Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de la fonction des cellules endothéliales en contexte physiologique, de régénération du thymus et de dissémination leucémique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées a 12 ou 18 mois, choisies pour leur involution thymique avancée, d'autres reçoivent une injection de cellules leucémiques. 295 souris vont être utilisées, 175 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 120 un niveau sévère, toutes tuées pour analyse. Deux séries de quatre injections quotidiennes éliminent un récepteur dans les cellules des vaisseaux sanguins, avant trois injections du ligand testé et des prises de sang sur animaux vigiles. Le porteur décrit une leucémie qui génère un inconfort et une douleur prolongée, précise que ce modèle est létal au-delà de 21 jours, et fixe la mise à mort au dixième jour au plus tard.
Objectifs
Notre projet de recherche porte sur la régulation du développement des lymphocytes T (LT). Les LT se développent au sein du thymus, hébergeant leur production et leur sélection. Or, le thymus est un organe extrêmement sensible aux perturbations de la physiologie tel que le vieillissement. En effet, avec l’âge, le thymus subit une réduction drastique en taille et en fonctionnalité. Ce processus résulte en une forte altération de la production de nouveaux LT, réduisant ainsi fortement leur renouvellement dans l’organisme. Ceci résulte en une susceptibilité accrue de l’organisme aux infections, aux pathologies auto-immunes et aux cancers. De manière intéressante, notre équipe a identifié que l’administration d’une protéine ligand-X capable de se fixer sur un récepteur-Y spécifique présent sur les cellules du thymus promeut la régénération de cet organe et la production des LT au cours de l'involution associée à l'âge. Nos résultats montrent que l’action de cette molécule est médiée par une amélioration du nombre et de la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins. Ce projet s’intéresse à comprendre comment ce Ligand-X agit sur la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins du thymus. Ainsi, le premier objectif de notre projet est de caractériser le rôle de l’axe ligand-X/ récepteur-Y dans la physiologie des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques ainsi que de déterminer le rôle de ces cellules dans la régénération du thymus. De plus, puisque le ligand-X est important pour la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et que nos résultats démontrent que les cellules leucémiques produisent fortement cette protéine ligand-X, nous émettons l’hypothèse que l’axe ligand-X/récepteur-Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins est impliqué dans la dissémination des cellules leucémiques. Ainsi, le deuxième objectif vise à démontrer et caractériser le rôle de cet axe dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques au cours de la leucémie. Ce projet permettra d’évaluer le rôle de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la fonction des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques en contexte physiologique, de régénération du thymus, de dissémination leucémique et de réponse vaccinale.
Bénéfices attendus
Du fait du vieillissement progressif de la population et de l’amélioration de l’espérance de vie, l’immunodéficience liée à l’âge, étroitement corrélée avec le processus d’involution thymique, devient une préoccupation de santé publique majeure. Notamment, de nombreuses études révèlent un lien étroit entre le vieillissement et l’incidence des cancers. Ainsi, notre projet est susceptible d’avoir des retombées majeures dans la compréhension et la lutte contre le vieillissement immunitaire. A moyen terme, notre étude évaluera le rôle des cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques et de l’axe ligand-X/récepteur-Y dans la régénération thymique. Par ailleurs, notre étude du rôle de l’axe ligand-X /récepteur-Y dans la dissémination leucémique permettra de mettre en avant une nouvelle cible thérapeutique, particulièrement en ciblant cet axe afin de limiter l’invasion dans les tissus. A plus long terme, nos études devraient participer au développement des thérapies promouvant le vieillissement en bonne santé en corrigeant les défauts de développement thymique liés à l’âge et pourrait permettre d’améliorer la prise en charge des patients atteints de leucémies.
Procédures
Pour l’étude du rôle du ligand-X dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques, des souris âgées de 8 semaines, 12 mois (involution thymique avancée) ou 18 mois (involution thymique très avancée) vigiles recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les souris âgées de 12 et 18 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle par injection sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. Une partie des animaux recevront des progéniteurs de lymphocytes T par injection sous anesthésie gazeuse légère. La fonctionnalité des cellules sera ensuite analysée. Pour le modèle de leucémie, les souris âgées de 8 semaines recevront 2 séries d’injections (1 injection quotidienne par série de 4 jours, espacée de 3 jours de la suivante) permettant d’éliminer le récepteur Y dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins. Trois jours après la dernière injection, les animaux recevront une injection de cellules leucémiques sous anesthésie gazeuse légère durant 2 minutes par animal. Aux jours 3 et 6 après l’injection des cellules leucémiques, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang sur animaux vigiles. Finalement, pour les tests de réponse vaccinale, des souris de 12 mois seront traitées avec le ligand-X ou un contrôle sous anesthésie gazeuse légère, 3 injections par animal sur 3 jours consécutifs. 28 jours après la première injection, les animaux recevront par voie sous-cutanée une protéine A en tant que modèle de vaccination sous anesthésie gazeuse légère.
Impact sur les animaux
Les injections intraveineuses (sous anesthésie gazeuse légère) et intrapéritonéales peuvent générer un stress, un inconfort et une douleur légère de courte durée. Concernant le modèle de leucémies, la maladie peut générer des nuisances caractérisées par un inconfort et une douleur prolongée. Bien que ce modèle puisse être léthal au-delà de 21 jours, les souris seront mises à mort et analysées à un temps court (maximum 10 jours) dans le cadre de ce projet. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur prolongée. Concernant le modèle de réponse vaccinale, les injections sous-cutanées (sous anesthésie gazeuse légère) peuvent générer un stress et une douleur légère de courte durée et peuvent éventuellement générer une inflammation locale, qui sera surveillée quotidiennement attentivement. Les nuisances possibles sont : un stress, une perte de poids et une potentielle douleur modérée et prolongée.
Devenir
Les animaux utilisés seront mis à mort pour l'analyse à la fin des procédures.
Remplacement
A ce jour, aucune alternative non animale permet d’étudier l’effet de la régénération de la production du thymus par le traitement ligand-X. De plus, l’étude de la dissémination leucémique au sein des tissus nécessite l’utilisation du modèle in vivo. Notre projet nécessite donc une approche in vivo afin de mettre en relation les différentes composantes tissulaires et cellulaires impliquées dans la réponse étudiée.
Réduction
Le choix du nombre d’animaux est réalisé afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Il prend en considération la variabilité inter-individuelle, la variabilité de réponse au traitement et la variabilité de charge leucémique. Après la première expérience, le nombre d'animaux à utiliser sera ajusté après estimation du nombre d'animaux nécessaires pour garantir un résultat fiable. D’après nos analyses de la littérature et notre expérience passée, un nombre de 9 à 15 animaux par groupe devraient fournir des résultats suffisamment robustes et interprétables. Afin d’éviter les biais expérimentaux, les animaux seront répartis en aveugle dans les différents groupes de traitement par un expérimentateur tiers. Afin de réduire le nombre de souris contrôles utilisées, un maximum de groupes différents seront constitués lors d’une même expérience, e.g. l'étude de la dissémination leucémique chez les animaux et l’étude de l’effet d’une neutralisation du ligand-X chez ces animaux.
Raffinement
Afin de réduire les nuisances, plusieurs mesures seront prises. Concernant le stress de manipulation, les animaux seront manipulés par un seul expérimentateur sauf pour l’étape de répartition dans les groupes. Les animaux seront soumis à une anesthésiés gazeuse légère par inhalation gazeuse avant chaque injection intraveineuse. Les animaux bénéficieront par ailleurs d’une surveillance quotidienne ou tous les deux jours selon la procédure, afin d’identifier tout signe de gêne ou de douleur, à l’aide d’une grille d’évaluation dans le cas de la leucémie. Entre autres, les animaux seront pesés tous les jours avec une balance de précision, et seront soumis à une surveillance accrue dès l’identification d’une perte de poids. En cas de faiblesse pouvant générer un défaut d’alimentation ou de perte de poids importante, une alimentation hydratée spécifique sera déposée dans le fond de la cage. Les signes de douleurs seront monitorés avec précision selon la grille d’évaluation, et des analgésiques seront administrés à l’apparition de signes de douleurs.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix des divers projets de l’équipe, adapté à l’analyse du système immunitaire, et en particulier du thymus, ainsi qu’à l’oncologie. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons ont un fond génétique stable et après traitement, le récepteur Y sera spécifiquement mutée dans les cellules des parois des vaisseaux sanguins thymiques . Trois âges sont prévus : -stade jeune : souris de 8 semaines. -stade avancé d’involution thymique : souris âgées de 12 mois. -stade très avancé d’involution thymique : souris âgées de 18 mois.
Investigation du rôle des systèmes neuromodulateurs dans l’alignement de l’axe vertébral du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
2 012 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, 1 824 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 188 un niveau sévère. Une partie est exposée vingt heures par jour pendant quatre jours à un composé pharmacologique qui déforme la colonne vertébrale, avec une mortalité attendue jusqu'à 40 % chez les larves traitées. D'autres subissent une biopsie de la nageoire caudale, une immobilisation en gel d'agarose, une injection intramusculaire paralysante, puis jusqu'à quarante-cinq minutes d'illumination laser des tissus. Le porteur écrit que cette étude "ne peut donc être soumise au principe de remplacement", au motif que seules des espèces pourvues d'une colonne vertébrale permettraient d'étudier la scoliose.
Objectifs
Les déformations de la colonne vertébrale regroupent des pathologies de l’alignement du rachis qui surviennent autour de la période de forte croissance chez l’adolescent. Parmi elles, la scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la plus fréquente : elle consiste en des désalignements des vertèbres qui touchent 1 à 4% de la population. La correction de ces déformations spontanées, détectées principalement chez les filles, se base sur le port prolongé de corsets et sur des chirurgies invasives de fusions vertébrales dont le but est de recouvrer une posture correcte et d’atténuer les douleurs thoraciques associées. A ce jour, aucun traitement non invasif n’existe pour traiter la SIA, faisant de la compréhension de ses causes un enjeu majeur pour son traitement mais aussi pour sa détection précoce. L’étiologie de la SIA est restée longtemps peu comprise, principalement à cause de l’absence de modèles intégrant la complexité spatiale, temporelle et moléculaire, impliquée dans le développement et la consolidation du squelette vertébral. Récemment, le poisson zèbre a émergé comme un modèle puissant pour cette pathologie. Des travaux récents ont montré que le système nerveux est à l’origine de voies importantes, mais encore mal comprises, dans l’établissement de l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire. La finalité de ce projet est donc de comprendre, en utilisant le poisson zèbre comme modèle animal, par quels mécanismes le système nerveux influence l’alignement de la colonne vertébrale au cours du développement post-embryonnaire.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux. Du point de vue scientifique, il permettra à court terme (pendant la durée du projet) de faire progresser les connaissances liées à l’influence du système nerveux sur l’alignement de la colonne vertébrale ainsi que sur les mécanismes sous-jacents qui se mettent en place au cours du développement post-embryonnaire et de la croissance de l’organisme. Du point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux marqueurs de progression ou de nouvelles cibles pharmacologiques potentielles permettant d’infléchir l’évolution de la scoliose idiopathique de l’adolescent.
Procédures
Les signes cliniques attendus dans nos modèles de scoliose consistent en des déformations de la colonne vertébrale, sans troubles visibles attendus en termes de douleur, de nage, de comportement, ou d’alimentation (durée attendue des signes cliniques allant de 2 à 32 semaines en fonction des lots). Des animaux seront exposés à des traitements pharmacologiques délivrés directement dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose (un traitement par animal 20h par jour avec 4h de récupération, pendant 4 jours ; durée attendue des signes cliniques de 8 jours). Les animaux, sous anesthésie profonde, seront soumis soit à une biopsie de la nageoire caudale (biopsie de 1-2 mm, une fois par animal, 30 secondes), soit à des immobilisations en gel d’agarose (indolore, 1 fois par animal, durée : 10 à 15 minutes) suivies d’injections intramusculaires (une fois par animal, 2 secondes) suivies de d’enregistrements non invasifs d’images en fluorescence à des stades du développement où ils sont transparents et optiquement accessibles (une fois par animal, 30 à 45 minutes). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire en fin de procédure.
Impact sur les animaux
La première catégorie d’effets indésirables attendus est liée à l’apparition de déformations de l’axe du corps chez des animaux mutants et chez des animaux exposés à des traitements pharmacologiques permettant établir notre modèle. Ce signe clinique apparait spontanément chez les mutants étudiés (à environ 2 semaines d’âge) et sera effectif jusqu’à la fin des procédures expérimentales associées. Il sera induit pharmacologiquement chez les animaux traités pendant une durée de 7 jours. Les observations reportées dans la littérature et nos observations préliminaires n’indiquent aucun impact détectable de ce signe clinique sur l’alimentation des animaux, leur comportement de nage en milieu aquatique, et leurs interactions en groupe social, suggérant des conséquences modérées en termes de stress, de douleur ou de mobilité. La deuxième catégorie d’effets indésirables attendus est liée aux actes expérimentaux nécessaires pour effectuer des expériences d’imagerie. Elle comprend le prélèvement des animaux de leur aquarium avec une épuisette, l’anesthésie, l’immobilisation d’animaux profondément sédatés, la paralysie par injection intramusculaire, et l’illumination des tissus avec un laser. Les effets indésirables prévus pour ces animaux couvrent donc le stress induit par la manipulation jusqu’à la sédation, leur immobilisation après une sédation profonde, la douleur causée par une aiguille permettant de procéder à une injection intramusculaire et l’illumination des tissus sous un microscope à fluorescence, couvrant une durée ne dépassant pas 60 minutes par animal. La troisième catégorie d’effets indésirables concerne la toxicité du composé pharmacologique délivré dans l’eau permettant de mettre en place un de nos modèles de scoliose, auquel les animaux seront exposés et qui nécessitera une modification des conditions d’hébergement (modification du cycle jour-nuit), pouvant générer un stress, et diminuera leur taux de survie pendant la période d’exposition. Enfin l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale chez des adultes sous anesthésie générale afin d’identifier leur statut génétique constitue la dernière catégorie de nuisance pour les animaux étudiés.
Devenir
Pour toutes les procédures de ce projet, les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de nous permettre de réaliser les analyses prévues post-mortem. Elles comprennent des analyses de l’alignement vertébral, d’histologie, d’anatomie, et de prélèvement de tissus post-mortem qui seront utilisés pour des analyses de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal.
Remplacement
La scoliose idiopathique est une déformation de la colonne vertébrale qui apparaît spontanément chez l’adolescent au cours de la puberté. L’étude des origines génétiques ainsi que des mécanismes biologiques qui la sous-tendent ne peut donc être réalisée que chez espèces pourvues de colonnes vertébrales. Aucune alternative non animale n’existe à ce jour permettant d’étudier ces questions, notamment le rôle du système nerveux dans l’alignement vertébral, ni de sonder les conséquences induites par la manipulation de ce système sur leurs cibles en aval. Cette étude ne peut donc être soumise au principe de remplacement.
Réduction
2012 animaux seront utilisés dans ce projet. Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux prévus dans notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure en se basant sur : (i) l’identification de lots déterminés par les stades développementaux clés pour mener nos investigations et tester nos hypothèses de travail, (ii) une estimation de l’échantillonnage nécessaire pour détecter les effets biologiques testés, basée sur une comparaison statistique, (iii) la prise en compte d’une comparaison de groupes expérimentaux liée à l’identité génétique de frères et sœurs dont la distribution est connue, (iv) un taux de survie estimé à 80 pour cent pour les alevins mis élevage, (v) une mortalité maximale estimée à 40 pour cent pour les larves exposées au traitement pharmacologique permettant de mettre en place notre modèle, (vi) la prise en compte d’un échantillonnage équivalent de mâles et de femelles. Pour chaque quantification effectuée, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés dans nos procédures. Certains animaux seront utilisés pour mener des investigations post-mortem et répondre à plusieurs questions scientifiques. Pour chacune des procédures conçues, un nombre d’animaux inférieur à celui prévu sera utilisé si nos résultats sont statistiquement fiables avant l’utilisation de l’ensemble des animaux envisagés. En particulier, nous tenterons de développer une technique de biologie moléculaire nous permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant leur mise en élevage. Si cette implémentation s’avère fructueuse, un nombre moins important d’animaux sera effectivement utilisé, notamment pour les groupes témoins, pour atteindre des résultats statistiquement fiables.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée, où les paramètres environnementaux sont vérifiés, contrôlés et adaptés si nécessaire (qualité et température de l’eau, cycle lumineux, etc.). Les animaux seront nourris 1 à 2 fois par jour avec une alimentation adaptée à leur stade physiologique. Les mesures spécifiques de raffinement qui seront prises incluent : (i) une surveillance accrue des mutants étudiés et des animaux soumis aux traitements pharmacologiques permettant d’induire des scolioses, afin de détecter et limiter les signes de mal-être liés à leur désalignement axial ou à l’exposition au composé pharmacologique utilisé à cet effet, (ii) l’hébergement des animaux par groupes de phénotypes semblables dès que possible au cours du développement post-embryonnaire afin de limiter un accès compétitif à la nourriture si cela est pertinent, (iii) l’utilisation d’une grille de score standardisée au sein de la structure d’hébergement, permettant d’évaluer les signes de mal-être, de douleur ou de souffrance et permettant une prise en charge rapide et optimale par l’utilisateur en coordination avec la structure chargée du bien-être animal et l’équipe vétérinaire, (iv) l’identification de points limites pour chacune des procédures permettant une prise en charge rapide et optimisée en fonction des procédures expérimentales, (v) l’utilisation d’un composé non aversif et à induction rapide pour l’anesthésie et l’euthanasie, (vi) le choix de manipulations douces des animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère), (vii) la mise en place d’une habituation des animaux à un changement environnemental lorsque cela est pertinent, (viii) l’optimisation d’une technique de biologie moléculaire permettant de caractériser génétiquement chaque animal de façon précoce avant sa mise en élevage afin de permettre l’hébergement d’animaux qui auront des signes cliniques comparables, avant que ces derniers ne se déclarent ; (ix) une technique de biopsie sur animaux adultes sous anesthésie générale à induction rapide incluant des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec des outils désinfectés.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre constitue un modèle de choix pour l’étude de la scoliose idiopathique de l’adolescent. En effet, sa colonne vertébrale partage les mêmes caractéristiques morphoanatomiques que celles de l’homme. Elle est soumise, du fait qu’il évolue en milieu dense, à des forces biomécaniques similaires à celles des espèces bipèdes, contrairement aux quadrupèdes dont le rachis subit des sollicitations influencées par une perception différente de la gravité. Le poisson zèbre possède un génome conservé à 70 pour cent avec celui de l’homme, permettant des analyses étiologiques poussées. Il présente enfin l’avantage de se reproduire en milieu externe et de rester optiquement transparent pendant une large partie de son développement post-embryonnaire, permettant d’implémenter des méthodes non invasives basées sur la microscopie in vivo afin de mener les investigations appropriées sans induire de dommages durables. Chez le poisson zèbre, des animaux âgés de 4 à 29 jours post fertilisation sont considérés comme des larves, des animaux âgés entre 30 et 89 jours post fertilisation sont considérés comme des juvéniles, et au-delà de 90 jours post fertilisation comme des adultes. Dans ce projet, 1556 animaux seront utilisés au stade larvaire (7 jours à 4 semaines post fertilisation), 52 animaux au stade juvénile (6 semaines post fertilisation) et 404 animaux au stade adulte (12 et 32 semaines post fertilisation) afin de répondre aux questions scientifiques testées.
Etude de la vulnérabilité aux maladies psychiatriques chez un modèle murin hypocholinergique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Quinze minutes d'observation par jour pendant trois semaines sous pulvérisations de spray sucré, dix injections intrapéritonéales en dix jours, une restriction alimentaire faisant perdre jusqu'à 25 % du poids : 1 000 souris vont être utilisées, 336 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 664 un niveau modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Certaines subissent en plus une chirurgie cérébrale de deux heures pour injecter un virus et implanter des fibres. Le porteur cherche à provoquer des comportements compulsifs, toilettage excessif, anorexie d'activité sur roue, effets de substances psychoactives, chez une lignée porteuse d'un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques. Il affirme que l'absence de méthodes alternatives l'"oblige" à recourir à ces modèles murins, et ne dit rien de ce qu'un comportement de souris permet de conclure sur un trouble psychiatrique humain.
Objectifs
Ce projet de recherche s’intéresse aux mécanismes communs sous jacents aux maladies psychiatriques. Les comportements habituels persistants et la compulsion sont considérés comme des caractéristiques communes à plusieurs pathologies telles que les troubles obsessionnels compulsifs, les troubles liés à la consommation de substances et les troubles du comportement alimentaire. L’identification d’un variant sur-représenté dans des populations humaines poly-toxicomanes et anorexiques constitue un atout pour étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et comportementaux pouvant être à l’origine de ces désordres psychiatriques à composante compulsive sur un modèle murin. Les objectifs de ce projet sont 1) identifier la vulnérabilité aux compulsions de ce modèle murin, 2) comprendre comment ce variant module l’activité de certaines régions cérébrales au cours de la mise en place de ces comportements compulsifs et 3) identifier des stratégies thérapeutiques pharmacologiques pour rétablir un comportement normal chez ce modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de maladies psychiatriques à composante compulsive. A l’heure actuelle très peu de données permettent d’y voir clair et d’envisager une thérapie visant à empêcher voir réduire la sévérité de ces pathologies pour certaines mortelles. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet ainsi que d’approfondir nos connaissances sur ces pathologies psychiatriques. Nos travaux identifieront des facteurs et des processus qui permettront par la suite d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques afin de lutter contre ces maladies dévastatrices.
Procédures
Six procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des désordres compulsifs. En utilisant des modèles murins nous évaluerons l’efficacité d’un traitement pharmacologique sur le rétablissement d’un comportement normal. Un premier aspect consistera à s’intéresser à la mise en place comportementale de la compulsion en étudiant le toilettage compulsif chez les animaux (procédures 1 et 4) à travers l’exposition et l’analyse comportementale des animaux exposés à des pulvérisation de spray sucrée sur le pelage (15 min d’observation quotidienne durant 3 semaines max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (10 injections max à raison 1 fois par jour pendant 10 jours–quelques secondes). Nous nous intéresserons ensuite à la compulsion observée lors de la mise en place de troubles du comportement alimentaire (procédures 2 et 5). Les animaux seront individualisés, exposés à une roue d’activité (libre accès dans la cage durant 3 semaines environ) et l’apport en aliment sera contrôlé (sur une période de 10 jours max) avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale (7 injections max à raison 1 fois par jour pendant 7 jours max–quelques secondes). Enfin, nous nous intéresserons aux effets après administration ou non de substances psychoactives (procédure 3) délivrées quotidiennement en intrapéritonéale (1 injection par jour durant 6 jours – quelques secondes) et leur comportement sera enregistré avec ou sans administration de traitement pharmacologique en intrapéritonéale en amont (6 injections maxi à raison 1 fois par jour pendant 6 jours–quelques secondes). Les procédures 4 et 5 incluront une unique chirurgie au niveau cérébral qui se déroulera avant la mise en place des comportements de compulsion. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie permettra de pouvoir suivre les modifications neurobiologiques. Enfin, la procédure 6, inclura une chirurgie au niveau cérébral permettant d’administrer des vecteurs viraux permettant de modéliser différents modèles. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite exposés aux 2 types de compulsions (toilettage et alimentaire) de manière successive avec un temps de repos entre les deux. Les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.
Impact sur les animaux
1/ La mise en place de la compulsion de toilettage peut entrainer un stress ou une anxiété chez les animaux (perte de poids 5-1 pourcents) 2/ L’isolement peut entraîner un stress et une souffrance chez les les animaux 3/ L’ABA nécessitant une restriction alimentaire progressive entraine une perte de poids conséquente chez l’animal après plusieurs jours (5-25 poucents) 4/ L’injection ip peut entraîner une douleur légère au point de piqure 5/ Les chirurgies stéréotaxiques (injections de virus et implantation de fibres) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures 6/ Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardio-respiratoire
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques et moléculaires.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des désordres psychiatriques que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en œuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces pathologies. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des comportements compulsifs (de toilettage, du comportement alimentaire et de l’addiction) nous oblige à utiliser les modèles murins proposés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 1000 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux sont hébergés dans les conditions standard sur le plateau de phénotypage. Sauf procédure expérimentale le nécessitant, les souris seront hébergées par groupe de 2-5 dans des cages adaptées à leur taille et leur nombre. Dans ces cages, l’enrichissement utilisé sera du nid végétal. Les animaux seront suivis durant l'ensemble de la procédure. A minima, une pesée hebdomadaire sera effectuée. Une détérioration de leur état général (perte de poids, prostration, poils souillés) entrainera un arrêt immédiat de la procédure, un suivi journalier de l’animal avec traitement antalgique et éventuellement une euthanasie pour éviter toute souffrance. Pour tous les tests comportementaux, les animaux sont habitués à être manipulés par les expérimentateurs avant le début des tests afin de réduire le stress. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent se battre et se blesser ; elles sont, dans ces cas, prises en charge immédiatement avec l’avis du comité de bien être animal et/ou du vétérinaire-référent de notre établissement utilisateur. Nous avons défini des points limites pour toutes les procédures. Si ces points limites sont atteints, nous consultons notre vétérinaire référent pour décider du devenir des souris.
Choix des espèces
Notre projet est basé sur l’étude d’un variant identifié chez des patients humains. L’expression de celui-ci chez la souris est indispensable pour mieux comprendre la vulnérabilité qu’il confère aux humains envers diverses maladies psychiatriques. Ainsi, le modèle souris constitue un atout pour développer efficacement notre projet. L’étude d’animaux est indispensable puisque nous explorerons les altérations physiopathologiques dans le cerveau et leurs conséquences sur le comportement. Les mécanismes qui sous-tendent le contrôle du comportement par le système nerveux central ne peuvent pas être abordés uniquement par des études à l’échelle cellulaire. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les dysfonctionnement cérébraux opérants dans la mise en place des comportements compulsifs. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Nos études sur la mise en place des compulsions dans les maladies psychiatriques seront importantes non seulement pour mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de celles-ci mais permettront également d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de comportements compulsifs se focalisent pour le moment chez l’adulte.
Evaluation de 2 nouvelles formulations à 2 doses sur la cicatrisation chez la souris Hairless Skh-1
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Tester deux formulations de gel cicatrisant à deux doses mobilise 40 souris hairless, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie de 6 mm est découpée sur toute l'épaisseur de la peau du flanc gauche de chaque souris sous anesthésie générale, puis traitée et pansée tous les deux jours sous anesthésie jusqu'à cicatrisation complète. Chaque souris reste seule en cage transparente pendant toute l'étude, pour éviter qu'elles ne s'arrachent mutuellement leurs pansements. Le porteur prévoit la mise à mort de celles qui perdent plus de 20 % de leur poids maximal ou 15 % entre deux pesées, comme de celles qui présentent cachexie, vocalises ou convulsions.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer les effets de 2 nouvelles formulations sous forme liquide formant un gel, administrées par application cutanée locale (voie topique) à 2 doses, sur le processus de cicatrisation sur un modèle de plaies cutanées induites par excision cutanée complète chez la souris. Une plaie cutanée sera réalisée sur le flanc gauche de chaque souris. Les 2 nouvelles formulations seront appliquées tous les 2 jours directement sur les plaies cutanées induites jusqu’à cicatrisation complète de celles-ci. Après cicatrisation complète de leur plaie cutanée, les souris seront euthanasiées avant réalisation d’un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité sur la cicatrisation de 2 nouvelles formulations en cours de développement, formulations ayant montré des effets bénéfiques sur la prolifération cellulaire in vitro. L’évaluation se fera par des observations tous les 2 jours des plaies cutanées avec scorage de différents paramètres, la mesure de leur surface, la détermination du temps nécessaire à la cicatrisation complète, et après cicatrisation complète, par des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction des plaies cutanées. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le processus cicatriciel de ces 2 nouvelles formulations in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme avec l’une et/ou l’autre des 2 formulations testées.
Procédures
Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction des plaies cutanées. Sous anesthésie générale, une plaie cutanée de 6 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectuée sur le flanc gauche de chacune des 40 souris nécessaires à la réalisation de ce projet. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 5 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les plaies cutanées seront traitées immédiatement après leur induction puis tous les 2 jours jusqu’à cicatrisation complète. Les plaies cutanées seront protégées par un pansement de couverture changé tous les 2 jours sous anesthésie générale et seront observées et scorées lors de chaque change effectué. Chaque retrait du pansement de couverture, observation et traitement des plaies cutanées et mise en place d’un nouveau pansement de couverture seront réalisés en moins de 10 minutes pour chaque souris. Un suivi quotidien des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des souris en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Impact sur les animaux
L’induction des plaies cutanées peut engendrer une douleur au cours des premières heures suivant celle-ci. La répétition des anesthésies même de courte durée (moins de 10 minutes), nécessaires afin d’enlever délicatement le pansement de couverture pour observer, photographier puis traiter les plaies cutanées avant de mettre en place un nouveau pansement de couverture, induiront une nuisance pour les souris. D’autre part, un stress dû à la limitation des interactions sociales directes pourra être induit par l’hébergement en cage individuelle transparente des souris, rendu nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture permettant le maintien des traitements appliqués au contact des plaies cutanées et la protection de celles-ci.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction des plaies cutanées puis le traitement et le suivi de celles-ci jusqu’à leur cicatrisation complète, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction des plaies cutanées pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la régénération du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant une durée prolongée, au moins 2 semaines selon notre expérience du modèle de plaie cutanée utilisé. D’autre part, le processus cicatriciel met en jeu des mécanismes complexes entre différents types cellulaires qu’il est pour le moment impossible à reproduire in vitro ou ex vivo (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, formation de nouveaux vaisseaux sanguins fonctionnels…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé par un calcul de puissance statistique effectué à l’aide d’un logiciel adapté. Selon ce test de puissance statistique, il est ainsi nécessaire de n’utiliser que 8 animaux avec 1 plaie cutanée par animal (soit 8 plaies cutanées) par groupe expérimental pour mettre en évidence des différences significatives.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celles-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré tous les 2 jours à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’infection des plaies cutanées ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées individuellement dans des cages de taille adaptée dans une animalerie maintenue en cycle de lumière inversé afin d’observer leur comportement avant et après traitement pendant leur phase active. Cela permet de respecter leur horloge biologique (chronobiologie) et d’évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Des morceaux de papier absorbants et de papier kraft seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière effectué 2 fois par semaine.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des plaies cutanées représentatives des plaies à traiter chez l’Homme, et la souris Hairless est un modèle très utilisé et largement décrit dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur la cicatrisation. De plus, elle présente une structure de la peau relativement proche de celle de l’Homme permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur la cicatrisation (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats très intéressants.
Campagnes Sturat. Suivi de la fraction estuarienne de la population soutenue d’esturgeons européens et des espèces piscicoles du milieu (Avenant)
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Autres poissons : 9000
Remis à l'eau sur leur lieu de capture, 9 070 des 9 200 poissons annoncés dans ce projet sont déclarés rendus vivants au milieu, l'écart de 130 individus restant sans explication dans le résumé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance légère pour 9 150 poissons et modéré pour 50 d'entre eux, capturés par 126 traits de chalut de fond de trente minutes par an. Les esturgeons européens, espèce en danger critique d'extinction, sont anesthésiés puis marqués par pit-tag intramusculaire et marque transmusculaire, biopsiés à la nageoire, échographiés, photographiés et, pour 70 à 75 % d'entre eux, soumis à un lavage gastrique provoquant des spasmes pour faire régurgiter leur contenu stomacal. Le porteur estime à une cinquantaine par an les esturgeons capturés et juge cet effectif "raisonnable pour une espèce en danger critique".
Objectifs
Le projet consiste à réaliser un suivi des populations de poissons en milieu estuarien et plus particulièrement, celui d’une espèce de poisson en danger critique d’extinction, qui a bénéficié d’un plan de sauvegarde national et de soutiens via des programmes européens, l’esturgeon européen. Ces mesures ont permis de maîtriser la reproduction en captivité de ce dernier et de lâcher dans le milieu naturel des juvéniles issus de ces reproductions pour soutenir la population sauvage. Afin de connaître l’évolution de cette nouvelle population dans son milieu naturel et d’évaluer le succès de ces pratiques de repeuplement, un suivi régulier doit être mis en place. Celui-ci sera réalisé dans le milieu estuarien puisque c’est là que ces poissons vont séjourner plusieurs années avant de partir grossir en mer et de revenir en estuaire pour entamer leur migration de reproduction jusqu’aux frayères fluviales. Les possibilités de trouver des individus seront donc beaucoup plus importantes dans ces endroits qu’en pleine mer. L’espèce ayant décliné avant l’acquisition de connaissances la concernant, il est nécessaire de mieux documenter son écologie en milieu naturel (régime alimentaire, croissance, structure en âge, préférences environnementales, migrations). Lors de précédentes campagnes d’échantillonnage, une procédure-pilote de marquage et de monitoring de quelques spécimens par marque satellite a permis de documenter pour la première fois leur comportement en mer ainsi que leurs migrations entre l’estuaire et la mer. Depuis ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves (déclarations de pêcheurs professionnels), mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle à ce jour. Mis à part la description de sites de frayères historiques potentiels, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Pour l’étudier, nous nous proposons de remplacer la procédure de marquage satellite par des marquages acoustiques chez quelques grands spécimens, ce qui permettra de suivre par télémétrie leurs trajectoires pour la reproduction jusque dans les fleuves.
Bénéfices attendus
L’esturgeon européen (A. sturio) ayant décliné avant l’acquisition de connaissances, il est important de mieux documenter son écologie en milieu naturel. Ce projet permettra la collecte de données sur les régimes alimentaires, structures en âge des populations, croissance, préférences environnementales, migrations. Outre leur intérêt fondamental, les résultats informeront sur l’évolution, dans son milieu, de cette population soutenue et permettront d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement. Suite au repeuplement dans le bassin versant de plus de 1.7 M de juvéniles d’esturgeon européen entre 2007 et 2015, les individus sont actuellement en âge de se reproduire. Durant les campagnes d’échantillonnages précédentes, le marquage de grands spécimens avec des marques satellites a documenté pour la 1ère fois leur comportement en mer et leurs migrations trophiques entre l’estuaire et la mer. Cette procédure-pilote s’est avérée très informative. La modélisation des données est en cours pour reconstituer les trajectoires maritimes a posteriori ; les 1ers résultats sont encourageants mais nécessitent une analyse approfondie avant d’envisager la pose de nouvelles marques satellites. Ces dernières années, quelques grands spécimens adultes ont été observés dans les fleuves par des pêcheurs professionnels, mais il n’y a aucun signe de reproduction naturelle. Nous supposons qu’il s’agissait d’individus mâles en exploration et qu’il n’y a pas encore eu de remontée d’individus femelles. Excepté la description de frayères historiques potentielles suite aux concentrations d’individus observées par le passé, le comportement de reproduction de l’espèce reste inconnu. Le marquage par télémétrie acoustique d’une dizaine d’autres grands spécimens entre septembre 2024 et juin 2025 permettra de suivre en continu sur les prochaines années leurs trajectoires jusqu’aux fleuves. Grâce au monitoring dans les fleuves et à l’embouchure de l’estuaire, nous disposerons d’informations sur la migration de reproduction et le retour en mer des individus (trajets, périodes, vitesses). L’intérêt est l’obtention de données individuelles 1/ complémentaires, indépendantes des captures accidentelles déclarées sur la base du volontariat car l’espèce est protégée, 2/ sans avoir besoin de recapturer le poisson et 3/ sur le long terme (jusqu’à 6 ans), certains individus pouvant se reproduire chaque année ou tous les deux ans.
Procédures
Tous les 2 mois (6 campagnes/an), un échantillonnage piscicole par chalutage de fond est réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’A. sturio ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître les autres populations de poissons présentes pour identifier les interactions possibles. Par campagne sont réalisés 21 traits de chalut, d’une durée de 30 min. A chaque trait, toutes les espèces présentes sont identifiées le plus rapidement possible, en les maintenant humides ou immergées (viviers), puis relâchés sur le lieu de capture. S’il s’agit d’A. sturio, on renseigne leur nombre, longueur, poids, état et numéro des marques d’identification s’ils en sont déjà dotés au moment de la capture. Si ce n’est pas le cas, les individus sont marqués pour identification (Pit-tag interne et marque numérotée externe) et de petits morceaux de nageoire sont prélevés pour réaliser des analyses génétiques (origine repeuplement ou sauvage) et isotopiques (utilisation des habitats) et estimer leur âge (durée de ces marquages et prélèvements : 2 à 3 min). En fonction de leur état, on réalise une échographie (maturité, sexage), une photographie (morphologie générale) et un lavage gastrique (exploration du régime alimentaire) (durée totale de ces 3 manipulations moins de 10 min). S’ils ont un poids suffisant, une marque à mémoire externe enregistrant température, oxygène et salinité du milieu est fixée à la base des écussons dorsaux pour documenter leurs préférences environnementales (moins de 5 min pour la pose de cette marque). Les plus gros spécimens sont aussi dotés d’une marque acoustique pour suivre leurs trajectoires, posée en interne (cavité abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) selon la date de capture et l’avancée présupposée de la maturation (environ 5 min pour cette manipulation). Pour toutes les manipulations, les esturgeons européens sont anesthésiés.
Impact sur les animaux
Ces effets sont liés au stress de capture, voire de stabulation et biométrie (confinement, émersion). La durée de chalutage est de 30 min pour limiter les blessures des poissons prélevés. Les esturgeons européens peuvent aussi subir du stress et/ou blessures occasionnés par les actes expérimentaux successifs suivants : 1) marquage individuel (Pit-tag en intramusculaire et marque numérotée en transmusculaire) et 2) prélèvements de tissus de nageoires, qui peuvent entrainer des blessures tissulaires de type plaie cutanée, mais qui ne sont pratiqués que si nécessaire (i.e. individu échantillonné pour la 1ère fois) ; 3) échographie (état de maturité, sexage) et photographie (morphologie générale), qui bien que non invasives, ne sont opérées qu’en fonction de l’état du poisson ; 4) lavage gastrique provoquant des spasmes transitoires facilitant la régurgitation du bol alimentaire, fait seulement si l’individu est en bon état ; 5) selon sa taille, pose d’une marque DST externe (fixée à la base des écussons dorsaux pour éviter d’endommager la musculature) et 6) pour les plus gros poissons, pose d’une marque acoustique interne (intra-abdominale) ou externe (à la base des écussons dorsaux) si l’individu est en période de reproduction et auquel cas, il n’est pas doté d’une DST.
Devenir
Etant donné que le projet porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire et notamment sur le suivi, dans son milieu, de la population soutenue d’esturgeon européen, l’objectif de l’étude ne peut pas être atteint en dehors du milieu naturel. A l’issue des procédures, les poissons sont remis en liberté dans leur secteur de capture, ce qui est couvert par une autorisation préfectorale. Les esturgeons européens sont traités à part en priorité (biométrie, échographie, marquage d’identification, prélèvements tissulaires et lavage gastrique). Ils sont ensuite conservés en vie. Ceux dont l’état ou la taille ne permet pas un marquage supplémentaire (avec marque à mémoire et/ou marque acoustique), seront remis à l’eau rapidement sur leur lieu de capture. Il en sera de même pour les plus gros individus qui auront été marqués. De par l’objectif de l’étude, il est nécessaire de relâcher les esturgeons européens marqués au niveau de leur secteur de capture afin d’étudier la population en milieu naturel. La décision du moment du lâcher est prise par les intervenants qui sont formés à l’expérimentation animale et à la pratique de la chirurgie expérimentale. Ce moment sera fonction de l’état du poisson au réveil (reprise d’un comportement de nage normal). Nous bénéficions de toutes les autorisations réglementaires pour impliquer dans ce projet cette espèce d’esturgeon qui est protégée.
Remplacement
Aucun remplacement des poissons étudiés ne peut être effectué puisque les données recherchées ne peuvent être fournies que par les espèces elles-mêmes vivant dans le milieu naturel. Comme indiqué précédemment, afin de connaître l’évolution, dans son milieu, de la population soutenue d’A. sturio et d’évaluer le succès des pratiques de repeuplement mises en place dans le cadre du PNA, un suivi régulier doit être réalisé dans des secteurs estuariens adjacents aux fleuves dans lesquels les juvéniles d’esturgeons européens ont été déversés. Il s’agit de recapturer ces individus pour estimer l’évolution de leur abondance et connaître également les autres populations de poissons présentes dans l’estuaire pour identifier les interactions possibles. Par conséquent, pour réaliser le suivi des populations piscicoles estuariennes et en particulier, de l’état de la population soutenue d’esturgeons européens, il est nécessaire de capturer les poissons pour pouvoir les dénombrer (estimer les abondances), les mesurer, les marquer (suivi individuel de croissance), les équiper de marques spécifiques (étude des déplacements et des préférences environnementales).
Réduction
D’après les échantillonnages historiques, on peut s’attendre à capturer en moyenne une cinquantaine d’esturgeons européens par an au grand maximum. Tous seront marqués individuellement pour identification afin d’avoir un suivi le plus exhaustif possible de la population. En effet, étant donné la faible abondance de l’espèce (soutien de population) et de l’effort de capture ciblant l’espèce relativement faible (campagnes bimestrielles en estuaire, captures accidentelles par des pêcheurs), le taux de recapture attendu est faible (150 cm pour les marquages acoustiques de géniteurs). Cela représente sur l’année environ 10-15 individus marqués avec une DST dont une dizaine par acoustique. Les effectifs capturés dans l’estuaire peuvent varier d’une année à l’autre en fonction notamment des actions de repeuplement. D’après nos estimations, l’effectif envisagé correspond en moyenne, à l’échelle de l’année, au nombre d’animaux qui ont un poids supérieur au poids minimal requis pour le marquage sur le maximum d’individus possible, et il peut être considéré comme raisonnable pour une espèce en danger critique telle que l’esturgeon européen.
Raffinement
- 21 traits de chalut de fond par campagne (soit 126 traits/an) sont effectués dans des secteurs médian et aval chalutables de l’estuaire en suivant 2 grilles d’échantillonnages légèrement décalées alternativement d’une campagne à l’autre. Cela représente environ 1 % de la surface totale de l’estuaire subtidal (i.e. les secteurs non soumis au marnage), soit un impact sur le fond de l’estuaire qui nous parait négligeable sachant que ce dernier est par ailleurs soumis à des dragages réguliers et importants pour les besoins de la navigation. - La durée de chalutage de 30 min est fixée sur la base d’échantillonnages historiques qui mettaient en évidence qu’elle limitait les blessures des poissons prélevés. A la remontée du chalut, les poissons sont réceptionnés sur un matelas, et transférés dans un ou des viviers alimentés en circuit ouvert. - Quelle que soit l’intervention, l’A. sturio est anesthésié au préalable pour limiter stress et douleur (les dosages du produit anesthésiant sont adaptés à sa taille et au type d’intervention). Durant les manipulations, il est immergé, ou alimenté, via un tuyau, d’anesthésique à dose sédative ou arrosé d’eau claire de l’estuaire (maintien humidité cutanée). L’ensemble est réalisé avec le plus grand soin par des intervenants ayant une bonne expérience de ces pratiques et parfaitement conscients de la fragilité de l’espèce. Après son réveil dans un vivier alimenté en eau courante de l’estuaire bien oxygénée et sa reprise d’un comportement de nage normal, l’A. sturio est relâché sur le lieu de capture à l’aide d’un toboggan. Les procédures seront adaptées à la situation : réduction si l’individu est blessé ou maigre et/ou s’il y a beaucoup d’individus, pas de lavage gastrique chez ceux marqués par acoustique.
Choix des espèces
- Etant donné que l’étude porte sur le suivi des espèces piscicoles de l’estuaire, l’ensemble des espèces capturées sont identifiées et traitées. En plus des esturgeons européens (Acipenser sturio), on s’attend à capturer en majorité les espèces suivantes : mulet-porc (Chelon ramada), maigre (Argyrosomus regius), anguille européenne (Anguilla anguilla), bar franc (Dicentrarchus labrax) et bar moucheté (Dicentrarchus punctatus), flet (Platichthys flesus), merlan (Merlangius melangus), sole (Solea solea), sprat (Sprattus sprattus), anchois (Engraulis encrasicolus), gobies (Pomatoschistus spp.), raie bouclée (Raja clavata), alose feinte (Alosa fallax) et grande alose (Alosa alosa), congre (Conger conger), lamproie marine (Petromyzon marinus), ainsi que 2 espèces d’esturgeons exotiques suite à des échappements de piscicultures : l’esturgeon sibérien (Acipenser baeri) et l’osciètre (Acipenser gueldenstaedti). - En fonction des espèces capturées et de la saison, il s’agira de poissons de stades juvéniles ou adultes. Pour l’esturgeon européen, il s’agira de juvéniles de plus d’un an. Il est également possible que des adultes en migration de reproduction (âge> 12 ans) soient capturés.
Rôle des vésicules extracellulaires tumorales dans la douleur associée au cancer
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
458 souris pour une injection unique sous la plante de la patte chacune, suivie de tests de douleur mécanique et thermique dans les vingt-quatre heures. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis disséquées pour prélever la patte, les ganglions rachidiens et la moelle épinière. Le porteur explique que le seuil de douleur est "repéré par l'animal lui-même", le test s'arrêtant au retrait de la patte. L'objet réel est de savoir si des vésicules issues de tumeurs pancréatiques rendent les nerfs plus sensibles, question posée loin en amont de toute application pour les malades.
Objectifs
Le cancer du pancréas est de très mauvais pronostic et douloureux. Nous pensons que cette douleur est causée par des substances libérées par les cellules cancéreuses. Ces substances peuvent rendre les nerfs plus sensibles à la douleur et favoriser leur croissance dans la tumeur, mais leur nature exacte demeure inconnue. Nous proposons d’étudier le rôle potentiel des petites vésicules extracellulaires (appelées EVs) dans ce processus. Notre objectif est de caractériser l’impact des EVs produites par les cellules cancéreuses pancréatiques sur les réseaux nerveux et la douleur associée au cancer chez les souris. Pour cela, nous voulons observer si l'injection de ces EVs dans les pattes des souris provoque : 1/ Une sensibilité accrue à la douleur 2/ Des changements dans l’innervation de la patte 3/ Une activation des circuits neuronaux impliqués dans la douleur.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale et la génération de la douleur dans le cancer. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et de la douleur afin d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Les animaux auront une injection intraplantaire unique avant de subir les tests de comportements pour évaluer la douleur.
Impact sur les animaux
Les injections intraplantaires peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Les souris peuvent donc développer un stress, pour éviter cela, elles seront anesthésiées sous isoflurane. Pour les tests de comportement, le stimulus mécanique ou thermique peut provoquer de la douleur qui sera visualisée par un retrait de la patte de l’animal. Le point limite (seuil nociceptif) est donc repéré par l’animal lui-même. Le test est arrêté au retrait de la patte de l’animal donc on ne dépassera pas le seuil. Les expériences sont arrêtées au maximum à 24h post-injection. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.
Devenir
Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort puis disséqués pour récupérer différents organes (patte, les ganglions de la racine dorsale et la moelle épinière) afin d’être analysés.
Remplacement
Notre recherche vise à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de la douleur associée au cancer. Nous explorons l'idée que les petites vésicules (EVs) provenant des tumeurs pancréatiques pourraient causer une sensibilité accrue à la douleur en modifiant les nerfs dans la tumeur. Pour étudier cette question, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Ainsi, l’observation du comportement animal est nécessaire pour comprendre comment la douleur est perçue et transmise au cerveau. Cette approche est d’autant plus pertinente que des différences comportementales entre mâles et femelles peuvent également influencer la façon dont les signaux sensoriels sont traités à différents niveaux dans le corps. En résumé, l'utilisation de souris est essentielle pour étudier les causes pathophysiologiques de la douleur cancéreuse et mener à bien notre projet de recherche.
Réduction
Nous mettrons en place des stratégies pour limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires tout en collectant suffisamment de données pour répondre à nos questions de recherche. Cela implique de définir précisément nos protocoles comportementaux et de choisir judicieusement nos contrôles. Nous utiliserons également des outils statistiques pour estimer le nombre optimal d'animaux nécessaires. En contrôlant les paramètres environnementaux et en surveillant la santé des animaux, nous réduirons la variabilité des résultats expérimentaux et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ces procédures sont bien établies dans notre institut et nos chercheurs sont expérimentés dans leur mise en œuvre et dans l'évaluation de l'impact sur le bien-être des animaux. En optimisant notre plan expérimental et en analysant attentivement le nombre d'animaux requis, nous minimisons ainsi l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité et la validité de nos résultats scientifiques.
Raffinement
Les souris utilisées dans notre projet seront élevées en groupes sociaux et bénéficieront d'un environnement enrichi avec du coton et/ou un dôme pour assurer leur bien-être et favoriser un comportement normal, réduisant ainsi au maximum leur stress. L'élevage des souris est effectué dans notre établissement agréé par une équipe de cinq personnes dédiées à leur organisation et leur entretien. Nous contrôlons quotidiennement la santé et les conditions environnementales des animaux pour assurer leur bien-être. Les procédures expérimentales seront minutieusement planifiées, y compris la disponibilité des locaux, du matériel et la période d'acclimatation des animaux, afin de minimiser leur stress et d'assurer la fiabilité des résultats. Avant les tests comportementaux, les souris seront habituées pendant 45 minutes dans l'enceinte pour s'adapter à leur environnement. Nous établirons également des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests comportementaux utilisés. Toutes ces mesures sont mises en place dans le but de réduire, voire d'éliminer, la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être tout au long de l'étude.
Choix des espèces
Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.
Evaluation du rôle carcinogène d’une souche bactérienne issue d’isolat clinique sur le développement tumoral colique en modèle murin prédisposé
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Gavées jeunes et vigiles avec une bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectal, 576 souris génétiquement prédisposées développent des tumeurs coliques jusqu'à leur mise à mort, 65 jours après le gavage. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend un amaigrissement, une anémie visible aux pattes blanches, des phases de diarrhée ou de constipation, du sang dans les selles et un prolapsus, suivis par un système de score de douleur. Il décrit les actes infligés en trois lignes, "chaque geste technique dure quelques secondes", sans préciser le nombre de prélèvements sanguins ni la dose bactérienne administrée.
Objectifs
Ce projet a pour but de poursuivre les études sur les mécanismes d’action d’une bactérie capable de sécréter une toxine,, dans la carcinogénèse colorectale. En effet, l’infection par cette bactérie isolée de patients atteints de cancer colorectal accélère le développement tumoral dans un modèle murin prédisposé à développer ce cancer .
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus pourraient permettre de mieux comprendre les mécanismes de l'interaction bactéries-hôtes sur la carcinogénèse et d'étudier les voies de signalisation cellulaires/moléculaires impactées. A long terme, les résultats générés par ces recherches devraient permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques en ciblant la colonisation bactérienne
Procédures
Chaque geste technique dure quelques secondes et est réalisé par un personnel formé. Des prélèvementsde sang sont réalisés à différent temps sous anesthésie gazeuse . Un gavage est réalisé sur souris vigiles jeunes.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables liés au développement tumoral et à l'infection sont attendu L’expérimentateur contrôlera quotidiennement le comportement général de l’animal durant toute la durée de l’expérimentation (de la naissance à la mise à la mort, soit de J-36 (naissance) à J65 (mise à mort), J0 étant le jour de gavage). Une baisse d’activité, de locomotion, une perte de poil, une posture voutée, une anémie (pattes blanches) et un amaigrissement sont attendus. Au niveau digestif, l’expérimentateur pourra également observer des phases de diarrhée ou de constipation, un hyper toilettage anal ou à l’inverse un orifice souillé, du sang dans les selles et un prolapsus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort
Remplacement
L’expérimentation animale est indispensable pour ce projet car il n’existe pas de méthodes alternatives pour évaluer les effets de la colonisation bactérienne sur le développement tumoral. Il n'existe aucuns modèles d'infections chroniques sur cellules.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure ou cela ne compromet pas les objectifs du projet. En effet, des expérimentations antérieures réalisées au laboratoire ont mis en évidence une forte variabilité du modèle, de la colonisation bactérienne post gavage et de son maintien au cours du temps. Néanmoins, suite à une meilleure connaissance du modèle et à une formation interne du personnel à la technique de gavage, le nombre d’animaux par lot a été réduit au minimum. Le nombre de 8 souris par lot permettra donc d’analyser statistiquement les résultats de colonisation bactérienne, de perméabilité intestinale et le développement tumoral observées dans les différents lots. Toutefois, si l’analyse statistique suivant la première manipulation permet de réduire le nombre d’animaux, nous prendrons, bien entendu, ces résultats en compte pour définir l’effectif des manipulations suivantes.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien être des animaux, plusieurs mesures spécifiques seront prises. Tout d’abord un suivi renforcé des animaux. L’expérimentateur contrôlera quotidiennement la présence d’eau / de nourriture et observera le comportement général de l’animal (activité, locomotion, état du poil, prostration, vocalise, sang, anémie…etc). Cela permettra de repérer d’éventuelle anomalies comportementales et de traiter rapidement tous signes de douleurs par des antalgiques fort, utilisés dans le traitement des douleurs cancéreuses. Enfin, si les douleurs ne sont pas soulagées par les antalgiques, une mise à mort anticipées de l'animale sera réalisée. L'évaluation de la douleur sera réalisée grâce à un système de score et le suivi des animaux sera réalisé par une personne formée en interne et désignée compétente au suivi de ce modèle murin prédisposé à développer des tumeurs.
Choix des espèces
Nous avons choisi de travailler en modèle murin car la physiologie intestinale reste similaire à celle de l’homme. En effet, ce modèle animal présente plusieurs avantages pour l’étude du développement tumoral : -La mutation du gène est retrouvée dans 80% des cancers colorectaux chez l’homme -Les souris développent spontanément des tumeurs au niveau ducôlon -Il est représentatif des relations entre cellules tumorales et cellules de l’environnement tumoral -Il s’agit du modèle le plus proche de la physiologie humaine et le plus représentatif de l’interaction entre microbiote et tube digestif. Également, ce modèle nous a déjà permis de conclure de manière satisfaisante sur les questions scientifiques dans un contexte de cancer colorectal. De plus, nos animaleries sont adaptées à la prise en charge de ce type d’animaux. Le matériel utilisé est conforme aux règles du bien-être animal (cages, enrichissements, température, cycle jour/nuit) et le personnel a suivi une formation adaptée à la gestion et à la prise en charge de ces animaux. L’étude sera réalisée chez les souris femelles adultes. Les animaux seront gavés à l'âge de 6semaines (20-25 g). L’objectif est de réaliser l’expérience sur des animaux adultes et suffisamment jeunes puisque la durée totale de l’expérimentation est estimée à 50 jours
Développement d’un candidat vaccin contre les virus transmis par les moustiques EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 590 souris sont utilisées dans cet établissement, l'un des deux du projet, dont 935 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Injections de la cible vaccinale, saignées répétées des veines mandibulaire et saphène, ponctions cardiaques au terme de l'immunisation, exposition à des moustiques infectés : toutes sont tuées à l'issue. Le porteur annonce un vaccin universel protégeant contre plusieurs flavivirus, tout en situant le projet au stade de l'optimisation du protocole d'immunisation. Sur le remplacement, il écrit que "le modèle animal est incontournable" et qu'aucun autre modèle ne permet ce test, après avoir produit ses données préliminaires in vitro.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.
Procédures
Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.
Devenir
A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.
Raffinement
Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.
Développement d’un candidat vaccin contre les virus transmis par les moustiques EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Immunisées à J0 puis à J14, saignées par la veine mandibulaire ou saphène tous les deux jours pendant quatorze jours, 1 590 souris sont ensuite exposées sous anesthésie à des moustiques porteurs de flavivirus, trente minutes par séance. Le protocole en déclare 655 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère et 935 un niveau modéré, avec perte de poids, fièvre, troubles neurologiques et comportement anormal liés à l'infection. Une partie est saignée par ponction cardiaque sous anesthésie pour récupérer le sérum. Toutes sont tuées, à la fin des expériences ou plus tôt si la souffrance devient sévère.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de développer une nouvelle stratégie de vaccination contre tous les flavivirus. Les flavivirus sont un groupe de virus transmis par les moustiques et causant différents types de symptômes pouvant entraîner la mort. La stratégie consiste à inhiber la transmission de ces virus lors d’une piqûre de moustique. L’avantage de cette nouvelle stratégie est qu’elle sera universelle et pourra protéger contre plusieurs maladies causées par plusieurs flavivirus avec un seul vaccin. Le projet se déroulera dans 2 EU.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme sont : i) la caractérisation d'un candidat vaccin contre plusieurs maladies transmises par les moustiques, ii) une augmentation de la compréhension fondamentale de l’infection lors d’une piqûre de moustique. A long terme, les résultats permettront le développement d’un vaccin à large spectre contre plusieurs maladies à fort potentiel épidémique dans le monde et en Europe. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de centaines de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique des maladies transmises par les moustiques.
Procédures
Dans la procédure 1 (P1), nous optimiserons l’immunisation contre la cible vaccinale. Nous injecterons les souris avec la cible vaccinale à 0 et 14j et ferons des prélèvements sanguins à 0, 14 et 28j au niveau des veines mandibulaire/saphène par alternance. Les injections et prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P2, nous testerons l’effet de l’immunisation contre la cible vaccinale sur l’infection par piqûre de moustiques infectés. Les souris seront injectées avec la cible vaccinale comme dans la P1, puis exposées aux moustiques infectés sous anesthésie générale. L’exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30 min. Nous effectuerons ensuite des prélèvements sanguins tous les 2j par les veines mandibulaire/saphène par alternance pendant 14j. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans la P3, nous collecterons le sérum de souris immuniser pour identifier les antigènes (Ag) de la cible vaccinale. Après immunisation comme dans la P1, le sang des souris sera collecté par ponction cardiaque sous anesthésie générale à 14j après la dernière immunisation. La ponction cardiaque sous anesthésie durera 10 min. Dans la P4, nous déterminerons si la protection contre l’infection est liée aux anticorps. Nous collecterons le sérum de souris immunisées comme dans la P3 par ponction cardiaque. La ponction cardiaque sous anesthésie générale durera 10 min. Nous injecterons ensuite le sérum dans des souris, exposerons les souris anesthésiées à la piqûre de moustiques infectés, et collecterons le sang des souris par ponction des veine mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pour évaluer l’infection pendant 14j. L’exposition aux moustiques durera moins de 30 min. Les prélèvements sanguins sous anesthésie dureront quelques min. Dans la P5, nous testerons les différents Ag identifiés dans la P3. Nous injecterons les souris avec chacun des Ag comme dans la P1. Nous exposerons ensuite les souris aux moustiques infectés sous anesthésie, et réaliseront des prélèvements sanguins par ponction des veines mandibulaire/saphène par alternance tous les 2j pendant 14j. L'injection des Ag durera quelques min. L'exposition aux moustiques sous anesthésie durera moins de 30min. Les prélèvements sanguins dureront quelques min. Dans l’EU2 seront réalisées les protocoles d’injection d’Ag et le prélèvement avant infection. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur animaux infectés.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection de la cible vaccinale, des antigènes et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendu aux points de piqûres des moustiques. Perte de poids, mobilité réduite ou inactivité, mauvais état corporel, fièvre, stress, comportement anormal, troubles neurologiques, liés à l’infection.
Devenir
A la fin des expériences ou lors d’une souffrance sévère, les souris seront mises à mort sous anesthésie.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. Aucun model autre que le modèle animal ne permet de tester l’effet de l’immunisation sur l’infection par exposition à une piqûre de moustique infectés. Néanmoins, nous avons générés les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles in vitro.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous optimiserons le protocole de vaccination et ne reproduiront que le protocole optimisé dans les autres expériences.
Raffinement
Les souris seront maintenues 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements en alternance, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. L’eau et la nourriture seront à volonté. Elles seront manipulées de façon à réduire au maximum le stress, la douleur et la souffrance. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Nous utiliserons des coussins chauffant pour maintenir la température des souris anesthésiées. Un contrôle régulier, toutes les 15 min, sera effectué pour déceler toute possible anomalie liée à la narcose : suivi des grandes fonctions et dessèchement de la cornée (nous ajouterons du gel ophtalmique pour palier au dessèchement de la cornée). En dehors des expériences, le suivi des animaux s’effectuera chaque jour. Les animaux seront transportés entre les EU dans leur cage en couvrant la cage d’un tissu opaque pour ne pas stresser les animaux.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris de type sauvage avec un système immunitaire complet. Notre projet vise à étudier la réponse immunitaire et nécessite un modèle animal avec une immunité fonctionnelle. Nous avons déjà validé et établie les conditions pour infecter ces souris par piqûre de moustique. Nous allons utiliser des sujets adultes de 6 à 8 semaines, qui ont une taille corporelle et un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate et une piqûre par plusieurs moustiques simultanément.
Suivi longitudinal à long terme d’une espèce de mammifère sociale : la marmotte Alpine
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
Piégées au sol, transportées dans un sac, puis anesthésiées de dix à trente minutes, 650 marmottes alpines subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À la première capture de leur vie, elles reçoivent un transpondeur et des marques auriculaires et subissent un prélèvement de peau, puis chaque année des prélèvements de poils, de sang et, pour les mâles matures, de sperme obtenu par électrostimulation en dix à vingt minutes. Le porteur signale un risque d'hyperthermie potentiellement fatale quand un animal reste piégé trop longtemps par forte chaleur, sur un site où aucun arbre ne fait de l'ombre, et le compense par des ombrelles posées sur les cages et de l'eau versée sur l'animal. Toutes sont relâchées près de leur terrier après environ deux heures, avec le risque, pour une marmotte dominante trop longtemps absente, qu'un rival ait pris son territoire et tué les marmottons.
Objectifs
Les suivis à long-termes de populations d’animaux sauvages constituent aujourd’hui une ressource scientifique précieuse pour répondre à de nombreuses questions concernant l’écologie et la biologie évolutive. L’objectif du présent programme de recherche est la perpétuation d’un suivi démographique, phénotypique, génétique, physiologique d’une population de marmotte Alpine (Marmota marmota). La marmotte Alpine est une espèce sociale, à reproduction despotique (seul le couple dominant se reproduit) et hibernante. Ces caractéristiques biologiques en font une espèce modèle originale pour les mammifères et, de manière plus générale, pour les espèces qui vivent en groupes structurés et stables. Nous souhaitons mieux comprendre le rôle de la vie en groupe et de la socialité sur l’écologie des populations et de mettre en évidence la manière dont la variabilité environnementale (par exemple les changements globaux) affecte le rapport coût – bénéfice de la vie en groupe. Nous étudierons également les variations de la sex-ratio des jeunes en réponses aux changements globaux. Cela passe notamment par une quantification de la variabilité inter- et intra-individuelle de la proportion relative de spermatozoïdes avec un chromosome Y versus X.
Bénéfices attendus
Nous testerons l’hypothèse que les changements climatiques ont des répercussions majeures sur la socialité des individus, qui deviennent en quelque sorte plus égoïstes, en préférant quitter le groupe de naissance que de rester et aider à l’élevage des marmottons frères et sœurs. Les résultats attendus auront des implications pour les autres espèces sociales, y compris l’homme face aux changements globaux. Enfin, déjà fragilisée par le changement climatique, la marmotte Alpine est chassée à l’automne dans certains départements du sud-est de la France. La chasse à la marmotte semble assez marginale, mais les effets négatifs du changement climatique pourraient pousser nos décideurs politiques à en interdire la pratique. Notre projet apportera une meilleure compréhension du rôle des pères dans l’allocation selon les sexes en comparant la proportion de spermatozoïdes avec un chromosome X versus Y. La recherche sur l’allocation selon les sexes s'est concentrée jusqu’ici presque exclusivement sur le rôle de la mère alors que les parents peuvent avoir des intérêts divergents. Quelques études récentes ont montré une proportion déséquilibrée des chromosomes sexuels X et Y dans les échantillons de sperme de bovins domestiques et dans les populations humaines affectées par des polluants, ce qui rend difficile l’extrapolation des résultats à des populations sauvages comme la marmotte alpine. L’importance du rôle des pères reste à démontrer, mais ses multiples implications potentielles pour l’évolution de l’allocation selon les sexes et les conflits parentaux invitent à un surcroît d’attention.
Procédures
L’ensemble de ces prélèvements est réalisé après induction d’une anesthésie générale (~ de10 à 30 minutes): - Prélèvements de tissu cutané, injection d’un transpondeur et pose de marques auriculaires lors de la première capture dans la vie de l’animal (10 minutes) ; - Prélèvements de poils à chaque première capture de l’année (1 minute) ; - Prélèvements sanguins à chaque première capture de l’année (de 1 à 5 minutes) ; - Prélèvement de sperme chez les mâles sexuellement matures à chaque première capture de l’année (de 10 à 20 minutes) ;
Impact sur les animaux
Les principales sources de nuisance identifiées pour les marmottes sont (i) les risques de blessures superficielles, de traumatologie et le stress thermique causé par la capture (phase d’attente dans le piège puis transfert dans le sac de transport) ; La marmotte étant une espèce thermosensible avec une thermorégulation comportementale marquée (refuge dans le terrier), il existe un risque d’hyperthermie potentiellement fatal lorsqu’un animal reste piégé pendant trop longtemps lors des épisodes de forte chaleur (note : il n’y a aucun arbre sur le site d’étude). (ii) douleur et stress lors des mesures biométriques et lors des prélèvements biologiques ; (iii) le risque de déstructuration sociale par la prise de pouvoir sur un territoire par des rivaux lors de la capture d’un individu dominant. Un changement de dominance par un animal transient ou d’un territoire voisin, change la composition du groupe et induit souvent un infanticide des marmottons.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie et relâchés dans leur milieu de vie après la procédure à proximité immédiate du terrier où ils ont été capturés.
Remplacement
Notre programme de recherche sur la marmotte Alpine repose en grande partie sur l’étude des réponses individuelles et populationnelles aux variations des conditions environnementales d’origine diverse (ex : climat, phénologie de la végétation, socialité). Ces réponses sont étudiées aux niveaux comportemental, physiologique et démographique. Notre étude s’inscrit dans la lignée des suivis à long termes en écologie évolutive qui repose sur le suivi le plus long et plus exhaustif des individus au cours de leur vie en milieu naturel. Les populations de marmottes en captivité (par exemple en zoo) ne constituent pas une alternative pertinente à l’utilisation de populations sauvages lorsqu’il s’agit d’étudier le rôle de l’environnement sur la démographie et les processus évolutifs. Il n’existe donc, par essence, aucune méthode substitutive à notre protocole de recherche. Notre protocole a été réfléchi de sorte que toutes les quantités de tissus prélevées soient utilisées pour répondre à nos problématiques de recherche. Toutefois, si certains échantillons s’avéraient non utilisés (en particulier les échantillons de sperme pour lesquels nous ne pouvons pas anticiper de manière précise la quantité que nous allons collecter), les échantillons supplémentaires seront mis à disposition de notre réseau de collaboration et participent ainsi à du “remplacement” pour des projets futurs.
Réduction
Chaque année, 30 familles de marmottes Alpines sont suivies, correspondant ainsi à environ à 250 individus capturés. Ce nombre de 30 est le nombre minimal permettant d’approximer la distribution réelle de traits quantifiés dans la population par la loi normale et ainsi utiliser les outils statistiques appropriés. D’autre part, étant donnée les forts effets structurant de l’âge dans les paramètres démographiques des espèces à longue durée de vie, la description de la dynamique des populations nécessite des tailles d’échantillon substantielles d’animaux d’âge connu (donc suivis de la naissance à la mort) afin d’estimer les paramètres démographiques (survie, reproduction, dispersion). Le suivi longitudinal des animaux nous permet d’avoir des mesures répétées pour les individus et contribue ainsi à limiter le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats interprétables et fiables.
Raffinement
Nous réduisons les risques d’hyperthermie en plaçant des « ombrelles » sur le dessus des cages à pièges qui recouvrent environ la moitié de leur longueur, offrant une zone ombragée pour l’animal le temps qu’un membre de l’équipe arrive sur place. Des bouteilles d’eau sont prévues pour arroser légèrement l’animal pendant le transport quand la température de l’air est 27°C, et une vérification des pièges est faite systématiquement toutes les 30 minutes de 07:00 à 21:30, une plage horaire qui couvre l’activité journalière des marmottes. Le stress lié à la manipulation et à la contention est atténué car les animaux sont anesthésiés avant que les prises de mesures, d’échantillonnage des tissus et le marquage débutent. Les manipulations sous anesthésie sont effectuées dans un local réservé à cet effet par du personnel qualifié et le plus silencieusement possible. La durée totale entre la capture et le relâcher est en moyenne de 2 heures incluant 20 minutes de contention et de manipulation en dehors du sac de capture, mais il existe une forte variabilité individuelle dans le temps de réveil. Un temps de réveil long est risqué pour un dominant car pendant son absence un animal transient ou voisin peut tenter de prendre le contrôle de son territoire en tuant notamment les marmottons. Bien que nous limitions ce risque en plaçant un effaroucheur ou une personne sur le territoire le temps de la manipulation, cela n’est pas optimal en termes de dérangement. Ainsi en 2024, nous prévoyons d’expérimenter un nouveau protocole d’anesthésie dans le but de réduire le temps de réveil des individus et d’induire une analgésie plus puissante. Une analgésie plus puissante est mise en place pour les mâles sexuellement matures afin de limiter les possibles douleurs associées à l’électrostimulation dont la mise en place est prévue en 2024. Les protocoles d’anesthésie et d’électrostimulation seront optimisés en fonction des réponses des marmottes aux protocoles initialement définis. Nous envisageons aussi des protocoles alternatifs, comme la collecte de sperme par pharmo-induction si l’électrostimulation s’avérait trop inconfortable pour les animaux.
Choix des espèces
La marmotte Alpine (Marmota marmota) est une espèce particulièrement pertinente pour l’étude de la socialité (élevage coopératif, groupes sociaux hiérarchiques et stables), et représente un modèle biologique pour nombre d’espèces de mammifères sociaux. Sa structure sociale est bien décrite, et son comportement de territorialité et sa longévité (jusqu’à 16 ans) facilitent grandement le suivi des compositions de groupe et de leur dynamique temporelle. Ces caractéristiques biologiques permettent donc d’appréhender en détails la façon dont la vie en groupes sociaux affecte les traits d’histoire de vie et comment la socialité contraint les stratégies biodémographiques des espèces. Grâce à ce projet, nous disposons d’un jeu de données biodémographiques conséquent à l’échelle individuelle (30 ans de suivis) ainsi qu’une connaissance de nombreux facteurs environnementaux (météorologie, pathogènes…). Le recours à des populations captives ne permettrait pas de répondre aux objectifs de nos projets. Tous les stades de développement sont concernés par l’étude. La marmotte Alpine étant particulièrement longévive (longévité maximale observée sur le site de 16 ans), il est impératif de prendre en compte la structure d’âge de la population, et donc de connaître l’âge exact des animaux. A notre connaissance, la seule méthode fiable à disposition est de marquer les individus au stade juvénile (marmottons c’est-à-dire les jeunes de l’année), seule classe d’âge pouvant être déterminée à l’année près avec certitude. Ensuite, le statut social des marmottes est une variable capitale structurante les traits d’histoire de vie (conditionnant l’accès à la reproduction, la dispersion, et le taux de mortalité des individus) mais qui changent rapidement au cours d’une saison et d’une année à l’autre – ce n’est pas une variable fixe propre à chacun. Nous devons alors capturer les animaux tout au cours de leur vie pour être en mesure de décrire leur histoire de vie correctement.
SARS-CoV-2 : histoire naturelle de l’infection, essais d’efficacité de traitements et de vaccins sur hamster doré
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Tués à l'issue au motif du risque lié à un agent pathogène de groupe III, 1 000 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le SARS-CoV-2 par voie nasale sous anesthésie gazeuse, puis des traitements ou des vaccins administrés sur animal vigile, et jusqu'à trois prélèvements de sang au sinus rétro-orbital. Le porteur décrit l'infection comme une perte de poids transitoire d'environ 10 %, que l'animal contrôle au bout d'une semaine, et présente le hamster doré comme un modèle des formes non sévères de la COVID-19. La mise à mort de la totalité des animaux est acquise dès le départ, quelle que soit leur récupération.
Objectifs
Depuis fin 2020, la COVID-19 évolue par vagues épidémiques et l’émergence de variants préoccupants de SARS-CoV-2 requiert dans l’urgence de nouvelles données scientifiques. Dans ce contexte, l’apport de la recherche utilisant des espèces animales modèles est essentiel à la gestion de la crise sanitaire. De nouveaux besoins urgents de recherche sont apparus en lien avec l’apparition de formes symptomatiques longues de la maladie et l’émergence des variants préoccupants du SARS-CoV-2. Le présent projet a pour objectifs (i) l’étude de la physiopathologie des infections à SARS-CoV-2 et ses variants et ce, principalement, au niveau de l’épithélium respiratoire du hamster Syrien modèle de la COVID-19, (ii) une meilleure compréhension de la diffusion et de la multiplication du SARS-CoV-2 et ses variants dans les tissus (immunité croisée, transmissibilité, réinfection) et (iii) l’évaluation de vaccins, et d’approches thérapeutiques adaptés à l’évolution épidémiologique des infections à SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
L’étude chez le hamster des infections à SARS-CoV-2 et des stratégies de prévention et/ou de contrôle est déterminante pour l’élaboration de stratégie de lutte contre la pandémie de COVID-19. Ce projet s’inscrit dans une démarche de sciences appliquées au domaine médical en lien avec les déclarations d’intérêt, d’urgence ou de priorité nationale du gouvernement et des organismes publics de recherche.
Procédures
L’inoculation de la souche virale est réalisée par voie nasale sous anesthésie gazeuse. Les traitements (thérapeutiques ou vaccinaux) sont administrés par différentes voies à l’animal vigile par des manipulateurs expérimentés. Ces manipulations durent quelques secondes. Le traitement par voie nasale est administré sous anesthésie. Des analyses sérologiques seront réalisées au cours des essais vaccinaux. Les prélèvements sanguins nécessaires pour ces analyses seront réalisés au sinus rétro-orbital sur animal anesthésié avec ajout d’un collyre anesthésique. Ces prélèvements effectués par un manipulateur expérimenté durent quelques secondes. Un maximum de 3 prélèvements sanguins sont prévus sur les animaux sur toute la durée du protocole.
Impact sur les animaux
Dans les conditions expérimentales les plus défavorables, l’infection du hamster doré par le SARS-CoV-2 se traduit par une perte de poids transitoire d’environ 10%. L’animal infecté contrôle l’expression pulmonaire de la maladie au bout du septième jour de l’infection et retrouve son poids d’origine vers le 10ème jour.
Devenir
La mise à mort des animaux est requise au regard de la gestion du risque d’exposition de l’agent pathogène de groupe III utilisé dans cette procédure.
Remplacement
L’étude de la physiopathologie de l’infection et de l’efficacité vaccinale ne peut être menée sans avoir recours à l’administration de l’agent pathogène à l’animal vivant. En revanche, les stratégies thérapeutiques sont validées préalablement sur des modèles d’infection utilisant des lignées cellulaires appropriées. L’effet du traitement antiviral sur la multiplication du SARS-CoV-2 ainsi que son innocuité sont ainsi entérinés par des analyses in vitro. Les essais vaccinaux et thérapeutiques sont ensuite réalisés chez l’animal dans les meilleures conditions possibles afin d’évaluer l’efficacité du traitement.
Réduction
Les modèles d’infection à SARS-CoV-2 chez le hamster sont maîtrisés depuis 2020 au laboratoire. Nous disposons d’un protocole d’administration de souches virales présentant des conditions de répétabilité et reproductibilité satisfaisantes qui nous permettent de réduire nos études à des groupes de 6 animaux pour atteindre une significativité statistique.
Raffinement
Nous nous sommes employés à définir les conditions optimales d’hébergement des hamsters dorés. L’observation du comportement du hamster, d’une part, et l’adaptation des méthodes d’anesthésie, de contention et des gestes techniques à l’animal, d’autre part, garantissent une bonne prise en compte du principe de raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation une semaine avant les expérimentations. Les hamsters sont hébergés par deux dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Une grille de points limites est établie afin de limiter la douleur des animaux.
Choix des espèces
Le hamster doré est naturellement sensible aux infections à SARS-CoV-2, quel que soit le variant, et représente un modèle de choix pour étudier les formes non sévères de la COVID-19. Ce modèle restitue naturellement la physiopathologie humaine de la COVID-19. Les signes cliniques sont transitoires (perte de poids modérée et hyposmie/anosmie), l’animal contrôlant naturellement l’infection au bout d’une semaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes mâles ou femelles. Ils sont sensibles à l’infection SARS-CoV-2 et ne développent pas de symptômes graves.
Effet d’un régime hyperénergétique sur la dysfonction mitochondriale des cellules épithéliales intestinales chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Quatre-vingt-quatre gavages, un par jour pendant douze semaines, pour 96 des souris de ce projet. 432 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 96 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 336 un niveau modéré. 264 subissent un test de tolérance au glucose, gavage d'une solution sucrée puis sept piqûres de la veine de la queue étalées sur deux heures, répété jusqu'à trois fois, pour mesurer l'effet d'un régime riche en gras sur les défenses de l'intestin grêle. Le porteur fixe le seuil de mise à mort à une perte de poids supérieure à 20 % en une semaine.
Objectifs
Le surpoids et l’obésité sont des conditions de santé induisant une inflammation faible mais chronique à l’origine de maladies comme le diabète de type 2 ou certains types de cancer. Ces maladies auraient comme origine des modifications des capacités de défense de l’intestin liées à une alimentation trop riche en gras ou en sucre. Dans une étude précédente, il a été démontré chez la souris qu’une alimentation riche en gras induisait un certain nombre d’altérations au niveau de l’intestin grêle. Le présent projet se situe dans la continuité de cette étude, en cherchant à mieux caractériser l’origine de ces altérations d’une part et les moyens de les réduire d’autre part. Le microbiote intestinal est central dans le maintien des fonctions de défense de l’intestin. Il a récemment été montré qu’un microbiote altéré était retrouvé dans l’intestin grêle d’individus en situation de surpoids ou d’obésité. Cependant, aucun lien entre cette modification du microbiote de l’intestin grêle et les altérations des défenses intestinales que nous avons observées n’a été encore établi. De plus, l’étude précédente n’a pas caractérisé l’effet à long-terme de ces altérations des défenses intestinales, même après retour à un régime normal. En effet, les recommandations de santé suggèrent une perte de poids via des mesures hygiéno-diététiques afin d’améliorer l’état de santé. Cependant, il n’a pas encore été démontré à ce jour l’impact fonctionnel d’une perte de poids liée à un changement de régime alimentaire sur les fonctions de défense de l’intestin. Enfin, nos données in vitro ont montré des effets prometteurs d’une molécule extraite d’algues sur certains aspects des altérations des défenses intestinales liées à un excès de graisse. Cette molécule pourrait donc être un moyen simple de prévenir les altérations de l’intestin. Cependant une validation in vivo reste à montrer. Les objectifs de ce projet sont donc triples : une première partie du projet concernera l’étude du rôle du microbiote de l’intestin grêle dans les altérations de l’intestin induites par un régime riche en lipides, une deuxième partie s’attachera à caractériser l’effet à long-terme des modifications des défenses intestinales induites par un régime riche en gras lors d’une perte de poids et la troisième partie visera à évaluer les effets de la molécule extraite des algues sur l’apparition des altérations intestinales et les maladies associées à l’obésité.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans le cadre du développement des connaissances sur la physiopathalogie des maladies associées à l’obésité et au surpoids, problèmes de santé publique majeurs puisque près de 50% de la population française est maintenant en surpoids ou obèse. Notamment, une connaissance accrue sur le microbiote de l’intestin grêle permettrait de cibler des probiotiques ou prébiotiques à proposer à des personnes souffrant de surpoids ou d’obésité afin de restaurer la fonction intestinale. De même, connaître l’effet à long-terme de l’obésité sur l’intestin et les conséquences métaboliques qui en découlent contribuera à évaluer la capacité de l’intestin à revenir à un état fonctionnel optimal après arrêt du régime riche en gras. Enfin, les connaissances sur les effets de l’extrait d’algue sur l’intestin pourront contribuer au développement de composés nutraceutiques permettant de prévenir l’apparition des troubles métaboliques associés à l’obésité et au surpoids.
Procédures
Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, une seule fois ou 3 fois par animal. Un gavage intra-gastrique avec une solution de glucose sera réalisé. Cette intervention prendra de 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée de l’intervention (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s’étaleront sur deux heures. 264 souris seront concernées par cette intervention. Un gavage (solution de fucoxanthine ou de PBS) quotidien pendant 12 semaines sera mené sur des animaux vigiles, ce qui représente 84 interventions par souris. Le gavage prendra de 10 à 15 secondes par animal. 96 souris sont concernées.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables qui pourraient survenir durant cette étude sont : 1) Du stress et de la douleur lors des tests de tolérance au glucose nécessitant une étape de gavage et une ponction de la veine caudale à l’aide d’une aiguille pour prélever du sang. 2) La perte de poids prévue durant l’une des procédures du projet est inévitable car elle fait partie des objectifs de la procédure, mais cela ne devrait pas entrainer d’effet indésirables chez les animaux. 3) Du stress lors des gavages quotidiens des souris avec la molécule extraite d’algue ou une solution saline. Les autres procédures ne devraient pas entrainer d’autres souffrances ni d’angoisse.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet.
Remplacement
Dans ce projet, nous cherchons à évaluer les interations entre l’alimentation, le microbiote et l’intestin, ainsi que les impacts sur le métabolisme de l’individu. Ces interactions sont, à l’heure actuelle, impossibles à modéliser in vitro ou in silico. Le recours à des animaux nous parait donc nécessaire pour intégrer l'ensemble des données sur la composition du microbiote intestinal et/ou l’ensemble des données biologiques obtenues in vivo (poids corporel, test de tolerance au glucose) ou à partir des tissus prélevés chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris par groupe (n=24, 12 femelles et 12 mâles) a été déterminé afin de pouvoir comparer les paramètres étudiés soit à l’aide de tests paramétriques si la distribution des données le permet, soit de tests non paramétriques le cas échéant. Ce nombre a été calculé à partir de la variabilité des paramètres étudiés, notamment de la fonction mitochondriale (données issues d’une étude précédente au laboratoire) ainsi que la variabilité éventuelle entre les sexes.
Raffinement
Les souris seront logées en groupe de 4 par sexe, dans des cages enrichies offrant des zones où elles pourront se dissimuler. De même, les souris seront habituées au gavage et à la contention avant le test de tolérance au glucose ou d’administration de la molécule extraite d’algue ou de solution saline. Les souris seront pesées régulièrement, et elles seront toutes observées chaque jour afin de prévenir la survenue d’un potentiel problème. Des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur (crème anesthésiante avant ponction de la veine caudale, analgésique avant le prélèvement intra-cardiaque). De même, une anesthésie à l’isoflurane et une analgésie seront pratiquées avant le prélèvement sanguin intracardiaque suivi de l’euthanasie des souris. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués, comme la perte de poids >20% du poids sur une semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur l'obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une reproductibilité des résultats. L'abondance des données dans la littérature sur ce modèle permet le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles, évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). De même, les précédentes études menées au laboratoire sur ce modèle souris nous permettent de disposer de nombreuses données et méthodes (notamment en ce qui concerne les méthodes d’analyse à partir des tissus prélevés) qui serviront dans ce projet. Nous avons choisi de travailler sur des animaux en croissance de 6 semaines d'âge afin de travailler sur des animaux adultes ayant un microbiote stabilisé.