Recherche fondamentale

Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.

Objectifs

Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.

Raffinement

Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.

Nées avec une mutation qui bloque la dégradation du céramide, les souris de ce projet ont une espérance de vie de 100 jours et développent dès trois semaines un retard de croissance, un gonflement du foie et de la rate et une faiblesse musculaire qui leur rend l'accès à la nourriture difficile. 1 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des vecteurs viraux censés apporter une copie fonctionnelle du gène ASAH1. Chaque mois, elles subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie au sinus rétro-orbital ou à la mandibule, une mesure de conduction nerveuse de vingt minutes et une heure trente d'observation de leur activité, avant un prélèvement terminal de muscles et une perfusion de fixateur par le flux sanguin. Les souris qui héritent de la mutation partent toutes en expérimentation puis sont tuées, celles qui n'en héritent pas sont mises à la reproduction pour entretenir l'élevage ou tuées faute d'usage.

Objectifs

La maladie de Farber et l’amyotrophie spinale associée à une forme d’épilepsie progressive myoclonique (SMA-PME) sont deux maladies génétiques rares causés par des mutations dans le gène ASAH1. Ce gène produit une enzyme appelée céramidase acide, qui décompose une substance appelée céramide dans les cellules. Lorsque ce gène est défectueux, l'enzyme ne fonctionne pas correctement, entraînant une accumulation toxique de céramide dans les cellules. Ces maladies affectent principalement le système nerveux et d'autres tissus du corps. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif pour ces maladies. Notre projet vise à développer une thérapie génique pour traiter le déficit en céramidase acide. Pour cela, nous utilisons de virus modifiés appelées AAV comme transporteurs pour introduire une version correcte du gène ASAH1 dans les cellules des patients. Nous avons testé cette thérapie chez des souris modèles représentant la maladie de Farber. Deux méthodes d'injection ont été explorées : l'injection dans tout le corps et l'injection directement dans le cerveau. Les deux méthodes ont montré une amélioration de la survie des souris et une correction des symptômes de la maladie. Cependant, l'utilisation de ce vecteur à des fortes doses peut provoquer des altérations dans certains tissus après injection dans tout le corps. Par conséquence, l'objectif actuel de notre projet est de tester de nouveaux virus AAV qui ciblent plus efficacement les cellules malades. Cela nous permettrait de réduire la dose nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique après injection dans tous les corps, minimisant ainsi les risques d'inflammation. Enfin, pour l’injection directe dans le cerveau il est important de confirmer si une telle méthode d’administration pourrait représenter une stratégie efficace pour traiter les formes du déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’investiguer sur des défauts tissulaires dû à la maladie pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients qui aujourd’hui n’existe pas. D’abord nous allons investiguer sur la présence ou non d’une atteinte au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Si cette hypothèse se révèle correcte, nous en tiendrons compte pour ajuster la conception des thérapies, y compris le choix du vecteur et la dose, afin de favoriser une distribution optimale du traitement. Par la suite, nous espérons choisir un vecteur AAV qui cible mieux les cellules affectées par la maladie. Cela nous permettrait d'utiliser une dose plus faible pour obtenir une correction complète, réduisant ainsi les coûts de production du produit et les effets secondaires liés aux doses élevées, comme observé lors des études précédentes. Enfin, nous aurons une vue plus claire sur l'efficacité de l'injection directe dans le cerveau comme méthode d’administration pour traiter les formes de déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Procédures

Le prélèvement d’un petit bout de queue (2/5 mm) sera effectué sur des souris à la naissance ou à 15 jours de vie (5sec). L’administration des vecteurs AAV sera réalisé par voie intraveineux (15sec si volume ≤100 µL/20g; jusqu’à 1min si volume ≤ 250µL/20g) et par voie intra-cérébro-ventriculaire (ICV) (15sec). Afin d’évaluer l’efficacité du traitement lors des études, des tests fonctionnels pourront être réalisés chez des animaux vigiles : évaluation de leur activité tous les mois pendant 1h30 et analyse de leur force musculaire toutes les semaines pendant 10min. La force spécifique d’un muscle sera étudié chez d’autres animaux anesthésiés pendant 1h15 par animal une seule fois lors de l’étude. L’analyse de la transmission électrique entre les nerfs et les muscles sera réalisée chez des animaux anesthésiés pendant 20min tous les mois lors de l’étude. Chaque mois afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, tous les animaux seront anesthésiés pendant moins de 5min pour réaliser un prélèvement de sanguin. En fin d’étude, des prélèvements de muscles (5min) ainsi que l’injection d’un fixateur par perfusion via le flux sanguin (5min) seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène Asah1 chez la souris entraîne une accumulation toxique de céramide dans plusieurs organes de l’animale en accord avec les manifestations cliniques aussi décrites chez l’homme. Les animaux ont une espérance de vie de 100 jours, avec des symptômes apparaissant dès 3 semaines de vie : retard de croissance, gonflement du foie et de la rate, et faiblesse musculaire généralisée, rendant les déplacements et l'accès à la nourriture difficiles. Le test d'échappement peut causer une légère nuisance avec un pincement de la queue, provoquant rarement un léger saignement. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Certaines souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les accouplements nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.

Remplacement

Le modèle murin utilisé dans ce projet est le premier modèle pertinent publié dans la littérature qui récapitule les symptômes retrouvés chez les patients affectés par la maladie de Farber. Des modèles in vitro 2D existent, mais ils ne permettent pas d’étudier certains défauts majeurs de la pathologie, tels que l'infiltration de cellules immunitaires dans les organes cibles de la maladie. Les modèles in vitro 3D (ou organoïdes) ne possèdent pas à ce jour toutes les structures anatomiques spécifiques de chaque organe. De plus, on ne peut pas reproduire exactement la biodistribution du vecteur après administration dans le corps entier, ce qui limiterait les informations collectées pendant les études pour la transposabilité des résultats vers des études précliniques. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques. Cela permet d’observer les différences entre les animaux sains et malades concernant la barrière hémato-encéphalique, d’étudier le potentiel thérapeutique de chaque vecteur testé et de maintenir les lignées tout au long du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies avec du coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Concernant les souris porteuses de la mutation pour le gène Asah1, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. De plus, un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès à la nourriture des souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis pour chaque procédure et manipulation. En cours du suivi du traitement, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire ou rétro-orbitale, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et le prélèvement sera au maximum du 10% de volume sanguin total de la souris. La méthode de prélèvement sanguin sera adaptée et réalisée au sinus rétro-orbital dans le cas où un processus de cicatrisation serait en cours (présence de croute, hématome, rougeur ou gonflement). L’œil sur lequel le prélèvement est effectué sera noté sur la fiche de suivi de l’animal afin de privilégier l’autre côté pour un prélèvement le mois suivant. Raffinement pour analyses fonctionnelles et prélèvement des muscles : afin de réaliser une mesure de force musculaire, l’animal recevra une injection d’analgésique en sous-cutanée, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles, et sera anesthésié par voie intrapéritonéale. L’animal sera également disposé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.

Choix des espèces

Pour évaluer des stratégies thérapeutiques contre le déficit en céramidase acide, le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène Asah1 a été choisi car il reproduit très fidèlement les symptômes de la maladie observées chez l’homme. Pour générer les animaux nécessaires à l’étude, les souris seront mises en reproduction entre l’âge de 8 semaines et 6 mois. Afin d’investiguer un défaut de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, les animaux contrôles et malades seront injectés à l’âge de 7 semaines et euthanasiés 8 jours après le traitement. À ce stade, la pathologie est suffisamment avancée pour déterminer si une altération existe et pour étudier les conséquences à court terme sur la capacité du vecteur à atteindre les régions touchées par la maladie. Lors de l’étude visant à identifier la combinaison vecteur-dose la plus efficace après injection via la veine de la queue, les souris seront traitées à l’âge de 7 semaines. Pour évaluer si l’injection directement dans le cerveau de vecteurs sélectionnés peut prévenir l’état inflammatoire dans le système nerveux central ainsi qu’au niveau des tissus périphériques pour les formes les plus sévères et précoces de la maladie, les animaux seront traités le jour de leur naissance.

Les souris seront tuées dès les premiers signes cliniques de l'infection, seuil qui fixe la limite de ce que le protocole les laisse endurer. 2 127 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans l'abdomen une injection de Toxoplasma gondii, avec des souches de type I que le porteur décrit comme conduisant systématiquement à la mort en l'absence de traitement, puis un gavage quotidien pendant sept jours et quatre séances d'imagerie sous anesthésie, avant dissection du cerveau pour compter les kystes. Le porteur teste des molécules déjà approuvées par l'agence américaine du médicament et situe les retombées possibles à moyen et long terme, aucun traitement n'existant à ce jour contre les formes persistantes.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet de recherche est double, visant à approfondir notre compréhension d'une maladie due à une infection par des parasites, et à développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans un premier volet, l'équipe se concentre sur l'identification et la caractérisation des des protéines sécrétées par les parasites lors de l'infection de la cellule hôte. L'objectif ultime est de déterminer le rôle de ces protéines dans le processus de virulence du parasite chez son hôte intermédiaire naturel, la souris. Ce volet comprend une analyse in vivo, en se penchant particulièrement sur la phase initiale de la maladie et la formation de kystes pendant la phase persistante de la maladie. Dans un second volet, le projet a pour objectif d'évaluer l'efficacité in vivo de composés antiparasitaires, préalablement sélectionnés parmi des molécules approuvées par la "U.S. Food and Drug Administration" (FDA, fda.gov). La FDA veille à ce que des médicaments sûrs et efficaces soient disponibles pour améliorer la santé de la population des États-Unis. Ces composés sont donc déjà utilisés dans le traitement de différentes maladies, garantissant leur non-toxicité chez l'humain. L'objectif est de comparer leur efficacité à la sulfadiazine, un médicament antiparasitaire utilisé actuellement en clinique, tout en confirmant in vivo leur cible moléculaire. Notez que ce projet se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (nommés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche présente des avantages significatifs sur plusieurs aspects. Tout d'abord, il vise à répondre à des questions fondamentales sur les infections causées par les parasites, en éclairant le rôle des protéines sécrétées dans la virulence et le processus infectieux. À moyen terme, ces réponses permettront de mieux comprendre le dialogue établi entre le parasite et son hôte ainsi que les mécanismes permettant le contrôle de l'infection, guidant ainsi le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En ce qui concerne le deuxième volet, l'évaluation in vivo des composés antiparasitaires présente un intérêt majeur. À long terme, si ces composés s'avèrent efficaces, cela pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans le traitement contre les infections parasitaires, offrant des alternatives potentielles aux traitements actuels, tout en minimisant les effets secondaires. Il est important de souligner ici qu'il n'existe jusqu'à présent aucun traitement contre les formes persistantes d’infections parasitaires. Une fois établis, les kystes persistent théoriquement pendant toute la durée de vie de l'hôte. Pour information, il est estimé que 30% de la population mondiale est infectée par un parasite. En somme, ce projet offre une approche globale, alliant une compréhension approfondie des mécanismes d'infection à des solutions thérapeutiques novatrices. Les connaissances générées et les avancées thérapeutiques potentielles contribueront à la lutte contre les maladies parasitaires, avec des implications positives pour la santé publique à moyen et long terme.

Procédures

Lors de ce projet, les interventions sur les animaux vivants seront de trois types : (i) Les injections au niveau abdominal (1 par expérience et par souris, durée du geste : quelques secondes) des parasites dans le but de déclencher l'infection parasitaire avec une charge parasitaire contrôlée. Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU1. (ii) Traitement des animaux par administration par voie orale des composés à l'aide de sondes de gavage adaptées à la souris (1 gavage par jour pendant 7 jours consécutifs et par souris, durée du geste : quelques secondes à chaque gavage). Cette étape sera réalisée dans les Etablissements Utilisateurs EU1 et EU2. (iii) Pour les expériences d'imagerie in vivo, les animaux sont anesthésiés et le produit luminescent est injectée dans l’abdomen des animaux (4 fois par souris à J0, J2, J5, et J7, durée du geste : quelques minutes chaque jour). Cette étape sera réalisée dans l’Etablissement Utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les infections parasitaires peuvent est caractérisées par deux phases distinctes : la première phase de l’infection, qui correspond à la phase de dissémination des parasites dans les différents organes de l'hôte (la souris ou l’homme). Celle-ci peut être mortelle chez la souris comme chez l'homme si elle n'est pas contenue et contrôlée par le système immunitaire. Les souches de type I sont particulièrement virulentes chez les souris de laboratoire et conduisent systématiquement à la mort des animaux infectés en l'absence de traitement. Les souches de type II, non-virulentes, induisent une première infection légère, conduisant systématiquement à une infection parasitaire persistante sans symptômes. Cette phase correspond à l'étape où la multiplication des parasites est contenue par le système immunitaire de l'hôte, et seuls les parasites capables de s'enkyster dans les muscles et le cerveau vont survivre. Cette étape se met en place plus tardivement, et les kystes vont persister pendant toute la durée de vie de l'hôte.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser des prélèvements sur les animaux morts tels que le prélèvement du sang dans le but de détecter la présence d’une réaction immunitaire contre le parasite et la dissection du cerveau pour la détection et la quantification des parasites sous forme de kystes dans le cerveau des animaux.

Remplacement

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Des études préliminaires réalisées in vitro en culture cellulaire nous ont permis d’identifier spécifiquement des gènes (24 gènes candidats) du parasite codant pour des protéines du parasite sécrétées dans la cellule infectée et ayant donc un rôle potentiel dans le contrôle de la virulence chez l’animal. De même, que des études de biochimie ont permis de montrer que ces protéines s’associent avec des protéines de la cellule hôte confirmant leur rôle potentiel dans la régulation des interactions hôte-parasite. Il est donc essentiel de pouvoir réaliser des expériences chez la souris afin de déterminer l’importance de ces gènes dans le contrôle de la virulence, ainsi que dans la capacité des parasites à persister chez l’animal sous forme de kystes (infection persistante). En effet, aucune autre approche alternative in vitro ou de culture cellulaire ne permet de répondre à ces questions. Le modèle murin d’étude des maladies parasitaires est communément utilisé par la communauté scientifique. En effet, la souris constitue un hôte intermédiaire naturel et privilégié étant donné que le cycle sexué du parasite s’effectue exclusivement chez les félidés en tant qu’hôte définitif, après ingestion de proies infectées. Contrairement aux études in vitro de culture cellulaire, la souris permet l’étude de l’infection parasitaire avec la formation de kystes dans les tissus. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides" : L'activité antiparasitaire des composés (27) a été déterminée à travers des tests effectués sur des cellules in vitro. Il est maintenant essentiel de tester ces composés in vivo chez la souris afin de confirmer leur activité parasiticide chez un mammifère. En effet, des essais cliniques chez l'homme ne seront envisageables que si des études précliniques chez l'animal ont été réalisées.

Réduction

Volet "étude des protéines sécrétées par les parasites" : Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, 3 souches mutantes différentes seront testées en parallèle d’une souche sauvage parentale de référence. Par exemple, les souches mutantes de type I seront comparées entre elles et à la souche sauvage de référence de type I. Idem pour les souches parasitaires de type II. Concernant les souches de type I (virulentes), une première lignée des souris seront d’abord testées. Si une atténuation de virulence est observée, l’analyse sera poursuivie sur lignée différente de souris. Ces dernières étant plus sensibles, cette expérience permettra d'évaluer la robustesse de l’atténuation de virulence. Si aucun effet du mutant n’est observé sur la virulence avec la première lignée de souris, l’expérience ne sera pas poursuivie sur la deuxième lignée de souris, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Volet "évaluation de l'efficacité de composés parasiticides dans les phases initiale et persistante de l’infection parasitaire" : La première expérience sera conduite avec 2 à 3 animaux par condition à tester (totalisant 13 souris pour cette première expérience). L'objectif est d'assurer une efficacité totale des composés, et les expériences subséquentes ne seront menées que si la survie atteint 100% parmi les souris traitées avec les composés testés lors de cette première expérience. Si les composés se révèlent seulement partiellement efficaces, le protocole ne sera pas poursuivi. De plus, les contrôles sont mutualisés puisque les trois composés sont testés simultanément. En cas de réussite, les expériences ultérieures seront menées avec 2 à 5 animaux par condition à tester.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un établissement utilisateur agréé par du personnel formé. Les souris seront maintenues en groupes autant que possible, dans des cages offrant un enrichissement du milieu de vie, et leur bien-être sera régulièrement contrôlé. Les animaux seront logés dans un environnement contrôlé, exempt de germes dangereux pour les animaux, afin d'éviter toute infection supplémentaire pouvant biaiser l'interprétation des résultats obtenus. Dès le début de chaque expérience, les souris sont observées 3 fois par semaine jusqu'à l'apparition des symptômes, puis quotidiennement (jusqu'à deux fois par jour) jusqu’à la fin de la procédure expérimentale et elles seront euthanasiées dès l'apparition des premiers signes cliniques dû à l’infection parasitaire, avec le point limite défini dans ce document. Les composés testés, non toxiques, seront mis en solution selon une formulation préalablement déterminée. Pour l'expérience d'imagerie in vivo réalisée dans une autre animalerie, les animaux seront transportés dans des conditions optimisées afin de limiter le stress lié au transport.

Choix des espèces

Le modèle murin utilisé pour étudier les infections parasitaires est largement adopté par la communauté scientifique. La souris, en tant qu'hôte intermédiaire naturel du parasite, offre un cadre privilégié, car le cycle sexué du parasite se produit exclusivement chez les félidés, en tant qu'hôtes définitifs, après l'ingestion de proies infectées. Les souris développent ainsi une infection parasitaire avec une réponse immunitaire comparable à celle observée chez l'homme. Les souches de souris utilisées présentent des niveaux de sensibilité variables aux parasites. Il est donc pertinent d'explorer le potentiel rôle des effecteurs parasitaires dans la virulence des différents types de parasites (Type I virulent et Type II non-virulent), ainsi que chez des souris présentant divers niveaux de sensibilité à cette infection. De plus, les modèles murins sont particulièrement adaptés pour étudier l'efficacité de composés antiparasitaires, car les souris peuvent reproduire les différentes phases de l’infection, tant infection initiale que persistante. Seules des expériences in vivo, réalisées sur des modèles murins, permettront de confirmer l'efficacité de ces composés au cours des différentes phase de l’infection parasitaire, et de répondre à la question cruciale : représentent-ils de véritables candidats médicaments ? Par conséquent, les expériences seront réalisées sur de jeunes adultes, car le système immunitaire doit être mature afin de pouvoir répondre à l’infection parasitaire.

Une tumeur hypophysaire est implantée par chirurgie stéréotaxique dans le crâne de chaque rat, avec une canule d'injection laissée en place pendant les soixante jours du protocole. 60 rats Wistar Furth vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils développent des symptômes d'hypertension intracrânienne quand la tumeur devient volumineuse, ressentent une gêne de type démangeaison à cause de la canule, et sont tués au soixantième jour pour peser les tumeurs et chercher des métastases par autopsie cérébrale. Le porteur qualifie cette chirurgie de "peu douloureuse" et les injections intratumorales de "non douloureux", en faisant valoir que les mêmes gestes se pratiquent chez l'être humain sous simple anesthésie locale.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet des analogues de la somatostatine sur le contrôle des tumeurs hypophysaires sécrétant l’hormone de croissance en fonction de la voie d’administration du traitement (voie orale versus traitement local intratumoral) afin de s’affranchir de l’obstacle que représente la barrière hémato-encéphalique

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse de travail selon laquelle les analogues de la somatostatine donnés comme traitement des tumeurs hypophysaires sont relativement peu efficaces à cause de leur incapacité à pénétrer dans l'hypophyse à cause de la barrière hémato-encéphalique, les résultats de notre projet pourraient ouvrir la voie au développement d'une technique chirurgicale visant à délivrer la médicament directement dans la tumeur résiduelle et à améliorer les taux de guérison de ces patients. de guérison des adénomes somatotropes.

Procédures

Les animaux seront initialement soumis à une procédure chirurgicale (stéréotaxie) peu douloureuse (sous anesthésie générale gazeuse). A titre de comparaison, ces chirurgies stéréotaxiques sont réalisées sous anesthésie locale pure chez l'homme en pratique clinique courante en France. Les autres procédures comporteront des prises de sang bi-mensuelles (sous anesthésie générale gazeuse) ainsi que des injections bi-hebdomadaires sur la canule d'injection prévue à cet effet (non douloureux, mais anesthésie générale gazeuse de < 1 minute envisageable en cas d'angoisse de l'animal). Au total, chaque animal ne subira qu'une seule procédure chirurgicale initiale pour implanter la tumeur (20 minutes de chirurgie sous anesthésie générale), puis 3 prises de sang à 15 jours d'intervalle (10 minutes sous anesthésie générale).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux sont principalement en lien avec les symptômes d'hypertension intracrâniennen lorsque les tumeurs deviennent trop volumineuses. Aussi, les animaux peuvent ressentir une gêne à type de démangeaison en raison de la canule intratumoral qui restera en place pendant toute la durée de l'expérimentation. Enfin, les injections hebdomadaires peuvent être source d'anxiété chez les animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure, après 60 jours, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tumeurs hypophysaires obtenue pour les peser et les analyser sur le plan moléculaire. Aussi, une autopsie cérébrale sera réalisée à la recherche de métastases à distance.

Remplacement

L’utilisation de modèle animaux pour l’étude du développement tumoral dans son microenvironnement habituel est indispensable. L’effet de la somatostatine administré par voie systémique sur ces tumeurs est connu mais son effet après administration directement dans la tumeur n’est pas connu. Bien que les propriétés de la barrière hémato-encéphalique soient largement connues, il est indispensable de confirmer notre hypothèse dans un modèle préclinique avant d’envisager toute nouvelle procédure chez l’homme. Actuellement il n’existe pas de modèle préclinique non-animal fiable de cette barrière hémato-encéphalique.

Réduction

L'évaluation de l'effet des médicaments selon la voie d'administration nécessite de comparer le médicament à la fois à un placebo mais aussi à sa voie d'administration systémique habituelle (sous-cutanée) ce qui nécessite au moins 3 groupes. Idéalement, il serait utile de tester la voie d'administration en placebo la molécule et la voie d'administration, soit 4 groupes d'animaux. Néanmoins, on peut s'affranchir d'un groupe d'animaux si tous les animaux recoivent une injection locale et une injection sous-cutanée (de placebo ou de médicament), permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux en n'utilisant pas de 4ème groupe. D'un point de vue statistique, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique à partir des différences de survie moyenne observées entre les groupes d'animaux dans notre précédente étude de survie des animaux de notre modèle expérimental en fonction de leur exposition à un médicament anti-tumoral. Le nombre d'animaux nécessaire est estimé statistiquement à 19 par groupes. Le geste technique d'insertion d'une canule d'injection intra-sellaire étant nouveau, 3 rats supplémentaires semblent nécessaires à l'optimisation de la technique opératoire. Le nombre total d'animaux nécessaire s'élève donc à 60 animaux (19 par groupe + 3 de mise au point).

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par deux minimum dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre les points limites. Les animaux ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie et celle-ci sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Toute procédure pouvant engendrer une douleur (prise de sang, injection) sera également effectuée sous anesthésie générale gazeuse. Tous les animaux seront opérés et surveillés par les membres de l’équipe qui a mis au point le modèle expérimental de tumeur hypophysaire orthotopique, sont habitués à ces procédures et à la reconnaissance précoce des points limites des animaux. Les points limites surveillés par l'équipe sont les suivants : hérissement du poil, isolement, aggressivité, ralentissement, inconfort. En cas d'apparition d'un de ces signes clinique, une fiche individuelle sera réalisée de manière quotidienne et ous les animaux qui présentent un score supérieur ou égal à 6/10 seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le choix d'un modèle animal de rat repose l'absence d'autre modèle expérimental préclinique de tumeur hypophysaire orthotopique. En effet, des modèles d'adénomes hypoophysaires obtenues par modifications génétiques chez la souris ne permettent ni d'étudier ces maladies dans un contexte immunologique physiologique, ni d'étudier des pathologies hypophysaires sécrétantes, ces modèles se limitant à des adénomes non-sécrétant. De plus, les adénomes hypophysaires chez l'homme sont sporadiques dans plus de 95% des cas et les modèles génétiques ne correspondent donc qu'à de rares situations cliniques chez l'homme. Le choix de cette souche spécifique de rats (Wistar Furth) est en lien avec la seule lignée cellulaire immortalisée de cellules hypophysaires somatotropes (GC) qui provient de cette souche de rat. Plusieurs tentatives de reproduction de norte modèle dans des souches plus courantes (Wistar Wi et Han) ont été réalisées, sans succès. Les procédures expérimentales débuteront entre 8 et 12 semaines après leur naissance, âge qui correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d’obtenir un environnement ostreogénique favorable au développement des tumeurs.

Pour observer en temps réel l'activité des neurones du cortex préfrontal pendant un apprentissage associatif, 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'une heure pour injection virale et implantation de fibres optiques, et 150 d'entre elles une seconde chirurgie quelques semaines plus tard pour implanter un miniscope sur le crâne. Le porteur signale le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et de perte de poids inhérent à ces interventions, l'hypothermie et les troubles respiratoires liés aux deux anesthésies, et la contrainte posturale que représente le port permanent d'un appareil d'imagerie sur la tête. Sur la réduction, il décrit une conception expérimentale soigneuse et des études pilotes, sans donner un seul effectif par groupe ni justifier le chiffre de 260.

Objectifs

La mémoire est la clé de notre existence. Les mécanismes fondamentaux de la mémoire ont été étudié depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention sur le cerveau a été possibles. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet est de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères. Pour mener ces études, nous souhaitons étudier, en temps réel, l’activité des neurones du cortex préfrontal impliqués dans une tâche d’apprentissage associatif. Nous analyserons, ensuite, l’activité associé aux différentes phases de la tâche, ainsi que la réactivation de ces neurones dans les jours qui suivent la séance d’apprentissage.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

- Procédure 1 :10 animaux; L’ensemble de ces animaux subiront une chirurgie pour infection virale avec implantation de fibres optiques 1h de chirugie en totale maximum. Cette procédure à pour but de mettre en place et optimiser le protocole utiliser pour soit campari2 ou cal-light. - Procédure 2: 100 animaux,les mémes étapes que la procédure vont se dérouler que la promiére procédure. - Procédure 3 :150 animaux, Une implantation de miniscope va se faire aprés quelques semaines de la premiére chirugie (implantation de fibre +injection virale) afin de permettre un minimum de rétablissement .

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro et des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Dans une optique de réduction, nous avons également prévu des études pilotes permettant l’évaluation de la faisabilité technique de certains aspects de notre étude. Nous avons également intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure dès leur obtention. Cela nous offrira, si nécessaire, la flexibilité de réduire le nombre d'individus requis pour atteindre nos objectifs scientifiques, tout en garantissant la validité et la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation.iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'un gel oculaire pour éviter le dessèchement des yeux et d'un tapis chauffant (avec sonde rectale) pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. Formation spécialisée de l'expérimentateur. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie : administration de sérum physiologique, nourriture humide placée sur le sol de la cage. v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation d'un tube de transfert. viii) Habituation à la salle de comportement. ix) Hébergement en binôme jusqu'à l'implantation de la lentille. Utilisation d'une double enrichissement. Pendant la période d'utilisation des séparateurs, les souris bénéficieront également d'une séance d'exploration "supervisée" de 45 minutes par jour. x) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que le NC3R, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, les modèles génétiques murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions pathologique. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.