Recherche fondamentale

Capturées au verveux, anesthésiées cinq à dix minutes, incisées au scalpel pour recevoir dans l'abdomen une puce RFID de 23 millimètres, 4 000 anguilles argentées passent ensuite une heure et demie en bac d'observation avant d'être remises à l'eau. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur liste parmi les atteintes possibles la perte de mucus et d'écailles, le saignement, la perforation de l'intestin et d'autres organes, puis note que le poisson "retrouve très rapidement un comportement de nage normal". Classée en danger critique d'extinction, l'anguille européenne est ici marquée par milliers pour mesurer ce qui entrave son retour en mer, chaque individu étant relâché à proximité immédiate de son lieu de capture.

Objectifs

Dans le but de mieux connaître et gérer la population d’Anguille du complexe lagunaire Vaccarès, l'étude vise à : (1) Estimer le taux d’échappement des anguilles argentées à l’échelle du delta de Camargue, (2) Caractériser les facteurs influençant l’échappement, (3) Identifier les points de pression pouvant entraver les déplacements migratoires des anguilles et mesurer l’impact des futures mesures de restauration de la continuité écologique sur les ouvrages connectés à la mer. Les anguilles argentées sont des anguilles qui ont atteint un stade de maturité sexuelle qui les conduit à adopter un comportement de migration vers la mer pour se reproduire.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance du comportement des anguilles qui cherchent à rejoindre la mer. Une meilleure connaissance des pressions pouvant entraver leur migration permettrait d'engager des mesures de gestion afin de faciliter voire améliorer les possibilités de retour en mer pour cette espèce classée en Danger critique d'extinction.

Procédures

Sédation/anesthésie profonde (5-10 minutes), puis implantation d'une puce RFID de 23 mm en intrapéritonéal (environ 1 minute) par incision au scalpel, suivi d'un réveil et de la remise en contact avec les congénères dans un bac de stabulation (environ 1h30 en observation), relâcher dans le milieu naturel

Impact sur les animaux

stress et changement de comportement. Nuisance induite par l'anesthésie: répulsion Nuisance induite par la manipulation et la biométrie : stress des individus, perte de mucus, perte d'écailles, éblouissement, dessication Nuisances induites par le marquage : saignement léger lors de l'injection, perte intégrité cutanée, perforation intestinale et d'autres organes / stress et douleur/gêne post-opératoire de courte durée (le poisson retrouve très rapidement un comportement de nage normal).

Devenir

Toutes les anguilles capturées sont relâchées dans le milieu naturel, à proximité immédiate de leur lieu de capture.

Remplacement

L'étude vise à étudier le comportement d'individus sauvages dans leur milieu naturel. De plus, l'Anguille est le seul migrateur amphihalin à se reproduire en mer. Il n'est donc pas possible de remplacer cette espèce par une autre.

Réduction

Le marquage a été limité à 1000 individus maximum par an. Toutefois les deux premières années sont expérimentales. Le marquage est limité à 500 individus par an sur ces deux années. Cette approche semble être cohérente en lien avec les premiers retours d'expérience d'échantillonnages réalisés en Camargue et permettra d'obtenir des données fiables quant à l'échappement des individus vers la mer. Selon le Retour d'expérience des deux premières années, nous nous autoriserons de porter le marquage à 1000 anguilles par an.

Raffinement

Le projet prévoit de capturer les anguilles au verveux car c'est la technique la plus à même de maintenir les anguilles vivantes et dans un bon état. Les anguilles de moins de 30g seront triées à l'oeil afin d'éviter de les anesthésier. Avant et après le marquage, de l'enrichissement est proposé aux animaux pour limiter leur stress durant la stabulation et l'anesthésie (blocs pour se cacher, recouvrement des bacs pour un maintien dans l'obscurité, nombre d'individus limité à 5 anguilles par bac, contrôle de la température de l'eau, changement de l'eau du bac si la température augmente de plus de 2°C). Le marquage est réalisé uniquement pour les anguilles en stades ultimes de développement. Il est réalisé avec des petites marque pit Tag de 23mm. La taille de la marque est donc réduite au maximum pour pouvoir procéder à un suivi long terme et limiter au maximum l'aspect intrusif de la méthode. Le marquage est réalisé au mois de septembre /octobre pour optimiser les chances de captures d'individus argentés et éviter les fortes températures estivales. Le marquage, comparable à celui effectué pour l'identification des animaux domestiques, n'a pas d'effet néfaste à long terme sur la santé des animaux. Le marquage est réalisé sur une mousse polyuréthane humide en V afin de bien figer l'anguille au moment de l'injection du Pit Tag. Avant le marquage, les anguilles se verront administrer un analgésiant pour limiter la douleur (lidocaine 1mg/kg dans la zone d'incision, diluée au quart dans du chlorure de sodium). Les anguilles sont transportées à l'aide d'une barque puis relâchées dans un endroit suffisamment profond de l'étang pour éviter la prédation aviaire. Le suivi est principalement réalisé avec des antennes fixes pour éviter d'ajouter des campagnes de recaptures au verveux.

Choix des espèces

L'Anguille européenne est le seul migrateur amphihalin dont la reproduction se déroule en mer. Les modalités de retour en mer pour les individus présents dans la lagune du Vaccarès sont mal connues. Les échanges mer/lagunes sont très limités et gérés au travers du Grau de la Fourcade. Une passe à poissons doit y être construite en 2025 2026. Elle ne sera pas tout le temps ouverte pour éviter les entrées d'eau de mer dans la lagune. Les modalités de gestion de cette passe à poissons nécessite de connaitre les périodes clés de migration de l'Anguille qui est l'espèce cible. Les antennes RFID qui seront installées au niveau des Graus dans le cadre de ce projet permettront de détecter les dates de passages et donc les périodes de migration. Les anguilles marquées sont des individus de type "anguilles argentées" (stades FIV = femelles stade 4 et FV = femelles stade 5 / MD (mâles Dévalants)). Ces stades sont des morphotypes plus ou moins agés, qui correspondent aux stades ultimes de migration en lien avec la maturation des gonades. Il s'agit d'individus théoriquement en migration active pour aller se reproduire en mer. Cette classification des individus a été proposée par la chercheuse Caroline Durif en 2009 : DURIF C., GUIBERT A., ELIE P., 2009b. Morphological Discrimination of the Silvering Stages of the European Eel., American Fisheries Society Symposium, 58:103-111.

12 788 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 11 088 subissent une biopsie de la queue, 4 808 une injection dans le sinus rétro-orbital, 12 588 reçoivent un composé pharmacologique par l'eau de boisson jusqu'à quatre mois d'affilée, et 6 336 passent des tests cognitifs nommés, actimétrie, labyrinthe en Y et labyrinthe de Barnes. Ces souris portent des modifications génétiques qui reproduisent les lésions de la maladie d'Alzheimer, que le porteur décrit pourtant comme dépourvues de "phénotype dommageable". Aucun calcul ne vient soutenir ces effectifs, le RNT indiquant seulement que le nombre a été "réduit au maximum" pour cinq familles de composés brevetés par l'équipe.

Objectifs

L’objectif général de notre projet consiste à comprendre le mode d’action, a découvrir la cible et à optimiser l'effet thérapeutique de 5 familles de composés pharmacologiques innovants, brevetées par notre équipe, dans la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette maladie neurodégénérative liée à l’âge, est caractérisée par la présence de deux types de lésions neuropathologiques cérébrales particulières: les dépôts amyloïdes, constitués de peptides amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF), qui résultent de l’agrégation de protéines microtubulaires Tau anormalement phosphorylées. Nos composés se différencient des molécules développées jusqu’à présent par un mécanisme d’action qui s'adresse à ces deux caractéristiques de la maladie. L’étude de l'action de nos composés sur les deux processus lésionnels, la neuroinflammation et les fonctions cognitives de la MA nécessite l’utilisation de modèles intégrés. Elle ne peut pas être abordée sur d’autres systèmes biologiques. Nos composés pharmacologiques ont fait l'objet de nombreuses études in vitro préalables aux analyses in vivo. Une première étape a permis d'éliminer les composés présentant de la toxicité cellulaire. Les composés sélectionnés ont ensuite été caractérisés en fonction de leurs capacités à inhiber l'expression et la phosphorylation de la protéine Tau sur ses sites pathologiques et à inhiber la voie amyloïdogénique dans des modèles cellulaires caractérisés. Le chef de file de chacune des 5 familles a été sélectionné. Leur effet thérapeutique doit maintenant être analysé par des approches intégratives dans des modèles expérimentaux reproduisant soit les altérations de la protéine Tau, soit les lésions amyloïdes. La cible thérapeutique sera également validée in vivo après identification dans nos modèles cellulaires. Ainsi, l'efficacité et la sélectivité de nos candidats médicaments sera renforcée. Les résultats obtenus grâce à nos modèles expérimentaux constituent une étape essentielle et préalable à la translation vers le patient sur le plan thérapeutique, mais également sur le plan diagnostic. Notre stratégie expérimentale a déjà fait ses preuves par le passé. Elle a permis le développement d’une start-up et la mise en place d’essais cliniques. Ainsi, notre projet permet de lever des interrogations fondamentales quant aux processus mis en jeu dans la MA, mais il répond également à des besoins cliniques en termes de thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet combine des approches expérimentales pré-cliniques indispensables à la validation des effets bénéfiques de composés innovants. Il permet de disséquer les mécanismes lésionnels et les fonctions cognitives, de comprendre le mode d’action de nos composés et d’optimiser leur structure chimique. L’originalité de ce projet repose sur une action originale de nos composés, à la croisée des voies induisant les altérations de la protéine Tau et les lésions amyloïdes. Les pathologies liées à la neurodégénérescence ne bénéficient, à l’heure actuelle, d’aucun traitement permettant de ralentir ou stopper la maladie. Elles touchent plusieurs dizaines de millions de personnes dans le monde. Nous bénéficions du soutient de la SATT et d’Inserm Transfert pour la valorisation et la protection de nos résultats. A plus long terme, nos données pourront implémenter les approches cliniques existantes et susciter des essais cliniques ultérieurs.

Procédures

11088 animaux subiront une biopsie de la queue pour le génotypage. 4808 animaux subiront une administration intraveineuse rapide et unique dans le sinus retro-orbital. 12588 feront l’objet d’une administration de composé pharmacologique. Les molécules seront préférentiellement administrées via l’eau de boisson (composés solubles dans l'eau), pendant 4 mois maximum. Alternativement, les composés pourront être administrés par voie orale ou par voie intra-péritonéale (administration journalière, 100 à 150 µL). Les animaux seront alors traités pendant 1 mois maximum. En dernier recours, si une administration par voie intra-veineuse devait être réalisée, une seule injection sera réalisée (100 µL max). Les fonctions cognitives seront étudiées sur 6336 animaux grâce à des tests comportementaux afin d’étudier les effets des composés sur les déficits cognitifs associés à la pathologie. La motricité globale des individus est analysée par un test d’actimétrie. La mémoire spatiale à court terme est évaluée par le test du labyrinthe en Y. La mémoire à long terme est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables consistent aux douleurs associées à la réalisation de la biopsie de la queue ou à la douleur au point d'injection lors des administrations. Il peut également y avoir un impact oculaire suite aux injections retro-orbitaires. Ces nuisances possibles seront prises en charge de manière adéquate.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au point d’analyse final. Des études histochimiques, moléculaires et biochimiques seront réalisées sur les échantillons de cerveaux afin d’analyser les modulations des caractéristiques physiopathologiques spécifiques aux modèles.

Remplacement

Ce projet combine des approches expérimentales pré-cliniques, indispensables à la validation des effets bénéfiques de composés innovants. Les résultats obtenus grace à nos modèles expérimentaux consituent une étape essentielle et préalable à la translation vers le patient sur le plan thérapeutique, mais également sur le plan diagnostic. Notre équipe de recherche a recours à des systèmes biologiques alternatifs aux modèles animaux (techniques de biologie moléculaire et cellulaire) préalablement à l’étude de l’impact des composés sur les deux processus lesionnels, la neuroinflammation et les fonctions cognitives de la maladie d'Alzheimer qui ne peuvent être abordés sans l’utilisation de modèles intégrés.

Réduction

Notre plan d’expériences permettra de limiter le nombre d’individus au maximum. Une première procédure permettra définir deux concentrations, ainsi qu’un protocole d’administration et un schéma thérapeutique optimaux pour chaque des chefs de file de chacune des 5 familles de candidats médicaments. Les données récoltées seront exploitées et maximisées pour chaque individu afin de limiter ou d’éviter l’utilisation subséquante d’animaux supplémentaires. Pour chacun des groupes d’individus, le nombre a été réduit au maximum tout en permettantl’obtention de résultats robustes (différences statistiquement observables).

Raffinement

Les modèles expérimentaux sont maitrisés par notre équipe et répandu dans les laboratoires étudiants les mécanismes lésionnels et les fonctions cognitives dans la maladie d'Alzheimer. Les points d’analyses nécessitant une mise à mort ont été clairement définis grâce à la bibliographie. Les animaux seront hébergés en groupe. Des éléments d’enrichissement du milieu seront disposés dans chaque cage. Un suivi hebdomadaire des paramètres macroscopiques comportementaux (prostration, isolement, douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable) sera réalisé, en lien avec le personnel animalier. Toute modification de comportement sera prise en charge par des approches appropriées. Les signes de souffrance seront recherchés de manière active, en lien la personne en charge du suivi du bien-être animal (SBEA). Les animaux présentant un des points limites spécifiés dans chacune des procédures seront mis à mort dans une salle dédiée.

Choix des espèces

Dans notre étude, nous utilisons des souris de fond génétique C57BL/6J et génétiquement modifiées. Les modèles utilisés ne présentent pas de phénotype domageable. Ils reproduisent les altérations de la protéine Tau (modèle THY-Tau22) ou les lésions amyéloïdes (modèle APP/PS1) observées lors de la maladie d'Alzheimer et permettent d’étudier les mécanismes pathologiques et l’impact de nos candidats médicaments sur le processus lesionnels et les fonctions cognitives par des approches intégratives et complémentaires (transcriptomique, protéomique, étude du comportement, histochimie). Nos traitements, à visée curative, sont donc administrés à des animaux agès de 6 mois, période à partir de laquelle la pathologie est avérée. Dans les procédures qui nous permettront de valider notre cible thérapeutique, d’étudier son impact sur le developpement de la maladie et les concéquences de sa modulation, la surexpression ou l’inhibition de l’expression de cette cible sera réalisée grace à un protocole utilisé classiquement par les équipes de recherche, consistant à une injection unique d’un vecteur chez de jeunes animaux.

Rendus migraineux par une injection quotidienne pendant quatre jours, puis soumis au test de Von Frey qui mesure leur réaction à une stimulation, une minute toutes les quinze minutes pendant deux heures, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le cinquième jour, une injection locale et deux injections sous-cutanées leur sont administrées sous anesthésie générale. L'objectif tient en peu de choses, le porteur indiquant que l'activité antimigraineuse de la molécule est déjà établie et cherchant seulement à comparer les voies d'administration et une dose plus faible. Tous les rats sont tués à l'issue, le RNT justifiant leur mort par une "impossibilité de récupérer les animaux du fait des procédures réalisées", sans dire lesquelles.

Objectifs

Nous savons que la molécule d'intérêt a bien une activité dite antimigraineuse. Le but de ce projet est d'étudier l'amélioration de la douleur dans un modèle de migraine, selon différentes voies d’administration de la molécule d'intérêt et de tester l’effet de cette molécule à une dose plus faible.

Bénéfices attendus

A moyen terme, selon les résultats obtenus, ce projet nous permettra de mieux connaitre le mécanisme d'action de la molécule d'intérêt et proposer des cibles thérapeutiques avec des effets secondaires limités. Dans le contexte de ce projet, une diminution de l'effet antimigraineux après l'administration centrale indiquera que la majorité de l'effet antimigraineux de ces agonistes est dûe à une action sur les récepteurs delta opioïdes localisés en périphérie, notamment dans le ganglion trigéminale. Il serait donc accessible à des molécules qui ne passent pas la barrière hémato-encéphalique ce que permettrait d'avoir la même efficacité et moins d'effets secondaires.

Procédures

Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 5 jours. Ce sont des injections (intrapéritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (maximum 5 injections). Les premiers 4 jours de l'induction du modèle de migraine chronique, chaque animal reçoit au maximum une injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). Au 5ème jour de l'induction de la migraine chronique ou le premier jour de l'induction de la migraine aigue, une injection locale et/ou deux injections sous-cutanées seront réalisées sous anesthésie générale. Dans le cas du test comportemental de Von Frey, nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum conformément aux règles éthiques éditées par l'International Association for the Study of Pain (IASP). L’animal a la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements (intervention de 1 minute par rat, toutes les 15 minutes pendant 120 min, maximum).

Impact sur les animaux

Le modèle de migraine, que ce soit en aigu ou en chronique, ne montre pas d'effets indésirables sur les animaux autre que le développement d'une douleur modérée majoritairement faciale. L'injection centrale (intra-cisternale) ou systémique (sous-cutanée ou intra-veineuse) de la molécule d'intérêt est réalisée sous anesthésie. L'administration de cette molécule peut produire une augmentation transitoire de la mobilité.

Devenir

Impossibilité de récupérer les animaux du fait des procédures réalisées.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet, il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique anti-migraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l'effet d'une molécule sur le seuil nociceptif. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine une étape encore trop primaire aujourd'hui.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Les animaux seront hébergés collectivement (au moins 2 par cage), avec de l'enrichissement, afin d'éviter le stress. Pas de groupe témoin pour le modèle de migraine (réutilisation des données précèdentes) ni de groupe véhicule pour l'administration sous-cutanée car il a déja été réalisé dans l'étude précèdente. Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum 15 à 20% (complexité de la technique d'admnistration, exclusion après la phase d'habituation, rats non-répondeurs à l'ISDN). L’ensemble des données sera analysé par une analyse de variance à 2 ou 3 voies (effet douleur et/ou traitement et/ou sexe) en mesures répétées (ou non) et suivi d'un test post-hoc.

Raffinement

Pendant sept jours, les rats seront acclimatés à l’animalerie. Les conditions d'hébergement sont standard et enrichies à l'aide de rouleaux en carton permettant aux animaux de se cacher. Les animaux auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les expériences peuvent être interrompues si un point limite est atteint (mise à mort).

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Adultes (6-8 semaines) pour comparaison avec les autres données de la littérature.

1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une greffe de cellules tumorales, des injections de vecteurs viraux dans la tumeur et deux prélèvements de sang sous anesthésie, la taille de la tumeur étant mesurée au pied à coulisse sur animal éveillé. Le porteur reconnaît que les cellules injectées peuvent former des métastases, entraîner une perte de poids importante et dégrader l'état général, et que les vecteurs peuvent déclencher une inflammation générale. Sur le remplacement, il affirme que seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration entre cellules immunitaires et cellules tumorales, et qu'une nouvelle approche thérapeutique "ne peut se faire que chez l'animal".

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients ayant ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie beaucoup selon les cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il apparait que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies doivent être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. On sait que l’efficacité d’une réponse inflammatoire dépend de la qualité et de la quantité de médiateurs inflammatoires tels que cytokines et chimiokines produites dans le microenvironnement tumoral (MET). Dans ce contexte, les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semblent un outil idéalement adapté à des approches de vaccination/immunothérapie. L'objectif du projet est d’utiliser de nouveaux AAV codant pour des cytokines d’intérêt afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Nous avons développé des AAV codant pour l’une des 4 cytokines murines suivantes : IL-12sc (protéine de fusion entre les sous-unités IL-12p40 et IL-12p35) qui module l’activité des lymphocytes T et cellules NK, IFN-α ayant des activités anti-tumorales, GM-CSF (facteur stimulant granulocytes et macrophages) et IL-15sushi (protéine de fusion entre le domaine sushi de la chaine α du récepteur à l’IL-15 avec la cytokine IL-15) dont le rôle anti-tumoral est établi. Nous pensons que l’injection intra-tumorale des AAV codant pour une cytokine donnée ou plusieurs (combinaison d’AAV codant pour des cytokines différentes ou un AAV codant pour plusieurs cytokines à la fois) entrainera une production locale et aiguë de ces cytokines favorisant le recrutement et l’activation des cellules immunitaires dans le MET, ce qui permettra de générer une réponse immunitaire anti-tumorale efficace permettant une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet de la tumeur. Nous envisageons également de combiner cette stratégie thérapeutique avec 1) les immunothérapies utilisant des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (CTLA-4 et PD-1/PDL1) et 2) avec des AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique (ou mort cellulaire inflammatoire capable d'induire la stimulation du système immunitaire).

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succès des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénéficiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codant pour les différentes cytokines (IL-12sc, IFN-α, GM-CSF et IL-15sushi), induise une réponse immunitaire permettant un rejet de la croissance tumorale et l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codant pour ces différentes cytokines seule, mais aussi en combinaison avec d’autres immunothérapies déjà bien connues (tels qu’un anti-PD1, anti PD-L1 ou anti-CTLA-4) et/ou en cours de développement dans le laboratoire (l’utilisation d’AAV codant pour des protéines capables d’induire une mort cellulaire immunogénique et de permettre l’initiation d’une réponse immunitaire antitumorale), aura pour but : (1) d’apporter des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire amplifiée et (2) de permettre le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. Les vecteurs AAVs possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux Etats-Unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme, si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

- Prélevements de sang sur souris anesthésiées : 2 prélevements par souris à 10 jours d'intervalle, 15 secondes - Injections de cellules tumorales et de vecteurs AAV sur souris anesthésiées, 10 secondes - Mesures de la taille de la tumeur au pied à coulisse sur souris vigile, 45 secondes

Impact sur les animaux

Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet écueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenté dans la littérature, minimisant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent aussi induire une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV pourrait induire une inflammation systémique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant, nous limitons cet effet secondaire par une injection intra-tumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse. Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, de la buprénorphine sera administrée (0,05 mg/kg). Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressants dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début du protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.