Recherche fondamentale

Pour corriger l'hyperexcitabilité cérébrale associée à la maladie d'Alzheimer, 918 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit un prélèvement d'oreille pour le génotypage, une chirurgie cérébrale de vingt minutes suivie d'une heure de pose d'électrodes, puis quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré vingt-quatre heures sur vingt-quatre. Des tests sont répétés chaque mois pendant une semaine, dix minutes trois fois pour la mémoire et une heure en arène pour les mouvements, sans que le porteur nomme les épreuves employées. Il annonce de nombreux critères permettant de détecter une détresse et d'arrêter la procédure, sans en citer un seul.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux pour le génotypage auront unprélèvement d'un bout d'oreille (3mm maximum). Les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les nuisances lors d'un prélèvement de tissus pour le génotypage sont essentiellement un léger stress lors de la contention et une douleur légère pendant le prélèvement. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles génétiquement modifiésont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Pour savoir si les animaux sont porteurs du gêne d'intérêt, une biopsie d'oreille sera faite entre 7 jours et 15 jours après la naissance Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés. Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

Placées dans un appareil stéréotaxique après craniotomie pour recevoir un virus dans le cerveau, parfois équipées d'une fibre optique ou d'un émetteur télémétrique implanté dans l'abdomen, 4 404 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines sont isolées pendant sept jours avant injection, pour les besoins des tests de comportement moteur. Le projet consiste à les exposer à "des situations menaçantes imitant le danger dans leur environnement naturel" pour observer si elles fuient ou se figent, et mesurer le rôle des récepteurs CB1 dans ce basculement. Le porteur écrit par ailleurs qu'"un stress mineur est attendu compte tenu des tests comportementaux utilisés".

Objectifs

Les comportements adaptatifs consistent en des actions et des réactions qui reflètent des réponses spontanées ou apprises qui maximisent les chances de survie. Les organismes peuvent adopter des stratégies défensives actives (par exemple, la fuite) ou passives (par exemple, le « congélation ») pour réagir en conséquence et l'équilibre entre ces réponses peut être défini comme l'équilibre actif-passif. Étant donné le rôle récemment découvert du système endocannabinoïde dans les comportements d'adaptation à la peur, cette proposition élucidera l'implication des récepteurs CB1 dans le contrôle de l'équilibre actif-passif des réponses adaptatives. Si l'activation des récepteurs CB1 entraîne généralement l'inhibition du circuit, il est possible qu'ils soient nécessaires lorsque des réponses actives ou passives sont exécutées. Notre nouvelle hypothèse est que les récepteurs CB1 striataux sont des modulateurs neuronaux clés dans l'exécution de différentes réponses comportementales adaptatives, représentant des commutateurs critiques entre des stratégies d'adaptation distinctes et sous-jacentes à plusieurs troubles psychiatriques. Pour ce faire, nous exposerons des souris dépourvues de récepteurs CB1 dans des régions cérébrales spécifiques à des situations menaçantes imitant le danger dans leur environnement naturel et nous utiliserons des outils moléculaires et comportementaux de pointe pour caractériser les mécanismes sous-jacents médiés par les récepteurs CB1.

Bénéfices attendus

Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronale. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux central et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal et vise donc au développement d’outils thérapeutiques pour les troubles associés à un comportement inadapté, y compris les maladies neurodégénératives et neuropsychiatriques.

Procédures

Les injections intra-péritonéales (i.p) se font dans quelques procédures. Cette technique se caractérise par l'injection de substances dans la cavité intrapéritonéale de la région abdominale de l'animal et dure environ 20 secondes (effectuée par une personne expérimentée). Pour la chirurgie et l’injection d’un virus (durée 45 minutes environ), les animaux seront placés dans une boîte contenant de l’anesthésique pour l'induction d'une anesthésie générale. Après tous les soins analgésiques systémiques et locaux, les animaux seront placés dans un appareil stéréotaxique (avec un débit d'anesthésie constant) et une craniotomie sera pratiquée afin d'injecter le virus dans le cerveau à l'aide d'une seringue fixée à une micropompe. Dans le cas de l’implantation d’une fibre optique en verre pour l'enregistrement de l'activité neuronale, une fibre optique sera implantée après craniotomie et injection de virus (durée 60 minutes environ). Certains animaux seront soumis à une autre chirurgie pour l'implantation d'un dispositif télémétrique dans l'abdomen afin d'évaluer les réponses physiologiques associées. Cette intervention ne devrait pas entraîner de complications post-opératoires majeures. Après la chirurgie, les animaux seront placés dans une armoire chauffante (30°C) pendant environ 30 min, puis remis dans leur cage d'hébergement avec de la nourriture humide placée à l'intérieur. Un suivi sera assuré tous les jours pendant 5 jours puis tous les deux jours pendant 1 semaine puis toutes les semaines. Les animaux recevront également un traitement analgésique par injection sous-cutanée une fois toutes les 24 heures pendant 3 jours après la chirurgie. Trois à quatre semaines aprés les chirurgies, les souris seront soumises à des tests comportamentaux afin d’évaluer leurs réponses défensives ainsi que leur locomotion (durée totale de 5-30 minutes).

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie appropriée et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleurs après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures d’injection. Un stress mineur est attendu compte tenu des tests comportementaux utilisés. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures pour prélèvement des cerveaux pour analyses.

Remplacement

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui possèdent un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 14 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience démontre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leurs doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées à la suite des injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaires. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures afin de reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur nécessitant une semaine d'isolement. Les souris seront hébergées avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaires. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoient aussi l’utilisation d’analgésiques pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui possèdent un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-16 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le domaine.

1 280 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre elles subissant sept séances d'ouverture de la barrière sang-cerveau par ultrasons et quatorze injections intraveineuses sous anesthésie. S'y ajoutent, pour d'autres, une chirurgie cérébrale de trente minutes, un prélèvement de queue vers le dixième jour de vie, et vingt et un essais de nage de quatre-vingt-dix secondes dans un bassin circulaire répartis sur six jours. Le porteur reconnaît que ces souris développent vers sept ou huit mois une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement lié aux difficultés d'accès à la nourriture, et que l'épreuve de piscine peut provoquer une hypothermie. Les retombées annoncées pour les malades d'Alzheimer restent au conditionnel et à long terme, quand la paralysie, elle, est programmée par le génotype des animaux.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. L’autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients et s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, une technologie de molécules thérapeutiques de petites tailles, appelée « nano-anticorps » a été développé, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Par ailleurs, un moyen d’ouvrir cette barrière a récemment été décrit par l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, permettant de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autoriser la pénétration de molécules thérapeutiques. De plus, le développement des thérapies géniques a aussi ouvert de nouvelles opportunités pour surmonter les limitations dues à la présence de cette barrière sang-cerveau. En conséquence, ce projet vise à combiner ces technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. En particulier, l’utilisation de nano-anticorps visant les agrégats de protéines Abéta et tau, associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau ou à l’emploi d’une thérapie génique, pouvant permettre de freiner la propagation de ces agrégats d’une aire cérébrale à une autre. Ce projet sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine Abéta et tau, caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante combinant les technologies de nano-anticorps visant les agrégats des protéines Abéta et tau, et celles des thérapies géniques. L’efficacité de cette première stratégie sera comparée avec l'utilisation de nano-anticorps associés à une ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau pour faciliter leur passage. Les multiples tentatives d’utilisations d’anticorps classiques dirigés contre les protéines Abéta et tau pour traiter la maladie d'Alzheimer ont montrées, jusqu'à présent, une efficacité clinique limitée. Cela est dû à la grande taille des anticorps et à l’existence de la barrière sang-cerveau qui réduit leur efficacité. Les nano-anticorps sont beaucoup plus petit que des anticorps classiques et ont un potentiel plus élevé de traverser cette barrière et atteindre des cibles thérapeutiques dans le tissu cérébral. Par ailleurs, plusieurs études récentes chez l’animal ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons et de microbulles, favorisant le passage d’anticorps anti-Abéta et montrant une diminution des dépôts dans le cerveau. De plus, plusieurs équipes de recherches ont récemment montrées que l’utilisation de thérapies géniques pouvait permettre de libérer à long terme des molécules thérapeutiques ciblant les agrégats de protéine tau directement dans le cerveau. L’utilisation de nano-anticorps en combinaison avec l’ouverture de la barrière sang-cerveau ou produits dans le cerveau par thérapie génique pourrait donc être une stratégie probante afin de délivrer des molécules thérapeutiques pour la maladie d’Alzheimer. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les animaux transgéniques sont des modèles de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces (entre 5 et 7 mois selon les souris). Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée du projet (examen et pesée 1-2 fois par semaine). -Tous les animaux produits auront un prélèvement d'un fragment de queue à l'âge de 7 à 10 jours pour définir leur génotype (patrimoine génétique) (moins d’une minute par animal, une fois) -Pour une partie des animaux une chirurgie cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale pour une durée de 30 minutes environ et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux des séances d'ultrasons seront effectuées pour ouvrir transitoirement et sans effets secondaires la barrière sang-cerveau et faciliter l’accès des thérapies au cerveau. 7 séances d’ouveture (10 minutes par séance) couplée à deux injections intraveineuses (14 injections au total, durée de chaque injection : 30 secondes), le tout sous anesthésie générale et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). -Pour une partie des animaux, on procédera à des tests de mémoire non-invasifs sur une durée de 9 jours : 1) une observation du comportement spontané dans une enceinte carrée (3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours) et 2) une observation d’un comportement inné de nage dans un bassin circulaire (21 essais de 90 secondes max. distribués sur 6 jours de tests). Une partie des animaux recevra une injection intraveineuse vigile (1 minute par animal, une fois) A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 7-8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur génotype. Les chirurgies sous anesthésie générale sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. L’inoculation intra-cérébrale de matériel accélérant la propagation des lésions neuropathologiques pourrait également favoriser l’apparition d’effets indésirables à un âge où ils ne sont normalement pas observés (entre 4 et 6 mois). Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané et inné de l’animal, impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement et un stress plus important lors de l’épreuve de nage en piscine, pouvant également induire une hypothermie.

Devenir

A l’issue de toute les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.

Remplacement

L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études « vitro », dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permi ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux produits (1280) et maintenus sur site est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature.

Raffinement

L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes ou en trio (cages de reproducteurs) et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme de suivi rapproché de nos lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé à partir de 4-5 mois et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale. Les étapes chirurgicales du projet (inoculations intracérébrales et ouvertures de la barrière « sang-cerveau ») sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, déshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. Les chirurgies d’inoculation intra-cérébrale pourraient de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant à priori pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel envirronnment avant les tests pour minimiser le stress induit.). Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris. En fin d’étude toutes les souris seront euthanasiées par des méthodes réglementaires.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux reproducteurs pour générer nos lots expérimentaux seront utilisés de 2 mois à 8 mois maximum. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 6 mois). Les traitements thérapeutiques seront eux aussi initiés à 3 ou 4 mois (début des lésions) sur une durée de 6-7 semaines avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 5 ou 7 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.

Clampage de l'artère rénale sous anesthésie, irradiation du corps entier, reconstitution de moelle osseuse, injections rétro-orbitaires : 960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à six prélèvements sanguins et six prélèvements d'urine, et jusqu'à quatre mesures du débit de filtration glomérulaire de quarante-cinq minutes chacune, réparties sur un mois. Une partie d'entre elles voyage entre deux établissements utilisateurs installés sur des sites différents. Sur le remplacement, le porteur se contente d'une phrase, l'insuffisance rénale aiguë serait "impossible à reproduire in vitro".

Objectifs

Récemment, nous avons identifié un peptide CD99 prédictif du développement d'une insuffisance rénale aigue (IRA) dans les urines obtenues 4h après un pontage cardiaque provenant d’une cohorte humaine. Ce peptide est également différentiellement représenté dans les urines pré-opératoires des patients développant une IRA post-opératoire. CD99 est une protéine transmembranaire principalement identifiée sur la membrane des cellules endothéliales et immunitaires. Dans la cohorte de patients utilisée pour identifier le ratio CD99 (peptide/protéine entière) comme nouveau biomarqueur de l'insuffisance rénale aiguë, l'expression du CD99 sur les cellules immunitaires circulantes (monocytes, neutrophiles, cellules B, cellules T) était similaire chez les patients ayant développé ou non une insuffisance rénale aiguë. Il est donc nécessaire de caractériser la façon dont les CD99 « rénal » (c’est à dire à la surface des cellules endothéliales et immunitaires résidentes) modulent le risque de développer une insuffisance rénale aiguë avant de mettre en œuvre une approche thérapeutique ciblant les CD99. Ce projet est un projet multisite qui se déroule deux EU (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

Mieux caractériser le rôle respectif de CD99 endothélial et immunitaire dans le développement d’une insuffisance rénale aiguë et chronique afin de développer ensuite une approche thérapeutique ciblant CD99.

Procédures

1/prélèvements sanguins à la queue (sous anesthésie) avant chirurgie et avant mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque rélèvement dure environ 2min par animal (anesthésie et prélèvement compris) 2/prélèvement d'urine lors de la contention de l'animal avant chirurgie et avant la mise à mort (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 6 prélèvements seront réalisés (J0, J2, J7, J14, J21 et M1). Chaque prélèvement dure environ 2min par animal. 3/Mesure du Débit de Filtration Glomérulaire avant chirurgie et avant sacrifice (placement du capteur et injection en retro-orbitaire sous anesthésie) (EU1 et EU2). Pour l'étude d'insuffisance rénale aigue 2 prélèvements serons réalisés (J0 et J2). Pour l'étude d'insuffisance rénale chronique, 4 mesures seront réalisées (J0, J7 ou J14 J21 et M1). Chaque mesure dure environ 45min par animal (placement du capteur, injection en retro-orbitaire sous anesthésie et mesure) 4/irradiation (EU2). Une seule irradiation par animal est réalisée, la totalité de la procédure ne dépasse pas 2h (mise en cage, irradiation et retour en cage animalerie) 5/Induction d’une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) (EU1). Une seule chirurgie est effectuée par animal, la procédure dure entre 30 et 45min (anesthésie, chirurgie, clampage d'aorte rénale (le temps varie en fonction du sexe et de la souche) et souture).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront : 1/Une irradiation sans geste invasif suivi d’une reconstitution de leur moelle osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. osseuse. Les effets indésirables possibles sont une légère baisse de l'alimentation avec légère perte de poids. Les animaux peuvent avoir un léger stress du fait de l'enfermement et du bruit, mais ce stress est de courte duréee. L'irradiation ne procure aucune douleur. 2/Une agression rénale (chirurgie, régime spécifique, injection de drogues) résultant en une détérioration de leur fonction rénale. Les effets indésirables possibles sont une baisse de l'alimentation liée à l’agression rénale et dans peu de cas, des complications suite à l'acte chirurgical. C'est pour cela que les souris sont surveillées attentivement pendant les heures qui suivent l'intervention. Les animaux ne doivent pas resentir de stress mais pourraient ressentir une douleur lors de l'acte chirurgical et après réveil, c'est pour cela que nous injectons en sous cutanée un analgésique avant chirurgie et après. 3/ Une mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) n'est normalement pas suceptible d'induire de douleur. L'anesthésie permet de faciliter la procédure pour l’expérimentateur et en particulier d’être sûr que l’animal est complètement immobile pour l’injection rétro-orbitaire afin d’éviter toute blessure. Notre expérience de ce système montre que la plupart des animaux tolèrent très bien le dispositif et se comportent normalement pendant la période de mesure. Cependant, certains animaux peuvent être gênés, si des signes de stress importants sont observés (agitation), le dispositif est retiré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure ou si l'un des points limites était atteint. A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever de l’urine, du sang et différents organes (dont le rein) en vue de leur analyse.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable car l’insuffisance rénale aiguë est impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Les modèles expérimentaux sont bien maitrisés par les expérimentateurs impliqués, ce qui évite les étapes de mise au point couteuses en animaux. Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre principal et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 960 Souris.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature ou les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés dans un service de zootechnie agréé par le ministère, par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie et les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Des points limites ont été définis : 1) Perte de poids supérieure à 25% du poids initial ; 2) Posture de prostration ou léthargie au-delà de 24 heures après l’agression rénale ; 3) Signes de souffrances (comportement ou apparence anormaux, présence de lésions, absence de toilette…) sans amélioration pendant plus de 24h. Si un de ces points est atteint au cours du protocole, les animaux concernés seront mis à mort. Concernant le transport des animaux entre l'EU1 et l'EU2, il sera effectué sur des animaux aptes à supporter le voyage qui sera effectué dans des conditions telles qu'ils ne puissent être blessés ou subir des souffrances inutiles. Le transport sera effectué par une société agrée qui effectue de manière régulière la navette entre l'EU2 et l'EU1.

Choix des espèces

L’espèce utilisée permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons le plus souvent la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines au début de l'expérience, à cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.