Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système immunitaire
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- Système respiratoire
- Système urogénital
Induction et synchronisation des chaleurs et ovulations des brebis pendant l’anoestrus saisonnier, par la pratique de l’effet mâle associée à un traitement progestatif.
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- Oncologie
- Système urogénital
Faire naître des agneaux hors de la saison de reproduction, pour maintenir l'offre de lait et de viande toute l'année, conduit à utiliser 100 brebis adultes de deux races allaitantes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque brebis reçoit une éponge vaginale imprégnée de progestatif puis sept prélèvements de sang à la veine jugulaire, avant l'introduction de béliers destinés à déclencher les chaleurs. Le projet est présenté comme une réponse au contexte sociétal et réglementaire qui pousse à réduire l'usage des hormones, alors que le traitement progestatif est maintenu et que seule l'injection d'eCG disparaît. Toutes les brebis restent en vie dans l'établissement à l'issue, sauf celles qui déclarent une maladie sans réponse au traitement ou une blessure jugée non soignable, tuées par surdosage de barbiturique.
Objectifs
Chez les ovins et caprins, il existe au cours de l’année une période d’activité sexuelle maximale (saison sexuelle), en général d’août à janvier, et une autre d’activité minimale ou de repos sexuel, en général de février à juillet. Cette saisonnalité de la reproduction conduit à des variations annuelles dans la disponibilité des produits (lait/viande), la reproduction hors saison sexuelle (désaisonnement) est alors une solution pour maintenir l’offre toute l’année. Le traitement hormonal d’induction et de synchronisation des chaleurs et des ovulations (combinant 2 médicaments vétérinaires chez les ovins) est aujourd’hui la pratique la plus efficace pour désaisonner la reproduction. Son utilisation est associée à l’Insémination Animale (IA). Or, le contexte sociétal et réglementaire incite fortement à la recherche de méthodes alternatives réduisant voire excluant l’utilisation d’hormones, pour synchroniser les chaleurs des femelles. La pratique de l’effet mâle pour l’IA hors saison sexuelle est une solution alternative, consistant à induire l’activité ovulatoire des femelles en anoestrus saisonnier (repos sexuel) par leur exposition à des mâles sexuellement actifs. Toutefois, son utilisation en élevage est freinée par la moindre synchronisation des chaleurs obtenue. Des essais ont été conduits dans des races de brebis laitières afin d’améliorer la synchronisation des ovulations en pré-traitant les brebis avec un progestatif (sous forme d’éponge vaginale, traitement vétérinaire utilisé en élevage) avant l’introduction des béliers parmi les brebis pour l’effet mâle, afin de pratiquer ensuite une IA. La plupart de ces essais ont concerné des races laitières qui ont la faculté de "désaisonner" naturellement. Or des essais sont également nécessaires pour les races de brebis allaitantes et notamment pour les races herbagères, dites saisonnées. L’objectif de ce projet est d’étudier pendant l’anœstrus saisonnier, la cinétique des venues en chaleur et des ovulations induites par l’effet mâle chez des brebis prétraitées avec un traitement progestatif, dans deux races allaitantes : une race dite saisonnée et une race qui "désaisonne" facilement au printemps.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à faciliter la mise en œuvre par les éleveurs d’ovins allaitants d’une mise à la reproduction des brebis par insémination animale (IA) après induction et synchronisation des chaleurs et ovulations par effet mâle : d’une part en améliorant la synchronisation des chaleurs grâce à un traitement progestatif préalable (sous forme d’éponge vaginale), d’autre part en réduisant l’utilisation d’hormones pour le traitement de synchronisation (l’effet mâle remplaçant l’injection d'eCG - habituellement associée à l’éponge vaginale).
Procédures
Les brebis seront soumises à des prélèvements de sang : au total 7 prélèvements/brebis, avec une durée de prélèvement moyenne d'environ 30 secondes par brebis, et un délai minimum de 3 jours entre chaque prélèvement. Chaque brebis aura une pose d'éponge vaginale (traitement vétérinaire), la pose durant quelques secondes et étant faite avec un applicateur dédié.
Impact sur les animaux
Un stress léger peut être ressenti par les brebis lors de la contention pour la pose d’éponge vaginale et pour les prélèvements de sang. Lors des prélèvements de sang (par ponction à la veine jugulaire), les brebis peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Ces interventions n’entrainent pas d’altération de l’état général.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et restent dans l'établissement utilisateur à l'issue du projet.
Remplacement
Ce projet concerne l’induction et la synchronisation des chaleurs et des ovulations chez des brebis en conditions d’élevage. Il ne peut être réalisé qu’avec l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Le projet utilisera 100 brebis adultes ainsi que 4 béliers pour la réalisation de l’effet mâle mais ces derniers ne subiront aucune procédure. L’effectif de 50 brebis/race (2 races de brebis seront étudiées) a été déterminé grâce à un calcul d’effectif et correspond à un effectif nécessaire et suffisant d’animaux pour obtenir une bonne puissance statistique. Le ratio de 1 mâle pour 25 femelles permet une stimulation efficace des femelles.
Raffinement
Les brebis seront dans leurs conditions d’élevage habituelles (en groupes) dans un bâtiment d’élevage conventionnel sur litière paillée et feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée du protocole. Pour les prélèvements de sang, la contention sera faite par des expérimentateurs animaliers, dont la présence journalière répétée en interaction positive (alimentation, soins) est associée à une diminution du comportement de fuite des brebis et donc de leur stress face à la contention. En cas de signes de maladie (par exemple fièvre > 40°C, problèmes respiratoires, décubitus prolongé, anorexie, perte de poids >15 %...) ou d’impact sur l’état général des animaux (prostration, cachexie, alopécie…), une intervention vétérinaire aura lieu et un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place (l’animal sortira du protocole si nécessaire). Le cas écheant (non réponse aux traitements ou blessure de l'animal non soignable), l’animal sera euthanasié par surdosage de barbiturique par voie intraveineuse, selon la posologie appropriée et le poids de l'animal.
Choix des espèces
L’espèce ovine est la cible de l’étude portant sur le traitement d’induction et de synchronisation des chaleurs et ovulations des brebis. Brebis et béliers adultes, sexuellement matures (étude de physiologie de la reproduction).
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement altérées pour l’étude du cytosquelette des neurones.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tués dès qu'ils ne portent pas la modification génétique attendue, pour ne pas garder d'animaux jugés "non nécessaires" au projet, la grande majorité des 4 040 poissons zèbres déclarés ne passent pas l'étape de la sélection. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans qu'aucune intervention ne soit déclarée sur eux, la protéine fluorescente s'observant sur l'animal vivant. Les lignées sont créées pour rendre visibles des protéines du cytosquelette des neurones, et le porteur annonce que ces poissons se comporteront comme des animaux sauvages, tout en reconnaissant que la modification touche une protéine du système nerveux et pourrait entraîner une nage anormale ou une prostration. Une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an, gardés jusqu'à dix-huit mois, suffit à maintenir ces lignées, sans que l'écart avec l'effectif déclaré soit expliqué.
Objectifs
Le cytosquelette, une structure fibreuse présente dans nos cellules, joue un rôle crucial en agissant comme des piliers de soutien. Son bon fonctionnement est essentiel pour les neurones, mais des anomalies dans ces structures sont associées à diverses maladies neurologiques. Pour mieux comprendre ces structures et leurs rôles, nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire au nôtre et sont transparents à un stade précoce de leur développement. Dans notre projet, nous allons introduire des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine fluorescente. Cela nous permet d’observer précisément où se trouvent les protéines du cytosquelette à l'intérieur du poisson et des suivre leur comportement alors que le poisson grandit et dans un contexte de maladie. L'objectif principal est de comprendre comment ces structures fonctionnent normalement lors du développement des cellules nerveuses, sans perturber le processus naturel. Cette compréhension pourrait éclairer les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques associées au cytosquelette.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les fonctions des protéines du cytosquelette au cours du développement. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes physiologiques impliquant les protéines du cytosquelette dans un contexte pathologique, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.
Procédures
Aucun
Impact sur les animaux
D'après les connaissances, la modification de notre protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente n'affecte pas la fonction de cette protéine. Par conséquent, nous nous attendons à ce que les poissons se comportent comme des animaux sauvages et nous ne prévoyons pas de nuisances indésirables pour les poissons génétiquement modifiés. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement d’effets indésirables Comme nous apportons une modification d'une protéine du système nerveux, les effets indésirables pourraient être liées à un système nerveux défectueux, avec des anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) ou une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité).
Devenir
Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.
Remplacement
Le projet vise à mieux comprendre comment les protéines du cytosquelette fonctionnent dans les cellules nerveuses. Ces fonctions dépendent de processus comme la présence de certaines cellules qui protègent les nerfs. Les méthodes actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Pour surmonter ces limitations, nous nous tournons vers des modèles de laboratoire appelés organoïdes, qui sont des petites structures cellulaires qui imitent certaines caractéristiques des tissus réels. Cependant, ces organoïdes sont difficiles à imaginer en direct, ce qui est important pour notre recherche. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec toutes les cellules nécessaires, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.
Réduction
Nous avons utilisé une technique qui nous permet de sélectionner et d’élever uniquement les poissons dont la modification génétique a réussi, et éviter d'élever ceux qui n'ont pas le modification de notre intérêt. Le nombre d'animaux nécessaires est strictement déterminé en fonction de la fréquence à laquelle la modification génétique est transmise à la prochaine génération, ainsi que du nombre de couples de poissons reproducteurs requis. Pour maintenir ces lignées génétiquement modifiées, nous conservons seulement un nombre limité de poissons, environ une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an.
Raffinement
Étant donné que la protéine fluorescente est observée sur l’animal vivant, cela nous permet d’éviter d'avoir à effectuer des prélèvements invasifs sur le poisson. Comme la modification génétique ne devrait pas altérer la manière dont les gènes sont exprimés ni les fonctions de la protéine, nous prévoyons que ces animaux se comporteront de la même manière que les animaux sauvages et qu'ils ne présenteront aucun changement dans leur apparence ou leur comportement. Cependant, une surveillance hebdomadaire sera effectuée. De plus, une évaluation sera réalisée lorsque les poissons seront autonomes pour se nourrir (après 5-6 jours) et lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle (environ 12 semaines), en utilisant une grille de score pour détecter toute anomalie éventuelle. Nous avons mis en place des points limites prédictifs et précoces pour identifier les signes de mal être chez le poisson. Les poissons atteignant l’un de ces points limites seront immédiatement mis à mort pour abréger toute souffrance.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.
Evaluation du rôle d’un acide aminé dans le potentiel pro-carcinogène d’une souche bactérienne (E coli) isolé d’adénocarcinome colique humain, sur le développement tumoral, en modèle murin prédisposé
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement prédisposées à développer des tumeurs du tube digestif, elles reçoivent à six semaines un gavage de bactéries Escherichia coli productrices de colibactine, puis deux prélèvements sanguins, et vivent avec leurs tumeurs jusqu'à la mise à mort au 65e jour. Le porteur attend une baisse d'activité, une perte de poils, une posture voûtée, une anémie visible aux pattes blanches, un amaigrissement, des diarrhées, du sang dans les selles et un prolapsus. À court terme il s'agit de savoir si un acide aminé, la sérine, conditionne l'effet pro-cancérogène de ces bactéries, les régimes appauvris en sérine administrés en prévention à des personnes à risque restant renvoyés au long terme.
Objectifs
Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine, nommée : « Escherichia coli producteurs de colibactine (CoPEC) », dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectaux accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer. Les résultats préliminaires semblent démontrer le rôle essentiel d’un acide aminé (sérine) dans l’activité pro-carcinogène des souches CoPEC. Ainsi, nous proposons premièrement d’évaluer l’effet d’une alimentation déplétée en sérine sur l’effet pro-carcinogène de la souche CoPEC. Ensuite, nous souhaitons également vérifier la spécificité des besoins en sérine de cette souche, en étudiant une souche incapable d’utiliser la sérine. Pour cela, nous évaluerons l’effet de la toxine, la colonisation bactérienne, la perméabilité intestinale et le développement tumoral à un stade précoce et/ou tardif dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats obtenus pourraient permettre de conclure sur l’implication de la sérine dans l’activité pro-carcinogène des CoPEC et de mieux comprendre les mécanismes de l’interaction bactéries/hôte/nutrition sur la carcinogénèse colique. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant les personnes les plus colonisées par ces bactéries. Ce projet permettra de mettre au point des traitements curatifs afin d’empêcher la bactérie d’utiliser la sérine et ainsi diminuer le développement tumoral. Également, des alimentations déplétées en sérine pourront être administrées en prévention chez les personnes susceptibles de développer un cancer colorectal, ou en curatif chez les patients opérés afin de limiter la réimplantation des CoPEC.
Procédures
Une injection (gavage) sera réalisée à J0, soit lorsque la souris a 6 semaines. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J9 et en pré-mortem sous anesthésie gazeuse. Les gestes techniques seront réalisés rapidement en quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après la reproduction ou à la fin de l'expérience. A la fin de l'expérience, les animaux sont sacrifiés afin de réaliser des prélèvements tissulaires. Lors des reproductions, seul les animaux d'intérêt sont conservés.
Remplacement
L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n’est pas possible d’étudier le rôle de la sérine sur les effets pro-carcinogènes des bactéries suite à une infection chronique sur des cellules en culture.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de scooring et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de superficie adaptée, avec des cabanes pour se cachées et des enrichissements à ronger. Des croquettes seront également mis à disposition dans le fond de la cage et les tétines des biberons allongées si les douleurs empêchent l'animale de grimper sur la grille. Enfin certains animaux pourront être isolés si leur état général le nécessite.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, le modèle animal APC présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène APC est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau du tube digestif -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Ainsi, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien être animale (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les femelles adultes âgées de 6 semaines (20g au gavage). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérience est estimée à 65 jours post-gavage.
Etude des effets protecteurs de peptides mimétiques dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
64 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune subissant deux anesthésies successives pour poser puis retirer un monofilament dans une artère cérébrale, puis vingt heures de surveillance seule en cage. L'occlusion provoque un accident vasculaire cérébral, et le porteur liste un déficit locomoteur avec rotation, un risque modéré d'hémorragie, une hypothermie, des difficultés à s'alimenter et un fort risque de mortalité lié à la double anesthésie. Toutes sont tuées par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde, pour des marquages immunohistochimiques. Les deux peptides testés sont déjà en cours de validation clinique chez des patients hypertriglycéridémiques, et le porteur qualifie pourtant les tests chez la souris d'étape "indispensable" au développement préclinique.
Objectifs
L’objectif du projet est de tester les effets protecteurs de deux peptides mimétiques (D6PV et 5ASM) dans un modèle d’accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris. Par rapport aux protéines dont ils sont issus, les peptides mimétiques présentent l’avantage d’être facilement synthétisables et de contenir des modifications chimiques au niveau de leurs acides aminés qui les rendent non-immunogènes. Les peptides D6PV et 5ASM correspondent à des fragments d’apolipoprotéines humaines et présentent des propriétés hypolipémiantes, antidiabétiques, anti-inflammatoires, et vasculo-protectrices in vitro et in vivo. Leurs effets potentiellement protecteurs dans le cadre des complications vasculaires cérébrales n’est pas connu. Nous voulons montrer que ces deux peptides réduisent la taille et les complications hémorrhagiques d’un AVC in vivo. Leurs effets potentiellement protecteurs dans le cadre des complications vasculaires cérébrales n’est pas connu.
Bénéfices attendus
Les peptides que nous allons tester ici sont actuellement en cours de validation clinique pour traiter des patients hypertriglycéridémiques. Ces études ont aussi montré que ces peptides ont en outre des propriétés antiathérothrombotiques et vasculo-protectrices au niveau du muscle cardiaque suite à un infarctus provoqué chez la souris. Notre projet vise à établir que ces peptides seront également bénéfiques pour le traitement de l’AVC ischémique. Si, comme nous l’espérons, les résultats de l’étude que nous proposons sont positifs, ces deux peptides pourront être positionnés comme candidats médicaments pour prévenir la sévérité et les complications d’un AVC ischémique chez l’homme. Les tests in vivo que nous projetons de faire sont ainsi une étape indispensable au développement pré clinique de ces deux peptides.
Procédures
Un prélèvement sanguin par ponction caudale (100μL max, durée 1min). Insertion du monofilament et retrait sous anesthésie (2 x 10min). Perfusion intracardiaque au paraphormaldéhyde (4%) à la fin du projet.
Impact sur les animaux
Un prélèvement sanguin par ponction caudale (100μL max): risque d’hématome et stress chez l’animal. Double Anesthésie : fort risque de mortalité. Conservation du monofilament : Déficit locomoteur (rotation) Isolement des animaux : peut générer un stress chez l’animal. Chirurgie vasculaire : risque modéré d’hémorragie. Hypothermie. Difficulté à s’alimenter post AVC.
Devenir
La totalité des animaux du projet (n=64 ; 4 groupes de souris) sera gardée en vie pour la perfusion. A la fin du projet, les tissus de la totalité des animaux (n=64 ; 4groupes de souris) seront récupérés pour des marquages immunohistochimiques.
Remplacement
Il n’existe pas aujourd’hui de modèle in-vitro qui reflète la complexité cellulaire du cerveau. Cependant dans un souci de remplacement, nous réaliserons toutes les expériences portant sur l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels ces peptides protègent la barrière hémato-encéphalique sur des cellules endothéliales cérébro-vasculaires en culture (test in -vitro). L’utilisation de souris est cependant absolument nécessaire pour prendre en compte le contexte physiopathologique d’un AVC ischémique. Le modèle MCAO est en place au laboratoire
Réduction
Des études antérieures conduites au laboratoire ont déjà permis d'établir la durée de l’ischémie. Les expérimentateurs locaux ont de plus l’expertise des procédures chirurgicales. Nous avons également réalisé une analyse de puissance, nous indiquant que la taille minimale du groupe d'individus pour obtenir une puissance statistique d'au moins 0.8, avec un alpha de 0.05 est de 16 souris par groupe x 4 groupes soit 64 souris au total. Ces deux paramètres permettent la réduction au minimum du nombre d’animaux requis.
Raffinement
La phase d’induction de l’anesthésie est réalisée sous isoflurane, ainsi qu’une injection de buprénorphine La phase de maintien de l’anesthésie sera réalisée sous isoflurane. Lors de la ponction caudale une pression sera réalisée afin d’éviter le risque d’hématome. L’injection des peptides au moment de la reperfusion permet d’apporter un raffinement au protocole expérimental en diminuant le nombre des gestes interventionnels. Chaque animal sera observé en continu au cours de la procédure et pendant l’heure qui suit la chirurgie, en particulier son comportement, son activité et sa posture (s’il est prostré), son pelage (s’il est hérissé, s’il y a une perte de poils), sa respiration (si le rythme est rapide ou saccadé), et les mouvements qu’il effectue, pour détecter tout signe de souffrance. En cas de tels signes, nous augmenterons la dose d’analgésique buprénorphine. Si cela ne suffit pas et qu’une souris est en décubitus latéral avec une détresse respiratoire, elle sera euthanasiée par dislocation cervicale. Durant la phase de surveillance de 20 heures, chaque animal sera isolé dans une cage propre contenant les éléments d’enrichissement afin d’éviter toute blessure. Il bénéficiera d’une lampe chauffante pour maintenir sa température, ainsi qu’un accès facilité à la nourriture (directement dans la cage) et à l’eau (biberon avec bec allongé). L’environnement sera enrichi afin de limiter le stress et l’anxiété des animaux (abris en polycarbonate de couleur rouge leur offrant un abri obscur et permettant leur surveillance, croquettes d'alimentation préalablement hydratées afin de faciliter leur assimilation).
Choix des espèces
La souris représente une espèce validée dans ces modèles d’ischémie cérébrale, permettant de plus l’évaluation standardisée de l’étendue et de la sévérité de l’AVC. Il existe aussi une similarité du réseau vasculaire cérébral avec l’anatomie humaine (polygone de Willis). De plus, l’utilisation de souris du même âge, sur fond génétique C57BL/6 permet de limiter au minimum les variations inter-individuelles et de réduire la variabilité des résultats et donc le nombre d’animaux à utiliser. Les souris sont de plus idéales pour cette étude, car l’ensemble des procédures proposées (MCAO) a été établi dans ce modèle animal. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 8 et 12 semaines, un âge correspondant au stade adulte pour un poids de 25g en moyenne. La taille du monofilament est calibrée pour réaliser le MCAO sur des souris de cette taille.
Impact des bactéries du phylum firmicutes sur l’immunité intestinale, la migration lymphocytaire et le rejet de greffe
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Gavées avec une suspension bactérienne, puis greffées d'un morceau de peau au cours d'une chirurgie de trente minutes, 72 des 92 souris reçoivent ensuite des injections abdominales tous les deux jours pendant une semaine, puis deux fois par semaine pendant deux à trois semaines. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Il s'agit de savoir si modifier le microbiote intestinal allonge la survie d'une greffe de peau sous immunosuppresseur, piste ouverte par le constat que le taux de rejet varie selon le lieu de vie des patients greffés. Le porteur indique que la chirurgie induit une douleur et que l'isolement qui la suit comme la répétition des gavages stressent les souris, et prévoit leur mise à mort si la douleur persiste au-delà de 48 heures, avant les prélèvements terminaux qui ferment le protocole.
Objectifs
La transplantation d’organes est le seul traitement de certaines pathologies, elle augmente de plusieurs années la durée de vie des patients. Cependant, le système immunitaire du patient reconnaît l'organe greffé comme étranger ce qui provoque un rejet de l'organe. Plusieurs traitements sont utilisés pour contrer le système immunitaire et donc le rejet. Les traitements historiques de prévention du rejet de greffe présentent de nombreux effets secondaires, ils réduisent l'espérance de vie des patients. Un des derniers traitements développés, le bélatacept, présente moins d'effets secondaires que les traitements historiques, mais il est moins efficace pour prévenir certains rejets spécifiques. Le risque de subir un rejet avec ce traitement semble relié à l'environnement des patients et leur microbiote. En effet, le pourcentage de rejet cellulaire aigu des patients traités par bélatacept varie fortement en fonction de leur lieu de vie mais n’est pas associé à d’autres paramètres d’ordre génétique. De plus nos résultats, issus d’échantillons de patients pré-transplantation, montrent une association entre un moindre risque de rejet cellulaire aigu et la translocation d’ADN de bactéries appartenant au genre Coproccocus, qui fait partie des espèces commensales du microbiote digestif. Le microbiote est l’ensemble des bactéries présentes naturellement sur et dans le corps humain. Il influence la fonction des organes et cellules, il peut provoquer la production de certaines molécules. Ce projet a pour objectif de modifier le microbiote des animaux puis d'évaluer l'effet de cette modification sur le rejet de greffe. Nos résultats précédents laissent envisager que la prépondérance de Coproccocus au sein du microbiote induirait une population de cellules immunitaires régulatrices. Ces cellules pourraient être à l’origine d’une moindre prévalence du rejet de greffe aigu. Dans un modèle de greffe de peau de souris, nous analyserons la durée de greffe et l'effet du microbiote sur les systèmes immunitaire et digestif.
Bénéfices attendus
Les données obtenues permettront de comprendre le lien entre le microbiote et le rejet aigu. Nos études précédentes, sur des échantillons de patients, ont montré que certaines bactéries pourraient avoir un effet bénéfique, réduisant le nombre de rejet. Ce projet nous permettrait de valider l'effet bénéfique des bactéries du genre Coprococcus et de comprendre par quel moyen ces bactéries agissent. Il est connu que le microbiote modifie le fonctionnement et le nombre des cellules immunitaires au niveau des intestins. Ainsi, nous modifierons le microbiote des animaux puis nous analyserons les modifications de l’immunité en présence ou non d’un traitement utilisé en prévention du rejet de greffe. Nous étudierons également la survie de greffe dans ce contexte. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les causes du rejet de greffe des patients greffés et traités par de nouvelles thérapies immunomodulatrices. Ces résultats permettront de mettre au point un test pour déterminer quels patients feront plus probablement un rejet de greffe avec ce nouveau traitement. Il sera ainsi possible de mieux cibler les patients pouvant recevoir ce traitement et de concevoir des thérapies pour modifier le microbiote des patients susceptibles de subir un rejet.
Procédures
92 souris seront gavées par une solution non-irritante, le gavage durant moins de 5 min. Par la suite, nous réaliserons une greffe de peau sur 72 souris (ayant été préalablement gavées), la chirurgie durera 30 min par animal. Ces animaux recevront un traitement dans l'abdomen ; tous les 2 jours pendant une semaine puis deux fois par semaine pendant 2 à 3 semaines. Les injections dureront moins d'une minute chacune.
Impact sur les animaux
La réalisation d'une greffe de peau est une procédure chirurgicale qui induit une douleur pour l'animal. La chirurgie et l'isolement à la suite de celle-ci peuvent également être source d'un stress. De même, la répétition des gavages est à prendre en compte dans les éléments de stress pour les animaux. L'ensemble de ces éléments a été considéré dans la méthodologie décrite dans les procédures. Le traitement par la molécule étudiée (CTLA4-Ig) n'est pas décrit comme ayant des effets délétères.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour procéder aux prélèvements terminaux. Il n’est pas envisageable de procéder à un réveil des animaux suite à ces prélèvements.
Remplacement
Nous avons jusqu'alors utilisé des échantillons issus des patients traités par la molécule étudiée (CTLA2-Ig). Nos précédentes études, portant sur la réponse au CTLA4-Ig, utilisaient des cellules humaines isolées de prélèvements ou des sérums issus de cohortes de patients. Toutefois, l'utilisation d'un modèle murin nous permettra de valider nos observations dans un contexte d'interaction entre la greffe, le microbiote intestinal et les cellules immunitaires. Une étude in vitro ne mime pas l’interaction de l’ensemble de ces acteurs, elle ne permettrait pas l’étude des mécanismes associant le traitement et le microbiote au rejet de greffe. Le modèle de greffe de peau permet une dose de CTLA4-Ig, sur le site de greffe et dans les ganglions drainant, proche de celle présente chez les patients transplantés.
Réduction
Nous nous sommes attachés à réduire le nombre d'animaux dans cette expérimentation. La validation de la méthode de colonisation intestinale par des bactéries du genre Coprococcus nécessitera 20 animaux, 10 par groupe. Le gavage sera réalisé jusqu’à 3 fois par animal avec des suspensions bactériennes différentes permettant de limiter la variabilité issue des lots de suspensions bactériennes. A l’issus des trois premières répétitions (12 animaux) nous évaluerons la nécessité de réaliser le reste de la procédure en fonction de la variabilité des résultats obtenus. Si ce nombre est suffisant pour déterminer les conditions d’une colonisation effective ou inductrice d’une modification immunitaire la procédure sera arrêtée, sinon nous réaliserons les 2 répétitions supplémentaires. L'étude de la durée de greffe avant rejet par des souris OMM-12 nécessitera 16 animaux, 8 par groupe, afin de déterminer des moyennes, écart-types et délais de rejet minimum attendus Cette étape a été intégrée à la procédure permettant de répondre à la question scientifique, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L’obtention d’un nombre suffisant de données pour observer un allongement de la survie de la greffe nécessitera la greffe de 72 souris. Mais le nombre de répétition sera affinée à la suite de l’étude sur les 16 premiers animaux. Des mâles et des femelles en nombre équivalent seront inclus dans l’ensemble des procédures et à chaque répétition, afin d’évaluer la variabilité de réponse entre les sexes. Cette évaluation nécessite d’inclure un plus grand nombre d’animaux mais permettra de ne pas renouveler la procédure à l’avenir pour tester l’effet dépendant du sexe.
Raffinement
Les souris seront maintenues en groupe et dans des conditions d’hébergement habituelles tout au long de leur vie. L'alimentation des animaux sera adaptée (aliment humide au sol) suite aux procédures de chirurgie ou en cas de douleur limitant la mobilité. Au cours de l'expérimentation et en cas de douleur, un protocole d'analgésie sera défini. Toutefois, en cas de non-résolution de cette douleur dans les 48h, de rejet de greffe supérieure à 80% de la surface du greffon ou de perte de poids supérieur à 20%, l'animal sera mis à mort. Les greffes de peau seront réalisées sous anesthésie. La douleur post-chirurgicale sera anticipée et un protocole d’analgésie sera appliqué préventivement. La douleur sera évaluée et traitée si besoin tout au long des protocoles expérimentaux et du suivi post-opératoire des animaux.
Choix des espèces
L'utilisation d'un modèle murin les facteurs d'histocompatibilité du donneur et du receveur de greffe de peau. La greffe de peau est une technique parfaitement décrite dans ce modèle. L'utilisation de ce modèle permet dans le même temps une modification maîtrisée du microbiote intestinal, la greffe et l'utilisation d'un immunosuppresseur. Le modèle murin nous permet d'analyser l'interaction de ces trois composants (microbiote, greffe, traitement) avec l'immunité intestinale. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois. Une étude de l'effet du CTLA4-Ig en fonction de l'âge ayant montré que l'âge des animaux influe sur leur réponse au CTLA4-Ig. Nos résultats devant être transférables dans un modèle de greffe murine, l'étude de colonisation pilote sera réalisée également sur des animaux de 2-3 mois.
Evaluation chez la souris du potentiel thérapeutique de deux molécules dans le cancer de la prostate
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
L'ablation des testicules, pratiquée sur la moitié des souris, ouvre un protocole qui comprend aussi des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant vingt-huit jours et des gavages tous les quatre jours. 1 836 souris immunodéficientes vont être utilisées, dont 816 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des cellules tumorales humaines par voie intraveineuse ou directement dans un lobe de la prostate, puis passent chaque semaine trente minutes sous anesthésie gazeuse pour l'observation des tumeurs, pendant quatre mois au maximum. Seuls les mâles entrent en procédure, les femelles nées de ces élevages étant accouplées, proposées en don à l'institut, et tuées si personne ne les récupère.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la troisième cause de mortalité par cancer chez l’homme. Dès lors que le cancer est invasif, la castration chimique (déprivation en hormones masculine) est mise en place pour ralentir efficacement le cancer, mais dans 100% des cas, la tumeur récidive, menant au décès du patient. Une population cellulaire a été identifiée chez la souris comme candidate dans cette récidive tumorale. Plus particulièrement, ces cellules sont amplifiées dans des souris génétiquement modifiées et résistent à la castration. Deux cibles de ces cellules semblent être des cibles thérapeutiques potentielles. Deux drogues les ciblant sont efficaces in vitro contre des cultures 3D de ces cellules (avec et sans hormones masculines) et leurs effets sont additifs La même chose a été observée sur une lignée humaine issue de métastasees de patient. L’objectif de ce travail est donc d’évaluer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques sur l’inhibition ou la régression de métastases à partir d’une lignée cellulaire humaine.
Bénéfices attendus
Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire d’identifier les cellules responsables de la récidive tumorale et de les cibler de façon thérapeutique. Les études préliminaires in vitro nous ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire possédant les propriétés requises à l’initiation de la récidive et en faisant donc une population cellulaire candidate. Des expériences in vitro ont permis de trouver deux protéines cibles. Ce projet permettrait de définir in vivo, chez la souris, si leurs inhibiteurs, administrés seuls ou en combinaison, sont capables d’inhiber le développement métastatique tumoral et/ou faire régresser des métastases ou structures tumorales déjà établies dans un contexte naïf (présence d’hormones masculines) ou d’hormonothérapie (castration). Ces tests seront faits sur des métastases issues d’une lignée cellulaire humaine afin de voir si ces thérapies pourraient être étendues à l’homme par la suite.
Procédures
Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des injections par voie intra veineuse ou locale de cellules tumorales humaines (1 par souris (quelques secondes en intraveineuse ou quelques minutes en local)) . - 2- Des observations des tumeurs sous anesthésie gazeuse (toutes les semaines pendant maximum quatre mois pour toutes les souris durant 30 min). - 3- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique pour la moitié des souris. - 4- Des traitements en injections (de quelques secondes) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 5- Des traitements en gavage (de quelques secondes) tous les quatre jours pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions 4 et 5 au cours des procédures.
Impact sur les animaux
Toutes les souris de la demande d’autorisation recevront par voie intraveineuse (douleur légère) ou intra-lobe prostatique des cellules tumorales humaines, mais, potentiellement, toutes ne développeront pas de structures tumorales/métastases. Le développement tumoral qui peut être observé chez ces souris peut être indésirable mais nous ne connaissons pas encore le développement métastatique attendu. L’ablation des testicules et l’injection des cellules en intra-lobe dorsal prostatique (procédures 2) sont des actes chirurgicaux réalisés sous anesthésie et analgésie mais ils peuvent occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir modérément et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies et des séances d’imageries sont un stress. L’administration par gavage (procédures 2) comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées (procédures 2) peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les souris sont des souris immunodéficientes qui ont un risque infectieux plus élevé.
Devenir
Chaque animal sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égal à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il a dû être exclue (pas de développement tumoral). En revanche il ne sera pas mis à mort tout de suite si sa présence peut éviter l’isolement d’un individu encore en procédure. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de la durée de la procédure de prélever différents organes et les tumeurs afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé. Cet animal pourra appartenir soit à la branche des animaux témoins servant de référence, soit à une branche d’animaux traités. Parmi les animaux générés, seuls les mâles iront en procédure et les femelles (environ la moitié) seront soit utilisées pour les accouplements, soit proposées en don à l'institut. Si elles ne sont pas récupérées, elles seront mises à mort.
Remplacement
Nous avons mené l’étude par différentes approches dans un premier temps pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique (notamment les métastases) et de sa récidive postcastration.
Réduction
Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé est calculé de manière à obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Si un des modèles d'injection testés ne génère pas de métastases, les expériences se basant sur l’injection de ces cellules ne seront pas réalisées. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 16 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.
Raffinement
Pour s’assurer du bien-être des souris durant la croissance des greffes tumorales, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis dans des grilles de score. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car c’est le meilleur modèle connu pour éviter toute réaction immunitaire et rejet de greffe de cellules tumorales tout particulièrement pour les cellules humaines.
Evaluation des effets combinés des stress thermique et radiologique chez les stades précoces de poissons sauvages
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Évaluer comment des embryons et alevins de poissons encaissent une hausse de température doublée d'une irradiation gamma : 1 475 truites communes et ombles chevaliers vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Les actes déclarés se limitent à des photographies pour la morphologie et à des vidéos pour le comportement, avec un changement de bac. Le porteur attend pourtant une mortalité de 30 % due au stress thermique, et retient des débits de dose allant jusqu'à la valeur maximale mesurée à proximité de Tchernobyl. Les survivants, qui mesurent au plus un centimètre et demi, sont tués par surdose d'anesthésiant pour prélever foie et reins, un seuil de 30 % de perte de poids, estimé à l'œil, déclenchant une mise à mort anticipée.
Objectifs
Le réchauffement climatique à l’échelle de la planète sera compris entre 1,5 et 4,5°C avec des valeurs extrêmes allant jusqu’à 6°C d’ici 2100. Par conséquent, l’écotoxicité de substances chimiques classiques retrouvées dans les écosystèmes aquatiques doit être réévaluée en prenant en compte les effets du stress thermique. Peu de données concernent l’étude combinée des effets de l’augmentation de la T°C et de l’irradiation gamma. Ce type d’irradiation se rencontre suite à un défaut de central nucléaire et pénètre davantage dans l'organisme que les rayonnements alpha et bêta, mais il modifie moins les particules qu'il rencontre. Un précédent projet dans les même conditions d’irradiation et sur les mêmes espèces de poisson avait montré seulement une préciosité de la date d’éclosion. Ce projet permettra d’évaluer le stress lié à une irradiation gamma couplé d’une hausse de température à travers des expérimentations menées en conditions contrôlées de laboratoire, la réponse phénotypique (mortalité/développement/comportement/croissance) et moléculaire de plusieurs espèces de poisson sauvage exposées à différents stress de température (aigue pour mimer les rejets thermiques des centrales nucléaires et chronique pour mimer l’augmentation des températures en amont des centrales nucléaires en lien avec le réchauffement climatique) et à différents niveaux de débits de dose (valeur seuil de protection des écosystèmes aquatiques, valeur maximale mesurée à proximité de Tchernobyl.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait servir à terme à mieux évaluer les capacités de résilience des stades précoces de poissons sauvages face au stress thermique couplé à des effets de rayons ionisants.
Procédures
Les procédures de ce projet (prise de photo pour mesurer la morphologie, vidéo pour le comportement ) n'impliquent qu'un leger stress dû à la manipulation des animaux. Nous nous attendons à ce que ce stress se dissipe rapidement après avoir remis les individus dans leur aquarium.
Impact sur les animaux
Compte tenu des connaissances acquises lors d’études précédentes sur les radiations ionisantes sur l’omble chevalier au stade embryo-larvaires nous nous attendons à ne pas avoir impact sur leur survie. Pour les variations de températures, nous prévoyons une mortalité au cours de l’expérimentation de 30% en raison du stress induit par la température pour les alevins . En outre, les procédures de ce projet (vidéo pour le comportement) n’impliquent qu'un léger stress du au changement de bac. Les animaux seront ensuite mis à mort par surdose d’anesthésie pour les mesures morphologiques et les prélèvements d’organes.
Devenir
A la fin de l'expérimentation les animaux seront mis à mort pour le prélévément des organes (fois et reins) pour le dosages des biomarqueurs de stress (stress oxydatif: catalase, super oxyde dismutase ). La mise à mort sera réalisée par surdose d’anesthésiant (balnéation > 250 ppm de benzocaine ou > 400 ppm de tricaine). L’objectif est d’atteindre une anesthésie de stade 4 (paralysie médulllaire) , caractérisée par une perte totale d’équilibre, une réactivité nulle, un arrêt de la fréquence operculaire et une perte totale de tonus. La mort sera confirmée par une vérification à la loupe binoculaire de l'arrêt permanent de la circulation. Les animaux en fin d’expérimentation mesurant au maximum 1.5 cm.
Remplacement
Le modèle animal n'est pas remplaçable par un modèle in vitro car il nécessite une étude dans un système intégré ( différents tissus fondamentaux, différents organes et notamment système inflammatoire...), de plus les stades embryo-larvaire sont pollu-sensibles. De plus, l’omble chevalier est une espèce patrimoniale et sentinelle des lacs alpins. Ainsi, aucune expérience in vitro ne permettrait de répondre à cette question scientifique qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier.
Réduction
L’effectif totale est de 30 individus parconditions thermique et par traitements afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). L’effectif totale est de 30 individus afin de s’assurer un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction).
Raffinement
L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous- alimentation). De plus, dans chaque bassin, des tubes cérémiques seront installées pour permettre aux truites de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience. On considère qu'il y a un effet grave lorsque l'organisme perd 30 % de son poids. On considère qu'il y a un effet grave lorsque l'organisme qu’une perte de poids est estimé par contrôle visuel journalier des individus. Dans ce cas, l'individu sera immédiatement euthanasié par surdose d'anesthésie afin d'éviter toute souffrance à l'animal.
Choix des espèces
La truite commune (Salmo trutta) apparait comme un bon candidat modèle pour plusieurs raisons : i) est une espèce de relevance grâce à sa présence a niveaux mondial, ii) possède un fort attrait économique grâce à l’activité de pêche de loisir et iii) a un intérêt économique avec une production aquacole de 700 tonnes en France et de 19432 tonnes au niveau mondial . L’omble chevalier est une espèce patrimoniale et sentinelle des lacs alpins. Ainsi, aucune expérience in vitro ne permettrait de répondre à cette question scientifique qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier. Enfin, ces deux espèces présentent des thermo tolérance faible ce qui en font un bon modèle pour cette étude. Les stades embryo-larvaires ont été ciblés pour cette étude car le test sur les embryons de poisson a été validé compte tenu de son excellente corrélation avec le test de sensibilité aiguë sur les poissons basé sur des poissons juvéniles et adopté comme méthode d'essai standard pour les tests de libération sur les poissons.
Evaluation préclinique d’un immunomodulateur en combinaison avec la radiothérapie et un traitement anti-PD1 pour le traitement de cancers multisites.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des cellules tumorales injectées dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, les autres portent des tumeurs sous-cutanées, et toutes passent par une irradiation localisée de cinq minutes, réalisée sur animal vigile maintenu en contention un quart d'heure. Le porteur décrit l'irradiation comme indolore et annonce une perte de poids inférieure à 5 % liée au passage des rayons sur l'intestin ou l'œsophage. Le bénéfice avancé, réduire les doses de radiothérapie chez des patients, est renvoyé à un transfert clinique lointain, quand les tumeurs greffées et les mini-chirurgies pulmonaires, elles, sont immédiates.
Objectifs
Le cancer du poumon est l'un des cancers les plus répandus. La radiothérapie est un outil puissant qui fait partie de l’arsenal de traitements anticancéreux. De nombreuses études précliniques et cliniques montrent que l’efficacité antitumorale de la radiothérapie dépend du système immunitaire et du microenvironnement tumoral de l’hôte. Nous voulons évaluer un nouveau traitement.Nous pensons que la combinaison radiothérapie + traitement spécifique peut s’avérer être très efficace. Par ailleurs, de nombreuses données précliniques et cliniques suggèrent que la combinaison de radiothérapie + traitement classique est prometteuse. Toutefois, les données cliniques en faveur sont encore parcellaires et de nombreux modèles murins restent résistants à ce traitement. Nous évaluerons donc la triple combinaison radiothérapie + traitement classique+ traitement spécifique pour voir si l’ajout ce traitement spécifique peut sensibiliser les tumeurs au traitement radiothérapie + traitement classique. Il a été observé que la radiothérapie pouvait induire des effets antitumoraux « abscopaux », c’est-à-dire en dehors du champ d’irradiation. Ainsi, l’irradiation d’une tumeur primaire peut entraîner un effet antitumoral sur une tumeur secondaire ou une métastase placée hors du champ d’irradiation. Cet effet « abscopal » est augmenté par les modulateurs de l'immunité. Nous testerons la triple combinaison thérapeutique dans un contexte de tumeurs multisites (plusieurs tumeurs portées par le même hôte) pour évaluer si le traitement spécifique peut augmenter l’effet abscopal.
Bénéfices attendus
50% des patients traités pour un cancer reçoivent une radiothérapie au cours de leur traitement. Le but de la radiobiologie est de permettre l’amélioration de l’efficacité des radiations ionisantes sur les tumeurs (en diminuant la radiorésistance), et de minimiser les effets secondaires sur les tissus sains traversés par les rayons. L’amélioration de la réponse tumorale à l’irradiation pourrait permettre de réduire les doses d’irradiation et ainsi les effets secondaires sans affecter l’efficacité du traitement anti tumoral. Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostic de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’effet à distance induit par l’irradiation qui provient du système immunitaire est également un thème de recherche actif en radiothérapie. A court terme, notre étude permettra l’apport de connaissances scientifiques supplémentaires pour mieux appréhender les interactions radiothérapie/immunité mais elle constituera surtout un socle de données précliniques permettant d’envisager à plus long le transfert en clinique de cette combinaison lors d’essais cliniques et donc potentiellement permettra la mise au jour d’un nouveau traitement.
Procédures
Les souris pourront avoir des injections (1 à 4) sous anesthésie locale, durée 1 minute maximum. Injection de cellules tumorales dans le poumon après incision de la peau, sous anesthésie générale, n=1, durée 1 minute. Irradiation localisée sur souris vigiles, durée 5 minutes.
Impact sur les animaux
Le type d’irradiation utilisée dans notre étude est une irradiation localisée. Elle a lieu sans anesthésie pour les tumeurs sous-cutanées. Les souris sont placées dans un système de contention pendant une quinzaine de minutes ce qui peut générer du stress et de l’anxiété légers et transitoires. Elle a lieu sous anesthésie gazeuse pour l’irradiation du thorax dans le cas des tumeurs pulmonaires. L’irradiation en elle-même est indolore et, comme elle est localisée et à dose raisonnable, elle n’induit pas une perte de poids conséquente (perte de poids de moins de 5% due à l’irradiation d’une partie des intestins ou de l’œsophage qui sont proches de la tumeur). L’administration traitements peut engendrer un stress transitoire léger. Les tumeurs peuvent gêner la souris modérement. L Pour les prélèvements de sang, les souris seront d’abord anesthésiées ce qui peut générer un stress léger et transitoire. La principale nuisance réside dans l’implantation en orthotopique des cellules cancéreuses pulmonaires qui se fait au cours d’une mini-chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de sang et tumeurs pour analyses ultérieures, ou pour respecter les points limites dans le cadre des études d'efficacité.
Remplacement
Le recours à des modèles animaux nous permettra d’étudier les effets d’une nouvelle combinaison thérapeutique dans un contexte qui inclut le micro environnement tumoral et le système immunitaire. Ceci permet donc l’interaction des cellules tumorales avec leur environnement naturel. Ces interactions jouant un grand rôle dans les effets de la radiothérapie, il apparaît donc indispensable d’avoir une évaluation sur un modèle animal pour déterminer exactement les effets de ces immunomodulateurs avant d’envisager un passage en thérapie humaine. Aucun modèle in vitro ne permet actuellement d’obtenir la complexité présente dans un animal vivant (immunité, vascularisation, organo-dépendance,…).
Réduction
Uune analyse statistique à priori a été effectuée afin de calculer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives de croissance tumorale. L’analyse de la croissance tumorale se fera avec une analyse de la variance pour tester la significativité des différences obtenues pour les différents groupes, suivie d’un test de comparaisons multiples pour tester la significativité du traitement triple combinaison par rapport aux doubles combinaisons. La dernière procédure ne sera menée que si les résultats des procédures précédentes sont prometteurs.
Raffinement
Au cours de notre projet, les nuisances aux animaux sont de la douleur et du stress. Pour les injections, un anesthésique local sera utilisé. La mise en contention pour l’irradiation sera réalisée par une personne entraînée qui effectue déjà geste depuis des années au sein du laboratoire pour réduire le temps de la contention et le stress induit. La chirurgie pour l’implantation du tumeur dans le poumon se fera sous anesthésie gazeuse, également par une personne très entraînée et un analgésique sera administré avant et après le geste opératoire pour limiter au maximum la douleur induite. Les prélèvements de sang se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront observés quotidiennement (vérification de l’état général) et pesés 3 fois par semaine (pour surveiller la survenue d’une éventuelle perte de poids, même si elle est non attendue dans ce projet. Un complément alimentaire énergétique sera donné en cas de perte de poids. De l’enrichissement est introduit dans les cages tout au long de l’expérience. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6 ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Les animaux auront 8 semaines. Souris après sevrage.
Étude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
576 souris subiront une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'électrodes, puis six heures d'enregistrement électroencéphalographique par semaine pendant un mois, avec un hébergement individuel de sept jours après l'opération. 1 728 souris au total vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome humain rare, elles peuvent présenter déformations articulaires, faiblesse musculaire, difficultés respiratoires, crises d'épilepsie, troubles de l'équilibre et constipation sévère. 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif étalés sur six mois, sans que le résumé indique lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal sodique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.
Procédures
Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.
Devenir
L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal sodique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.
Raffinement
Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.
Efficacité de différentes modalités de synchronisation des chevrettes suite à une préstimulation par effet bouc dans un objectif d’insémination
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système urogénital
Réduire les hormones dans la préparation des chevrettes à l'insémination : c'est l'objet déclaré du projet, qui va utiliser 36 chevrettes de sept mois dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune subit quatre prises de sang à la veine jugulaire, la pose d'une éponge vaginale, jusqu'à deux injections intramusculaires et une échographie transabdominale, tous actes réalisés sur animal vigile. Le porteur reconnaît des douleurs légères de courte durée, des hématomes possibles, un risque de phlébite ou d'infection cutanée au point de ponction, et un stress lié à la contention. La finalité reste la performance de l'insémination en élevage caprin, avec une fertilité des chevrettes jugée trop hétérogène, et les 36 animaux retournent ensuite au troupeau où d'autres projets pourront les reprendre.
Objectifs
L’Insémination Animale (IA) a un rôle central dans le cadre de la sélection génétique. L’IA est pratiquée en élevages de petits ruminants quasi exclusivement après synchronisation hormonale des chaleurs et des ovulations. Chez les caprins, l’IA est rarement pratiquée sur chevrettes (385 par an au niveau national en moyenne sur 2018-2022) car les résultats de fertilité obtenus quasi exclusivement après synchronisation sont très hétérogènes et inférieurs aux adultes (50% versus 58% en moyenne sur la même période pour un total moyen de 67225 inséminations par an). Une étude préalable a montré que la préstimulation par effet bouc des chevrettes avant le programme hormonal de synchronisation (PHS) permettait d’obtenir des fertilités sur mise-bas similaires aux adultes et répétables d’un élevage à l’autre. Le contexte sociétal et réglementaire de l'élevage incite fortement à la recherche de traitements alternatifs excluant l’utilisation d’hormones. L’objectif de ce projet est d’évaluer si un programme de préparation des chevrettes à l’IA basé sur une préstimulation puis une synchronisation par éponge-effet bouc ou éponge-prostaglandine permet une fréquence de réponse ovulatoire et une expression de chaleurs d’au moins la moitié de celle obtenue suite à la synchronisation hormonale classique (réponse attendue de 100% d’ovulations), de façon à pouvoir proposer aux éleveurs une solution avec un moindre recours aux hormones.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à faciliter la mise en œuvre par les éleveurs caprins d’une mise à la reproduction des chevrettes par insémination animale (IA) après induction et synchronisation des chaleurs par préstimulation puis synchronisation hormonale avec un moindre recours aux hormones.
Procédures
Les chevrettes seront soumises chacune à 4 prélèvements sanguins, une pose d’éponge vaginale, 0, 1 ou 2 injections intramusculaires à la base de l’encolure et une échographie transabdominale. Chacun de ces actes est réalisé sur animal vigile et ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Lors des injections par voie intramusculaire (au total 2 injections par chèvre dans le lot T, 1 injection par chèvre dans le lot B), les chèvres pourront ressentir une douleur légère de très courte durée (quelques secondes), sans altération de leur état général (parfois, un hématome peut se former, régressant spontanément). Lors de la prise de sang par ponction à la veine jugulaire (au total 4 prélèvements par chèvre), les animaux peuvent ressentir une douleur légère de courte durée, mais pas de douleur chronique ou aigüe de forte intensité. Sur le site de prélèvement ou d’injection peut apparaître éventuellement une inflammation (phlébite), un hématome voire une infection cutanée. La pose d’une éponge vaginale peut causer à la chèvre un inconfort de courte durée mais n’entraine pas de douleur. Un stress léger pourra être ressenti par les chèvres lors de la contention pour les prises de sang, la pose d’éponge, les injections ou l'échographie.
Devenir
Tous les animaux restent dans l'élevage. Ils pourront être réutilisés dans d'autres projets sous réserve d'un avis favorable du vétérinaire sanitaire de l'établissement utilisateur.
Remplacement
Ce projet concerne la mise à la reproduction de chevrettes par insémination en conditions d’élevage. Il ne peut être réalisée qu’avec l’utilisation d’animaux vivants.
Réduction
Le projet utilisera 36 chevrettes. Dans la conduite habituelle de l’élevage caprin de l’unité expérimentale, un lot physique est un groupe de chevrettes élevées ensembles dans un même enclos et mises à la reproduction au même moment. Nous décrirons la cinétique des venues en chaleur selon la méthode de détection de référence (marques de chevauchement par les boucs, équipés de tabliers avec crayons marqueurs) lors de la préstimulation (de J0 à J10) et suite à la synchronisation (de J19 à J21). La progestéronémie à 8 jours après IA nous permettra de déterminer quelles femelles ont ovulé suite à la synchronisation et le dosage à 21 jours après IA est un diagnostic de non gestation déterminant les femelles vides. Les variables à étudier seront donc la proportion de chevrettes ayant ovulé suite au traitement et la proportion de chevrettes détectées en chaleur. Un calcul de puissance a été réalisé sur ces variables afin de déterminer le nombre de chevrettes par lot. La fréquence attendue des ovulations et des chaleurs dans le lot témoin est de 95% à 100%. Pour pouvoir envisager de proposer à des éleveurs de tester ces programmes de préparation avec préstimulation, nous voulons nous assurer qu’au moins la moitié des chevrettes répondent au traitement par une ovulation et des chaleurs.
Raffinement
Les chevrettes seront dans leurs conditions d’élevage habituelles (en groupes) dans un bâtiment d’élevage conventionnel sur litière paillée et feront l’objet d’une surveillance journalière pendant toute la durée du protocole. Pour chaque lot, le milieu d’élevage est enrichi avec des tapis (Grat'o gratte®) positionnés sur les claies pour se gratter les flancs, des disques suspendus à mordiller et des plateformes pour grimper et se cacher. Pour les prélèvements sanguins, les injections par voie intramusculaire, la pose d'éponge et l'échographie, la contention sera faite par des expérimentateurs animaliers, dont la présence journalière répétée en interaction positive (alimentation, traite, soins) est associée à une diminution du comportement de fuite des chèvres et donc de leur stress face à la contention. Un renforcement positif par caresse sera réalisé après chaque intervention nécessitant une contention. Une surveillance des sites de prélèvement et d’injection sera réalisée afin de traiter l’apparition éventuelle d’une inflammation (phlébite), d’un hématome voire d’une infection cutanée. Le cas échéant, un baume végétal décongestionnant, antiseptique et cicatrisant pourra être appliqué en massage sur les veines (Vétébiol) ou sur le site d'injection. Une surveillance journalière de l’état général des animaux sera aussi réalisée. En cas de signes de maladie, un traitement adapté (antidouleurs, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mis en place par les animaliers selon le protocole de soins établi par le vétérinaire sanitaire de l’installation expérimentale et avec son intervention si nécessaire.
Choix des espèces
L’espèce caprine est l’espèce cible de ce travail de recherche sur la préparation des chevrettes à l’IA par préstimulation par les boucs puis synchronisation pour une application en élevage caprin. L’étude sera réalisée avec des chevrettes de 7 mois. Il s’agit du profil habituel des chevrettes mises à la reproduction.
Effet des dérivés de probiotiques sur un modèle murin de péri-implantite.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un implant dentaire leur est posé, puis, quatre semaines plus tard, un fil de soie est noué autour pour déclencher l'inflammation, fil vérifié chaque semaine sous anesthésie gazeuse et remplacé s'il s'est relâché. Le porteur qualifie la pose de la ligature et l'application quotidienne du gel de non douloureuses, tout en prévoyant une évaluation quotidienne de la douleur par score de grimaces. Il indique travailler avec une équipe qui développe un modèle artificiel de gencive et d'os, ces expériences servant précisément à le valider, ce qui reviendrait à réduire plus tard le recours aux souris.
Objectifs
Les implants dentaires sont des racines artificielles qui permettent de remplacer une dent. Dans plus d’un tiers des cas, 2 ans après leur pose, une maladie inflammatoire localisée autour de l’implant survient et peut entrainer sa perte : la péri-implantite. Cette maladie est causée par un déséquilibre des bactéries orales avec la présence en excès de bactéries néfastes qui vont jouer un rôle dans l’inflammation. Ce projet a plusieurs objectifs : 1. fournir des données sur l’os et la gencive autour des implants qui serviront de références pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os en condition saine 2. fournir des données sur l’os et la gencive autour des implants qui serviront de références pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os lors de la péri-implantite 3. tester l’efficacité d’un nouveau traitement dans la péri-implantite : les dérivés de probiotiques. Les dérivés des probiotiques sont définis comme une préparation de micro-organismes inanimés et/ou de leurs composants exerçant un bénéfice pour la santé de l'hôte. Ils sont utilisés pour rééquilibrer les bactéries, réduire l’inflammation et pourraient améliorer la maladie de la péri-implantite. Ces 3 objectifs correspondent aux 3 procédures expérimentales du projet : la procédure 1 avec la mise en place d'un implant dentaire, la procédure 2 avec la mise en place d’un implant dentaire qui sera entouré dans un second temps par un fil de soie (ce qui induit la péri-implantite), et la procédure 3 qui correspond à l'application thérapeutique d'un gel contenant des probiotiques dans la péri-implantite.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Les données obtenues sur la gencive et l’os autour des implants chez la souris serviront de référence pour la réalisation d’un modèle artificiel de gencive et d’os en condition saine et de péri-implantite. La validation du modèle artificiel pourrait permettre de réduire l’utilisation des modèles animaux dans les études des implants dentaires dans le futur. En effet, en fonction de sa validation, il pourrait être utilisé en première intention, en remplacement des animaux. Les traitements utilisés à l’heure actuelle pour la péri-implantite ont des effets imprédictibles et variables d’un patient à l’autre. Les dérivés de probiotiques pourraient constituer un nouveau traitement prometteur dans cette maladie où un déséquilibre des bactéries a été retrouvé.
Procédures
Pour la procédure expérimentale 1, de 25 à 45 souris bénéficieront de la mise en place d’un implant dentaire (le protocole de mise en place de l'implant dure environ 3 minutes). Pour la procédure expérimentale 2, de 30 à 45 souris bénéficieront de la mise en place d’un implant dentaire, puis 4 semaines après de l’induction de la péri-implantite par mise en place d’une ligature péri-implantaire (le protocole de mise en place d'une ligature péri-implantaire autour de l'implant dentaire dure environ 5 minutes). Pour le procédure expérimentale 3, de 20 à 40 animaux bénéficieront de la chirurgie de la mise en place d’un implant dentaire, puis 4 semaines après de l’induction de la péri-implantite par mise en place d’une ligature péri-implantaire et de l’application quotidienne de gel au niveau de l’implant dentaire (l'application de gel autour de l'implant dentaire dure moins d'une minute).
Impact sur les animaux
La mise en place des implants dentaires a déjà été effectuée par d'autres équipes chez la souris : il n'y a pas de perte de poids ou de comportements anormaux entrainés par la chirurgie. Des antidouleurs sont administrés aux souris avant la chirurgie de façon systématique et après la chirurgie en fonction de l'évaluation de leurs douleurs (score de grimaces). L'évaluation de la douleur se fera quotidiennement au minimum et de façon renforcée si un signe de douleur est détecté. Pour induire l'inflammation autour de l'implant dentaire, dans les procédures expérimentales 2 et 3, un mois après la pose des implants, sous anesthésie générale, un fil sera placé autour de l'implant au-dessus de la gencive. La mise en place de cette ligature est non douloureuse. Chaque semaine, sous anesthésie gazeuse courte, on viendra vérifier que la ligature est en place ; si on observe un relâchement ou une perte de celle-ci, il en sera repositionné une autre. Une partie de la procédure expérimentale 3 consiste en l'application quotidienne d'un gel au niveau de l'implant dentaire. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse courte : il s'agit d'une application indolore.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort pour la réalisation de coupes histologiques, de mesure de la hauteur osseuse.
Remplacement
Actuellement, il n'existe pas de modèle n'utilisant pas d'animaux qui permet d'étudier le comportement de la gencive et de l'os après la mise en place d'un implant dentaire. Notre projet s'inscrit dans un projet collaboratif avec une équipe qui tente de développer un modèle de substitution n’ayant pas recours aux animaux. Ainsi nos expérimentations vont servir à valider ce nouveau modèle qui permettrait de diminuer l'utilisation d'animaux dans le futur. Nous ne pouvons pas remplacer les souris par des invertébrés car nous étudions en partie le comportement de l'os.
Réduction
Afin de réduire le plus possible le nombre d'animaux utilisés, nous allons effectuer des études préliminaires sur un petit nombre d'animaux. Ces études préliminaires nous permettent d'observer et de quantifier la réaction de la gencive et de l'os à l'inflammation dans les modèles que nous allons utiliser. A l'aide d'outils statistiques, nous pourrons ensuite calculer le nombre minimal d'animaux à utiliser par la suite dans les expérimentations pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les animaux, à la suite de leur arrivée dans l'animalerie, auront une période d'acclimatation d'une semaine afin qu'ils se familiarisent avec leur nouvel environnement. Ils seront hébergés par groupes de 5 dans des cages de taille adaptée. Des enrichissements de type de frisottis seront présents dans toutes les cages de souris. L'eau et l'alimentation seront proposées à volonté et en permanence aux souris. Après la chirurgie, une visite, au minimum quotidienne, sera effectuée pour observer les souris et évaluer la présence de signes douloureux : si un signe est repéré, des anti-douleurs seront donnés aux animaux et la fréquence de surveillance renforcée pour vérifier leur disparition. Si les animaux montrent une souffrance qui n'est pas soulagée par les traitements, ou un comportement reflétant un mal être ne pouvant pas être résolu, les animaux seront sacrifiés dès l'arrivée de ces signes (sans attendre la fin de l'expérimentation) : le bien-être animal étant un prérequis indispensable à nos procédures.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux fréquemment utilisés pour étudier les implants dentaires. L'utilisation de cette espèce a l’avantage de permettre la réalisation des protocoles sur des temps plus courts (entre 1 et 3 mois) que sur d'autres espèces (par exemple, les durées chez le lapin sont de 10 mois). Par ailleurs, les souris ont une maturité osseuse plus précoce que les autres mammifères (à 3 mois) : les protocoles peuvent donc avoir lieu sur des animaux plus jeunes. Utiliser des souris, nous permettra également d'avoir éventuellement recours à des modèles de souris génétiquement modifiés dans des études futures. Ceci pourrait nous permettre d’étudier certains mécanismes de l'immunité et de l'inflammation.
Amélioration de la greffe d’îlots par thérapie génique chez le rat dans le cadre du traitement du diabète
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des rats sont rendus diabétiques par une injection de streptozotocine, puis traités à l'insuline par une mini-pompe implantée sous la peau du dos, et reçoivent par voie veineuse un vecteur viral destiné à rendre leur foie tolérant à une greffe. Un mois après l'injection du vecteur, une chirurgie de 30 à 40 minutes leur greffe dans le foie des cellules du pancréas prélevées sur d'autres rats, tués pour ce don, sous un traitement immunosuppresseur qui peut les rendre plus sensibles aux infections, et la greffe peut entraîner selon le porteur des saignements "assez abondants". Leur glycémie est mesurée par des micro-prélèvements à la queue chaque jour pendant 15 jours, puis trois fois par semaine. Au total, 262 rats vont être utilisés dans des procédures sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les receveurs sont tués à la fin du protocole pour l'analyse de leurs organes, 6 rats sont tués après une seule injection du vecteur, des rats sont gardés en vie et réutilisés dans d'autres projets "si non rendus diabétiques", et 16 rats sont déclarés réutilisés.
Objectifs
Le diabète de type 1 est une maladie chronique qui apparaît souvent avant l'âge de 20 ans. Il survient lorsque le pancréas ne fabrique plus d'insuline, du fait d’une réaction anormale du système immunitaire qui conduit à l’élimination des cellules productrices. Il s’agit donc d’une maladie auto-immune. Le diabète est caractérisé par la présence d’un excès de sucre dans le sang, appelé hyperglycémie. Le projet vise à établir les bases expérimentales d'une nouvelle approche de greffe de cellules insulino-sécrétrices dans le foie chez les rongeurs, applicable en clinique humaine. Actuellement, des cellules du pancréas de donneurs ou des cellules productrices d’insuline dérivées de cellules souches humaines sont greffés, nécessitant une immunosuppression importante avec des effets secondaires sévères et une durée de survie limitée des cellules greffées. Comme les cellules greffées sont transplantées dans le foie du receveur, notre approche originale est de rendre le foie receveur tolérant aux cellules greffées. Pour cela, notre stratégie consiste à importer dans les cellules du foie le gène d'une molécule qui bloque la réponse anti-immunitaire et l’inflammation. Pour ce faire, un vecteur viral adéno-associé (AAV) sera utilisé pour transférer le gène dans les cellules hépatiques. Ce vecteur sera injecté avant la greffe des îlots. Nous espérons que grâce au vecteur, les cellules du foie pourront recevoir les greffes de cellules du pancréas sans les rejeter. Le succès de cette stratégie pourrait grandement améliorer les greffes de cellules du pancréas ou de cellules souches pour le diabète de type 1 chez l’Homme, résolvant le problème du faible nombre de donneurs disponibles et rendant les greffes accessibles à plus de patients. Le pancréas est un organe vital, vivre sans est possible, mais cela oblige à prendre chaque jour des traitements lourds, ce qui explique le fait de ne pouvoir prélevé sur donneur vivant. Des essais de greffes intra-hépatiques utilisant des cellules souches différenciées pour produire de l’insuline sont par ailleurs en cours, mais nécessitent des immunosuppresseurs puissants pour éviter le rejet. Ce projet propose une solution pour améliorer la tolérance immunitaire des cellules greffées dans le foie, répondant ainsi à un besoin crucial dans le traitement du diabète de type 1.
Bénéfices attendus
En cas de succès du projet chez le modèle rongeur, nous aurons obtenu une première preuve de concept d’un procédé permettant de rendre le foie d’un patient diabétique tolérant aux îlots (ou aux cellules souches qu’on lui greffera). La thérapie génique par vecteurs viral AAV étend actuellement ses applications à de nombreuses maladies humaines. La biodistribution et la tolérance de ces vecteurs ont été largement étudiées chez l’homme et ne représenteront pas d’effets inattendus dans notre projet clinique. Nous comptons de plus, employer de petites doses de vecteur chez le rat. On pourra donc, en cas de succès, anticiper une forte probabilité de transfert aux patients diabétiques de type 1, chez lesquels les greffes sont actuellement très restreintes du fait du peu de donneurs et des complications de l’immunosuppression.
Procédures
6 animaux subiront 1 seule injection de vecteur sous anesthésie gazeuse sur une durée d’environ 15 secondes (temps d’induction anesthésie gazeuse environ 4 minutes ). Ils seront euthanasiés en fin de procédure à l’aide d’une injection léthale sous anesthésie à l’isoflurane (temps d’induction anesthésie gazeuse environ 4 minutes à 4%, temps d’injection pour l’euthanasie environ 3 secondes), et couverts par une analgésie (injection d’environ 3 sec). Un prélèvement (durée : 15 sec) puis une perfusion (durée : 30 sec) conduiront rapidement à la mort de l’animal par arrêt cardiaque. Les animaux donneurs seront euthanasiés à l’aide d’une injection léthale (durée d’environ 3 sec) sous anesthésie (induction pendant environ 4 min) et couverts par une analgésie (injection d’environ 3 sec). Les animaux modèles, des rats, seront rendus diabétiques par une injection unique de streptozotocine (injection d’environ 3 sec), une molécule chimique naturelle, particulièrement toxique pour les cellules bêta du pancréas produisant l’insuline chez les mammifères. Ils seront traités à l’insuline à l’aide d’une mini-pompe implantée sous la peau dans le dos sous anesthésie /analgésie (durée approximative de l’intervention: 20 min). Un mois après l’administration intraveineuse du vecteur (1 seule injection d’environ 15 sec après l’induction d’une anesthésie gazeuse pendant 4 min), la greffe de cellules pancréatiques sera réalisée par chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée approximative de l’intervention : 30 à 40 min). De plus, les modèles animaux recevront un traitement immunosuppresseur 16 h avant intervention chirurgicale et pendant 1 semaine après la greffe, afin d’éviter un rejet aigu (injections qui prendront environ 3 sec). Leur glycémie sera surveillée pendant toute la durée du projet par des micro-prélèvements sanguins d’une durée d’1 sec, quotidiennement pendant les 15 jours suivant l’injection de streptozotocine, puis 3 fois par semaine jusqu’à la fin de la procédure. En fin de procédure, les modèles animaux seront euthanasiés après anesthésie générale (4 min environ), analgésie locale (injection d’environ 3 sec) et générale (injection d’environ 3 sec) avant injection léthale (injection d’environ 3 sec).
Impact sur les animaux
De manière générale, toutes les autres interventions pourront entraîner douleur, perte de poids, inactivité/mobilité réduite, et stress induisant par ailleurs un comportement anormal des animaux, nous serons donc très attentifs aux points limites, et prendrons les mesures nécessaires le cas échéant. L’induction du diabète, modèle de glycémie connu, pourrait induire des hyperglycémies non contrôlées. Les prélèvements répétés à la queue pour la mesure de la glycémie pourront éventuellement générer douleurs et stress. La transplantation des cellules du pancréas peut entrainer localement des saignements assez abondants. . Il est néanmoins possible qu'un léger saignement persiste après suture et réveil de l'animal. Également, les traitements immunosuppresseurs entraineront une diminution de l’immunité des animaux traités qui pourraient alors être plus sensibles aux infections.
Devenir
Les animaux utilisés pour définir la dose minimale de vecteur nécessaire seront euthanasiés à la fin de la procédure. Les animaux donneurs de cellules pancréatiques seront euthanasiés pour don du pancréas. Les animaux receveurs de cellules pancréatiques seront euthanasiés à la fin du protocole pour l’analyse de leurs organes et l’établissement de la preuve de concept. Une partie des animaux seront gardés en vie si non rendus diabétiques et réutilisés dans d’autres projets.
Remplacement
Le projet a pour objectif général l'amélioration de la transplantation de cellules pancréatiques humaines. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative efficace permettant de mimer les conditions physiologiques propres à l'organe et à l’organisme receveurs. L'emploi d'animaux est donc essentiel à notre projet.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit à son minimum pour obtenir des conclusions statistiquement satisfaisantes. En nous fixant un niveau de confiance de 95%, une puissance statistique supérieure à 80%, il faut prévoir au minimum 4 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence statistique significative entre les groupes. Le choix est donc orienté sur 7 animaux-receveurs traités et 5 animaux-receveurs non traités par groupe pour pallier toute défaillance technique, pour l’établissement du modèle. Les tests statistiques seront ceux utilisés pour l'analyse de petits échantillons
Raffinement
Une période d’au minimum 7 jours d'adaptation sera appliquée à chaque animal entrant dans le protocole. S’en suivra alors une petite période d’habituation pour limiter le stress (manipulation + boîte de contention). Lors des différentes chirurgies (sous anesthésie gazeuse), il sera administré au préalable une analgésie locale à l’endroit de l’incision ainsi qu’une analgésie générale pour le post-opératoire. Celle-ci sera renouvelée pendant 2 jours après l’intervention la plus lourde à savoir la transplantation des îlots dans le foie. On veillera que la paire de rats hébergés dans la même cage soit opérée le même jour de façon à limiter les interactions et ainsi le barbering (épilation des poils par l’animal lui-même ou un compagnon de la même cage) pour garder une plaie saine. On veillera lors des différentes interventions chirurgicales à assurer une asepsie stricte dans les conditions les plus stériles possibles pour éviter l’infection.
Choix des espèces
A la suite d’expériences antérieures sur des souris, nous avons préféré les rats pour notre étude. En effet, le rat est un modèle animal idéal pour tester notre stratégie : - Techniquement, il permet de réaliser des greffes d’ilôts de Langerhans dans le foie, comme cela est fait chez l’homme. Par ailleurs, du fait de sa taille, le rat est compatible avec une perfusion des ilôts via la veine porte ce qui ne peut être effectué chez la souris, ou en tout cas avec peu de succès. - Le rat aura besoin d’assez peu de vecteur, comparé à de plus gros animaux tels que porcs (30 kg), chiens (>3 kg) ou singes (>2,5 kg). - Des souches de rats sont disponibles pour la transplantation allogénique. - L’utilisation de rats évite l’utilisation de gros animaux, éthiquement plus problématique dans l’absolu et au vu du nombre d’animaux nécessaires. Les rats utilisés auront entre 8 et 12 semaines afin : - d’optimiser la quantité d’îlots extraits des donneurs d’après la littérature - de minimiser le poids des rats receveurs pour diminuer la quantité de vecteur à injecter - de faciliter la chirurgie chez les receveurs