Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de la capacité régénérative de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Gavées chaque jour pendant deux semaines, puis recevant une injection destinée à provoquer une lésion de l'intestin, 480 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées en fin de protocole pour analyse des tissus. Les dommages intestinaux entraînent diarrhées, inflammation, douleurs, déshydratation et perte de poids pendant cinq jours au plus, et le porteur signale qu'un mauvais positionnement de la sonde de gavage peut provoquer une détresse respiratoire imposant une mise à mort immédiate. L'objectif est d'observer la capacité de régénération de l'intestin chez des souris porteuses d'une hypercalcémie d'origine génétique, et de voir si une molécule en développement l'améliore. Ni la substance qui provoque la lésion ni celle administrée par voie orale ne sont nommées, et aucun seuil de mise à mort n'est chiffré pour un projet classé sévère.
Objectifs
Le maintien de l’équilibre du calcium dans l’organisme repose sur une régulation hormonale finement contrôlée principalement par le calcitriol, la forme active de la vitamine D. Une augmentation anormale des niveaux de calcitriol dans le sang peut conduire à des pathologies rares, chez l’enfant comme chez l’adulte, caractérisées par une accumulation excessive de calcium et de calcitriol dans l’organisme, communément nommée hypercalcémie liée à des excès de vitamine D. L’une des causes génétiques identifiées dans ces hypercalcémies est la perte de fonction du gène qui code une enzyme indispensable à la dégradation du calcitriol. En l’absence de cette dégradation, le calcitriol s’accumule, induisant une absorption excessive du calcium. Des études préliminaires conduites dans notre laboratoire ont montré que les souris génétiquement modifiées permettant l’inactivation sélective de cette enzyme, reproduisent fidèlement le phénotype des patients comportant une hypercalcémie marquée. Nous avons identifié que ces souris présentent également des anomalies au niveau des cellules souches intestinales, essentielles au renouvellement régulier du tissu. En cas de lésion intestinale sévère, ces cellules entrent dans un programme de régénération qui va permettre de réparer le tissu. Pour étudier les mécanismes de réparation tissulaire dans un contexte pathologique lié à des excès de calcitriol et de calcium, nous utiliserons une substance permettant d’induire une lésion transitoire dans l’intestin, afin d’observer la capacité de régénération du tissu chez ces souris. En parallèle, une partie des souris seront injectée préalablement avec une molécule thérapeutique qui améliore grandement la pathologie, actuellement en cours de développement, pour déterminer si le processus de régénération de l’intestin est amélioré grâce à cette molécule.
Bénéfices attendus
Ces études permettront d’étudier le potentiel des cellules souches intestinales dans un contexte d’hypercalcémie liée à des excès de vitamine D, et de comprendre des activités encore peu connues de la vitamine D. De plus, à terme, ce projet pourrait contribuer à l'identification d'un potentiel traitement pour les maladies liées à des excès de calcitriol.
Procédures
Pendant deux semaines, les animaux recevront chaque jour une petite quantité d’une substance, administrée par la bouche. Cette substance a pour but d’améliorer l’hypercalcémie liée à des excès de vitamine D. Ces administrations sont courtes et généralement bien supportées par les animaux. À l’issue de ces 2 semaines, une injection sera réalisée afin d’induire une liaison intestinale. Sur l’ensemble du projet, 480 souris seront nécessaires. Toutes les manipulations seront effectuées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect du bien-être animal. Si, malgré ces précautions, un animal présentait des complications ou des signes de souffrance (ce qui reste exceptionnel), il serait immédiatement retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée afin d’éviter toute souffrance inutile.
Impact sur les animaux
L’induction des dommages intestinaux peuvent conduire à des diarrhées, de l’inflammation des douleurs, une déshydratation et une perte de poids de l’animal. Ce traitement durera un maximum de 5 jours. Les injections peuvent exceptionnellement causer des infections au niveau du site d’injection. L’administration par la bouche peut rarement conduire à une irritation. Le gavage peut amener à des erreurs de manipulation due à un mauvais positionnement de la sonde qui peut mener à une détresse respiratoire nécessitant une euthanasie immédiate. Les différentes administrations de traitement pourront éventuellement générer un stress chez l'animal ainsi qu'une douleur au niveau du site d'administration. Ces gestes sont effectués par un personnel compétent et formé mais dans de rares cas peuvent conduire à une infection de la zone d'administration.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses de l'expression des gènes et des protéines).
Remplacement
Pour étudier comment l’intestin se répare dans certaines maladies liées à un excès de vitamine D et de calcium, il est nécessaire d’observer l’ensemble de l’organisme. En effet, plusieurs organes (comme les reins, le système immunitaire ou les os) interagissent entre eux et influencent ce processus. Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de manière fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’utilisation d’un animal vivant est donc indispensable pour comprendre ces mécanismes dans des conditions proches de la réalité. La souris est un modèle de référence en recherche, car son fonctionnement biologique et la structure de son intestin sont très proches de ceux de l’être humain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est strictement limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les méthodes employées sont bien maîtrisées par l’équipe, ce qui permet de mener des expériences de qualité sans multiplier les animaux. Chaque souris sera utilisée pour plusieurs analyses, afin d’éviter toute utilisation inutile. Les résultats étant comparables chez les mâles et les femelles, les données pourront être regroupées. Les groupes seront toutefois composés à parts égales de mâles et de femelles afin de garantir un bon équilibre. Ainsi, seuls les animaux indispensables à la validité scientifique de l’étude seront inclus.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, dans des cages adaptées et enrichies pour favoriser leur bien-être. Elles seront surveillées régulièrement, notamment par l’observation de leur comportement et le suivi de leur poids. Si un animal présente des signes de déshydratation ou de malaise, des soins adaptés seront immédiatement mis en place. Les manipulations (administration des traitements) seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec des techniques conçues pour réduire au maximum l’inconfort et le stress. Si un animal montre des signes clairs de souffrance, il sera retiré de l’étude et pris en charge sans délai afin d’éviter toute douleur inutile.
Choix des espèces
La régulation du calcium et de la vitamine D fait intervenir plusieurs organes et différents types de cellules. De même, la réparation de l’intestin est un mécanisme complexe qui ne peut pas être étudié correctement avec des cellules isolées. La souris est particulièrement adaptée à ce type de recherche, car elle réagit aux traitements de manière comparable à l’être humain. Elle permet également l’utilisation de techniques génétiques avancées, indispensables pour comprendre le rôle de certains gènes. L’étude porte sur des animaux adultes. Les souris recevront un traitement à partir de l’âge de 8 semaines, puis une injection unique à 10 semaines afin de déclencher un phénomène contrôlé de régénération intestinale, qui sera ensuite analysé.
Cibler la néovascularisation cornéenne : développement d’un traitement innovant à base de de peptidomimétiques topiques (modèle murin).
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 180 souris albinos vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une chirurgie de quinze minutes provoque sur un œil une néovascularisation de la cornée, dont le porteur indique qu'elle peut aller d'une vision floue à une perte totale de la vision pendant quatorze jours au plus, puis des collyres sont instillés deux fois par jour et l'œil est imagé sous anesthésie générale pendant quarante-cinq minutes. Des tests de cinq minutes doivent évaluer la douleur et l'inconfort oculaires, sans que le porteur précise lesquels, et l'objectif est de mettre au point un traitement en collyre qui éviterait aux malades les injections dans la cornée. Il affirme qu'aucun modèle ex vivo, in vitro ou in silico ne reproduit la formation de ces vaisseaux, et conclut que l'expérimentation animale est "indispensable" et le modèle rongeur "la seule approche scientifiquement valable".
Objectifs
La néovascularisation pathologique de la cornée est une affection grave causée par le développement anormal de vaisseaux sanguins dans la cornée, et présentant un risque important de perte rapide et irréversible de la vision. Malgré les progrès réalisés, qui ont permis le développement de thérapies, les options pour traiter la néovascularisation cornéenne restent limitées. L'administration topique de médicaments existants, dont la pénétration cornéenne est limitée, n'est efficace qu'à des doses qui risquent d'endommager la structure cornéenne. Il est donc important de développer des traitements topiques efficaces afin de traiter convenablement la néovascularisation cornéenne. Dans ce projet, notre objectif est de développer un agent administré par voie topique et capable d’inhiber le développement de vaisseaux sanguins dans la cornée (néovascularisation cornéenne pathologique), sans recourir à des procédures invasives ni induire d’effets indésirables sur la structure cornéenne. Nous évaluerons l’efficacité de plusieurs composés à l’aide de deux modèles murins de néovascularisation cornéenne qui reproduisent fidèlement les manifestations cliniques observées chez l’homme. Nous suivrons l’évolution de la néovascularisation cornéenne chez des souris sur plusieurs jours après instillation des différents composés. Une analyse détaillée de la cornée sera effectuée afin d’identifier et de confirmer l’effet des molécules testées, grâce à plusieurs tests d’imagerie. L’objectif principal du projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouvelles molécules administrées directement par voie topique, ainsi que d’analyser la réponse inflammatoire associée à la néovascularisation cornéenne.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est de développer une série de molécules anti-angiogénique pour une administration topique visant à traiter la néovascularisation cornéenne pathologique, une affection grave causée par le développement de néovaisseaux dans la cornée et présentant un risque important de perte rapide et irréversible de la vision. En effet, la néovascularisation cornéenne est la deuxième cause de perte de vision, touchant plus de 1,4 millions de personnes chaque année dans le monde. Nos résultats contribueront à la recherche fondamentale et pourront être adaptés à des ligands peptidiques ciblant d'autres domaines thérapeutiques. Nous souhaiterions améliorer le traitement de la néovascularisation cornéenne pathologique en évitant les injections dans le stroma cornéen ou l'espace sous-conjonctival. Cela constituera un avantage décisif pour la santé et une amélioration du confort des patients, avec une meilleure acceptabilité du traitement et moins d'effets secondaires.
Procédures
Les chirurgies seront effectuées une seule fois par animal sous anesthésie générale et injection d’analgésique, à raison de 15 minutes par animal. L’instillation sera effectuée deux fois par jour, par animal, sur différentes durées chez des souris naïves et dans des modèles de néovascularisation cornéenne. L’instillation sera effectuée sur animal vigile, à raison d’une seule minute par animal. Les tests de comportement, qui permettront d’évaluer la douleur et l’inconfort oculaires, seront effectués chez les souris naïves et les modèles de néovascularisation cornéenne instillées avec les composés, à raison de cinq minutes par animal. Les examens d’imagerie in vivo, qui permettront de prendre des images de la cornée et de suivre l’évolution de la néovascularisation cornéenne, seront effectués chez les souris naïves et les modèles de néovascularisation cornéenne instillées avec les composés, à raison de quarante-cinq minutes par animal. Ils seront effectués sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Les injections peuvent provoquer un stress transitoire. Les procédures d’imagerie, qui nécessitent une anesthésie générale, présentent un faible risque d’irritation de la surface oculaire. L’induction d’une néovascularisation cornéenne entraînera une diminution de la qualité visuelle, pouvant aller d’une vision floue à une perte totale de la vision. Cette atteinte unilatérale sera toutefois limitée à un seul œil tout en restant limité dans le temps maximum 14 jours, l’œil controlatéral restant intact. Les procédures sur la cornée sont susceptibles de provoquer des douleurs.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem étant nécessaires, les animaux utilisés dans le cadre de ce projet seront euthanasiés de manière règlementée en fin de procédure. En effet, les techniques fonctionnelles et d’imagerie utilisées sur l’animal vivant ne permettent actuellement qu’une analyse incomplète et partielle des mécanismes impliqués dans la néovascularisation cornéenne et doivent donc être complété par des analyses post-mortem.
Remplacement
L’induction et l’analyse de la néovascularisation cornéenne, ainsi que de la réponse inflammatoire associée, nécessitent l’utilisation d’un organisme entier. À ce jour, aucun modèle ex vivo ou in vitro ne permet de reproduire de manière fiable la formation de néovaisseaux cornéens ni d’en étudier les mécanismes. Par ailleurs, ce projet vise à évaluer les propriétés anti angiogéniques de composés synthétiques développés par nos collaborateurs, ce qui requiert des études in vivo pour examiner à la fois leur toxicité et leur efficacité. L’expérimentation animale est donc indispensable. Une revue de la littérature confirme également l’absence de modèle in silico pertinent pour répondre à ces problématiques. Afin de comprendre précisément les effets anti angiogéniques sur la néovascularisation cornéenne et l’inflammation associée, l’utilisation d’un modèle rongeur demeure la seule approche scientifiquement valable.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1180 animaux dans ce projet d’une durée de 5 ans. L’estimation du nombre d’animaux à inclure dans les procédures s’appuie sur des études antérieures de l’équipe utilisant des approches expérimentales comparables et des tests statistiques de puissance. Ces analyses nous permettent de réduire et d’estimer le nombre d’animaux par lot ou conditions expérimentales nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement robustes en tenant compte de la variabilité inter-individus. Lors de l’analyse de nos résultats, nous effectuerons un premier test statistique permettant de tester la distribution de nos échantillons suivi de tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux importés observeront une période d’acclimatation de 7 jours minimum avant le début des expérimentations ainsi que des temps de repos établis entre les différents actes expérimentaux. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées en stabulation standard avec enrichissement (maison en carton, bâton en bois à ronger, pas de coton car induit des inflammations du segment antérieur de l'œil), avec nourriture et eau ad libitum. Nous limiterons le nombre de 5 souris maximum par cage et nous éviterons tant que possible l’hébergement individuel des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur. Des points limites ont été définis et les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par notre structure du bien-être animal pouvant mener à l’administration d’un traitement, à décaler dans le temps les actes prévus ou à euthanasier l’animal si cela est nécessaire. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22 degrés Celsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour puis 12h nuit. Un système d’étiquetage associé à des pastilles visuelles indiquant les actes expérimentaux permettra d’assurer un suivi rigoureux du bien-être des animaux. Pour éviter toute souffrance les procédures expérimentales se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire pour les actes qui le nécessitent. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié présentait une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et, en l’absence de rétablissement selon le temps défini pour respecter le bien-être animal, l’animal sera euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
L’utilisation des souris est ici justifiée par la similitude de leur système visuel (caractéristiques anatomiques, cellulaires, et génétiques fondamentales) avec celui de l’homme. Dans ce projet, les souris albinos ont été spécialement choisies à cause de l’hypopigmentation des structures de leurs yeux, permettant une meilleure visualisation et étude de la néovascularisation cornéenne. Dans ce projet, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines, afin d’éviter les effets liés au vieillissement pouvant fausser les analyses.
Plasticité neuroanatomique du système opioïde en conditions neuropathiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Testées cinq jours de suite, opérées en dix minutes, puis testées tous les trois jours pendant deux semaines et une fois par semaine pendant dix semaines, 420 souris vont être utilisées dans des procédures menées sans réveil ou impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. À quatre, huit et douze semaines après la chirurgie, elles sont séparées de leurs congénères cinq heures, testées deux jours de suite, puis séparées quinze heures. La douleur induite persiste au moins six mois dans l'un des deux protocoles, et le porteur indique que les analgésiques ne peuvent pas être administrés puisque les mécanismes de sa chronicité sont l'objet même de l'étude. Vient enfin la chirurgie terminale, sous anesthésie profonde, que le résumé justifie en quatre mots, "mise à mort pour prélèvement".
Objectifs
La douleur neuropathique affecte 8 à 10% de la population et, dans nombre de cas, est réfractaire aux traitements actuels y compris les opiacés, tels que la morphine, ciblant le récepteur opioïde mu. Elle s’accompagne également de comorbidités de type anxio-dépressif plus fréquentes chez les femmes. Le système opioïde est un acteur clé de la modulation du seuil de sensibilité et de l’humeur. Il est composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par la libération de neuropeptides opioïdes endogènes. La compréhension des changements affectant ce système en condition neuropathique est donc essentielle pour appréhender son rôle dans le développement de la douleur mais aussi dans l’apparition des comorbidités émotionnelles. Elle est également cruciale pour identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos résultats antérieurs ont montré que les récepteurs opioïdes mu et delta peuvent s’associer et que leur interaction est associée avec une diminution de la douleur en condition neuropathique. Notre objectif est donc de cartographier les changements intervenant dans leur distribution dans le cerveau. Un modèle de douleur neuropathique dans lequel le seuil de sensibilité mécanique revient progressivement au niveau initial et un modèle dans lequel il reste faible de façon durable seront comparés pour déterminer si la plasticité observée est strictement associée au développement de la douleur ou si elle est également prédictive de la capacité de récupération. L'objectif global du projet est une compréhension fine des altérations du système opioïde qui interviennent en condition neuropathique afin de déterminer l’intérêt thérapeutique de cibler les récepteurs opioïdes mu et delta associés.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier les changements induits par la condition neuropathique et de déterminer leur implication dans le développement de la douleur. Elle permettra aussi de déterminer les potentielles différences liées au sexe, au caractère réversible ou pas de l’hypersensibilité mécanique et au développement ou non des comorbidités de type anxio-dépressif. Au final, cette étude améliorera notre compréhension de la plasticité du système opioïde et, plus particulièrement, du rôle et de l’intérêt thérapeutique de cibler les récepteurs opioïdes mu et delta associés.
Procédures
Un premier groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis 1 fois par semaine durant les 10 semaines suivantes. Le comportement de l’animal est également évalué 4, 8 et 12 semaines post-chirurgie sur une séquence de 4 jours comprenant une séparation des congénères pendant 5 heures le premier jour, un test de 5 minutes le 2ème jour, un test de 10 minutes le 3ème jour et une séparation des congénères de 15h le 4ème jour. Un deuxième groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis ensuite 1 fois par semaine. Au bout de 4 ou 8 semaines, une injection de 10 secondes sera pratiquée sur animal vigile suivie 1 heure plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un troisième groupe de souris adultes subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes suivie 4 ou 8 semaines plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un quatrième groupe de souris adultes sera testé quotidiennement sur une durée de 5 jours puis subira une chirurgie d'une durée de 10 minutes. A partir du 3ème jour après la chirurgie, il sera testé pendant 5 minutes tous les 3 jours pendant les deux premières semaines puis 1 fois par semaine durant les 10 semaines suivantes. Au bout de 4 ou 8 semaines, il subira une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes. Un cinquième groupe de souris adultes vigiles recevra 1 injection de 10 secondes suivie 1 heure plus tard d’une chirurgie terminale sous anesthésie profonde d'une durée maximale de 10 minutes .
Impact sur les animaux
Les deux modèles de douleur utilisés entraînent une douleur modérée qui perdure pendant au moins 6 mois dans l’un des modèles tandis que dans l’autre modèle les animaux récupèrent spontanément au bout de 3 mois. L’identification des mécanismes responsables du caractère chronique de la douleur représente le sujet de l’étude ; Par conséquent, les analgésiques ne peuvent être utiliser pour soulager la douleur. Par ailleurs, la chirurgie induit une inflammation et, potentiellement, une perte de poids transitoire.
Devenir
mise à mort pour prélèvement
Remplacement
Les changements au niveau cérébral induits dans les modèles de douleur ne peuvent être évalués que sur organisme entier et vivant. Le système opioïde exerce un rôle neuromodulateur similaire chez l‘homme et la souris qui constitue dès lors un bon modèle pour en étudier les altérations dans des modèles de douleur reproduisant les signes cliniques observés chez l'homme.
Réduction
Une veille de la littérature sera effectuée durant toute la durée du projet afin de s'assurer du caractère original des expériences proposées et d'intégrer toute nouvelle donnée qui permettrait de réduire le nombre de paramètres à tester. Des expériences pilote sur des groupes d'animaux de taille réduite seront menées pour toute mise au point de protocole. Le nombre d'animaux est déterminé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement robustes.
Raffinement
Les conditions d'hébergement (enrichissement, groupes sociaux, transfert de cage avec utilisation de tubes) et de manipulation (habituation à l’expérimentateur et aux pièces d’expérimentation) des animaux sont optimisées pour respecter leur besoin d'interaction sociale et réduire le stress des animaux. Les procédures invasives sont réalisées sous anesthésie générale et de façon à minimiser les effets négatifs sur l’animal (tapis chauffant, gel oculaire). Des points limites sont établis pour chaque procédure pour prévenir toute souffrance inutile. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.
Choix des espèces
L'espèce animale a été choisie car (1) ces animaux peuvent être modifiés génétiquement et (2) cette espèce est un modèle validé du comportement humain pour les questions abordées dans ce projet. l'étude sera réalisée sur des souris agées de 6 semaines ou plus.
Utilisation d’un modèle murin sensible aux souches virales émergentes et ré-émergentes transmises par les moucherons culicoïdes.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Choisies pour leur sensibilité accrue aux agents pathogènes, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont saignées à la joue, à la queue ou au sinus rétro-orbitaire, et le résumé présente ces prélèvements comme les seules procédures prévues, tout en annonçant par ailleurs des souris vaccinées puis inoculées avec des virus transmis par les moucherons culicoïdes. Toutes sont tuées au dernier jour expérimental, pour mesurer la quantité de virus et d'anticorps dans leurs organes et leur sang. Le porteur revendique un "immense avantage" à recourir à ces souris, celui de réduire l'utilisation de moutons, de bovins, de chèvres et d'équidés, et fixe l'effectif de 300 souris sur cinq ans d'après la moyenne des années précédentes.
Objectifs
Les nombreuses émergences et ré-émergences de virus transmis par les culicoides (moucherons) ces dernières années, touchant les animaux (maladie hémorragique épizootique, fièvre catarrhale ovine, …) ont été responsables d’une forte mortalité chez les ruminants et responsables de fortes pertes économiques. Dans le but de limiter les conséquences de ces émergences, la caractérisation des nouvelles souches virales circulantes et la vaccination des animaux est le meilleur moyen de protéger les animaux et de limiter la diffusion de ces maladies. De ce fait, il est nécessaire de bénéficier d’un modèle rongeur adapté pour tester des approches prophylactiques efficaces. De par leur sensibilité accrue à de nombreux agents pathogènes, les souris sensibles constituent un modèle de choix pour des études préalables à des essais sur l’espèce naturellement ciblée par ces agents pathogènes (mammifères de taille importante). Le but de ce projet est de caractériser la virulence de souche virale et d’évaluer la capacité des souris à produire des anticorps dirigés contre les virus d’intérêt. Un total de 300 souris pour 5 ans sera utilisé (ce qui correspond au nombre moyen d’animaux utilisés ces dernières années durant les différents projets).
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes d’infection de multiples virus émergents et ré-émergents. Ils pourraient permettre également le développement et la mise au point de nouveaux vaccins.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles pratiqués à la joue (veine submandibulaire), ou à la queue ou en dernier recours au sinus rétro-orbitaire, après pose d’un collyre anesthésiant par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement ne dure que quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlées tous les jours.
Impact sur les animaux
Une surveillance quotidienne de tous les animaux vaccinés et / ou infectés sera réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée sera effectuée avant chaque inoculation de virus, puis quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance sera augmentée à deux observations quotidiennes, y compris les week-ends. L’adjuvant utilisé a fait l’objet de tests toxicologiques qui ont conclu à la non-toxicité et à la tolérance favorable.
Devenir
Les souris seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes et de sang, pour l’analyse de la quantité de virus et d’anticorps dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Le modèle des souris s’avère particulièrement pertinent pour l’étude des virus et présente l’immense avantage de réduire l’utilisation de grands animaux (ovins, bovins, caprins, équidés…).
Réduction
Six souris par groupe permet d’avoir des résultats solides et statistiquement fiables. En moyenne, 2 souches virales et 2 essais d’efficacité de nouvelles molécules étant testées par année, 60 souris / an seront utilisées (soit 300 souris au maximum sur 5 ans).
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton ...). Elles sont abreuvées et nourries ad libitum. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée est effectuée avant chaque inoculation d’une souche virale (infectieuse), puis une pesée quotidienne est ensuite effectuée. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance est augmentée à deux observations quotidiennes. Le score clinique de chaque souris est établi quotidiennement et permet de poursuivre ou non la procédure pour chaque souris. Un collyre anesthésiant sera appliqué pour les prélèvements de sang au niveau du sinus rétro-orbitaire. Les prélèvements sont effectués par du personnel expérimenté et formé et ne dure que quelques secondes par souris.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour les virus, de par sa grande sensibilité à l’infection virale. Elle développe généralement des signes cliniques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris utilisées seront âgées de 10 semaines minimum afin de disposer d’animaux adultes présentant un système immunitaire mature et permettant la réalisation des prélèvements dans de bonnes conditions expérimentales.
Etude du contrôle astrocytaire des fonctions et dysfonctions cérébrales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 400 souris vont être utilisées, chacune subissant une injection intracérébrale de trente minutes et, pour certaines, trois injections supplémentaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'accès au cerveau passe par une incision de la peau et une perforation du crâne, suivies d'une douleur et d'une gêne post-opératoires pendant les premiers jours, d'une perte de poids transitoire et d'un risque d'infection de la suture. Toutes sont tuées environ vingt jours après le début des expériences, pour prélever leur cerveau. Le porteur annonce des retombées "majeures" sur la compréhension du rôle des astrocytes et de nouvelles pistes pour des pathologies neurologiques ou psychiatriques, sans que le projet comporte lui-même d'essai thérapeutique.
Objectifs
Le cerveau est composé de milliards de cellules appelées neurones, qui permettent de penser, bouger, ressentir et mémoriser. Mais les neurones ne sont pas seuls : le cerveau contient aussi un autre type de cellules très nombreuses, appelées astrocytes, dont le rôle est longtemps resté sous-estimé. On sait aujourd’hui que les astrocytes ne se contentent pas de « soutenir » les neurones, mais qu’ils participent activement au fonctionnement du cerveau. Ils peuvent influencer l’activité des neurones, la manière dont les messages nerveux circulent, et l’organisation globale des réseaux cérébraux. Lorsque ces cellules ne fonctionnent pas correctement, cela pourrait contribuer à certaines maladies du cerveau. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment les astrocytes agissent sur l’activité du cerveau, dans des conditions normales et lorsque ces mécanismes sont perturbés. Plus précisément, nous cherchons à comprendre comment les astrocytes communiquent entre eux, comment ils utilisent certains signaux internes pour fonctionner, et comment ils contribuent à maintenir l’équilibre chimique nécessaire au bon fonctionnement des neurones. En étudiant ces mécanismes dans le cerveau, ce projet vise à établir des liens clairs entre le fonctionnement des astrocytes et l’activité des neurones. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre comment le cerveau fonctionne normalement et pourquoi certains dysfonctionnements peuvent apparaître.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à améliorer notre compréhension du rôle des astrocytes dans la régulation des fonctions cérébrales, aussi bien en conditions normales que pathologiques. En identifiant les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les astrocytes influencent l’activité neuronale et les réseaux corticaux, ce travail pourrait contribuer à renouveler en profondeur notre vision du fonctionnement du système nerveux central. Les résultats attendus auront donc des retombées majeures non seulement sur le plan fondamental en enrichissant les connaissances sur les interactions neurogliales, mais aussi sur le plan biomédical, en ouvrant de nouvelles pistes pour la compréhension de pathologies neurologiques ou psychiatriques impliquant un dysfonctionnement des cellules gliales.
Procédures
Injection intracérébrale (1/animal, 30 minutes environ). Des injections complémentaires pourront être réalisées chez certains animaux (3/animal, 1 minute environ).
Impact sur les animaux
La procédure d’injection intracérébrale (environ 30 min) est susceptible d’entraîner plusieurs types de nuisances chez les animaux : 1. Un stress chirurgical associé à l’anesthésie générale et à l’injection intracérébrale pendant les heures suivant l’intervention. 2. Une douleur et une gêne post-opératoire liée à l’incision cutanée et à la perforation du crâne nécessaire à l’injection intracérébrale durant les premiers jours post-opératoires. 3. Une perte de poids transitoire dans les jours suivant l’intervention. 4. Un risque d’infection localisé au niveau de la suture.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études biochimiques ou immunohistochimiques, ou pour réaliser des techniques de patch-clamp et de field recording, d'imagerie calcique ou de réseaux multélectrodes.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les interactions entre neurones et astrocytes dans un contexte fonctionnel intégré, au sein d’un cerveau intact. Or, les modèles alternatifs tels que les cultures cellulaires, les simulations informatiques, ou les organismes plus simples (comme la drosophile ou Caenorhabditis elegans) ne permettent pas de reproduire la complexité du cerveau des mammifères, ni les interactions spécifiques entre neurones et astrocytes dans leur environnement naturel. Il n’est donc pas possible, dans le cadre de ce projet, de remplacer l’expérimentation animale par des approches alternatives tout en conservant la pertinence scientifique des résultats obtenus.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la taille des groupes de manière à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables. Par ailleurs, chaque souris est utilisée comme son propre contrôle, grâce à une injection bilatérale : l’hémisphère recevant la condition expérimentale est comparé à l’hémisphère opposé injecté avec une condition de référence. Cette approche de comparaison intra-individuelle permet de limiter significativement le nombre d’animaux requis. Ainsi, 10 animaux par groupe sont nécessaires. Enfin, le recours à des vecteurs viraux ciblés permet de réduire le nombre de lignées transgéniques à générer, croiser et maintenir, contribuant ainsi à la réduction globale de l’utilisation d’animaux dans le projet.
Raffinement
Les injections intracorticales seront réalisées sous anesthésie et analgésie appropriées. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant toute la durée de l’intervention afin de prévenir l’hypothermie per-opératoire. Après la chirurgie, les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique quotidienne. Une grille d’évaluation standardisée intégrant des critères d’apparence (toilettage, posture, aspect du pelage) et de comportement (locomotion, interactions sociales, prise alimentaire) sera utilisée pour détecter précocement toute altération du bien-être. Cette surveillance permettra d’identifier d’éventuels points limites justifiant une intervention rapide.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il présente une organisation du cerveau proche de celle de l’homme, permettant d’étudier de manière pertinente le fonctionnement des cellules cérébrales dans un contexte comparable. La souris est également l’espèce pour laquelle il existe un large éventail de modèles génétiquement modifiés, indispensables pour étudier de façon ciblée le rôle de certaines cellules et de certains mécanismes biologiques dans le cerveau. Ces outils ne sont pas disponibles, ou de manière très limitée, dans d’autres espèces animales. Enfin, le modèle murin présente également des caractéristiques biologiques permettant une gestion maîtrisée des effectifs, garantissant la disponibilité d’un nombre suffisant d’animaux pour les besoins du projet tout en limitant le recours à un nombre élevé d’animaux reproducteurs. Les expériences sont initiées chez des souris âgées d’environ un mois, car les animaux sont ensuite mis à mort environ 20 jours plus tard, à un âge où les circuits cérébraux sont fonctionnellement matures.
Effet de préparations pro-pré-post-biotiques sur la physiologie de l’hôte dans un modèle rongeur
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rats : 1440
Gavées chaque jour pendant vingt-huit jours, isolées dans une cage vide jusqu'à quinze minutes pour le recueil des fèces deux fois par semaine, et saignées une fois par semaine, 1 440 souris et 1 440 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués en fin de protocole pour analyse des tissus. Le porteur affirme qu'aucune nuisance liée aux substances n'est attendue parce qu'elles sont "connues pour leur sécurité d'emploi chez l'homme et l'animal", alors que le projet existe précisément parce que leurs mécanismes d'action "restent largement peu décrits". Il indique par ailleurs qu'un calcul de puissance formel ne peut pas être établi de façon robuste pour ces analyses, et retient un effectif de 2 880 rongeurs jugé adéquat.
Objectifs
L’utilisation de micro-organismes ou leurs dérivés (les « probiotiques » ou assimilés), ou d’autres interventions thérapeutiques visant le microbiote intestinal (certaines fibres, les « prébiotiques ») ont déjà démontré leur intérêt dans diverses aires thérapeutiques, en prévention ou en complément des traitements de référence. Pourtant, les mécanismes biologiques actionnés par ces substances (pré, post et probiotiques) restent largement peu décrits, notamment en raison de leur complexité en termes de composition, mais aussi d’interactions avec l’hôte et son microbiote. La recherche d’une meilleure compréhension de ces modes d’action se justifie car elle permet de mieux communiquer sur la pertinence scientifique de ces solutions de santé, mais également de renforcer leur sécurité. Dans cet objectif, si le recours à des modèles in vitro est possible dans certains cas, il n’existe pas à ce jour de modèle non animal capable de récapituler la complexité du système digestif, qui comprend l’hôte, son microbiote, les substances issues de l’alimentation, et met en jeu des interactions entre ces acteurs et le reste de l’organisme – système digestif, système gastro-intestinal, système nerveux, système immunitaire… L’utilisation de modèles animaux pour aborder l’aspect mécanistique est alors un complément indispensable à l’obtention des données cliniques. Outre la description des mécanismes, les modèles animaux sont idéaux pour développer, améliorer, comprendre les solutions existantes ou en développer de nouvelles. L’objectif du projet est donc de caractériser l’effet de préparations pré/post/probiotiques existantes ou en cours de développement sur la physiologie de l’hôte, notamment sa physiologie digestive, chez l’animal sain, et en en mesurant les conséquences sur des paramètres cliniques (courbe de poids, dosages sanguins) ou microscopiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer et de comparer l’efficacité de préparations pré/post/probiotiques dans un contexte physiologique, à travers des mesures de marqueurs biochimiques, d'inflammation, ... et de décrire leurs mécanismes d’action notamment sur la physiologie intestinale. Finalement, les données obtenues permettront de développer les solutions thérapeutiques les plus efficaces et les plus sûres, sur la base de critères scientifiques objectifs.
Procédures
Sur animaux vigiles : -administration des substance évaluées par gavage, quotidiennement, pendant 28 jours maximum. -prélèvements de fèces, deux fois par semaine maximum, pendant 6 semaines maximum. Les animaux seront isolés dans une cage vide jusqu’à l’émission, avec une durée maximale de 15 minutes. -prélèvements sanguins, une fois par semaine maximum, pendant 6 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, aucune nuisance liée aux substances administrées n’est attendue, car ces substances sont connues pour leur sécurité d’emploi chez l’homme et l’animal. Les administrations, l’isolement transitoire pour les prélèvements fécaux ainsi que les prélèvements sanguins et les contentions associées à ces gestes peuvent être une source de stress pour l’animal.
Devenir
Une partie du projet se base sur des mesures effectuées sur les tissus prélevés post-mortem. L'mise à mort en fin de protocole est donc nécessaire.
Remplacement
La physiologie du tube digestif, lieu d’action primaire des pré/post/probiotiques, est complexe. Elle implique le tube digestif, lui-même composé de plusieurs types cellulaires, le système immunitaire, le microbiote, et le dialogue biochimique complexe qui s’établit entre ces différentes composantes. Il n’est actuellement pas possible de reconstituer une telle complexité par des modèles non animaux, y compris les plus complexes.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux impliqués est basée sur : -une bonne connaissance du modèle permettant d’ajuster les effectifs au minimum tout en maximisant la qualité et la pertinence des résultats obtenus -une exploitation maximale du matériel biologique et des données cliniques, permettant de limiter le nombre de réitérations -une bonne connaissance des produits testés, de la dose efficace et de leur absence d'effet indésirable, permettant de ne pas requérir de mise au point ou d’ajustement de doses et de durées de traitement. -le regroupement des essais permettant de limiter le nombre de groupes témoins La taille des groupes est justifiée par une approche combinant données de la littérature, expérience acquise avec ce modèle et variabilité attendue des données collectées. Un calcul de puissance formel nécessitant de définir a priori un critère principal, une variance et une taille d’effet attendues, il ne peut être établi de façon pleinement robuste pour ces analyses exploratoires et multidimensionnelles. Le nombre d’animaux retenu vise donc à garantir des résultats interprétables et statistiquement exploitables, tout en limitant les effectifs au nombre adéquat.
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes, avec enrichissement (ouate, abri, roue, tube…). Une surveillance individuelle renforcée quotidienne (weekend et jours fériés inclus) sera appliquée pendant la procédure afin d’écarter au plus vite tout animal dont l'état général se dégraderait. Les prélèvements fécaux seront réalisés au maximum deux fois par semaine. Les prélèvements sanguins seront réalisés au maximum une fois par semaine et limités au volume minimal nécessaire aux analyses.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces de référence pour les raisons suivantes : -existence d’outils moléculaires pour l’exploration mécanistique -existence de données préliminaires sur ces modèles concernant les produits évalués Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, soit entre 8 et 15 semaines, car le projet concerne des produits visant une utilisation chez l’adulte
Evaluation du bien-être animal d’une nouvelle lignée murine crée par le système Crispr/Cas9.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souriceaux d'une lignée voisine meurent avant le sevrage dans 40 à 50 % des cas, dont environ 60 % dans les quarante-huit heures suivant la naissance, et le porteur n'exclut pas de retrouver les mêmes atteintes dans la lignée qu'il crée ici. 240 souris vont être utilisées dans des procédures classées légères et réduites à des observations non invasives, pour évaluer ce que le porteur appelle le "bien-être animal" de cette lignée obtenue par Crispr/Cas9. Dans cette lignée voisine, les survivants présentent une hypoglycémie, des déséquilibres hormonaux et une activité motrice réduite. Les souris affectées à l'étude comparative sont mises à mort, celles retenues pour l'évaluation restant en vie pour la reproduction.
Objectifs
Cette demande s’inscrit dans le cadre de la création d’une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiées, avec pour objectif principal d’évaluer les conséquences de cette altération génétique sur le bien-être animal, tout en les comparant à celles observées dans des modèles murins existants disponibles au sein de notre équipe. Cette approche comparative est essentielle afin de situer précisément les effets propres à la modification ciblée et d’en apprécier la spécificité. La lignée développée cible une région génomique impliquée dans une maladie humaine rare. À ce titre, ce modèle s’inscrit à l’interface entre recherche fondamentale et recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Nous considérons que ces travaux sont susceptibles d’améliorer notre compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques associés à cette pathologie, en particulier durant la période périnatale. Enfin, cette nouvelle lignée pourrait constituer un modèle préclinique pertinent, complémentaire des modèles existants, permettant d’explorer plus finement le rôle des éléments génétiques impliqués, notamment dans le contexte périnatal. Elle offrirait ainsi un outil original pour étudier l’émergence des phénotypes et, à plus long terme, pour identifier de potentielles cibles thérapeutiques.
Procédures
Cette évaluation est basée sur des observations non invasives.
Impact sur les animaux
La lignée développée ici cible une petite région génomique qui chez un autre modèle de la pathologie que nous étudions est altérée pour deux autres gènes. Cette dernière présente de la mortalité en période périnatale ainsi que des défauts métaboliques. 40 à 50 % des individus mutants décèdent avant le sevrage, dont environ 60 % dans les 48 heures suivant la naissance. Les souriceaux présentent un métabolisme altéré, caractérisé par une hypoglycémie, des déséquilibres hormonaux et une diminution de l’activité motrice spontanée. Les individus survivants apparaissent ensuite globalement normaux, malgré un poids corporel inférieur à celui des témoins. L'objectif étant de déterminer la contribution potentielle de ce gène dans les phénotypes observés il n'est pas exclu d'observer les mêmes altérations pour cette nouvelle lignée.
Devenir
Tous les animaux d'interêt pour l'évaluation du bien-être animal sont gardés en vie pour la reproduction. Tous ceux pour l'édude comparative sont mis à mort.
Remplacement
Nos gènes d’intérêts sont exclusivement retrouvés chez les mammifères placentaires et sont exprimés uniquement dans le cerveau. Ce mode d’expression strictement neuronal, associé à leur apparition tardive au cours de l’évolution des mammifères, restreint considérablement le choix de modèles d’étude biologiquement pertinents. Ainsi, toutes les études publiées à ce jour ont été menées chez la souris, d’autant que ce modèle reproduit certains traits pathologiques caractéristiques de la maladie. Enfin, notre demande porte sur un stade de développement crucial : la naissance. À ce jour, il n’existe aucun modèle alternatif crédible et biologiquement pertinent pour cette étude.
Réduction
Pour étudier les individus sur 2 générations à partir de la G1, nous souhaitons produire 4 mâles fondateurs par génération pour s’affranchir des mutations non voulues et augmenter la diversité génétique. Donc en croisant chaque mâle avec 2 femelles et en raison de 6 naissances par portées nous estimons pouvoir obtenir d'après les rapports Mendélien 12 souris par sexe et par génotype. Il s'agit là d'un chiffre théorique qui nous permettra d'obtenir les 7 animaux minimum par sexe recommandés par le guide européen.En ce qui concerne la génération de la colonie, notre stratégie de croisement permet de limiter le nombre d’animaux produit. Nous attendons à ce que 50 % des souriceaux présentent la délétion pour notre gène d’intérêt contre seulement 25 % avec des croisements classiques.
Raffinement
Ce projet a pour objectif d’évaluer le bien-être des individus générés suite à la création d’une nouvelle lignée. Cette évaluation portera sur les individus issus de deux générations de la mise en place de la colonie. Il s’agit dans un premier temps de faire un suivi non invasif des souris basé sur l’observation pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Cette surveillance sera quotidienne. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation. Des points limites précoces seront mis en place. Si les animaux présentent des signes de souffrance alors ils seront mis à mort.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour ont été réalisés chez la souris. Ce modèle murin est donc devenu la référence incontournable dans notre domaine de recherche, car il permet non seulement d’établir des comparaisons avec les données existantes dans la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant la répétition d’expériences déjà publiées et donc pouvant être considérées comme inutiles sur le plan éthique. Notre demande porte sur un stade de développement crucial, la naissance, jusqu'à l'âge adulte.
Étude des altérations précoces de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de la trisomie 21
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour prélever leur cerveau, ou tuées faute de pouvoir être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique, 1 085 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un dixième d'entre elles développe une accumulation de liquide dans le cerveau, et toutes sont plus petites et plus légères que les souris sans cette modification. Elles subissent une biopsie de tissu pour génotypage sur animal éveillé, une injection de traceur fluorescent sous anesthésie brève et, pour une partie, un prélèvement sanguin. Le porteur retient la souris parce que son génome est modifiable et que la barrière cérébrale y est complète dès la troisième semaine, et fixe l'examen à un et trois mois, avant l'apparition des signes de vieillissement.
Objectifs
Le syndrome de Down, aussi appelé trisomie 21, est la cause génétique la plus fréquente de déficience intellectuelle. Il est dû à la présence d’un chromosome 21 supplémentaire, en totalité ou en partie. Les personnes porteuses de trisomie 21 présentent également un risque très élevé de développer une maladie d’Alzheimer précoce. Le cerveau est protégé par une barrière naturelle appelée barrière hémato-encéphalique. Cette barrière agit comme un filtre très sélectif : elle contrôle strictement ce qui peut passer du sang vers le cerveau afin de maintenir son bon fonctionnement. Elle est formée par différents types de cellules qui travaillent ensemble au sein d’une structure appelée unité neurovasculaire. Lorsque cette barrière est endommagée, des substances normalement exclues du cerveau peuvent y pénétrer, ce qui peut perturber son fonctionnement. Une altération de cette barrière est observée dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la maladie d’Alzheimer. Des travaux récents suggèrent que la barrière hémato-encéphalique pourrait également être fragilisée chez les personnes atteintes de trisomie 21 et de maladie d’Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore si ces altérations apparaissent très tôt au cours de la vie en raison de la trisomie elle-même, ou si elles sont une conséquence plus tardive des mécanismes liés à la maladie d’Alzheimer. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre ce phénomène en étudiant si la barrière hémato-encéphalique est déjà altérée dès les premières étapes de la vie dans la trisomie 21. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris génétiquement modifiées reproduisant les principales caractéristiques génétiques de la trisomie 21. Grâce à des méthodes complémentaires bien établies, nous chercherons à déterminer si la barrière protectrice du cerveau laisse passer des molécules anormalement et à identifier les changements affectant les cellules qui assurent son bon fonctionnement.
Bénéfices attendus
Jusqu’à présent, la recherche sur la barrière protectrice du cerveau dans la trisomie 21 s’est surtout intéressée aux périodes tardives de la vie, lorsque les lésions caractéristiques de la maladie d’Alzheimer sont déjà bien installées. En revanche, ce qui se passe très tôt dans la vie, bien avant l’apparition de ces lésions, reste largement méconnu. Cette absence de données rend difficile la compréhension de ce qui déclenche réellement la maladie, par opposition à ce qui en est une conséquence. Dans la trisomie 21, plusieurs facteurs liés à la présence d’un chromosome supplémentaire, comme une inflammation chronique, des perturbations du métabolisme ou des réactions immunitaires anormales, pourraient fragiliser dès le plus jeune âge la barrière qui protège le cerveau. Une telle fragilité précoce pourrait, à long terme, favoriser l’apparition de troubles neurologiques. Malgré l’hypothèse largement admise selon laquelle un dysfonctionnement de cette barrière pourrait jouer un rôle clé dans l’apparition précoce et l’évolution rapide de la maladie d’Alzheimer chez les personnes atteintes de trisomie 21, aucune étude n’a jusqu’à présent examiné de manière approfondie l’état de cette barrière dans des modèles animaux représentatifs de la trisomie 21. Ce projet est donc le premier à s’intéresser à l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique dès le début de la vie dans un modèle de souris de la trisomie 21. Les bénéfices attendus de ce projet seront donc, à court terme, de pouvoir révéler un potentiel problème jusqu’ici insoupçonné dans la circulation sanguine du cerveau et ainsi ouvrir la voie à de nouvelles recherches pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie. A plus long terme, cela pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes de prévention ou de traitement.
Procédures
Pour identifier les souris porteuses de la modification génétique d’intérêt, un très petit prélèvement de tissu sera réalisé pour tous les animaux (une seule fois, d’une durée inférieure à une minute, animal vigile). En cas de problème technique rare, un second prélèvement pourrait être effectué chez ces mêmes animaux, à l’âge adulte et à l’état éveillé, également d’une durée inférieure à une minute et réalisé une seule fois. Une partie des animaux recevra une injection d’une molécule permettant de vérifier l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, elle sera effectuée sous anesthésie générale de très courte durée (une seule injection d’une durée inférieure à 1 minute, durée de l’anesthésie inférieure à 5 minutes). Une partie des souris aura également un seul prélèvement sanguin (durée inférieure à cinq minutes, animal vigile).
Impact sur les animaux
La biopsie pour identifier le patrimoine génétique des animaux peut causer une douleur passagère et un petit risque de saignement. Les souris utilisées dans cette étude présentent une modification génétique spécifique et, dans 10 pourcents des cas, une accumulation de liquide dans le cerveau, appelée hydrocéphalie. Ces souris sont aussi plus petites et plus légères que les souris ne présentant pas cette modification génétique. Lors des manipulations nécessaires aux injections et aux prélèvements, les souris peuvent ressentir un stress léger et passager. Une douleur brève peut également être ressentie au moment de la piqûre. Les injections peuvent entraîner un inconfort temporaire et un faible risque de saignement. Dans de rares cas, une irritation ou une atteinte de l’œil peut survenir. Les animaux seront sous anesthésie générale pour l’injection, celle-ci peut entraîner quelques effets secondaires, comme une légère baisse de la température corporelle, une sécheresse des yeux, et dans de très rares cas, des problèmes respiratoires ou cardiaques. Toutefois, cette anesthésie générale sera très courte et présente donc des risques moins importants. Les prélèvements de sang peuvent occasionnellement provoquer un saignement persistant.
Devenir
Une partie des souris utilisées seront euthanasiées afin de prélever puis analyser des cerveaux dans le but de répondre à notre question scientifique. Toutes les autres souris seront euthanasiées car elles ne pourront pas être replacées ou réutilisées en raison de leur modification génétique spécifique.
Remplacement
Il n'existe malheureusement pas d'alternative à l'utilisation d'animaux pour ces recherches. Pour étudier comment le cerveau est protégé et comprendre quand cette protection devient défaillante, il est nécessaire d’utiliser des modèles animaux, comme la souris. La barrière qui protège le cerveau ne dépend pas d’un seul type de cellule, mais du travail coordonné de plusieurs cellules différentes (cellules des vaisseaux sanguins, cellules de soutien, neurones et cellules immunitaires). Ces interactions complexes ne peuvent pas être reproduites de façon fiable en laboratoire à partir de cellules isolées. L’injection de substances fluorescentes de tailles différentes permet de vérifier si cette barrière joue correctement son rôle de filtre. En observant si ces substances restent dans les vaisseaux sanguins ou si elles passent anormalement dans le tissu cérébral, il est possible de déterminer si la barrière est fragilisée et dans quelle mesure. Après ces injections, l’analyse du cerveau est indispensable pour visualiser précisément où ces substances se sont accumulées et pour étudier les changements affectant les cellules qui composent les vaisseaux du cerveau. Ces observations sont essentielles pour mieux comprendre les mécanismes responsables des troubles de la barrière protectrice du cerveau et, à terme, pour améliorer la prévention et le traitement des maladies neurologiques.
Réduction
Sur une période de quatre ans, ce projet utilisera au maximum 1085 souris. Ce nombre a été soigneusement calculé afin de répondre aux objectifs scientifiques tout en utilisant le moins d’animaux possible. Les souris utilisées seront élevées au sein du laboratoire tout au long du projet. L’élevage sera géré de façon raisonnée, avec pour objectif de ne produire que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Tous les paramètres ont été pris en compte, comme la proportion de souris réellement porteuses du gène étudié, la nécessité d’obtenir autant de mâles que de femelles, ou encore les difficultés de reproduction propres à cette lignée. Dans nos lots expérimentaux nous inclurons des souris mâles et femelles, ainsi que des animaux jeunes et adultes, afin de tenir compte des différences naturelles liées à l’âge et au sexe. Nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 15 à 20 animaux, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables sans multiplier inutilement le nombre de souris. Les résultats que nous obtiendrons seront ensuite analysés avec les tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les souris seront élevées et hébergées dans des conditions strictement conformes à la réglementation. Les animaux provenant d’un élevage extérieur disposeront d’une semaine d’adaptation après leur arrivée avant d’être utilisés pour la reproduction. Les souris auront accès librement à l’eau et à la nourriture. Elles vivront également dans un environnement adapté à leur bien-être, avec du matériel pour faire un nid, ronger et se cacher. Elles seront observées quotidiennement et, au moindre signe anormal, l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire seront immédiatement informés afin d’assurer une prise en charge rapide et appropriée. Des mesures préventives seront mises en place pour réduire tout impact des procédures expérimentales sur les animaux. Cela comprend la formation du personnel, la surveillance constante des animaux, et des méthodes pour les habituer à la manipulation avant les expériences. Pour identifier les souris nécessaires à l’étude, un très petit prélèvement est réalisé chez des animaux très jeunes. Ce geste est conçu pour être le moins invasif possible et permettre une cicatrisation rapide. Les souris sont surveillées juste après le prélèvement, puis un peu plus tard, afin de s’assurer de leur bon état. Le choix d’utiliser uniquement des mâles porteurs des modifications génétique d’intérêt comme reproducteurs permet à la fois de faciliter la prise en charge des portées par les mères et de limiter le nombre d’animaux présentant des fragilités liées à leur génétique. Afin de réduire au maximum le stress et toute douleur lors des injections, les souris sont placées sous anesthésie générale de courte durée. Pendant toute la procédure, leur état est étroitement surveillé. Des mesures simples seront mises en place pour assurer le confort des animaux, comme le maintien de leur température corporelle et l’application d’un gel protecteur sur les yeux afin d’éviter leur dessèchement et de limiter les irritations après l’injection. Après l’intervention, les animaux sont surveillés attentivement pendant leur réveil dans un environnement chauffé.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus adapté pour étudier le syndrome de Down et ses effets sur le cerveau. En effet, la souris est un modèle bien connu et largement utilisé pour modéliser les pathologies humaines. Notamment, son génome est parfaitement connu et des outils sont disponibles pour le modifier. Ainsi un modèle de souris génétiquement modifiées possède une copie supplémentaire d’une grande partie des gènes du chromosome correspondant au chromosome humain 21, et il reproduit plusieurs caractéristiques importantes du syndrome de Down. Cette lignée de souris permet d’étudier très tôt dans la vie l’intégrité et la perméabilité de la barrière qui protège le cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique, ainsi que les modifications des vaisseaux sanguins et l’inflammation dans le cerveau. Chez les souris, cette barrière cérébrale est pleinement développée dès la troisième semaine après la naissance. Les signes liés au vieillissement ou à la maladie d’Alzheimer, comme la perte de certaines protéines et de neurones, ou l’accumulation de molécules toxiques dans le cerveau, n’apparaissent qu’après neuf mois. C’est pourquoi nous étudierons les souris génétiquement modifiées à 1 et 3 mois. Cette approche nous permettra de savoir si les premières altérations de la barrière cérébrale apparaissent avant les autres signes caractéristiques de la maladie, et de déterminer si ces changements vasculaires et au niveau de la barrière peuvent servir de marqueurs précoces du syndrome de Down. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et connaitre leur modification génétique très tôt.
Evaluation de l’impact d’une protéine sur la formation, la stabilité et la dissolution d’un caillot sanguin au cours d’un accident vasculaire cérébral chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une moitié des souris est maintenue sous anesthésie jusqu'à sa mise à mort, sans jamais reprendre conscience. 360 souris vont être utilisées, 180 dans ce régime sans réveil et 180 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang, le caillot et les tissus. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué par une intervention chirurgicale d'environ une heure trente avec injection dans le cerveau, suivie selon les groupes d'une observation au microscope pouvant durer deux heures. Le porteur affirme que seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau et la réaction des cellules immunitaires lors d'un AVC, après des essais préalables menés sur du sang de souris.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux dits ischémiques sont dus à un caillot, qui bloque la circulation sanguine dans une artère cérébrale. La résistance de ces caillots aux traitements varie selon les individus. Ce projet étudie une protéine présente dans les vaisseaux sanguins qui, lorsqu’elle circule dans le sang, peut limiter la formation des caillots ou destabiliser les caillots. L’objectif de ce projet est d’évaluer le potentiel de cette protéine, pour empêcher la formation du caillot, ou le déstabiliser une fois formé. Cette protéine permettra de proposer de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter les accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la protéine étudiée dans la formation et la dégradation des caillots lors d’un accident vasculaire cérébral. L’ischémie cérébrale, due à l’occlusion d’une artère, endommage les tissus cérébraux et altère les fonctions cérébrales. Plus cette occlusion persiste dans le temps, plus les dommages causés au cerveau deviennent irréversibles pour les patients. Cette étude pourrait ouvrir la voie à une nouvelle stratégie thérapeutique visant à rétablir ou améliorer la circulation sanguine dans les artères cérébrales et ainsi limiter les séquelles liées à l’ischémie. À terme, cette approche pourrait contribuer à réduire la survenue des complications et la mortalité associées aux accidents vasculaires cérébraux. Les résultats obtenus dans ce projet permettront d’améliorer les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la formation et la dégradation des caillots, et pourraient contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Les animaux seront répartis en différents groupes selon les expériences réalisées. Ils recevront jusqu’à trois administrations de traitement contre la douleur, chaque administration durant environ 30 secondes. Selon les groupes, une anesthésie générale sera réalisée soit pour une intervention chirurgicale d’une durée totale d’environ 1 heure 30 minutes, soit pour une observation au microscope d’une durée maximale de 2 heures. Une injection d’un marqueur permettant la visualisation du caillot, sera effectuée avant cette observation (environ 30 secondes). Plusieurs administrations de molécules seront réalisées à différents moments de l’étude (30 minutes avant ou après l’intervention, ou 2 heures après), chaque administration durant moins d’une 1 minute. En fin d’étude, une anesthésie générale profonde sera réalisée afin de permettre le prélèvement des tissus. Enfin, une ou deux administrations de solution physiologique seront réalisées après la chirurgie pour assurer la réhydratation, chaque administration durant environ 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’induction d’un accident vasculaire cérébral dû à un caillot nécessite une intervention chirurgicale et une injection dans le cerveau, réalisées sous anesthésie générale. Les effets indésirables attendus comprennent une douleur liée à la chirurgie, d’intensité modérée, prise en charge par un traitement contre la douleur. Selon les situations expérimentales, les animaux peuvent soit être maintenus sous anesthésie pendant toute la durée de l’expérimentation, soit être réveillés après l’intervention. Dans ce dernier cas, ils font l’objet d’un suivi attentif afin de limiter toute douleur ou souffrance.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer du sang, le caillot et les tissus.
Remplacement
Des expériences in vitro ont été réalisées permettant de réduire l’utilisation d’animaux vivants. Ces expériences, faites sur du sang de souris, ont permis d’étudier comment la protéine d’intérêt influence la formation et la stabilité des caillots. Elles nous ont aussi aidés à réduire le nombre d’animaux nécessaires, en déterminant à l’avance la dose la plus adaptée pour les études suivantes. Cependant, pour comprendre l’effet de cette protéine dans un accident vasculaire cérébral, il est indispensable d’utiliser un modèle vivant. Seules des souris peuvent reproduire la complexité vasculaire du cerveau, et des cellules immunitaires lors d’un accident vasculaire cérébral, ce qui n’est pas possible avec des tests entièrement in vitro. Ces informations nous permettent de mener les expériences dans les meilleures conditions, en appliquant la règle des 3R pour limiter au maximum l’inconfort animal.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires se fonde sur des travaux précédents réalisés avec le même modèle d’AVC, sur des données de la littérature scientifique et sur l’utilisation d’un logiciel statistique spécialisé.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Les interventions nécessitant une chirurgie seront faites sous anesthésie générale, avec des mesures destinées à assurer le confort des animaux avant, pendant et après l’intervention. La profondeur de l’anesthésie est surveillée tout le long de la procédure, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant. Une grille de score et des points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L’atteinte d’un point limite qui ne peut être soulagé induira une mise à mort anticipée de l’animal par le responsable du projet.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi car il permet d’étudier les maladies cérébro-vasculaires, comme l’AVC, en reproduisant plusieurs caractéristiques observées chez l’humain, telles que les déficits comportementaux et l’évolution des lésions cérébrales dans le temps. Les mécanismes complexes impliqués dans l’AVC ischémique, incluant différents types cellulaires et des réponses immunitaires différentes, nous impose l’utilisation de modèle in vivo pour intégrer l’ensemble de ces phénomènes impliqués dans l’étude de l’évaluation d’un traitement préventif ou curatif. En sachant que les accidents vasculaires cérébraux touche principalement les adultes, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 2 à 3 mois. Ce choix garantit que les animaux sont à un stade de développement comparable à celui des patients adultes, tout en permettant une observation fiable des effets du modèle et des traitements testés.
Etude et vectorisation de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Prostration, chute de la température, perte de poids : ces seuils, une fois atteints, déclenchent la mise à mort des souris. 300 souris vont être utilisées, 90 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, 170 modéré et 40 sévère, toutes tuées à la fin pour prélever et imager leurs organes. Une fibrose pulmonaire leur est provoquée par instillation de bléomycine dans la trachée ou par voie nasale, puis elles enchaînent jusqu'à cinq séances d'imagerie, sept injections intrapéritonéales et cinq prélèvements de sang, sous anesthésie gazeuse à chaque fois. Le porteur retient des mâles de huit semaines pour leur sensibilité aux atteintes pulmonaires provoquées par la bléomycine, autrement dit parce qu'ils développent la maladie plus facilement.
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique fibrosante associée à un déclin progressif de la fonction pulmonaire et a une durée médiane de survie inférieure à 5 ans après le diagnostic. Il n'existe pas de traitement curatif et les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la fibrose pulmonaire sont encore peu connus. Dans ce projet, nous proposons d’optimiser l'administration de nouveaux composés anti-fibrose et de tester leur efficacité dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Le développement de la fibrose sera suivi de manière non invasive par imagerie. Seuls les composés validés sur cellules seront évaluées chez l'animal. Les composés porteront un marqueur fluorescent afin de suivre leur comportement dans l’organisme en temps réel et de façon non-invasive par imagerie de fluorescence. L’efficacité des composés sera evaluée pour le traitement de la fibrose. De plus, l'efficacité, la spécificité et le mécanisme d'action des composés dans les différentes populations cellulaires du poumon atteint de fibrose seront évalués sur les poumons. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel traitement anti-fibrose d’un candidat médicament. Ces composés seront également évalués dans des cellules pulmonaires primaires provenant de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique pour valider ce médicament dans un contexte humain.
Bénéfices attendus
La fibrose est un processus complexe mettant en jeu de nombreux types cellulaires. Les options de traitement pour la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) sont limitées avec seulement deux médicaments approuvés, le nintedanib et la pirfénidone, qui ralentissent la progression de la fibrose pulmonaire mais sont incapables d'inverser ou même d'arrêter la maladie. Ce projet permettra d'optimiser l'administration de composés anti-fibrose pour augmenter l'efficacité de traitement. Il pourra également ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour d'autres types de fibrose, comme la fibrose rénale, hépatique ou musculaire.
Procédures
Dans le cadre de l'administration des composés, les animaux subiront soit une injection intraveineuse (1 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la cinétique sanguine, les animaux auront des prélèvements sanguins répétés dans la veine caudale (5 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la détermination de la biodistribution des composés, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (1 à 2 fois, 1 minute) et une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie de bioluminescence (1 à 2 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie de fluorescence, les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre du développement de la fibrose, les animaux subiront une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse) MOFIFICATION: ou par voie intranasale (2 fois, 5 min, sous anesthésie gazeuse), puis les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie µCT (5 fois, 10 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité thérapeutiques, les animaux avec fibrose subiront des injections intrapéritonéales (7 fois, 1 minute), et soit des injections intraveineuses (1 ou 3 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit des administrations par voie intratrachéale (1 ou fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les nuisances ou effets indésirables attendus sont : douleurs et conséquences de l'administration intratrachéale pour déclencher la fibrose, des injections intrapéritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies répétées (pour l'imagerie et les traitements), gène respiratoire et/ou douleurs induites par la présence de fibrose.
Devenir
Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. De plus, les processus biologiques à l’origine du développement de la fibrose sont mal connus. La fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrose d’un candidat médicament. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose, on retrouve de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine et nous disposons d’une grande variété d’outils moléculaires pour mener à bien nos expérimentations. Le consensus actuel est que l'utilisation du modèle murin de fibrose par instillation de bléomycine par voie oropharyngée représente le modèle animal le mieux caractérisé disponible pour les tests précliniques.
Réduction
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester in vivo. Les modèles utilisés dans ce projet utilisent des procédures couramment décrites, et qui ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. Le nombre des groupes sera ajusté en fonction des premiers résultats de biodistribution. La mise en place du modèle murin de référence pour la fibrose sera effectuée dans une étude pilote qui permettra de déterminer les doses optimales de bléomycine (dépendante de chaque lot de bléomycine) à administrer pour l’induction de la fibrose pulmonaire et la durée du suivi par imagerie non invasive afin d’observer une résolution totale. Cette étude nous permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux dans les procédures suivantes. De plus, seuls le meilleur composé et la meilleure voie d’administration seront testés dans des modèles de fibrose, ce qui permettra aussi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Les animaux seront maintenus dans des cages ventilées. Les animaux seront hébergés par fratries afin de limiter les bagarres. Les conditions standards de luminosité, hygrométrie et température seront appliquées. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La gravité des procédures est légère pour les biodistributions, cinétiques sanguines et traitements. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Des points limites pertinents seront déterminés et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale. Nous réaliserons une étude pilote afin d’optimiser et calibrer finement le modèle de fibrose et permettre un suivi non-invasif par imagerie. Les animaux seront anesthésiés afin de réduire le stress et la douleur. Un suivi quotidien accru des animaux sera effectué au cours de l’établissement de la fibrose. Les paramètres observés seront la prostration, la diminution de la mobilité, la forte baisse de température et la perte de poids. Tout animal présentant une perte de poids de 20% par rapport aux pesées précédentes sera sorti de l’étude et euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire, on retrouve en effet de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine. Plus particulièrement, nous utiliserons des souris de 8 semaines mâles en raison de leur sensibilité notamment aux atteintes pulmonaires induites par la bléomycine. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.
Evaluation du 9-HODE et 13-HODE sur le vieillissement vasculaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour mesurer l'effet de deux médiateurs lipidiques sur le vieillissement des vaisseaux, 320 souris âgées de deux à vingt-quatre mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à trois injections intrapéritonéales par semaine pendant un à trois mois, avec un prélèvement de sang hebdomadaire sur animal vigile, la dernière prise de sang étant terminale. Le porteur écrit que "le bien-être animal est au cœur de cette étude" et que les contraintes subies restent faibles, tout en reconnaissant le stress lié à la fréquence des manipulations et la douleur au point d'injection. Aucun analgésique ne peut leur être administré, les antidouleurs modulant l'expression des lipides étudiés, et les souris atteignant un point limite sont tuées.
Objectifs
Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle de 2 médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système de coagulation. Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation de l’implication du lipide 1 dans le vieillissement vasculaire Axe 2. Evaluation de l’implication du lipide 2 dans le vieillissement vasculaire
Bénéfices attendus
Le choix des lipides à tester (2) ainsi que leur concentration ont été déterminées grâce à nos études in vitro et ex vivo chez l’humain. Brièvement, les lipides circulants dans le sang des humains ont été mesurés et quantifiés en spectrométrie de masse, puis étudiés sur cellules tapissant les vaisseaux sanguins (les cellules endothéliales) in vitro. Cependant, l’effet in vitro est certes significatif, mais ne représente pas la complexité d’un modèle vivant entier. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’impact de ces lipides sur le vieillissement en général, mais aussi vasculaire et à l’échelle multi-cellulaire.
Procédures
Les prélèvements sur animaux vigiles auront lieu 1 fois par semaine sur 1 à 3 mois selon les groupes
Impact sur les animaux
Nous sommes conscients que la répétition de contentions restreignantes, d'injections IP, et de prises de sang peuvent entrainer des effets indésirables. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Les animaux risquent d'être stressé par le nombre fréquent de manipulation pour les injections en IP (1 à 3 fois par semaine, de 1 à 3 mois). Ils risquent de ressentir une douleur au niveau de l'injection en IP. La prise de sang est terminale sous anesthésie
Devenir
A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’usage de médiateurs lipidiques nécessite l’évaluation de l’efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant mise en place chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le vieillissement sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs. Afin de réduire le protocole, deux études pilotes dans l’Axe 1 et 2 utiliseront chacune 80 souris afin d’optimiser la durée du traitement avec les lipides et le nombre d’injection. Dans l’étude principale #2 et 4, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 10 par groupe experimentale (a
Raffinement
Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations de la coagulation par exemple. Les souris utilisées seront de 2 à 24 mois. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (2 mois) et souris vieillissante de 6 à 24mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.
Évaluation de thérapies anti cancer dans des modèles de greffe orthotopique de cellules tumorales par voie rectale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales sont injectées dans la muqueuse intestinale par voie rectale sous endoscopie, geste répété chaque semaine pour suivre la croissance de la tumeur. 2 752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever rate, ganglions, intestins et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements anticancéreux par voie orale, rectale, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou par gavage, avec des prélèvements de sang à la veine faciale jusqu'à une fois par semaine. Le porteur affirme que l'effectif est calculé "au plus juste" à partir d'expériences antérieures en greffe sous-cutanée, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 2 752 animaux.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la continuité de projets déjà existants et ayant donné des résultats très prometteurs. Il consiste à mettre au point des modèles de greffe de cellules tumorales dans la muqueuse intestinale afin de se rapprocher au plus près de ce qui se passe chez l’homme dans le cas de personnes atteintes de cancer digestif. En effet des expériences préliminaires ont été réalisées en greffant des cellules tumorales sous-cutanées afin de développer et de tester de nouvelles approches de thérapies de vaccination anti-cancer. Afin de continuer et d’optimiser ces thérapies, il est intéressant et judicieux d’améliorer les modèles d’études. La localisation des cellules tumorales est un paramètre important à prendre en compte dans nos études. En effet, celle-ci peut modifier la réponse aux thérapies due à un différentiel de biodistribution du médicament selon les organes, le microenvironnement, une réponse immunitaire différente selon les organes. C’est pour cela qu’il est important de développer des modèles murins de greffe de cellules tumorales au niveau de l'instestin. De plus dans le cancer colo-rectal les immunothérapies sont peu efficaces, cette étude a pour objectif de tester un traitement local in-situ afin d’augmenter les efficacités de traitements. La stratégie de vaccination des lésions in-situ permettrait d’empêcher les lésions pré-cancéreuses de se développer.
Bénéfices attendus
Malgré les progrès importants dans la prise en charge des patients atteints de cancer digestifs, un certain nombre ne répondent pas aux différente de traitement ou récidivent. Il est donc essentiel de développer de nouvelles thérapies ou d’optimiser les traitements existants. Pour cela, nous avons besoin de modèles se rapprochant au plus près de la pathologie humaine. L’utilisation du modèle murin de greffe de cellules tumorales issues de cancer digestifs au niveau de l'intestin permettra de créer un environnement au plus proche de celui des cancers digestifs chez l’Homme et pourra ainsi répondre à des interrogations auxquelles nous ne pouvons pas répondre dans les modèles traditionnels de greffe tumorale en sous-cutané.
Procédures
Les animaux subiront une endoscopie sous anesthésie afin d'injecter des cellules tumorales dans la muqueuse intestinale. Ces animaux subiront ensuite d'autres endoscopies sous anesthésie afin de suivre l'évolution de la tumeur (une par semaine). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie une fois par semaine, une injection intra-péritonéale de produit de traçage sera réalisée suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie. Les animaux recevront ensuite différents traitements anti-cancer (un traitement par animal). Ceux-ci seront administrés soit par voie orale, rectale sous endoscopie, intra-musculaire, intra-péritonéale, inra-veineuse ou par gavage. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
La greffe des cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie gazeuse par endoscopie dans la muqueuse intestinale ce qui peut induire un stress de l’animal. Le développement des tumeurs peut être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (poids, état général) 3 fois par semaine et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection IP de luciférine lors de l’utilisation de lignées cellulaire possédant la luciférase ou par endoscopie.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes (rate, ganglions, intestins, tumeurs...) et ainsi réaliser des analyses immunologiques complémentaires. Ces analyses sur les organes permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement tumoral ainsi que les mécanismes d'actions et les conséquences des traitements.
Remplacement
Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans le cancer. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire in vitro, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu. Préalablement à ces expériences in vivo des études in vitro ont été réalisées afin de définir des conditions optimales de croissance tumorale et de conditions d’administration des traitements.
Réduction
Ces expériences in vivo sont réalisées pour soutenir et compléter des résultats qui ont été obtenus in vitro. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de pouvoir montrer des différences significatives ainsi que la reproductibilité et la répétabilité des résultats obtenus. Ces effectifs sont calculés à partir des résultats que l’on a pu obtenir par le passé sur des expériences utilisant des modèles de greffe sous cutanée ainsi que les données de la littérature sur le sujet.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation, les souris seront habituées au geste de la contention et à la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, contrôle du cycle lumineux, de l’hygrométrie et de la température). Ils bénéficient d’un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont manipulés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les animaux seront suivis de façon adaptée à l’intensité de la pathologie afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie par bioluminescence seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place des endoscopies. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage, la capacité de locomotion et la présence d’une douleur qui sera évaluée grâce à une grille de score précise. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.
Choix des espèces
La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Des souris âgées de 4 à 12 semaines seront utilisées. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après implantation de la tumeur. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés. Par ailleurs, la majorité des données publiées concernant le modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales au niveau de l’intestin a été obtenue chez des souris jeunes adultes, ce qui permet de comparer les résultats générés dans ce projet avec ceux de la littérature scientifique et d'assurer la reproductibilité des expériences.