Recherche fondamentale

Les souris de ce projet portent une mutation qui les prive de dystrophine et ont été croisées avec des lignées immunodéficientes pour qu'elles acceptent des cellules humaines sans les rejeter. 665 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une irradiation locale sous anesthésie de vingt et une minutes au maximum, une injection d'agent de régénération dans le muscle tibial antérieur, puis une injection de cellules humaines au même endroit, une partie passant en plus quarante-cinq minutes en imagerie. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer un œdème, une pelade ou des ulcérations gênant les mouvements, et justifie la mise à mort de toutes les souris un mois après la greffe par la "nécessité" de retirer entièrement les muscles injectés.

Objectifs

L’objectif du projet est de comparer l’efficacité de la greffe de différents types de cellules dans la régénération musculaire, ce qui permettra ultérieurement de choisir le meilleur candidat pour de futurs essais cliniques dans le domaine des myopathies. Ce projet répondra à des questions scientifiques et représente en même temps une recherche pré-clinique. La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Le projet comporte deux étapes : la première consiste à mettre au point et standardiser la meilleure procédure expérimentale adaptée à nos modèles à l’aide d’études pilotes basées sur l’expérience antérieure et la bibliographie, et la seconde consiste à tester l’efficacité de différents types cellulaires. Pour faciliter le transfert à la clinique humaine, seules des cellules humaines seront utilisées, ce qui nécessitera l’utilisation d’animaux immunodéficients capables de tolérer ces greffes sans rejet immunologique. Ces animaux sont des souris modèles de la Dystrophie musculaire de Duchenne. Les explorations seront concentrées sur les muscles traités afin de classer l’efficacité des traitements étudiés. Les résultats permettront d’évaluer la faisabilité, d’affiner la logistique et d’orienter vers un projet clinique de plus grande ampleur.

Bénéfices attendus

La thérapie cellulaire est une approche thérapeutique possible des dystrophies musculaires. Sur le plan technique, une fois établi le "meilleur" candidat cellulaire il sera possible d’améliorer les paramètres de la greffe. Ces données permettront de mettre en place une nouvelle génération d’essais de thérapie cellulaire dans l’indication de la dystrophie musculaire de Duchenne, pour améliorer ou stabiliser la qualité de vie des patients. Les bénéfices de ce projet sont donc attendus dans le domaine scientifique fondamental et dans le domaine clinique. De plus, basé sur la mise en place d‘une plateforme collaborative, il bénéficiera à la communauté scientifique impliquée dans la thérapie cellulaire musculaire.

Procédures

L’ensemble des actes seront effectués sur des animaux modèles de dystrophies musculaires et immunodéficients. Une première partie des animaux servira à la mise au point de la dose d'irradiation optimale (étude pilote). Les animaux seront pesés et anesthésie afin de réaliser une irradiation à différentes doses (21 minutes maximum) suivi d’un maintien de deux semaines maximum. Une seconde partie des animaux sera utilisé pour la mise au point de la régénération musculaire (étude pilote). Les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de comparer l'efficacité de deux agents de régénération et de déterminer la dose minimale efficace, par injection localisée dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur). Cet acte est d’une durée de 5 minutes. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Enfin, une dernière partie des animaux sera impliqués dans des actes successifs après les étapes de mises au point préalable. Les animaux seront irradiés localement sous anesthésie générale (21 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection unique d’agent de régénération musculaire sous anesthésie et analgésie dans un muscle des pattes postérieures (Tibial antérieur) (5 minutes maximum), après 24h ils recevront une injection de cellules humaines sous anesthésie et analgésie au même site (5 minutes maximum). Si l’agent de régénération musculaire n’est pas toxique pour les cellules in vitro, une seule intervention d’injection sera réalisée le même jour. Un traitement antalgique sera maintenu durant les 3 jours suivants l’injection correspondant à la période de maintien des animaux. Une surveillance sera assurée quotidiennement. Après un mois d’observation, une partie des animaux de ce groupe seront analysés par imagerie (bioluminométrie) sous anesthésie après injection d’un agent produisant à l'émission des photons qui peuvent être quantifiés, et cet acte sera d’une durée de 45 minutes. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire après le temps de maintien défini (1 mois) en fonction des besoins pour prélèvements des muscles et leurs analyses.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés sont immunodéficients, ils peuvent donc être plus sensibles aux infections. Les animaux subiront une irradiation ce qui pourra induire une brûlure dans de rares car puis une perte progressive de masse musculaire vers 6-8mois (ce délai n'est pas atteint dans la procédure expérimentale). Certaines souches d'animaux immunodéficient sont plus sensibles à l'irradiation et pourront avoir un gonflement et un oedème de la peau, une pelade, ou des ulcérations, gênant les mouvements et pouvant générer de la douleur. L’anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire. Des injections intramusculaires seront réalisées ce qui peut engendrer une douleur de courte durée au point d'injection. La solution injectée pourra générer une inflammation dans les premiers jours et dans de rares cas une gêne de la mobilité.

Devenir

La décision d’euthanasier tous les animaux à l’issue de la procédure a été prise lors de la rédaction du projet par les concepteurs, car il est nécessaire de prélever les muscles injectés, et ceci ne peut être fait sans l'euthanasie des animaux. Les animaux ne peuvent être ré-utilisés, la procédure nécessite l’exérèse totale des muscles injectés, notamment afin d’étudier les capacités de migration des cellules injectées.

Remplacement

Le but du projet est d’évaluer la capacité régénérative musculaire de différents types de cellules pour développer une thérapie cellulaire dans l’espoir de soigner la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Au stade où les différents candidats cellulaires sont utilisés, ils ont déjà fait la preuve in vitro de leur capacité à fusionner et à former des petites fibres musculaires. Les modèles de cultures en deux dimensions ne représentent pas l’architecture musculaire ni les capacités contractiles et ne permettent pas de renseigner les déplacements des cellules injectées. Les modèles in-vitro de mini-muscle en trois dimensions qui existent ne renferment qu’un ou deux types cellulaires et aucun modèle pathologique complexe n’est encore développé. C’est pourquoi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable, car l’étude de la régénération doit prendre en compte l’environnement physiologique, les différents types cellulaires, les signaux et le micro-environnement d’un muscle qui influencent cette capacité régénérative, particulièrement dans un organisme malade. Les lignées de souris utilisées dans ce projet sont immunodéficientes et permettent la prise de greffe xénogénique (d’une espèce animale à une autre). Ainsi, le modèle peut être similaire à la DMD humaine.

Réduction

665 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études pilotes permettront d'optimiser les conditions et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Les animaux immunodéficients sont hébergés dans une pièce dédiée de statut sanitaire contrôlé, la nourriture et la litière sont irradiées et l’eau est osmosée. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris utilisée ici est un modèle classique de la dystrophie musculaire de Duchenne. Une mutation spontanée empêche l’expression de la dystrophine. Cet animal ne présente pas de signes cliniques avant un âge avancé (15-18 mois), ni de phénotype myopathique dommageable. Pour accepter les greffes de cellules humaines sans rejet immunologique, les souris ont été croisées avec des modèles immunodéficients. Ces modèles sont stabilisés et déjà existants. L’utilisation des modèles se justifie par leur différence de réactivité immunologique, et par des différences de susceptibilté à certains traitements musculaires. Les souris seront utilisées pour les greffes de cellules à l’âge de 3 à 5 mois. Dans ces modèles, un pic spontané de dégénérescence et régénération musculaire survient à l’âge de 3 à 10 semaines. Bien que la cause exacte de ce pic ne soit pas totalement élucidée, il s’agit probablement d’une mobilisation musculaire importante et nouvelle, qui coïncide avec la période du sevrage, le changement d’alimentation, l’acquisition d’une mobilité de plus en plus importante, la croissance des membres. Pour éviter les variabilités inter-animales liées à ce pic de remaniement musculaire, nous utiliserons des animaux ayant franchi ce cap, donc après l’âge de 3 mois. Par ailleurs, au-delà de 6 mois, certains animaux peuvent commencer à développer des anticorps susceptibles de permettre un rejet chronique des greffes, et c'est encore une variabilité que nous devons éviter. Les souris étant euthanasiées 1 mois après la transplantation cellulaire, soit au plus tard vers l’âge de 6 mois, nous pouvons réaliser les greffes dans une fenêtre d'âge de 3 à 5 mois.

Cinq injections en cinq jours, une castration chirurgicale trois mois plus tard, puis des prises de sang répétées de mois en mois : 300 souris mâles suivent ce protocole dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées deux mois après le début des expériences pour prélever leurs organes. Des lésions prostatiques leur sont d'abord provoquées par inactivation génique, avant de comparer trois régimes alimentaires dont une alimentation cétogène. Le porteur indique que les mesures de glycémie créent un inconfort et que la présence de sang dans la cage peut déclencher des comportements agressifs entre congénères, tout en affirmant n'avoir observé aucun inconfort majeur lors du suivi des lésions. L'allongement de la durée de vie des patients atteints d'un cancer de la prostate résistant à la castration reste annoncé au conditionnel.

Objectifs

L’objectif du projet de recherche translationnelle est d'explorer le rôle spécifique de l'alimentation, en particulier la restriction en glucides, dans la croissance des tumeurs des cancers résistants à l'hormonothérapie. En mettant l'accent sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents, nous aspirons à identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour surmonter la résistance à l'hormonothérapie, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives pour le traitement du cancer de la prostate.

Bénéfices attendus

Ce projet explore l'impact positif attendu de l'alimentation cétogène sur la progression tumorale et la résistance à la castration dans un modèle murin de cancer de la prostate. En s'appuyant sur les observations antérieures qui ont démontré les avantages de l'alimentation cétogène dans le cancer mammaire, et en dévoilant les mécanismes sousjacents, cette étude pourrait potentiellement ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le traitement de cette forme agressive de cancer de la prostate, et allonger la durée de vie des patients.

Procédures

Les souris subiront 5 injections sur 5 jours sur animal vigile sous contention (20 secondes de contention par injection), puis une intervention chirurgicale, sous anesthésie,3 mois plus tard durant environ 30 minutes. 6 prises de sang par test seront effectuées sur l'animal vigile pour quelques gouttes de sang (1 minutes maximum par prélèvement) à un intervalle de 1mois (3 tests sont prévus au total). 2 prélèvements sanguins de 5µL/g de souris vigile seront effectués, durant 1 minute au maximum.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements sanguins seront réalisés par des personnes agréées et compétentes, mais dans de rares cas peuvent conduite à une infection de la zone d'administration. L'orchidectomie (anesthésie et geste chirurgical) est une opération rapide qui est bien maitrisée au laboratoire. Après l'inactivation des gènes, l'évolution des lésions prostatiques sera monitorée mais d'après nos expériences, aucun inconfort majeur n'a été observé. Les mesures de glycémie peuvent entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité cellulaires associées à la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité souligne l'importance d'expérimentations in vivo pour élucider ce phénomène et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Les avancées notables en oncologie ont mis en lumière l'importance cruciale du microenvironnement tumoral dans le développement du cancer, avec ses interactions complexes impliquant le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. Ces mécanismes régulateurs et interactions cellulaires ne peuvent être pleinement compris qu'au sein d'un organisme vivant. Actuellement, l'évaluation des avantages potentiels d'une stratégie alimentaire in vitro demeure impossible, et il est impraticable pour les patients d'évaluer les bienfaits des régimes alimentaires en dehors de tout traitement conventionnel. Les progrès significatifs en oncologie ont largement découlé de l'utilisation de modèles animaux, soulignant leur importance. Les souris, partageant les mêmes protéines que l'homme, simplifient la génération des mutations couramment observées dans le cancer de la prostate humain. Ces similitudes permettront une étude approfondie de l'évolution des lésions prostatiques, favorisant ainsi le développement de traitement précoce. Un suivi bibliographique attentif évitera la redondance avec des travaux existants.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes alimentations pouvant favoriser ou retarder le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 300 animaux. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions. Afin d'obtenir des résultats significatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous étudierons 2 lignées de souris, une qui développe un cancer, souris dites « d’étude » et une qui n’en développe pas, souris dites « contrôles », il nous faut utiliser 40 souris par groupe pour les souris d’études (20 pour les analyses histologiques et 20 pour l'analyse moléculaire) ainsi que 10 souris par groupe pour les souris contrôle (5 pour les analyses histologiques et 5 pour l'analyse moléculaire). Nous avons 3 types d'alimentations, 2 procédures chirurgicales. En conclusion, il nous faudra 50*3*2 souris soit 300 souris afin de confirmer le ralentissement de la croissance tumorale avec l’alimentation cétogène. Nous comparerons l’effet de la castration par rapport au groupe contrôle ainsi que le changement alimentaire par rapport à l’alimentation standard. Nous utiliserons, dans une première analyse, des paramètres quantitatifs (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, poids des tumeurs, poids des animaux) et également qualitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique). Si la normalité le permet, nous analyserons les données plus finement en utilisant un test statistique.

Raffinement

L'expertise du laboratoire dans l'étude de l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et avec des points critiques étroitement surveillés. Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement. Les souris seront soumises à une anesthésie générale. En post-opératoire, une analgésie systématique sera administrée. Un suivi attentif de la zone d'incision sera effectué, comprenant la surveillance des points de suture, la palpation abdominale et l'inspection à la recherche de signes d'infection locale. En cas de manifestations douloureuses, l'administration d'analgésique pourra être répétée jusqu'à trois fois par jour. Si un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal sera réalisée. Pour préserver le bien-être social des animaux, des groupes de deux ou trois seront maintenus et les souris seront réintroduites dans leur cage respective avec leurs partenaires préalables, évitant ainsi toute situation d'isolement. De plus, une séparation entre les animaux castrés et ceux soumis à la procédure contrôle sera mise en place, afin de minimiser les risques de comportements dominants.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin récapitule de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. Ces souris nous permettront d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris auront le même fond génétique enrichi. Les souris mâles (étude du cancer de la prostate) utilisés seront adultes. A l'âge de 8 à 12 semaines (jeunes mâles pubères), nous induirons le développement de tumeurs. Puis, 3 mois plus tard (soit vers les 5 mois de la souris correspondant à un adulte), nous débutons les expériences (castration et changement alimentaire) avec les différents groupes expérimentaux. Nous mettrons à mort 2 mois après le début des expériences.

Six injections abdominales par jour pendant deux jours, puis six par jour un jour par semaine pendant quatre semaines, après quatre premières injections quotidiennes à l'âge de cinq semaines : 160 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces injections déclenchent les modifications génétiques et favorisent des lésions précancéreuses du pancréas, dont le porteur attend une légère perte de poids le lendemain de chaque séance. Les souriceaux sont tatoués à la base des phalanges et amputés de moins de 2 mm de queue pour le génotypage. Le modèle repose sur des souris génétiquement modifiées prédisposées à ces lésions, tuées avant le stade du cancer pour analyser ce qui le précède.

Objectifs

Les cellules acineuses du pancréas sécrètent des enzymes digestives transportées dans les canaux pancréatiques jusqu’au tube digestif pour la digestion des aliments. La grande majorité des cancers du pancréas sont initiés par la transformation de ces cellules, notamment via l’activation du gène KRAS connu pour favoriser les cancers. Une inflammation progressive du pancréas associée à une perte des cellules acineuses constituent la pancréatite chronique. Elle peut être causée par des calculs biliaires, l’alcool, le tabagisme et des facteurs génétiques, mais environ 20 % des cas de pancréatite chronique ont une cause inconnue. Ces modifications du tissu pancréatique sont des facteurs de risque de cancer du pancréas. Ce cancer, en constante augmentation, est un des plus agressifs (taux de survie à 5 ans inférieur à 8%), notamment parce qu’il est dans la majorité des cas diagnostiqué trop tardivement. Il est crucial de mieux comprendre les causes de la pancréatite chronique et les facteurs qui favorisent les étapes précoces du cancer du pancréas. Notre objectif est d’étudier le rôle d’un gène de prédisposition au développement du cancer du pancréas. Pour ce faire, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle des gènes et l’impact de leur inactivation sur le développement des lésions précancéreuses. Ceci a un intérêt pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ces modèles de souris sont nécessaires pour comprendre les causes de prédisposition et de progression des lésions pré-cancéreuses pancréatiques, ce qui a un intérêt pour le développement de stratégie de dépistage et de stratégie thérapeutique du cancer du pancréas.

Procédures

Les souriceaux sont marqués par tatouage à la base des phalanges et un prélèvement d’un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectué pour le génotypage, c'est à dire l'identification des modifications génétiques induites chez chaque animal. La manipulation est très rapide et n’induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise très rapidement à ce stade. Les souris sont traitées par injections au niveau de l’abdomen (1 fois par jour pendant 4 jours consécutifs à l’âge de 5 semaines, puis 4 semaines après elles sont injectées 6 fois par jour pendant 2 jours consécutifs, puis 6 fois par jour 1 jour par semaine pendant les 4 semaines suivantes. La nécessité de ce nombre d'injection a été établie par des travaux de mise au point validés dans différents laboratoires dans le monde). Ces injections servent à induire les modifications génétiques et à favoriser le développement des lésions pré-cancéreuses pour étudier les causes de leur initiation et de leur progression.

Impact sur les animaux

Les souris sont traitées par un certain nombre d’injections, au niveau de l’abdomen. Cela peut entrainer une légère perte de poids le jour suivant l’injection. Les souris vont développer des lésions microscopiques pré-cancéreuses au niveau du pancréas. Les souris seront euthanasiées précocement pour l’analyse de ces lésions avant le stade de cancer.

Devenir

Les animaux de la procédure sont euthanasiés pour des analyses effectuées sur le pancréas (visualisation et études de molécules) afin d’étudier les lésions précancéreuses.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être actuellement obtenues par d’autres méthodes compte-tenu de la complexité physiologique du développement des lésions précancéreuses, nous obligeant à travailler à l'échelle d'un organisme. Des études in vitro sur des cellules et des "mini-organes" en culture ou issus de prélèvements de lésions humaines sont également possibles en complément mais ne peuvent pas remplacer cette étude avec ce modèle physiologique. Les retombées de ce travail sont utiles du point de vue des implications thérapeutiques à terme chez l'homme.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal de souris, determiné par des résultats obtenus précédemment et dans les publications scientifiques pour ce type d’analyse, et qui permet d'obtenir des résultats statistiques permettant la validation de l'étude.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les souris sont placées dans des conditions optimales d'élevage, en portoirs ventilés. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant être isolés car ce sont des animaux grégaires. La température, l'hygrométrie, la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours. En plus de la litière, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi régulier de l'expérimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de différents éléments bien définis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'éviter toute souffrance des animaux. Nos analyses sont précoces et concernent les phases de lésions pré-cancéreuses. Les souris sont euthanasiées pour analyse avant de développer un cancer.

Choix des espèces

Les souris modifiées génétiquement sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques de pathologie humaine. L’objectif du projet est d’étudier le développement et l’évolutivité de lésions pré-cancéreuses pancréatiques grâce au modèle de souris et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Les souris seront utilisées à l’âge de 5 semaines car au tout début de l’âge adulte. On laisse les lésions pré-cancéreuses se développer dans ce modèle de souris jusqu’à l’âge de 4 mois (ce qui correspond à environ 1/4 de la durée de vie de la souris). Cela permet d’étudier l’impact de notre gène d’intérêt dans l’initiation et la progression de ces lésions précancéreuses.

1 136 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et, selon les protocoles, chacune peut recevoir une tumeur, deux administrations orales de matières fécales de souris, jusqu'à quatre traitements d'immunothérapie et une prise de sang par semaine. Certaines procédures ajoutent une chirurgie de cinq minutes sous anesthésie générale pour injecter un traceur qui suit la migration des cellules. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour l'analyse de leurs organes. L'équipe cherche à comprendre pourquoi une transplantation de microbiote fécal réussit ou échoue à lever la résistance des patients aux immunothérapies contre le cancer, avec un bénéfice renvoyé à plus tard, mieux choisir donneurs et patients, quand la douleur liée à la tumeur et une possible perte de poids sont prévues pour les souris.

Objectifs

Des précédentes études ont montré l'impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse immunitaire et la réponse aux traitements par immunothérapies contre le cancer. Il a d’abord été montré que la prise d’antibiotiques (ATB), en créant une dysbiose intestinale, est associée à une diminution de l’efficacité de ces immunothérapies dans de nombreux types de cancers. Puis, des compositions spécifiques du microbiote intestinale ont été mises en évidence comme étant associées à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies. Ensuite, des travaux sur des modèles de souris ont permis de démontrer que la transplantation de microbiote fécal (TMF) à partir de selles de patients répondeurs ou résistants aux immunothérapies conduisait à la réponse ou à la résistance aux immunothérapies chez ces souris, respectivement. Finalement, la transplantation de microbiote fécal chez les patients parait être une approche efficace pour contourner la résistance aux immunothérapies induite par une dysbiose intestinale. Malgré des résultats prometteurs en clinique, il est nécessaire de comprendre les mécanismes qui expliquent la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. L'objectif principal de ce projet est de décrire les effets de la transplantation de microbiote fécal sur le système immunitaire et son implication dans la réponse antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes expliquant la réussite ou l'échec de la transplantation de microbiote fécal à contourner la résistance aux immunothérapies. Cela permettra par la suite de mieux sélectionner les donneurs pour la transplantation, ainsi que de mieux sélectionner les patients pouvant recevoir la transplantation de microbiote fécal. De plus, ce projet apportera plus de compréhension sur les liens existants entre le microbiote intestinale, le cancer et la réponse aux immunothérapies. Enfin, par la compréhension des ces mécanismes, les patients ayant une dysbiose intestinale et résistants aux immunothérapies pourront bénéficier d'une tranplantation de microbiote fécal afin de contourner cette résistance.

Procédures

Les interventions prévues seront pour certaines procédures l'implantation d'une tumeur (une fois, d'une durée d'1 minute), l'administration orale de matières fécales murines (2 fois, durée 1 minute), l'administration de traitements d'immunothérapie (4 fois maximum, durée 1 minute), l'injection au niveau de la queue (une fois, durée 1 minute, anesthésie locale). De plus, il est prévu pour certaines procédures d'utiliser un traceur pour suivre la migration cellulaire, nécessitant une procédure chirurgicale, sous anesthésie générale, d'une durée de 5 minutes (une fois). Enfin, des prélèvements de sang seront réalisés, au maximum 1 fois par semaine (durée 5 minutes). Les injections seront réalisées sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures une douleur et une gêne modérée liée à l'implantation d'une tumeur, un inconfort lié à l'administration de matières fécales par voie orale au moment de l'administration, ainsi qu'une potentielle perte de poids liée à la tumeur, aux traitements et à l'administration des matières fécales.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure, afin de prélever les organes pour analyser les tissus, les cellules, doser des protéines ou de l'ADN.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale, intestinale et périphérique et l’effet de la transplantation de microbiote fécal sur l'immunité et la réponse antitumorale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles, dont certaines dites "GO-NO-GO", et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. Notre critère de jugement principal est le suivi de la croissance tumorale. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons défini un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Cela a permis de définir le nombre d'animaux nécessaire et suffisant pour observer l'effet recherché. L'analyse des résultats sera faite en utilisant des méthodes statistiques.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être : stabulation conventionnelle, régime alimentaire normal et de l’eau ad libitum, ainsi qu’un enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière quotidienne permettra le suivi clinique de la souris ainsi que de son comportement, permettant l’éventuelle mise en place de mesures d'analgésie. Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale. Les souris auront un examen clinique quotidien et des pesées régulières. Les points limites précoces seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. La génétique et l'immunotlogie sont proches de celle de l’Homme et bien connues. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques, la plus susceptible d’apporter les résultats satisfaisants pour nous au vu des objectifs du projet. Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des bactéries et de la transplantation de microbiote fécal sur l’immunité et la réponse antitumorale. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de 6-7 semaines de développement, les cancers cibles touchant l’adulte. De plus, à cette âge là, les animaux sont matures du point de vue immunologique.