Recherche fondamentale

6 macaques rhésus au maximum vont être utilisés dans le second établissement de ce projet multisite, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres projets. Chacun peut subir jusqu'à trois IRM et trois scanners sous anesthésie, deux à quatre chirurgies d'implantation crânienne, et des séances d'entraînement puis d'enregistrement cinq jours par semaine au moins, tête immobilisée. Le porteur énumère lui-même les atteintes possibles : douleurs postopératoires de plusieurs jours, infections des implants qui traversent la peau, isolement postopératoire sans contact avec les congénères, perte de poids en cas de contrôle de l'accès à l'eau. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne permet d'étudier ces circuits à l'échelle de "l'ensemble de l'organisme" et désigne le macaque comme "le modèle animal le plus pertinent", en invoquant la proximité de son cerveau avec celui de l'humain.

Objectifs

Ce projet est multisite et se déroulera dans les établissements EU 1/2, EU 2/2. Réaliser des tâches quotidiennes nécessite de coordonner tout un ensemble de fonctions cognitives imposant des contraintes contradictoires à notre système nerveux. Par exemple, chercher un objet spécifique caché au milieu d’autres objets nécessite d'en construire une représentation et de la maintenir en mémoire sur une courte période. Pour éviter de changer de but constamment, cette représentation et ce but doivent être protégés d’interférences, notamment sensorielles. Par contre, détecter cet objet nécessite d’intégrer les informations sensorielles et de les analyser. La prise de décision est dans ce cas guidée par les mécanismes attentionnels. Des difficultés à correctement contrôler les différents processus cognitifs émergent dans des troubles psychiatriques très handicapants tels que les troubles schizophréniques ou des déficits attentionnels avec ou sans hyperactivité. Ces mécanismes résultent des interactions de plusieurs aires cérébrales, corticales et sous-corticales. Notamment, les réseaux pariétaux et pré-frontaux sont centraux dans le contrôle de ces mécanismes. Basés sur des résultats précédents acquis au sein du groupe, nous proposons de tester une hypothèse originale. Dans cette hypothèse, le cortex préfrontal, qui biaise le traitement des informations sensorielles dans les réseaux cérébraux sensoriels et décisionnels, doit être en mesure de mesurer l’effet de ses propres modulations pour les ajuster en ligne aux besoins de la tâche. Nous postulons donc l’existence de boucles de rétro-contrôle attentionnelles médiées par les interactions fortes entre cortex pariétaux et frontaux et permettant d'ajuster en ligne la force du contrôle cognitif.

Bénéfices attendus

Ce projet portera des bénéfices à différentes échelles. Il permettra l’élargissement des connaissances sur les réseaux pariéto-frontaux impliqués dans les comportements complexes impliquant du control cognitif. Coupler des approches d’électrophysiologie et de manipulations ciblées permettra de mieux appréhender les influences réciproques et les fonctions associées au sein des réseaux pariéto-frontaux. Les processus cognitifs empruntent des termes de la psychologie qui n’ont pas nécessairement de corrélats neuronaux clairs alors qu'il est maintenant admis que les fonctions cognitives émergent d’interactions corticales complexes. En liant clairement des fonctions cognitives à des processus neuronaux aux seins de réseaux corticaux, ce projet permettra une meilleure définition des processus cognitifs et devrait ainsi avoir un impact fondamental sur notre connaissance de la cognition humaine. De plus, nous proposons une hypothèse originale concernant le contrôle exécutif des processus cognitifs. Cette hypothèse est à même d’éclairer les mécanismes défectueux dans certains aspects de troubles comportementaux hautement débilisant tels les troubles déficitaires de l’attention, la schizophrénie ou la dépression.

Procédures

Anesthésies pour Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (1 à 3 par animal sur la durée du projet, 1h30/intervention) Anesthésies pour CT scan (1 à 3 par animal sur la durée du projet, 20 minutes/intervention). Chirurgies d'implantations (2 à 4 par animal sur la durée du projet, 4 à 8 heures par intervention). Entrainement à réalisation de tâches comportementales (1 à 2 heures par séance, 5 séances par semaines). Acquisition de données électrophysiologiques simultanément dans plusieurs aires corticales (1 à 3 heures par jours, 5 à 7 jours/semaines). Définir la durée en nombre de semaines des phases d'apprentissage et d'acquisition de données est compliquée pour les raisons suivantes: - cette durée dépend énormément de chaque individus et du temps nécessaire pour habituer les animaux à chaque étape sans induire de stress excessif (certains apprennent très vite et d'autre moins voire pas du tout). - cette durée dépend de la quantité et de la qualité de données acquises à chaque séance, qui dépendent de facteurs incontrollables. - cette durée dépend d'un ensemble d'évènements externes imprevisibles et intrinsèques à l'utilisation des primates non-humains.

Impact sur les animaux

Ce projet impliquera des macaques soumis à des procédures classées légères ou modérées en termes de sévérité. Plusieurs étapes de ce protocole sont susceptibles de causer une gêne ou un stress aux animaux : 1. Mise en chaise et manipulation initiale : Lors des premières sessions, le fait de placer les animaux dans une chaise de transport, en les manipulant à l’aide d’une canne depuis leur lieu d’hébergement, pourra induire un stress. : La durée de cette phase d’adaptation dépendra de la vitesse d'apprentissage de animaux. D'expérience, cette phase peut s'étendre sur plusieurs semaines. 2. Contention de la tête : La restriction des mouvements de la tête, rendue nécessaire pour les acquisitions électrophysiologiques et le contrôle de la position du regard, constituera une source de stress, notamment au début. 3. Contrôle hydrique partiel : Le contrôle hydrique partiel (qui ne sera utilisé qu'en dernier recours si des méthodes de motivation alternatives échouent) pourrait entraîner du stress, une déshydratation, une perte d’appétit et, par conséquent, une perte de poids pendant la durée de l’expérience. 4. Anesthésie et intubation : Les procédures d’anesthésie et d’intubation, nécessaires pour réaliser les examens d’IRM, de CT-scan et les chirurgies pourront provoquer des douleurs postopératoires pendant plusieurs jours. Ces interventions comportent également des risques d’hémorragie, d’infection, de perte de température corporelle. 5. Douleur et infection postopératoires : après les actes chirurgicaux, les animaux pourraient ressentir de la douleur et développer des infections liées à ces interventions. 6. Isolement postopératoire : Un isolement postopératoire sans contact physique avec leurs congénères (en fonction d’éventuelles complications), pourrait générer un stress supplémentaire. 7. Infection des implants : des infections sont susceptibles de se développer au niveau des implants transcutanés (chambre, plot de tête et connecteur de matrices). 8. Inactivations réversibles : Les inactivations réversibles, bien que temporaires (moins de 24 heures), pourraient altérer la perception visuelle des animaux pendant quelques heures.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront experts dans la réalisation de tâches comportementales complexes. De plus, les implants peuvent avoir une durée de vie qui va au-delà de la durée d'un projet. En fonction du déroulé du projet et en accord avec la Structure responsable du Bien Etre Animal (SBEA) et l'équipe vétérinaire, les animaux seront réutilisés dans d'autres projets permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux, car il n’existe à ce jour aucune méthode alternative permettant de répondre aux objectifs du projet. Les simulations informatiques, les organes sur puce et les cultures cellulaires ne permettent pas d’étudier, dans un organisme vivant, les substrats neuronaux de comportements complexes tels que le contrôle cognitif. Ces processus reposent sur l’activité coordonnée dans un contexte comportemental de réseaux cérébraux distribués, engagés dans des interactions dynamiques à l’échelle de l’ensemble de l’organisme. Les techniques électrophysiologiques utilisées ici permettent d’enregistrer l’activité de neurones unitaires avec une résolution spatio-temporelle fine. Bien qu’elles puissent être utilisées dans certains contextes cliniques, elles restent trop invasives pour être déployées chez l’être humain dans une démarche expérimentale. Le recours au macaque est justifié par la grande proximité de son cerveau avec celui de l’être humain, tant sur le plan anatomique que fonctionnel, notamment pour les circuits pariéto-frontaux et visuels impliqués dans l’attention, la mémoire de travail et le contrôle cognitif. Les dysfonctionnements des circuits pariéto-frontaux et visuels sont impliqués dans des troubles neurodéveloppementaux humains très invalidants, tels que les troubles de l’attention avec ou sans hyperactivité. Le macaque est en outre capable de réaliser des tâches oculomotrices similaires à celles réalisées par des humains. Il représente ainsi le modèle animal le plus pertinent pour étudier les mécanismes neuronaux du contrôle cognitif à l’échelle du neurone unique et des populations neuronales, dans un cadre expérimental impossible à mettre en œuvre chez l’humain.

Réduction

Les interventions chirurgicales prévues comportent certains risques. Nous prévoyons d’inclure au maximum six animaux dans cette étude, en fonction de leur manière de réaliser les tâches comportementales proposées. Les capacités d'apprentissage, les stratégies cognitives et le nombre d'essais réalisés par séance sont très variables chez chaque individu. Il est donc possible que les objectifs scientifiques puissent être atteingnables avec trois animaux uniquement. La puissance statistique provient de la quantité de données acquises chez chaque animal, et non pas de la taille de la cohorte d'animaux Ainsi, si les données recueillies (activité cérébrale et comportement) sont suffisantes pour obtenir des résultats fiables avec trois animaux, aucun autre animal ne sera utilisé. Pour chaque animal, des dispositifs expérimentaux innovants permettront d’enregistrer l’activité de nombreux neurones dans différentes zones du cerveau en même temps. Cette méthode permet de recueillir beaucoup d’informations lors d’une même séance, ce qui réduit le nombre de séances nécessaires et la durée des enregistrements. Les enregistrements seront répétés sur plusieurs semaines afin d’observer un plus grand nombre de neurones et d’obtenir des résultats scientifiques solides. La durée totale des enregistrements pour chaque animal dépendra du nombre de neurones pouvant être enregistrés chaque jour. Elle ne peut donc pas être fixée à l’avance, mais sera limitée au temps strictement nécessaire pour atteindre les objectifs de l’étude.

Raffinement

Tous les hébergements répondent ou dépassent les exigences de la directive européenne 2010/63 sur l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Le suivi sanitaire est effectué par une équipe vétérinaire spécialisée dans le traitement des PNH. Les animaux sont hébergés dans une unité composée d’une volière centrale de 3 m de hauteur et de cages latérales. Le sol de la volière est couvert de copeaux de bois dans lequel ils recherchent de la nourriture. La cage et volière sont enrichies de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires. Les singes sont hébergés en groupes sociaux de 2 à 4 individus et séparés uniquement pendant les heures d’entrainement. Leur pièce d’hébergement est éclairée par un mélange de lumière artificielle (cycle jours/nuit) et de la lumière naturelle. Des méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées tout au long du protocole afin de réduire le stress des sujets. L'IRM anatomique et le CT-SCAN pré-chirurgicaux permettent de mieux planifier l’implantation des implants crâniaux afin de limiter l’invasivité de la procédure. Ces examens seront réalisés sous anesthésie générale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, réduisant de fait le stress de l'animal lors de leur réalisation. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesthésie, un analgésique sera administré et prolongé en période post-opératoire. Les tâches comportementales seront adaptées à la motivation et à l’état de chaque animal afin de limiter les situations d’échec, de frustration ou de stress excessif. Les techniques d'enregistrements simultanés de grande quantité de neurones permettent de réduire (i) le nombre d'essais nécessaires, (ii) le temps d'acquisition globale de l'expérience et (iii) le temps de chaque séance quotidienne. Des points limites précoces et adaptés seront appliqués tout au long du protocole.

Choix des espèces

Le primate non humain, en particulier le macaque (Rhésus), est utilisé pour la proximité anatomo-fonctionnelle de son cerveau avec celui de l’humain, notamment pour les réseaux pariéto-frontaux impliqués dans l’attention, la mémoire de travail et le contrôle cognitif. Ces réseaux sont particulièrement développés chez les primates par rapport à d'autres mammifères. Les macaques constituent le modèle animal le plus pertinent pour étudier les bases neuronales de fonctions cognitives de haut niveau dans des conditions expérimentales compatibles avec les objectifs du projet. Seuls des animaux jeunes adultes ou adultes seront utilisés, afin de disposer d’un cerveau mature et de performances comportementales stables, compatibles avec l’apprentissage des tâches cognitives prévues.

Deux à quatre chirurgies d'implantation de quatre à huit heures chacune, puis des enregistrements cérébraux d'une à trois heures par jour, cinq à sept jours par semaine : 6 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Conduits à la canne jusqu'à une chaise de transport, la tête immobilisée, ils sont entraînés à des tâches comportementales que le résumé ne décrit pas, et un "contrôle hydrique partiel" est prévu si les autres méthodes de motivation échouent. L'objet déclaré est de tester une hypothèse sur les échanges entre cortex pariétal et préfrontal, les retombées sur la schizophrénie ou les troubles de l'attention restant au conditionnel. Aucun macaque n'est tué à l'issue : devenus "experts" dans ces tâches et porteurs d'implants crâniens, ils seront réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

Ce projet est multisite et se déroulera dans les établissements EU 1/2, EU 2/2. Réaliser des tâches quotidiennes nécessite de coordonner tout un ensemble de fonctions cognitives imposant des contraintes contradictoires à notre système nerveux. Par exemple, chercher un objet spécifique caché au milieu d’autres objets nécessite d'en construire une représentation et de la maintenir en mémoire sur une courte période. Pour éviter de changer de but constamment, cette représentation et ce but doivent être protégés d’interférences, notamment sensorielles. Par contre, détecter cet objet nécessite d’intégrer les informations sensorielles et de les analyser. La prise de décision est dans ce cas guidée par les mécanismes attentionnels. Des difficultés à correctement contrôler les différents processus cognitifs émergent dans des troubles psychiatriques très handicapants tels que les troubles schizophréniques ou des déficits attentionnels avec ou sans hyperactivité. Ces mécanismes résultent des interactions de plusieurs aires cérébrales, corticales et sous-corticales. Notamment, les réseaux pariétaux et pré-frontaux sont centraux dans le contrôle de ces mécanismes. Basés sur des résultats précédents acquis au sein du groupe, nous proposons de tester une hypothèse originale. Dans cette hypothèse, le cortex préfrontal, qui biaise le traitement des informations sensorielles dans les réseaux cérébraux sensoriels et décisionnels, doit être en mesure de mesurer l’effet de ses propres modulations pour les ajuster en ligne aux besoins de la tâche. Nous postulons donc l’existence de boucles de rétro-contrôle attentionnelles médiées par les interactions fortes entre cortex pariétaux et frontaux et permettant d'ajuster en ligne la force du contrôle cognitif.

Bénéfices attendus

Ce projet portera des bénéfices à différentes échelles. Il permettra l’élargissement des connaissances sur les réseaux pariéto-frontaux impliqués dans les comportements complexes impliquant du control cognitif. Coupler des approches d’électrophysiologie et de manipulations ciblées permettra de mieux appréhender les influences réciproques et les fonctions associées au sein des réseaux pariéto-frontaux. Les processus cognitifs empruntent des termes de la psychologie qui n’ont pas nécessairement de corrélats neuronaux clairs alors qu'il est maintenant admis que les fonctions cognitives émergent d’interactions corticales complexes. En liant clairement des fonctions cognitives à des processus neuronaux aux seins de réseaux corticaux, ce projet permettra une meilleure définition des processus cognitifs et devrait ainsi avoir un impact fondamental sur notre connaissance de la cognition humaine. De plus, nous proposons une hypothèse originale concernant le contrôle exécutif des processus cognitifs. Cette hypothèse est à même d’éclairer les mécanismes défectueux dans certains aspects de troubles comportementaux hautement débilisant tels les troubles déficitaires de l’attention, la schizophrénie ou la dépression.

Procédures

Anesthésies pour Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) (1 à 3 par animal sur la durée du projet, 1h30/intervention) Anesthésies pour CT scan (1 à 3 par animal sur la durée du projet, 20 minutes/intervention). Chirurgies d'implantations (2 à 4 par animal sur la durée du projet, 4 à 8 heures par intervention). Entrainement à réalisation de tâches comportementales (1 à 2 heures par séance, 5 séances par semaines). Acquisition de données électrophysiologiques simultanément dans plusieurs aires corticales (1 à 3 heures par jours, 5 à 7 jours/semaines). Définir la durée en nombre de semaines des phases d'apprentissage et d'acquisition de données est compliquée pour les raisons suivantes: - cette durée dépend énormément de chaque individus et du temps nécessaire pour habituer les animaux à chaque étape sans induire de stress excessif (certains apprennent très vite et d'autre moins voire pas du tout). - cette durée dépend de la quantité et de la qualité de données acquises à chaque séance, qui dépendent de facteurs incontrollables. - cette durée dépend d'un ensemble d'évènements externes imprevisibles et intrinsèques à l'utilisation des primates non-humains.

Impact sur les animaux

Ce projet impliquera des macaques soumis à des procédures classées légères ou modérées en termes de sévérité. Plusieurs étapes de ce protocole sont susceptibles de causer une gêne ou un stress aux animaux : 1. Mise en chaise et manipulation initiale : Lors des premières sessions, le fait de placer les animaux dans une chaise de transport, en les manipulant à l’aide d’une canne depuis leur lieu d’hébergement, pourra induire un stress. : La durée de cette phase d’adaptation dépendra de la vitesse d'apprentissage de animaux. D'expérience, cette phase peut s'étendre sur plusieurs semaines. 2. Contention de la tête : La restriction des mouvements de la tête, rendue nécessaire pour les acquisitions électrophysiologiques et le contrôle de la position du regard, constituera une source de stress, notamment au début. 3. Contrôle hydrique partiel : Le contrôle hydrique partiel (qui ne sera utilisé qu'en dernier recours si des méthodes de motivation alternatives échouent) pourrait entraîner du stress, une déshydratation, une perte d’appétit et, par conséquent, une perte de poids pendant la durée de l’expérience. 4. Anesthésie et intubation : Les procédures d’anesthésie et d’intubation, nécessaires pour réaliser les examens d’IRM, de CT-scan et les chirurgies pourront provoquer des douleurs postopératoires pendant plusieurs jours. Ces interventions comportent également des risques d’hémorragie, d’infection, de perte de température corporelle. 5. Douleur et infection postopératoires : après les actes chirurgicaux, les animaux pourraient ressentir de la douleur et développer des infections liées à ces interventions. 6. Isolement postopératoire : Un isolement postopératoire sans contact physique avec leurs congénères (en fonction d’éventuelles complications), pourrait générer un stress supplémentaire. 7. Infection des implants : des infections sont susceptibles de se développer au niveau des implants transcutanés (chambre, plot de tête et connecteur de matrices). 8. Inactivations réversibles : Les inactivations réversibles, bien que temporaires (moins de 24 heures), pourraient altérer la perception visuelle des animaux pendant quelques heures.

Devenir

A la fin du projet, les animaux seront experts dans la réalisation de tâches comportementales complexes. De plus, les implants peuvent avoir une durée de vie qui va au-delà de la durée d'un projet. En fonction du déroulé du projet et en accord avec la Structure responsable du Bien Etre Animal (SBEA) et l'équipe vétérinaire, les animaux seront réutilisés dans d'autres projets permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux, car il n’existe à ce jour aucune méthode alternative permettant de répondre aux objectifs du projet. Les simulations informatiques, les organes sur puce et les cultures cellulaires ne permettent pas d’étudier, dans un organisme vivant, les substrats neuronaux de comportements complexes tels que le contrôle cognitif. Ces processus reposent sur l’activité coordonnée dans un contexte comportemental de réseaux cérébraux distribués, engagés dans des interactions dynamiques à l’échelle de l’ensemble de l’organisme. Les techniques électrophysiologiques utilisées ici permettent d’enregistrer l’activité de neurones unitaires avec une résolution spatio-temporelle fine. Bien qu’elles puissent être utilisées dans certains contextes cliniques, elles restent trop invasives pour être déployées chez l’être humain dans une démarche expérimentale. Le recours au macaque est justifié par la grande proximité de son cerveau avec celui de l’être humain, tant sur le plan anatomique que fonctionnel, notamment pour les circuits pariéto-frontaux et visuels impliqués dans l’attention, la mémoire de travail et le contrôle cognitif. Les dysfonctionnements des circuits pariéto-frontaux et visuels sont impliqués dans des troubles neurodéveloppementaux humains très invalidants, tels que les troubles de l’attention avec ou sans hyperactivité. Le macaque est en outre capable de réaliser des tâches oculomotrices similaires à celles réalisées par des humains. Il représente ainsi le modèle animal le plus pertinent pour étudier les mécanismes neuronaux du contrôle cognitif à l’échelle du neurone unique et des populations neuronales, dans un cadre expérimental impossible à mettre en œuvre chez l’humain.

Réduction

Les interventions chirurgicales prévues comportent certains risques. Nous prévoyons d’inclure au maximum six animaux dans cette étude, en fonction de leur manière de réaliser les tâches comportementales proposées. Les capacités d'apprentissage, les stratégies cognitives et le nombre d'essais réalisés par séance sont très variables chez chaque individu. Il est donc possible que les objectifs scientifiques puissent être atteingnables avec trois animaux uniquement. La puissance statistique provient de la quantité de données acquises chez chaque animal, et non pas de la taille de la cohorte d'animaux Ainsi, si les données recueillies (activité cérébrale et comportement) sont suffisantes pour obtenir des résultats fiables avec trois animaux, aucun autre animal ne sera utilisé. Pour chaque animal, des dispositifs expérimentaux innovants permettront d’enregistrer l’activité de nombreux neurones dans différentes zones du cerveau en même temps. Cette méthode permet de recueillir beaucoup d’informations lors d’une même séance, ce qui réduit le nombre de séances nécessaires et la durée des enregistrements. Les enregistrements seront répétés sur plusieurs semaines afin d’observer un plus grand nombre de neurones et d’obtenir des résultats scientifiques solides. La durée totale des enregistrements pour chaque animal dépendra du nombre de neurones pouvant être enregistrés chaque jour. Elle ne peut donc pas être fixée à l’avance, mais sera limitée au temps strictement nécessaire pour atteindre les objectifs de l’étude.

Raffinement

Tous les hébergements répondent ou dépassent les exigences de la directive européenne 2010/63 sur l’utilisation des animaux à des fins scientifiques. Le suivi sanitaire est effectué par une équipe vétérinaire spécialisée dans le traitement des PNH. Les animaux sont hébergés dans une unité composée d’une volière centrale de 3 m de hauteur et de cages latérales. Le sol de la volière est couvert de copeaux de bois dans lequel ils recherchent de la nourriture. La cage et volière sont enrichies de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires. Les singes sont hébergés en groupes sociaux de 2 à 4 individus et séparés uniquement pendant les heures d’entrainement. Leur pièce d’hébergement est éclairée par un mélange de lumière artificielle (cycle jours/nuit) et de la lumière naturelle. Des méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées tout au long du protocole afin de réduire le stress des sujets. L'IRM anatomique et le CT-SCAN pré-chirurgicaux permettent de mieux planifier l’implantation des implants crâniaux afin de limiter l’invasivité de la procédure. Ces examens seront réalisés sous anesthésie générale afin de s'assurer de l'inconscience de l'animal, réduisant de fait le stress de l'animal lors de leur réalisation. Lors d'interventions chirurgicales, en plus de l'anesthésie, un analgésique sera administré et prolongé en période post-opératoire. Les tâches comportementales seront adaptées à la motivation et à l’état de chaque animal afin de limiter les situations d’échec, de frustration ou de stress excessif. Les techniques d'enregistrements simultanés de grande quantité de neurones permettent de réduire (i) le nombre d'essais nécessaires, (ii) le temps d'acquisition globale de l'expérience et (iii) le temps de chaque séance quotidienne. Des points limites précoces et adaptés seront appliqués tout au long du protocole.

Choix des espèces

Le primate non humain, en particulier le macaque (Rhésus), est utilisé pour la proximité anatomo-fonctionnelle de son cerveau avec celui de l’humain, notamment pour les réseaux pariéto-frontaux impliqués dans l’attention, la mémoire de travail et le contrôle cognitif. Ces réseaux sont particulièrement développés chez les primates par rapport à d'autres mammifères. Les macaques constituent le modèle animal le plus pertinent pour étudier les bases neuronales de fonctions cognitives de haut niveau dans des conditions expérimentales compatibles avec les objectifs du projet. Seuls des animaux jeunes adultes ou adultes seront utilisés, afin de disposer d’un cerveau mature et de performances comportementales stables, compatibles avec l’apprentissage des tâches cognitives prévues.

Rendues obèses par un régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, 80 souris reçoivent aussi, sous anesthésie, un tatouage d'identification et une injection de vecteurs viraux AAV dans le muscle. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis transportées vers un second établissement pour un test terminal avec injection d'insuline, glucose radiomarqué et trois prises de sang pour la moitié d'entre elles. La description des procédures affirme qu'après l'injection les souris "ne subiront ensuite qu'une expérimentation terminale", sans mentionner le régime que le porteur dit susceptible d'"engendrer un inconfort significatif". Toutes sont tuées et nécropsiées à l'issue pour prélever tissus et organes, et le porteur fixe leur nombre d'après ses "habitudes expérimentales".

Objectifs

Les sphingolipides constituent une vaste famille de lipides complexes impliqués dans de nombreux mécanismes physiopathologiques. Les céramides, à la base de leur métabolisme, sont connus pour influencer la sensibilité à l’insuline dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique. Plus récemment, plusieurs travaux ont démontré que l’inhibition de la synthèse de novo des céramides chez la Souris permet de prévenir le déclin de la masse musculaire et de la performance physique dans plusieurs contextes pathologiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la réduction des concentrations intramusculaires de ces espèces de céramides sur la masse musculaire et l’homéostasie glucidique et ce chez des animaux adultes jeunes dans le contexte de l’obésité qui favorise le développement de la résistance à l’insuline. Ce projet est multisite sur deux établissements utilisateurs, EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait nous apporter de nouvelles connaissances théoriques sur la physiologie des muscles squelettiques et plus précisément sur l'importance de certains lipides sur la dégradation de certaines fonctions musculaires dans le contexte de l’obésité et/ou du vieillissement. La compréhension du rôle de ces espèces de sphingolipides dans le muscle squelettique dans le contexte précité nous permettra d’envisager de nouvelles stratégies dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur (EU1/2), les animaux seront individuellement identifiés par tatouage sous anesthésie (moins d’une minute). Ensuite, ils recevront une injection par voie intramusculaire (env. 30 sec). Cette procédure sera réalisée une seule fois sur animaux anesthésiés et ayant reçu un antalgique ce qui diminuera grandement la douleur, avec une procédure de réveil adaptée. Les animaux ne subiront ensuite qu’une expérimentation terminale nécessitant une injection (env. 30 sec), effectuée par un expérimentateur maîtrisant le geste. Dans le second établissement utilisateur (EU2/2) et pour la moitié des animaux, l’expérimentation terminale nécessite le prélèvement de sang à 3 reprises durant le test (moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables allant de l’inconfort à des douleurs légères sur de courtes durées pourraient être observés au cours de la vie des animaux. Un inconfort, une mobilité légèrement réduite et une légère douleur pourraient être constatés suite à leur identification par tatouage. Le régime enrichi en lipides pendant 14 à 16 semaines, en créant une obésité associée éventuellement à une insulino-résistance, pourrait engendrer un inconfort significatif pour l'animal. Un inconfort et/ou un stress pourrait intervenir lors des pesées de suivi. Les injections intramusculaires pourraient entrainer des douleurs et une mobilité réduite pendant quelques minutes. Un stress et une légère douleur liée à la contention et aux injections par voie intrapéritonéale pourrait survenir lors des expérimentations terminales (test de transport de glucose et injection d’insuline). Les prélèvements répétés de sang (3 prélèvements) lors du test terminal de flux de glucose radiomarqué peut provoquer du stress, des douleurs légères, œdèmes et gonflements. Enfin le transport d’un établissement utilisateur à l’autre dans les cages d’origine des animaux peut entraîner de l’inconfort et/ou du stress même si la distance est restreinte et qu’il sera réalisé selon des procédures établies et bien éprouvées.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront nécropsiés, des tissus et organes collectés pour des analyses histologiques, d'expressions génique et/ou protéique.

Remplacement

Des expériences préliminaires sur des cultures cellulaires issues de muscles squelettiques ont déjà été réalisées et ont montré l'importance de l'intérêt porté aux lipides intramusculaires. Cependant, pour faire le lien entre les quantités de certaines espèces lipidiques, ici les céramides, et la masse musculaire, ainsi que l'homéostasie glucidique, l'animal en tant que modèle intégré est indispensable.

Réduction

Pour déterminer le nombre d'animaux nécessaires et suffisants nous nous sommes essentiellement basés sur nos habitudes expérimentales et sur les variabilités inter-individuelles régulièrement constatées. En effet, un calcul de puissance est difficile à mettre en œuvre étant donné le nombre de tests inclus dans la même procédure. Les tests statistiques qui seront mis en œuvre seront des tests non paramétriques utilisés soit pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux temps des procédures pour un même animal, ou pour comparer des variables quantitatives uniques entre deux groupes d'animaux, et encore pour comparer des variables quantitatives continues entre plusieurs groupes d'animaux. D'autre part, grâce à l'utilisation d'un appareil permettant de mesurer la répartition des masses maigre et grasse, nous pouvons réaliser un suivi longitudinal de ces paramètres sans euthanasier les animaux. Enfin, récemment a été mis en place au sein de notre Institut un fichier de partage des tissus ou organes collectés lors des nécropsies, nous pensons proposer les tissus autres que nos tissus d'intérêt aux autres équipes de recherche du centre.

Raffinement

A l’arrivée des animaux en zootechnie, ils seront répartis en cages de 4 à 5 individus et acclimatés à minima 5 jours. Les animaux seront hébergés par fratrie dans des cages sur portoirs ventilés en respectant le nombre d'animaux indiqué dans le Directive Européenne 2010/63/UE. De l'enrichissement type feuille de papier, bâtonnet en bois ou igloo seront systématiquement ajoutés en accord avec la SBEA du site. Un suivi quotidien sera réalisé soit par les zootechniciens soit par les expérimentateurs en charge du projet. La pesée hebdomadaire permet une habituation à l'Homme ce qui diminue le stress des animaux et indirectement la variabilité inter-individuelle dans les réponses mesurées ; ce paramètre permet également de se rendre compte de l’état de l’animal. Si des lésions cutanées apparaissent suite à des bagarres, une pommade sera appliquée. 30 minutes avant l’injection des AAV, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’antalgique. Le réveil de l'animal, après anesthésie et injection des AAVs, se fera dans une cage posée sur tapis chauffant. Du collyre sera appliqué sur les yeux de l’animal. Une vérification de l’absence d’œdème ou de rougeur au point d’injection des AAV sera effectuée dans les 48 heures post-injection. Si le cas se présentait nous consulterions le vétérinaire référent afin de soigner les animaux ; l’utilisation d’une crème type Cortanmycétine ou Meloxicam sont envisagés. Des critères d’arrêt stricts sont mis en place et détaillés dans une grille de scoring en annexe. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du score obtenus, le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU 2/2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages d’origine des animaux incluant des enrichissements type igloos ou tunnels sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est prédéterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L'espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d'Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Des animaux adultes jeunes (8 semaines lors de leur arrivée dans le service de zootechnie et 7-8 mois en fin de protocole) seront utilisés, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. En effet, nous souhaitons analyser divers paramètres et facteurs (cf description du projet et procédures) sur des animaux jeunes rendus obèses par un régime nutritionnel approprié pour lesquels une insulino-résistance peut se développer. Les animaux seront hébergés entre 8 semaines et 7 mois, ce qui correspond à un âge Humain compris entre jeune adulte et adulte d’âge moyen. La mise en régime obésogène débutera à 3 mois, afin d’induire une obésité et une insulino-résistance chez la souris adulte.

Six à huit essais de nage d'une minute par jour, pendant dix à douze jours, attendent une partie des 724 souris de ce projet dans la piscine de Morris, en plus de l'open-field, du labyrinthe en croix et d'un test de reconnaissance d'objets. Toutes reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant cinq jours à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis sont tuées pour l'analyse de leur cerveau. Ces souris, privées par invalidation génétique du gène en cause dans le syndrome de Coffin-Lowry, sont utilisées pour tester un traitement des déficits cognitifs, dès 14 jours de vie pour les plus jeunes. Le porteur précise que ce traitement est déjà administré en recherche clinique à des adultes et à des enfants.

Objectifs

Nous étudions une souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Cette pathologie est due à des mutations d'un gène et conduit à une déficience intellectuelle modérée à sévère chez l’Homme. Il n’existe à ce jour aucun traitement. Pour ce projet, nous utilisons des souris invalidées pour le gène responsable. Notre projet a pour premier objectif de mettre au point un traitement pharmacologique pour corriger les altérations comportementales et cognitives de la souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Notre second objectif sera de tester si ce traitement pharmacologique délivré au plus tôt au cours de la période postnatale, permet d’éviter le retard de développement cérébral et de prévenir l’apparition des altérations cognitives. Enfin, nous combinerons le traitement pharmacologique à un enrichissement environnemental dans le but de corriger les altérations à plus long terme.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement pour les patients atteints syndrome de Coffin-Lowry. Compte tenu de la sévérité des altérations cognitives, la qualité de vie pour ces patients et leurs familles est profondément impacté. Au niveau expérimental chez la souris modèle, la description des altérations moléculaires nous permet aujourd’hui d’envisager de développer des stratégies thérapeutiques basées sur la délivrance d’agents pharmacologiques. Les traitements proposés ont déjà été testés chez d'autres souris modèles et s’avèrent bénéfiques sur certains comportements. Pour information, le traitement proposé est déjà utilisé dans la recherche clinique chez des patients, adultes et enfants, c’est pourquoi nous souhaitons commencer nos expérimentations avec ce candidat médicament. Dans ce contexte, notre projet testera pour la 1ère fois si ce traitement permet aussi de réduire, voire restaurer les altérations cognitives chez la souris modèle du Syndrome de Coffin Lowry.

Procédures

Pour le projet, tous les animaux recevront des injections quotidiennes du traitement ou de solution saline en intrapéritonéale. Après différents délais, ces souris seront mises à mort afin d'analyser leurs cerveaux. Une partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée dans une boite appelée open-field (durée 10 minutes) ou dans un labyrinthe en croix ((durée 10 minutes), ce qui ne génère aucune nuisance. La mémoire de reconnaissance s’effectue dans l’openfield préalablement exploré dans lequel on ajoute des objets à explorer. Pour ce test, les souris sont placées dans cet openfield pendant 10 minutes, 1 à 2 fois par jour pendant 5 jours maximum. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un léger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 10-12 jours, à raison de 6-8 essais par jour (2 blocs de 3-4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéale pendant 5 jours à 6 semaines, selon les procédures expérimentales. Les tests comportementaux pourraient générer une légère réactivité émotionnelle chez les animaux en tout début de test.

Devenir

à l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin d'étudier leur cerveau.

Remplacement

Notre projet de recherche consiste à évaluer les bénéfices d’un traitement visant à réduire / compenser les altérations comportementales et cognitives associées à la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certaines cascades moléculaires peuvent être décrites sur des cultures neuronales en conditions basales, il est ensuite absolument nécessaire de valider les bénéfices du traitement sur les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 4-8 souris par groupe expérimental pour les analyses biochimiques et analyses cérébrales, et 8-15 souris par groupe pour les études de comportement sont nécessaires. Des tests de puissance de nos analyses statistiques seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=4), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé. Si cette valeur est atteinte, il ne sera pas nécessaire d’augmenter les effectifs jusqu'a à 8 pour les analyses cérébrales ou jusqu'à 15 pour les analyses comportementales. De plus, afin de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, les mêmes souris seront réutilisées dans plusieurs tests successifs, les premiers tests d’exploration ne durant que 10 minutes par jour et par souris.

Raffinement

Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études, et la fiabilité de nos résultats. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre aux premières injections ou aux tâches comportementales, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et les habituer à sa présence. Afin de s’assurer que l’administration du traitement n’altère en rien la santé et le bien-être des souris, la mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela, une grille d’évaluation sera utilisée.

Choix des espèces

Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Dans notre projet, une partie des expérimentations seront effectuées à l’âge adulte (>56 jours) afin de montrer les effets potentiellement bénéfiques de notre traitement sur des fonctions cognitives altérées. L’autre partie des expérimentations sera effectuée chez des souris juvéniles (de 14 à 35 jours). En agissant au cours de cette période de développement, nous souhaitons corriger au plus tôt le retard de développement cérébral et éventuellement éviter les altérations cognitives à plus long terme.

Tuées à la fin du protocole pour l'analyse de leurs organes et tissus, 396 souris mâles et femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules de cancer du sein sous la peau, puis six jours d'injections de chimiothérapie par anthracyclines, avec cinq semaines d'échographies cardiaques hebdomadaires sous anesthésie et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil. Le porteur indique que la tumeur "pourrait être douloureuse" et que la chimiothérapie peut causer des douleurs, et les souris qui restent au-delà des points limites sont "exclues de l'expérience", sans autre précision sur leur sort. Pour justifier le choix de l'espèce, il cite l'homologie avec l'humain et des souris "relativement peu coûteuses à élever".

Objectifs

Depuis longtemps la cardio-toxicité des agents chimiothérapiques est établie chez l'Homme, cependant la chronologie et les facteurs aggravant de la maladie ne sont pas connus. Aussi, aucune stratification des patients n’est réalisable en amont du traitement car les mécanismes précis de cette cardiotoxicité restent complexes et imparfaitement étudiés. L’objectif du projet est de déterminer l’impact de notre protéine, une protéine fréquemment surexprimée dans différents cancers, sur le devenir des animaux traités aux anthracyclines , un des traitement de base du cancer du sein. Ce qui nous intéresse tout particulièrement sera la capacité du coeur à se contracter lorsque nous initierons le traitement.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : 1. De valider l’hypothèse que les effets toxiques de la tumeur sur le coeur pré-traitement sont médiés par la protéine retrouvé dans la circulation 2. De confirmer l’intérêt d’utiliser la protéine dans la circulation comme biomarqueur prédictif de cardiotoxicité associée à la chimiothérapie 3. De prévenir la cardiotoxicité associée aux anthracyclines par l’utilisation d'un anticorps dirigé contre notre protéine.

Procédures

Pose de bague d'identification à l'oreille: 1 fois au moment du sevrage à 21 jours. Biopsie de 2mm à l'oreille au moment du sevrage à 21 jours. Anesthésies par voie intrapéritonéales: 1/semaine pendant 5 semaines, durée 15 minute. Prélèvements rétroorbitaires sur animaux anesthésiés: 1/ deux semaines pendant 5 semaines, durée 2 min. Injection rétro-orbitaires 1 fois à la 4ème semaine, durée 1 min. Injection sous cutané 1 fois en début de protocole, durée 2 min.

Impact sur les animaux

Concernant la méthode de prélèvement pour le génotypage : inconfort ponctuel lors de la pose de la bague auriculaire et du prélèvement de tissu (2mm à l'oreille). A la suite de l’injection sous-cutanée des cellules cancéreuses, les souris développeront une tumeur, et cette croissance de la tumeur pourrait être douloureuse. La chimiothérapie utilisée peut elle aussi engendrer des douleurs pour l’animal.

Devenir

L'euthanasie de tout les animaux à la fin de la procédure permettra une analyse histologique des organes d'intérêts, ainsi qu'une analyse protéique et génétique de divers tissus selon les groupes d'appartenance des animaux.

Remplacement

Les expérimentations in vitro ne permettent pas de représenter la complexité d’un organisme vivant. L'effet d'un traitement sur une monocouche de cellules cancéreuses in vitro nous permet de montrer l'efficacité de ce traitement sur ce type cellulaire mais le traitement devra être étudié in vivo pour être sûr de son efficacité dans un organisme vivant complexe qui contient une multitude de tissus et organes qui peuvent être touchés.

Réduction

Nous avons effectué un calcul nous permettant d’avoir le nombre précis de souris nécessaire à l’étude. En utilisant les résultats d’une précédente étude de notre laboratoire sur un projet relativement similaire, nous sommes arrivés au chiffre de 12 souris par groupe en début de protocole. Enfin, le suivi par échographie cardiaque permet également une réduction du nombre d'animaux car cette technique permet un suivi longitudinal sur le même animal sans mise à mort à des temps intermédiaires.

Raffinement

Les animaux disposeront d’une période d'acclimatation de 5 jours et seront observés quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie ainsi que par l'expérimentateur. Différents points limites seront particulièrement surveillés et seront notifiés dans un cahier de suivi des animaux. Les animaux âgés de 12 à 18 semaines recevront une injection sous cutanée de 100 microlitres de cellules cancéreuses du sein. A cette occasion, ils seront surveillés de manière visuelle (fréquence respiratoire) pendant 1h après injection. Deux semaines après l'injection de la tumeur, les animaux, mâles et femelles, recevront une injection intrapéritonéale de chimiothérapie tous les jours pendant 6 jours, laquelle peut engendrer des douleurs et donc une analgésie adaptée sera administrée en cas de besoin. Chaque semaine pendant 5 semaines, l’échocardiographie et le prélèvement sanguin (fait une semaine sur deux en l'occurence pour éviter un excès de prélèvement de sang) seront faits l’un après l’autre pour limiter le nombre d’anesthésie hebdomadaire. Nous évaluerons la fonction cardiaque par échographie sous anesthésie générale, puis nous ferons des prélèvements sanguins via le sinus rétro-orbitaire, environ 100 microlitres à chaque prélèvement, 5 min après l'application d'un anesthésique locale. Une pommade ophtalmique afin de réhydrater l'oeil de l'animal sera utilisée post prélèvement. La même procédure aura lieue pour l'injection de notre médicament candidat. Différents points limites seront particulièrement surveillés tels que la perte de poids, le comportement, l’apparence physique et la gêne pour sedéplacer. En cas d’atteinte des points limites, les souris concernées auront alors un suivi adapté avec analgésie quotidienne, nourriture en gelée dans la cage, et si les points limite persistent, elles seront alors exclues de l'expérience.

Choix des espèces

La souris est utilisée en sciences expérimentales pour plusieurs raisons essentielles. Tout d’abord les souris partagent une grande homologie génétique et physiologique avec les humains, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Ensuite, les souris se reproduisent rapidement et sont relativement peu coûteuses à élever, ce qui permet d'obtenir rapidement des cohortes expérimentales. Troisièmement, les souris peuvent être facilement génétiquement modifiées pour étudier l'impact de gènes spécifiques sur les processus biologiques, offrant ainsi des informations précieuses sur la fonction des gènes. Pour notre étude, nous avons choisis des souris mâles et femelles C57Bl/6. Ces souris sont utilisées fréquemment dans la recherche en cancérologie et en cardiologie pour leur robustesse, leur survie malgré de forte dose de chimiothérapies, leur facilité de manipulation génétique, et d’après des recherches bibliographiques la croissance tumorale est la même pour les deux sexes, ce qui nous permettrait donc de comparer les effets du PCZ selon le sexe. Les animaux seront agés de 12 à 18 semaines dans un but de prendre des souris adultes, car le cancer du sein est une maladie fortement liée à l'âge. Prendre des animaux plus jeunes risquerait de masquer certaines observations, et ne serait pas cliniquement relevant lorsque nous voudrions transposer les résultats à l'homme. Prendre des animaux plus agés risquerait d'augmenter la probabilité de morts liés aux traitements, ainsi que la survenue de comorbitidés ou d'autres tumeurs spontanées chez nos souris. Par ailleurs, le cancer du sein triple négatif touche particulièrement les jeunes femmes, donc nous avons choisis des souris dans la première moitié de leur vie.

30 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis replacés d'après le porteur, sauf ceux qui atteignent un point limite et sont alors tués. Pendant 314 jours, chaque lapin subit jusqu'à onze interventions : cinq séances d'injections sous la peau en dix points, parfois avec de l'adjuvant complet de Freund qui peut laisser des nodules inflammatoires et un œdème plusieurs jours, et six prises de sang de 2 à 5 mL. Les anticorps obtenus doivent servir à des tests rapides de détection de résidus d'antibiotiques, de toxines ou de polluants. Le porteur reconnaît l'existence de bibliothèques d'anticorps produites en laboratoire, qu'il juge "inadaptées aux contraintes de notre projet".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux de lapin à des fins diagnostiques et scientifiques, en réponse à des besoins environnementaux, en santé publique et en recherche. Ces anticorps constituent des outils essentiels pour la détection de petites molécules d’intérêt, telles que des contaminants environnementaux, des résidus de médicaments ou des toxines bactériennes, et permettent le développement de tests immunologiques sensibles et spécifiques, notamment sous forme de tests rapides ou de dosages de type ELISA. Les anticorps produits dans ce cadre présentent des caractéristiques d’affinité et de spécificité adaptées à leur utilisation dans des dispositifs de diagnostic à grande échelle. En l’état actuel des connaissances, la phase initiale d’immunisation chez l’animal reste nécessaire pour générer une réponse immunitaire polyclonale diversifiée et de haute affinité. Cette étape permet la production de lymphocytes B spécifiques qui ne peuvent pas encore être reproduits de manière équivalente par des approches entièrement in vitro ou synthétiques. Le recours aux animaux est donc strictement limité à cette phase d’immunisation. Les étapes ultérieures de caractérisation et de sélection des anticorps sont réalisées à partir de techniques in vitro, sans réutilisation d’animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à lever un verrou technologique majeur pour la santé publique, l'environnement et la sécurité sanitaire : la détection ultra-sensible et rapide de petites molécules d'intérêt (toxines, polluants, résidus médicamenteux). Ces cibles sont historiquement très difficiles à identifier avec des anticorps murins (souris), qui manquent d'affinité pour de si petits motifs. Le recours au modèle lapin est scientifiquement indispensable car la diversité de son répertoire immunitaire permet d'obtenir des anticorps à très haute affinité, garantissant des seuils de détection jusqu'alors inaccessibles. Les bénéfices socio-économiques et sanitaires se traduiront par le développement de tests rapides sur le terrain (bandelettes, dosages ELISA) répondant à deux enjeux critiques. D'une part, dans le cadre de la lutte contre l'antibiorésistance et les urgences infectieuses, la propagation des bactéries résistantes aux antibiotiques de dernier recours (comme les carbapénèmes) constitue une menace sanitaire mondiale. Les anticorps générés permettront de concevoir des tests de détection rapide utilisables au chevet du patient (sur urines, sang ou colonies) afin d'identifier les mécanismes de résistance en quelques minutes et d'adapter immédiatement le traitement. D'autre part, en matière de surveillance environnementale et de sécurité sanitaire, ces outils permettront le suivi d'ultra-traces de micropolluants et de toxines dans des matrices complexes comme l'eau potable ou les fluides biologiques, assurant ainsi une prévention sanitaire efficace et accessible. Enfin, ce projet s'inscrit pleinement dans une démarche éthique et d'application stricte des 3R. Les procédures sur les lapins se limitent exclusivement à des étapes d'immunisation et de prélèvements sanguins légers sous anesthésie, sans aucune mise à mort requise dans le cadre du protocole. La phase animale est par ailleurs restreinte à la réponse immunitaire initiale, car les gènes codant les anticorps d'intérêt seront directement isolés par clonage pour assurer l'ensemble de la production ultérieure exclusivement in vitro sous forme recombinante. Cela garantit la pérennité de ces outils de diagnostic sans aucun recours ultérieur à l'animal.

Procédures

Les animaux seront immunisés sous contention douce et sous anesthésie locale topique (crème EMLA appliquée 30 à 45min avant le geste), par des injections sous-cutanées multipoints brèves (durée de 2 à 3 minutes par animal pour répartir le volume en 10 points d’injection) d’une molécule appelée immunogène qui correspond à la cible d’intérêt. Chaque animal recevra au total un nombre maximal strict de 5 sessions d'injections dans le cadre du protocole : une injection initiale à J+1 suivie de quatre rappels répartis sur l'étude. Des prélèvements sanguins de 2 à 5mL chacun, également réalisés sous anesthésie locale, seront effectués à intervalles réguliers (8 à 10 jours après chaque injection ainsi qu’un prélèvement final à J+314) afin de suivre la réponse immunitaire des animaux. Ces prélèvements représentent un nombre exact de 6 interventions sur la durée globale du protocole, avec une durée très brève de 1 à 2 minutes par prélèvement. Au total, chaque animal sera soumis à un nombre maximal absolu de 11 interventions sur l'ensemble des 314 jours de l'étude.

Impact sur les animaux

Une douleur et/ou une infection au niveau des points d’injection sont susceptibles de survenir, bien que limitée par l’application d’une anesthésie locale (lidocaïne) au point d’injection ou de prélèvement. En cas d'utilisation d'adjuvant complet de Freund pour l'immunisation primaire, une réaction inflammatoire nodulaire locale ou un œdème peut persister plusieurs jours sur les sites d'injection, générant une sensibilité prolongée qui fera l'objet d'un suivi quotidien strict. La douleur aiguë liée à la piqûre est donc très brève, mais une gêne locale d'intensité légère à modérée peut être ressentie les jours suivants selon l'adjuvant employé. Une douleur légère peut toutefois être ressentie lors des prélèvements sanguins. Les manipulations nécessaires peuvent entraîner un stress transitoire chez certains animaux, de l’ordre de quelques minutes, qui sera minimisé par une habituation préalable à la manipulation et à la contention douce.

Devenir

Tous les animaux (n = 30) seront replacés, sauf avis contraire du vétérinaire ou en cas d’atteinte des points limites définis dans le protocole, auquel cas ils seront mis à mort.

Remplacement

Il existe aujourd’hui des méthodes alternatives permettant de générer ou de sélectionner des anticorps sans recourir directement à l’immunisation d’animaux, (notamment l’utilisation de bibliothèques d’anticorps produites en laboratoire), mais elles restent inadaptées aux contraintes de notre projet pour trois raisons principales. En premier lieu, notre objectif est de détecter des molécules d'intérêt extrêmement petites (comme les carbapénèmes). Pour ces petites cibles, les banques d'anticorps artificielles manquent de sensibilité et échouent à fournir des seuils de détection suffisamment fins dans des échantillons complexes (sang, eau). En second lieu, le lapin possède un système immunitaire unique. Contrairement à d'autres espèces comme la souris, son organisme est capable d'adapter et de perfectionner naturellement la structure de ses anticorps pour épouser la forme de ces très petites molécules. Les technologies actuelles ne parviennent pas à reproduire cette maturation naturelle avec le même niveau de précision. Enfin, notre protocole repose sur l'isolement de ces cellules d'intérêt. L'immunisation initiale de l'animal est indispensable pour stimuler la production de ces lymphocytes B. Une fois ces cellules sélectionnées, nous récupérons leur matériel génétique pour produire définitivement les anticorps en laboratoire, de manière recombinante. Toutes les étapes ultérieures de sélection, de caractérisation et de production à grande échelle des anticorps sont ensuite réalisées exclusivement in vitro, sans recours supplémentaire à l’animal.

Réduction

Chaque production d’anticorps polyclonaux sera réalisée à partir de deux lapins par immunogène. Ce choix tient au fait que les animaux peuvent répondre différemment à une même substance injectée. Certains développent une réponse immunitaire plus forte ou plus adaptée que d’autres. L’utilisation de deux animaux permet donc d’identifier celui qui présente la meilleure réponse immunitaire grâce à une analyse réalisée sur des prélèvements sanguins, sans procédure supplémentaire sur l’animal. Le lapin présentant la réponse la plus adaptée est ensuite utilisé pour la production des anticorps. Le second animal permet de sécuriser la production : il peut être utilisé uniquement si la réponse du premier animal s’avère insuffisante en termes de qualité ou de performance des anticorps obtenus.

Raffinement

Les lapins seront hébergés par paire dans des cages communicantes afin de limiter l’isolement social tout en permettant le suivi individuel des animaux. Les cages seront aménagées pour favoriser le bien-être des animaux : elles comprendront un milieu enrichi avec une tablette, des haltères, des balles, des bâtonnets en bois à ronger et du foin. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long des procédures par du personnel qualifié. Afin de réduire le stress et la douleur liés aux expérimentations, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale à l’isoflurane et/ou avec anesthésie locale lorsque cela est compatible avec les procédures. Le niveau de douleur attendu ne doit pas dépasser celui ressenti lors d’une injection chez l’humain. Tout animal présentant des signes de souffrance ne pouvant être atténués par des mesures compensatoires (surveillance rapprochée, enrichissement, ajout de nourriture liquide, etc.) sera euthanasié.

Choix des espèces

Le lapin (Oryctolagus cuniculus) a été choisi comme modèle pour la production d’anticorps polyclonaux, en raison de son répertoire immunitaire diversifié et de sa capacité à générer des anticorps de haute affinité et spécificité, particulièrement adaptés à des cibles difficiles à adresser avec les anticorps murins, notamment les petites molécules. Les animaux utilisés seront des lapins adultes, car à ce stade le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour obtenir une réponse immunitaire robuste et reproductible, garantissant la qualité et la diversité des anticorps produits. De plus, les lapins sont des animaux de taille moyenne permettant de réaliser les injections multiples et prélèvements sanguins répétés dans des conditions de confort et de sécurité optimales, tout en limitant le stress et l’inconfort. Leur utilisation répond ainsi à des critères éthiques et pratiques, tout en assurant la fiabilité scientifique des résultats. Nous utiliserons des lapins âgés de minimum 12 semaines au démarrage des immunisations. Les animaux adultes ont la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses humorales lors des immunisations successives.