anesthésie peut induire un stress thermique et dans de rares cas des complications (arrêt cardio-respiratoire). Il peut egalement y avoir une inflammation au site d'injection. L'injection intraveineuse peut etre source de stress et de douleur de courte durée au point d'injection.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire des mécanismes cellulaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification des rôles pathologiques des modifications de phosphorylation des lamines (protéines) sur la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement chez la souris. Les souris mutantes récapitulent les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie. Néanmoins, autant que possible et si la question posée peut être résolue ainsi, des expériences in vitro avec des lignées cellulaires seront réalisées pour limiter au maximum le recours à l'utilisation de souris.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Le plan expérimental de ce projet a été déterminé à l’aide d'un logiciel dédié aux statistiques permettant de calculer le nombre minimum d’animaux par groupe pour obtenir des données quantitatives pertinentes pour les analyses statistiques. Néanmoins, 20 animaux par groupe (pour 12 groupes) seront malgré tout nécessaire (pour un total de 240 souris) pour permettre une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont définis dans l’agrément de l’établissement utilisateur. Les animaux sont acclimatés 1 semaine minimum. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Les zootechniciens assurent un contrôle des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier des cages, un nombre réduit d’animaux par cage (6 maximum hors cages d’accouplement). Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des bâtons à ronger. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de nécroses ou escarres). Des points limites ont été définis pour être suffisament prédictifs. Notre connaissance approfondie de l'histoire naturelle du developpement du phénotype chez le modèle souris (plus de 20 ans avec cette lignee de souris), permet de déterminer précisement la progression de l'atteinte cardiaque et en particulier l'âge.
Choix des espèces
Nous allons étudier les roles pathologiques des modifications de phosphorylation des lamines (protéines) dans un modèle de cardiomyopathie génétique. Le modèle récapitule les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie. Les souris seront utilisées jusqu'à 7 mois de vie (injection à 1 mois et suivi longitudinal pendant 6 mois). Les souris mutantes developpant une pathologie cardiaque vers 3-4 mois de vie, nous voulons nous placer en amont de ce stade pour pouvoir conclure des effets des construtcions mutantes.
Mécanismes de régulation de la réponse vaccinale par les protéines de liaison à l’ARN
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
8 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection d'antigènes puis une prise de sang tous les sept jours, et une partie d'entre elles est irradiée pour que son système immunitaire soit reconstitué à partir de moelle osseuse prélevée sur des souris donneuses. Le porteur situe la douleur du côté de cette irradiation, des injections de cellules et des biopsies de génotypage, et décrit l'épisode d'auto-immunité observé dans certains cas comme sans effet sur le bien-être de l'animal. Il indique par ailleurs que sept souris par groupe suffisent à obtenir des résultats concluants et que chaque expérience sera répétée trois fois, sans expliquer comment on parvient de là à 8 694 animaux.
Objectifs
L'aide entre lymphocytes B et T est une partie indispensable dans notre système immunitaire pour la génération d'anticorps de haute affinité qui nous protègent contre les infections. Nos travaux précédents montrent que la régulation des ARNs dans les lymphocytes B et T est essentielle pour développer cette protection immunitaire. Donc, avec l'utilisation de modèles de souris, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l'amplitude et l'extension des réponses immunitaires pour le développement de futures thérapies vaccinales. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 - Comprendre les interactions des lymphocytes T et B dans un contexte physiologique après immunisation, et 2 - Étudier l’importance de la régulation des ARNs par les protéines de liaison à l'ARN dans les mécanismes d’activation du système immune.
Bénéfices attendus
Nous avons sélectionné des modèles de souris pour évaluer l'importance des mécanismes qui régulent des ARNs tels que l'épissage, la traduction et la dégradation de l'ARNm. Le rôle de ces mécanismes dans le bon fonctionnement des lymphocytes B et T est peu exploré mais essentiel comme nous l'avons récemment rapporté. Nos études apportent des connaissances importantes sur la biologie des ARNm et le fonctionnement des lymphocytes B et T pour une meilleure optimisation des stratégies de vaccination basées sur l'ARN.
Procédures
Toutes les souris (contrôle et déficient en une protéine régulatrice de l'ARN) seront vaccinées avec des antigènes modèles par injection intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une prise de sang sera réalisée tous les 7 jours pour surveiller la réponse immunitaire. Les organes seront collectés après l'euthanasie. Certaines souris seront irradiées pour reconstituer leur système immunitaire avec des cellules de moelle osseuse provenant de souris donneuses. Dans d’autres cas, des lymphocytes B et/ou T avec des récepteurs de cellules T ou de cellules B spécifiques seront transférés à des souris hôtes avant la vaccination et évaluation du système immunitaire. Avant d'effectuer une procédure, le génotypage de tous les animaux sera déterminé par PCR après prélèvement d'une biopsie tissulaire.
Impact sur les animaux
La vaccination avec des antigènes émulsionnés dans un adjuvant n'a aucune conséquence dans nos modèles des souris. La souffrance et la douleur dans nos procédures sont principalement associées à l'irradiation de souris pour la reconstitution de cellules immunitaires, à l'injection de cellules ou d'antigènes et à des prélèvements de sang ou d’une biopsie tissulaire. Nous avons observé le développement d'un épisode d'auto-immunité léger dans certains cas mais il n'affecte pas la vie ou le bien-être de l'animal. Cet épisode disparaîtra au bout de 3 semaines, après la génération de nouvelles cellules T régulatrices fonctionnelles.
Devenir
Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.
Remplacement
Aucune alternative à l'utilisation de souris n'est disponible. Les réponses immunitaires contre les agents pathogènes sont des mécanismes complexes qui ne peuvent être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures ne retranscrivent pas la physiologie du système immunitaire.
Réduction
Les directrices ARRIVE et du Comité d'éthique sont suivies pour garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d'animaux. La stratégie d'élevage produit des souris tests et contrôles. Les souris seront sevrées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d'animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. En général, nous aurons besoin de 7 souris par groupe pour l’obtention de résultats statistique concluants. Nous répéterons chaque expérience 3 fois pour tester la reproductibilité.
Raffinement
Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Les utilisateurs ont reçu une formation spécialisée officiel que leur permettant le raffinement des procédures. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces points limites sont associés à une reconstitution défectueuse du système immunitaire mais pas à la vaccination avec des antigènes modèles (qui sont asymptomatiques). Des zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage.
Choix des espèces
La dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris est similaire à celle observée chez l'homme. En outre, il est connu que les mécanismes moléculaires régulés par de telles protéines de liaison à l'ARN sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Ainsi, ces modèles de souris nous permettront d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace dans un contexte physiologique de maladies immunitaires et de pathologies inflammatoires. Pour ces raisons, nous avons généré de nouvelles souris transgéniques knock-out pour étudier le rôle des protéines de liaison à l'ARN impliquées dans l'épissage, la maturation et la traduction de l'ARN dans la réponse immunitaire. Les procédures 1, 2 et 4 seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant. Le transfert de cellules B et T afin de reconstituer ces compartiments immunitaires (procédure 3) peut être réalisé chez les jeunes souris et après sevrage (3 semaines) pour favoriser l'expansion des lymphocytes innés.
Etude de l’effet préventif de la néoglucogenèse intestinale sur la plasticité neuronale de l’hypothalamus et le statut métabolique et énergétique chez la descendance née de mères avec un régime alimentaire déséquilibré. 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Les 64 mères nourries au régime hypercalorique sont tuées dès leurs petits sevrés, leur état prédiabétique rendant leur maintien en vie, écrit le porteur, non souhaitable. Ce second volet du même projet mobilise les mêmes 464 souris, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré, 96 reproducteurs étant gardés pour produire d'autres animaux transgéniques. Les mesures faites ici portent sur la composition corporelle sous contention et sur 48 heures en cage individuelle pour la dépense énergétique, après des prises de sang à la queue et des injections de glucose ou d'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement ne peut être employée, seule l'étude chez "l'animal entier" donnant accès à la complexité des mécanismes en jeu.
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante qui ne peut être attribuée uniquement aux modifications individuelles du régime. Un développement anormal des régions du cerveau impliquées dans la régulation du poids, pourrait participer à l’apparition de ces pathologies. Le développement de ces régions prend place en période périnatale et est affecté par un environnement maternel obèse et/ou diabétique. Chez la souris, un régime maternel hypercalorique induit chez les descendants des altérations du développement du cerveau et du métabolisme énergétique. La production intestinale de glucose est capable de transmettre des signaux au cerveau en réponse à l’alimentation. La production intestinale de glucose est fortement induite dans les dix premiers jours suivants la naissance, puis décroit progressivement jusqu’au sevrage. La production intestinale de glucose pourrait donc moduler le développement du cerveau spécifiquement dans cette période. Chez l’adulte, l’activation de la production intestinale de glucose a des effets anti-diabète et anti-obésité. Notre hypothèse est qu’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des souris nées de mères nourries avec un régime hypercalorique permettrait de contrecarrer les effets délétères de ce régime sur le métabolisme et le développement du cerveau. Pour vérifier cette hypothèse, nous comparerons les effets d’une activation de la production intestinale de glucose en période périnatale chez des petits nés de mères nourries en régime normal ou hypercalorique sur : 1/ le développement du cerveau, 2/ leur métabolisme à l’âge adulte. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU 1/2 et EU 2/2).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre les effets de programmation d’un régime maternel hypercalorique (induisant une légère résistance à l’insuline) sur le développement cérébral et sur le métabolisme de la descendance mâle et femelle et de déterminer si l’activation de la production intestinale de glucose peut être une cible nutritionnelle préventive efficace pour éviter et/ou limiter ces effets négatifs.
Procédures
176 souris mères subiront 5 prélèvements de sang à la queue pendant la période d’accouplement, de gestation et de lactation (de 30 secondes chacun) après 2h de jeûne. 48 souris mères subiront deux injections (une injection de glucose et une injection d’insuline, espacées d’une semaine) lors des tests servant à l’analyse métabolique. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (durée de 3 secondes chacun) et un prélèvement de quelques dizaines de microlitres (30 secondes). Les tests seront réalisés à l’EU 1/2. Une mesure de la composition corporelle des 48 mères sera réalisée chez l’animal éveillé par un analyseur dédié. La mesure n’engendre pas de souffrance particulière, elle est rapide (2 minutes) et non invasive. La mesure de la dépense énergétique se fait, de manière non-invasive et sur 48 heures (mesure des échanges gazeux, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée). Ce suivi des mères depuis la période d’accouplement et jusqu’au sevrage permettra de caractériser leurs statuts hormonal et métabolique. Ces 2 mesures seront réalisées à l’EU 2/2. 256 souriceaux descendants subiront une biopsie de l’extrémité de la queue (inférieure à 1mm) à l’aide de ciseaux de microchirurgie, par un technicien expérimenté afin d’établir le génotype de l’animal (EU1/2). Parmi ces derniers, 64 souris subiront une chirurgie terminale suite à une injection d’analgésique et d’anesthésique (10 secondes chacune) afin de prélever les organes. Cette procédure servira aux analyses au niveau du cerveau (EU1/2). Les autres descendants (192 animaux) subiront 3 prélèvements de sang à la queue (30 secondes chacun) à 3, 5 et 11 semaines d’âge qui permettront le dosage des hormones régulant le taux de glucose sanguin et l’appétit (EU1/2). Ces animaux subiront 4 tests pour l’analyse de leur métabolisme glucidique qui évolue avec l’âge : 2 tests à 7 semaines d’âge puis 2 tests à 14 semaines. Les 2 tests, espacés d’une semaine sur les mêmes animaux, nécessitent deux injections. Après chaque injection, les souris auront 7 prélèvements d’une goutte de sang (3 secondes chacun) et un prélèvement plus important (30 secondes). De plus, dans des conditions identiques aux mères, leur métabolisme énergétique sera étudié par une mesure de composition corporelle chez l’animal éveillé (par un analyseur dédié sans engendrer de souffrance particulière, temps moyen de 2 minutes) et par la mesure de la dépense énergétique sur 48 heures (EU2/2).
Impact sur les animaux
Le régime hypercalorique entraine une prise de poids et une résistance à l’insuline (caractéristique d’un état prédiabétique) au bout de 8 semaines mais ne provoque pas de diabète avant 16 semaines. Les mères ainsi que les descendants qui subiront l’analyse métabolique recevront, lors de deux tests, une injection (soit de glucose ou d’insuline) réalisée par notre personnel qualifié, ce qui assurer la réussite de l’injection et limite les irritations. L’injection d’insuline est susceptible de causer une hypoglycémie. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. La mesure de la dépense énergétique se fait dans des cages individuelles pendant 48 heures, ce qui peut engendrer un stress. Les nouveau-nés subiront une très petite biopsie du bout de la queue (moins de 1 mm) pour déterminer le génotype, qui sera réalisée entre 5 et 7 jours, en même temps que l’identification par tatouage de la première phalange, ce qui peut engendrer une légère douleur.
Devenir
Les 64 souriceaux seront mis à mort afin d’analyser le développement du cerveau. 48 mères et 192 descendants adultes (240 animaux en total) seront mis à mort afin de collecter les organes tels que le foie, les intestins et les reins permettant l’analyse en biologie moléculaire de la production de glucose par ces 3 organes. Les 96 animaux replacés (64 mères et 32 pères sous régime standard) serviront à produire d’autres animaux transgéniques pour l’établissement utilisateur EU 1/2. Les 64 mères ayant reçu un hypercalorique pendant 8 à 12 semaines développent un léger état prédiabétique qui peut s’aggraver à long terme. Leur maintien en vie dans ces conditions n’est donc pas souhaitable. Elles seront mises à mort une fois que leurs petits seront sevrés.
Remplacement
La production intestinale de glucose contrôle le cerveau via un relais nerveux. La détection, la transmission et l’intégration de ce signal sont réalisées par les connections nerveuses entre l’intestin et le cerveau. Ce projet nécessite de conserver ces communications inter-organes et sera donc réalisé in vivo dans des modèles de souris transgéniques surexprimant la production intestinale de glucose.
Réduction
Le nombre maximal d’animaux utilisés a été estimé à 464 souris sur une période de 5 ans. Le nombre de mères nécessaires par groupe a été calculé au plus juste afin d’optimiser les naissances, particulièrement pour obtenir une production suffisante à la formation de groupes bénéficiant d’un environnement maternel homogène, condition nécessaire pour les études de l’environnement périnatal. Le nombre de souris utilisées pour chaque expérience a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 12 souris par groupe. Notre personnel qualifié, permet de standardiser nos expérimentations afin de diminuer les sources extérieures de variabilité. A la fin de chaque procédure, des analyses statistiques adéquates seront réalisées. Si aucune différence n’est observée entre les individus mâles et femelles, les données seront regroupées pour augmenter le nombre d’échantillons. Dans un objectif de réduction du nombre de femelles reproductrices, à 3 jours, les portées seront équilibrées à 6 ou 7 petits. Les petits excédents par mère seront « adoptés » par les mères ayant un nombre inférieur. Les souriceaux obtenus en surplus de la quantité requise pour les procédures de ce projet seront élevés dans l’établissement utilisateur et utilisés dans des protocoles expérimentaux ultérieurs. Enfin, cette étude sera réalisée chez des descendants défiés ou non à un régime hypercalorique à l’âge adulte. La réalisation du dernier lot du projet est conditionnée aux résultats des lots précédents et ne sera peut-être pas effectuée.
Raffinement
Les souris sont hébergées par groupes, en milieu enrichi (frisottis, maison en carton, coton). Elles sont surveillées quotidiennement, et pesées au moins 2 fois par semaine. Dans le cas de toute modification physique ou comportementale, la surveillance sera accentuée. Si l’animal ne parvient pas à se rétablir, la mise à mort est envisagée pour raison éthique. Pour raffiner les reproductions et les adoptions croisées, les femelles seront synchronisées pour leur reproduction, en ajoutant de la litière de mâle souillée dans leurs cages, avant le démarrage des accouplements. Lors des prélèvements de sang à la queue, l’incision du bout de la queue n’est réalisée qu’une seule fois après application d’un analgésique local. Lors de la prise de sang, l’animal est libre de ses mouvements sur la grille de la cage et n’a pas besoin d’être maintenu. Les souris seront transportées dans des cages de transport, placées dans un double sac fermé permettant de conserver le confinement et en véhicule climatisé, de l’établissement ½ vers l’établissement 2/2. La mesure de composition corporelle sera réalisée chez l’animal éveillé. A l’issue de la mesure, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine. La mesure de la composition corporelle est réalisée sous contention et engendre donc un léger stress. Pour éviter que celui-ci perturbe la mesure de dépense énergétique, un délai de 24h sera laissé avant son évaluation. Le système utilisé permet une mesure non-invasive des échanges gazeux respiratoires, de la prise alimentaire et hydrique et de l’activité spontanée des animaux. Afin d’habituer les souris aux conditions de mesure, elles seront placées dans les cages individuelles 24h en conservant une partie de leur litière et l’enrichissement utilisé dans leur cage d’hébergement. A la fin de la période d’enregistrement, les souris seront remises dans leur cage d’origine avec un enrichissement renforcé. Le stress de l’isolement semble très modéré car au vu des protocoles réalisés sur la plateforme, les animaux remis dans leur cage d’origine après les mesures ne présentent pas de troubles de comportement (bagarre, isolement).
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par le foie et l’intestin sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. De plus, seule une étude chez l’animal entier incluant la complexité des mécanismes physiologiques mis en jeu lors du développement de maladies métaboliques, peut permettre d’atteindre l’objectif de ce projet. Aucune méthode de remplacement ne peut donc être employée. Dans ce projet, nous étudierons l’impact de la production intestinale du glucose sur le développement cérébral qui prend place pendant les trois semaines qui suivent la naissance. Nous utiliserons donc des animaux au stade précoce (21 jours après la naissance). La résistance à l’insuline se développe avec l’âge chez les souris. Il est donc nécessaire d’avoir une analyse des paramètres biologiques des individus à plusieurs stades de la vie. Nous analyserons ces 2 paramètres à 7 semaines (période de puberté) ainsi qu’à 14 semaines d’âge (stade adulte). Dans ce projet, nous étudierons l’impact de la PIG sur le développement cérébral qui prend place en période périnatale chez des descendants de mères ayant un régime alimentaire déséquilibré. Les circuits alimentaires hypothalamiques continuent à se développer pendant la période postnatale chez les rongeurs. Les altérations qui prennent place durant cette période sont toujours visibles chez l’adulte. Nous utiliserons donc des animaux au stade précoce post-natal (21 jours après la naissance). La résistance à l’insuline se développe avec l’âge chez les souris C57BL6J. Il est donc nécessaire d’avoir une analyse des paramètres glycémiques et énergétiques des individus à plusieurs stades de la vie. Nous analyserons ces 2 paramètres à 7 semaines (période de puberté) ainsi qu’à 14 semaines d’âge (stade adulte).
Modèle nutritionnel de calculs biliaires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire pour provoquer des calculs biliaires, elles reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans la veine sous anesthésie, subissent huit prises de sang, parfois après quatre heures de jeûne, et passent 20 heures isolées sur grille en cage à métabolisme après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement. Le porteur reconnaît que la répétition des traitements "génère un stress chronique", pour des études qui doivent "valider ou non" des candidats contre les calculs et leurs complications au foie et à l'intestin. Une partie des souris porte une mutation, Mdr2 ko +/-, qui les prive d'un transporteur de phospholipides, et il dit la choisir pour "exacerber l'effet du régime lithogénique" et étudier des stades "plus avancés et plus sévères de la maladie".
Objectifs
La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une cholestase menant à une cholangite sclérosante et une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.
Procédures
Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. Après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme).
Impact sur les animaux
1) La mise sous régime lithogénique, enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires, notamment chez les souris Mdr2 ko +/-. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h.
Devenir
Tous les animaux (1800 souris) seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)
Remplacement
Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.
Raffinement
Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.
Choix des espèces
La souris wild-type développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris Mdr2 ko +/- (FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J heterozygous) est une souris génétiquement modifiée. Elle est dépourvue de transporteurs de phospholipides, ce qui engendre une accumulation de phospholipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.