Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude, par imagerie intravitale, du rôle des HEV (high endothelial venule) induit par le vaccin H107e sur la migration, le positionnement et l’expansion des cellules immunitaires chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 960 subissant une chirurgie du thorax suivie de cinq heures d'observation au microscope sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 640 d'entre elles, modéré pour 640 et sévère pour 960. 1 600 sont infectées par la tuberculose au moyen d'un nébuliseur, maintenues éveillées en contention pendant 40 à 45 minutes dont 17 minutes d'exposition à la bactérie. 1 600 reçoivent aussi deux injections vaccinales sous anesthésie générale à quatre semaines d'intervalle, l'anesthésie provoquant selon le porteur une hypothermie et une déshydratation. Ce qu'il attend du projet, comprendre comment se forment des vaisseaux qui recrutent des lymphocytes dans les lésions pulmonaires, reste une étape de connaissance fondamentale, l'optimisation de vaccins étant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
Dans certaines maladies, des structures liées au système immunitaire appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS) apparaissent comme la conséquence d'agressions locales qui ne se résolvent pas, comme les infections chroniques, les maladies auto-immunes et certaines formes de cancer. Les TLS sont des structures qui ressemblent aux ganglions lymphatiques avec le même type d'organisation, des zones de lymphocytes B et des zones de lymphocytes T dans lesquelles on retrouve des veinules particulières appelées HEV . Ces dernières sont des portes d'entrées privilégiées pour les lymphocytes. Lors de l’infection par l’agent pathogène Mycobacterium tuberculosis (M. tb) chez l’Homme, des TLS pulmonaires se forment autour des lésions créées par la bactérie. Bien que les mécanismes soient encore méconnus, les TLS semblent posséder une capacité protectrice lors de l’infection par M. tb. L’hypothèse du projet présenté ici s'appuie sur cette observation et a pour but de comprendre comment les HEV se mettent en place lors de ces infections et si elles peuvent permettre une meilleure infiltration de lymphocytes dirigés contre la bactérie au sein des lésions afin d'améliorer la réponse immunitaire contre la bactérie. Enfin, la démonstration du caractère protecteur des TLS vis à vis des infections par M. tb permettrait d’optimiser le dévéloppement de vaccins favorisant la formation de ces structures au cours de l’infection.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) comprendre les mécanismes de formation et de fonctionnement des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) dans le contexte de l’infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tb) ; (ii) identifier des voies d'induction de TLS dans des pathologies pulmonaires infectieuses afin d'améliorer la réponse immunitaire contre ces infections.
Procédures
Dans ce projet, 1600 souris seront vaccinées sous anesthésie générale. Le vaccin sera administré deux fois au total, espacé d’une durée de quatre semaines entre chaque injection. Chaque injection ne durera pas plus de 10 secondes. L’infection par aerosol de Mycobacterium tuberculosis concerne 1600 souris parmi lesquelles 960 auront aussi été vaccinées. L'infection est réalisée sur des animaux vigiles à l’aide d’un nébuliseur. Les souris seront mises en contention pour une durée maximale de 40 à 45 minutes, dont 17 minutes correspondent à l’infection par l’agent pathogène. Les 960 souris vaccinées et infectées seront soumises à une chirurgie pour effectuer de la microscopie sur les poumons ainsi qu'à 2 ou 3 injections intraveineuse sous anesthésie générale. Ces 960 souris seront aussi soumises toujours sous anesthésie générale à une injection de serum physiologique en intrapéritonéale pour un maintien de l'hydratation. Chaque injection ne durera pas plus de 10 secondes. La chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes et l’acquisition au microscope ne dépassera pas une durée de cinq heures.
Impact sur les animaux
Les souris qui sont vaccinées et celles qui sont soumise à une chirurgie subissent du stress dû à l’injection et à l’anesthésie. Les lignées de souris démontrées comme étant susceptibles à l’infection par Mycobacterium tuberculosis (M. tb) subissent une perte de poids suite à l’infection. L’anesthésie nécessaire pour la chirurgie et la microscopie provoque une hypothermie et une déshydratation chez la souris.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure car ces derniers nécessitent le prélèvement de rate (procédure 2 et 3) ou sont classées comme des procédures sévères.
Remplacement
Nous nous intéressons dans ce travail au rôle de vaisseaux appelés HEV dans le recrutement de cellules du système immunitaire, les lymphocytes dans des lésions pulmonaire liées à des infections bactériennes. Cela ne peux pas être réduit à des modèles en culture cellulaires car ces études nécessitent l'organisme entier avec la circulation sanguine, le système respiratoire et le système immunitaire. Nous devons donc travailler sur des organismes vivants et suffisamment proche de l’homme.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 2240 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré des points de décisions d'aller ou non de l'avant dans notre projet. Ainsi certaines étapes pourront être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des résultats obtenus. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque groupe a été déterminé par nos études antérieures et celles de la littérature. Il est de 10 animaux dans chaque groupe étudié, un nombre d’individus suffisants pour obtenir des résultats statistiquement significatifs
Raffinement
La stratégie de raffinement est premièrement fondée sur l’utilisation de points limites précoces, prédictifs et adaptés. Le suivi des animaux est réalisé par les expérimentateurs ou l’équipe de zootechnie quotidiennement (aspect externe, comportement, pesée). Les procédures d'injections et de chirurgie ont été optimisées afin de générer le moins de stress et de douleurs aux animaux. Pour ces chirurgies, les animaux sont anesthésiés et un analgésique est administré pour gérer la douleur. Les conditions d’hébergement et les méthodes expérimentales utilisées sont les plus appropriées pour réduire au maximum toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé pour étudier l’immunité anti-infectieuse de par son fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la pathologie chez l'Homme, par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, le recours au modèle murin dans la microscopie est très répandu grâce aux divers modèles permettant la visualisation, le suivi et l’identification des populations de cellules d’intérêt. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines au début des procédures. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
Étude du rôle du génome silencieux sur l’immunogénicité de lignées cancéreuses.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est immunodéficiente, dépourvue des défenses qui lui permettraient de rejeter les cellules tumorales qu'on lui greffe. 8 172 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Éveillées, elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous la peau du flanc, puis des traitements deux fois par semaine jusqu'à l'atteinte du point limite, environ trois semaines pour les groupes non traités, et pour certaines quatre injections directement dans la tumeur dès qu'elle atteint 100 mm3. Leur mort permet les analyses post-mortem, le porteur revendiquant la nécessité de valider dans "un organisme dans son intégralité" des observations qu'il a d'abord obtenues sur lignées cellulaires.
Objectifs
Les immunothérapies anti-tumorales visent à détruire les cellules cancéreuses en stimulant ou en réorientant le système immunitaire (SI). Ces traitements sont prometteurs et permettent déjà de guérir des patients, mais certaines tumeurs échappent au SI et il est essentiel d’améliorer ces approches. Les lymphocytes T tueurs sont des cellules essentielles pour l’immunité anti-tumorale. Pour fonctionner, elles ont besoin de reconnaître un peptide (appelé néoantigène - néoAg), exprimé par les cellules cancéreuses. Identifier les mécanismes de production de néoAgs et des stratégies pour moduler leur expression est un enjeu central de la recherche en immunothérapie. Les chercheurs ont longtemps cherché des néoAgs provenant de gènes codants, dérivant de mutations acquises par les cellules tumorales pendant le développement du cancer. Mais ces mutations sont souvent spécifiques à chaque patient, et donc difficiles à cibler. Il faut donc trouver d’autres sources de néoAgs. On parle souvent du rôle des gènes dans le développement de pathologies humaines, mais ils représentent seulement 2% du génome. On a longtemps pensé que le reste du génome (dit silencieux) ne s’exprimait pas. Plusieurs études récentes ont montré que le génome silencieux peut s’exprimer dans les tumeurs et favoriser leur destruction par le système immunitaire. L’inactivation de gènes impliqués dans « la mise sous silence » du génome silencieux permet son expression et conduit à une meilleure reconnaissance des tumeurs par le SI. Ils sont donc des candidats prometteurs pour le développement de thérapies. Il reste cependant beaucoup à comprendre sur la nature exacte de la régulation de ce génome silencieux et c’est le but de ce projet. Le premier objectif est d’identifier des gènes participant à sa « mise sous silence ». Le deuxième est de cibler ces gènes pour améliorer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le troisième est de déveloper un traitement pour spécifiquement réveiller une partie du génome silencieux codant pour un néoAg pour améliorer les réponses immunitaires anti-tumorales. L’objectif général du projet est de comprendre les mécanismes de régulation du génome silencieux pour mieux instruire l’établissement de protocoles d’immunothérapie.
Bénéfices attendus
Il est essentiel de noter que la très grande majorité des cancers développent des mécanismes très efficaces qui inhibent la réponse immunitaire. Un enjeu actuel de la recherche en immunothérapie est d’identifier des mécanismes de productions de néoantigènes (qui seraient des nouvelles cibles) par les cellules tumorales et d’établir des traitements ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet. Ces expériences vont permettre de mieux caractériser le ou les mécanismes de régulation du génome silencieux dans les cellules tumorales. En effet, certains éléments du génome permettent de produire des protéines spécifiques de la tumeur et capables d’augmenter la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur et non les tissus sains. Par ailleurs, ce projet cherche à mettre en place un protocole permettant d’augmenter l’expression de ces néoantigènes afin de pouvoir les utiliser dans des stratégies thérapeutiques pour améliorer de manière large la réponse des cancers à l’immunothérapie.
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales seront injectées à des souris par voie sous-cutanée au niveau d’un des flancs, sur animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une deuxième procédure, après l’injection de cellules tumorales (identique à la 1ère procédure), les animaux seront traités par injection sur animaux vigiles 2 fois par semaine (durée du geste inférieure à 10sec), jusqu’à l’atteinte du point limite (environ 3 semaines pour les souris recevant les tumeurs sans traitement) ou pour un maximum de 60 jours (si les tumeurs sont rejetées). Un à deux prélèvements sanguins (2 semaines après injection) et/ou au moment de la mise à mort des animaux seront réalisés sur animaux vigiles (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 sec). Dans une troisième procédure, les animaux seront injectés par voie sous-cutanée au niveau du flanc (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dans une quatrième procédure, des cellules tumorales seront injectées sur les animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inférieure à 10 sec). Dès que les tumeurs atteignent environ 100mm3, le traitement sera injecté dans la tumeur des animaux vigiles à raison de 4 injections tous les 4 jours ( durée du geste inférieure à 10 sec). Un des groupes d’animaux sera également injecté en intraveineuse 24h avant le début du traitement.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. Pour les expériences d’injections de cellules tumorales ou des traitements, il est attendu une douleur directe associée à l’utilisation d’une aiguille. Pour le prélèvement de sang, il est attendu une douleur légère liée à la réalisation (gène de courte durée). En ce qui concerne les injections intratumorales, nous utiliserons un format de traitement utilisé en routine pour traiter des patients par injections locales. Aucune inflammation n’est attendue après ce traitement, mais les souris peuvent ressentir de la douleur pour un temps limité après l’injection.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour des analyses post-mortem
Remplacement
Les lignées tumorales ont d’abord été étudiées in vitro (marqueurs de surface, croissance). Dans le cas des traitements visant à manipuler spécifiquement l’expression de néoantigènes dérivant du génome silencieux, des expériences ont été réalisées in vitro dans les lignées cancéreuses, nous savons donc qu’elles réagissent à ce traitement. Le projet est aussi avancé que possible, cependant des tests in vivo sont maintenant nécessaires pour comprendre le rôle de ces lignées sur la réponse immunitaire dans un contexte physiologique entier. En effet, dans le cas des lignées cellulaires déficientes pour des gènes de régulation, nous allons analyser la présence de cellules immunitaires entre les conditions déficientes et contrôles grâce à un prélèvement de sang.
Réduction
Lorsque cela est possible, afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, les études sont réalisées au préalable sur des lignées cellulaires in vitro, modifiées pour les gènes d'intérêt. Nous pouvons ainsi tester un nombre important de paramètres, puis passer aux modèles animaux uniquement quand le projet est aussi avancé que possible. Cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet. Néanmoins, il est nécessaire de valider ces observations dans le contexte d'un organisme dans son intégralité plus physiologique. Le nombre d'animaux par groupe est défini à l'aide d'un outil statistique.
Raffinement
Les animaux seront suivis régulièrement afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Une grille de score a été établie afin d’évaluer de façon objective l’état des animaux. Les animaux seront mis à mort dès l’atteinte des points limites. Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés 2 à 3 fois par semaines pour leur état général et pour mesurer la taille de la tumeur.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins. D’autre part, la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes. Enfin, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantables disponibles.
Etude du cervelet dans un modèle murin d’ataxie cérébelleuse pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris subissent une biopsie de la queue, puis une anesthésie de cinq minutes avant la mise à mort. 176 souris porteuses d'une mutation du gène de l'ataxine-1 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance modéré, une partie à cinq semaines, l'autre à vingt semaines. Ce qu'elles subissent tient surtout à leur génotype, les mutantes grandissant moins vite que les témoins et portant une ataxie qui atteint chez les patients la marche, la coordination et l'équilibre. Le porteur annonce les tuer à vingt semaines "avant l'apparition des symptômes les plus sévères", sans nommer les symptômes moteurs qui apparaissent avant ce terme ni la manière dont il les mesure.
Objectifs
Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies génétiques rares qui affectent un groupe spécifique de neurones dans une partie du cerveau appelée le cervelet. Elles entraînent des problèmes de mouvement tels que des difficultés à marcher, à coordonner les mouvements et à maintenir l’équilibre. L’une de ces maladies est l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1), qui se développe généralement à un âge avancé et est causée par une mutation génétique. Cette mutation empêche une protéine appelée ataxine-1 de fonctionner correctement. Malgré les progrès, les causes précises de cette maladie et pourquoi seulement certains types de cellules du cervelet sont affectés restent encore inconnus. L’objectif de cette étude est d’utiliser un modèle de souris génétiquement modifié pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires. Le modèle souris utilisé porte une mutation du gène de l’ataxine-1 comparable aux mutations retrouvées chez les patients et développe des symptômes récapitulant fidèlement les caractéristiques de la maladie chez l'homme. Les objectifs détaillés de cette étude sont : - d’identifier le profil d’expression des gènes de chaque type de cellules du cervelet chez des souris mutantes en comparaison des souris contrôles afin de détecter les changements d’expression de gène induit par la mutation dans un ou plusieurs types de cellules du cervelet - réaliser cette étude de profil d’expression des gènes à deux moments du développement de la maladie : avant et au moment de l’apparition des symptômes Ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition de la maladie SCA1.
Bénéfices attendus
Ce modèle murin présente les caractéristiques typiques de la maladie humaine SCA1, c’est pourquoi nous pensons qu’il est le bon modèle pour rechercher et étudier les voies moléculaires qui sont dérégulées. Trois bénéfices principaux sont attendus : -Identifier les voies moléculaires responsable pour le développement et la progression de la maladie qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier les régions du cervelet qui sont le plus touchés par cette mutation, ce qui nous permettra de mieux comprendre la maladie. -Identifier des défauts moléculaires précoces qui pourront être des nouvelles cibles thérapeutiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront soumis aux procédures suivantes (toutes sont incluses dans la classe modérée) : - biopsie au niveau de la queue pour génotypage, 1x par souris. Cette procédure dure 1 seconde. - anesthésie avant la mise à mort. Cette procédure dure 5 minutes. - injection des analgésiques et anesthésie avant la mise à mort. Ces procédures durent 15 minutes.
Impact sur les animaux
Au cours de la période couverte par le plan expérimental, les souris présentant une mutation de l’ataxine 1 présentent une croissance ralentie par rapport aux souris témoins. De plus, une douleur légère et transitoire est attendue au moment de la biopsie au niveau de la queue ainsi que lors des injections d’analgésique et d’anesthésique.
Devenir
Pour les analyses moléculaires, biochimiques et histologiques, une mise à mort est nécessaire à la fin de la procédure, en respectant les points limites et la progression de la maladie.
Remplacement
L’objectif de cette étude est de caractériser la dérégulation moléculaire dans chaque type de cellules du cervelet. Pour ce faire, nous devons utiliser des modèles animaux car il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Afin d’évaluer les modifications de transcription des gènes nous devons collecter des tissus (cervelet) de souris mutantes et sauvages.
Réduction
Pour mener à bien ce projet, nous prévoyons d'utiliser 176 souris sur une période de 5 ans, ce nombre comprenant la maintenance de la lignée et les procédures expérimentales. Toutes les procédures sont organisées de manière à réduire le nombre de souris, tout en tenant compte du nombre minimum d’animaux nécessaires pour appliquer des tests statistiques afin d'évaluer la robustesse des résultats finaux.
Raffinement
Les souris seront manipulées par contention douce (dans le creux de la main ou dans un tube en carton servant d’enrichissement). Les souris seront soumises à une anesthésie générale avant la mise à mort. De plus, pour la procédure chirurgicale nécessaires à la préparation du cerveau avant prélèvement pour analyse histologique, les souris recevront un traitement antalgique avant l'induction de l'anesthésie terminale. Les animaux seront mis mort à 20 semaines avant l’apparition des symptômes les plus sévères du phénotype. Néanmoins, en cas de difficulté d’accès à l’alimentation,de la nourriture gélifiée sera mise à disposition dans la cage.
Choix des espèces
Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser les souris parce que ces présents des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. Nous prévoyons d'analyser les animaux à deux âges différents : à 5 semaines quand les souris n’ont aucun problème moteur mais avec des dérégulations moléculaires déjà présentes, et à 20 semaines quand les symptômes débutent. La comparaison des souris témoins et des souris mutantes à ces deux moments du développement des symptômes nous fournira des indications intéressantes sur les dérégulations moléculaires dans cette maladie, ainsi que sur les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie.
Oestradiol et cachexie chez la souris Apc
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
300 souris Apc, qui développent une cachexie cancéreuse entre onze et quinze semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la moitié et sévère pour l'autre. Les femelles subissent une ablation des ovaires de quinze minutes, puis l'implantation sous la peau d'une pastille d'œstradiol, un prélèvement de sang et une mesure de force musculaire de trente minutes qui exige une incision de la peau. Le porteur indique que l'ablation des ovaires entraîne à elle seule une perte de poids et de masse musculaire de 2 à 5 %, celle-là même que le protocole cherche à mesurer. Il conclut que "seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu", après avoir écarté tout système in vitro en une phrase.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peuvent être observées dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Nos données préliminaires obtenues dans un modèle murin de cachexie associée au cancer, la souris Apc, suggèrent l'existence d'un dimorphisme sexuel dans le développement de la cachexie, les souris âgées de 15 semaines ne faisant ni l'experience d'une perte de masse musculaire ni celle d'une perte de force musculaire. Par ailleurs, des données de la littérature indiquent que
Bénéfices attendus
En déterminant le rôle protecteur potentiel des oestrogènes face au développement de la cachexie associée au cancer, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie, et de proposer des stratégies d'intervention basés sur l'utilisation de modulateurs de l'activité du récepteur aux estrogènes.
Procédures
Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris femelles, les souris femelles seront soumises aux interventions suivantes sous anesthésie gazeuse : ovariectomie (durée totale 15 min), implantation sous-cutanée de pastilles contenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min). Les prélèvements tissulaires (15 min) sont réalisés sous anesthésie chimique. Pour déterminer si l'oestradiol exerce un effet protecteur face au déconditionnement musculaire des souris mâles, les souris mâles seront soumises aux interventions suivantes: implantation sous-cutanée de pastillescontenant de l'oestradiol (durée totale 3 min), prélèvement sanguin (5 min), mesure de force musculaire (30 min), prélèvements tissulaires (15 min).
Impact sur les animaux
La procédure d'ovariectomie ainsi que l'implantation de la pastille sont réalisées avec administration de brupénorphine pour limiter les suites douloureuses de l'intervention. Une observation des animaux sera réalisée toutes les 2 heures pendant 6H00 après l'ovariectomie, puis toutes les 24H00 afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Le cas échéant une ré-administration de buprénorphine pourra être effectuée. L'ovariectomie est étant elle-même à l'origine d'une légère perte de poids et de masse musculaire (de l'ordre de 2 à 5%), nous serons donc particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une courbe de suivi de masse corporelle sera effectuée en mesurant leur poids tous les 2 à 3 jours. Les mesures de forces musculaires impliquent une approche chirurgicale nécessitant une incision au niveau de la peau. Afin de limiter les souffrances des souris, une anesthésie profonde à l'isofurane sera effectuée depuis le début de l'approche chirurgicale jusqu'à l'injection d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour réaliser les prélèvements tissulaires.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort de façon éthique au terme de chaque procédure afin de procéder à des prélèvements tissulaires.
Remplacement
La cachexie associée au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus, le muscle bien évidement, mais aussi le système neuroendocrinien (axe gonadotrope). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en jeu.
Réduction
Nous avons avons utilisé un teste statistique en ligne afin de déterminer la taille du groupe optimale pour obtenir des résultats ayant une force statistique suffisante robuste. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 15 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront inclus qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 14 animaux par groupe nécessaire à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères, le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
Les données dans le domaine de la cachexie associé au cancer ont largement été obtenue chez la souris. Par ailleurs, l'ensemble des techniques nécessaires à la réalisation de ce projet a été développé chez la souris. En travaillant chez la souris, nous pourrons donc interpréter nos données à la lumière des données publiées dans le domaine et nous éviterons toute étape de mise au point préalable qu'aurait nécéssité l'utilisation d'un autre modèle animal. Par ailleurs, la cachexie associée au cancer est un processus multifactoriel systémique mettant en jeu de nombreux tissus (muscle, tissus endocriniens, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 11 semaines correspondant à un stade précachectique chez les souris mâlesApc. La fin de procédure aura lieu a l'âge de 15 semaines correspondant à une stade cachexie modérée chez les souris mâles Apc. La cachexie sé développent entre l'âge de 11 et 15 semaines, un traitement pendant cette période permettra de vérifier l'efficiacité de l'oestrogénothérapie.
Effet d’une nouvelle molécule satiétogène associée ou non à une molécule de référence sur le poids corporel et la prise alimentaire de souris C57BL6/J nourries avec un régime hyperlipidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Rendues obèses par seize semaines de régime hyperlipidique, 108 souris sont utilisées pour tester une molécule satiétogène, seule ou associée à une molécule de référence, en vue d'un futur essai clinique de phase 1. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, et leur sang, leur foie, leur cœur et leur tissu adipeux sont prélevés. Elles reçoivent une injection sous-cutanée tous les deux jours pendant quatre semaines, sont pesées chaque jour pendant vingt-huit jours, puis passent une IRM de trente à quarante minutes sous anesthésie avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur écrit être "malheureusement contraint" d'utiliser des animaux non-humains, tout en précisant dans la même rubrique que ses collaborateurs américains ont déjà validé l'efficacité de la molécule par une étude pilote in vitro et in vivo.
Objectifs
L'obésité est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations de lipides élevées dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester l'effet d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt donnée seule ou en combinaison avec une molécule de référence.
Bénéfices attendus
Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules satiétogènes nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses.
Procédures
Les souris recevront une injection sous cutanée tous les 2 jours pendant 4 semaines. Les souris seront pesées chaque jour pendant 28 jours. A jour 28, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Le protocole est léger, il comporte que des injections sous-cutanées tous les 2 jours, des prises de poids et une analyse non invasive terminale par IRM. Nous n’attendons pas d’effets indésirables majeurs néanmoins une surveillance appuyée des sites d'injections sera réalisée pour s'assurer de la bonne tolérance de la molécule.
Devenir
A l'issu de la procédure tous les animaux seront mis à mort et des organes (sang, foie, coeur, tissu adipeux) seront prélevés.
Remplacement
Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux. il est à noter que l'efficacité de la molécule a déja été validé par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo.
Réduction
Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Le calcul d’effectif a été défini avec GPower.
Raffinement
Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les animaux seront hébergés dans un environnement sain et sans pathogène. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton.
Choix des espèces
Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégré les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Nous maitrisons un modèle de souris sauvages rendues obèses par un régime hyperlipidique. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous utiliserons des souris agées de 8 semaines au moment de la mise sous régime hyperlipidique et la fin de l'étude sera prévue 16 semaines plus tard. A cet age, les paramètres métaboliques sont stables et ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.
Mécanismes neuronaux impliqués dans une période critique de développement du cortex chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie du cerveau de 45 minutes est pratiquée sur des souriceaux d'un à sept jours, des juvéniles de quatorze à dix-sept jours ou des adultes. Une à deux semaines plus tard, un œil est suturé sous anesthésie, opération de dix minutes qui prive l'animal de la vision de cet œil pendant 36 à 72 heures. Un à trois jours après cette fermeture, une dernière chirurgie de cinq minutes est menée sans réveil. 1 620 souris passent par ces étapes, 300 dans des procédures conduites sous anesthésie sans jamais reprendre conscience et 1 320 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées parce que les prélèvements du cortex se font après la mort.
Objectifs
La plasticité (capacité de remodelage) du cerveau est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Cependant, cette perte de plasticité au cours du développement n’est pas un phénomène progressif. Le cortex présente une période de plasticité accrue dite « période critique », pendant laquelle les circuits sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une maladie touchant la vision binoculaire pendant la période critique chez l’enfant aura des impacts irréversibles sur l’acuité visuelle. Cette période critique a été identifiée chez un grand nombre de mammifères. La compréhension des mécanismes de la période critique ouvre aussi la perspective, à plus long terme, de pouvoir « réinstaurer » une plasticité de type juvénile au cerveau adulte et lésé. La période critique est généralement étudiée dans le cortex visuel en utilisant une fermeture d’un oeil. Cette augmentation des réponses neuronales (plasticité) ne se produit pas si la fermeture de l’œil a lieu avant ou après la période critique. Des études récentes ont pu mettre en évidence le rôle de certains types de neurones dans ce phénomène. Dans ce projet, nous étudions le développement des neurones impliqués dans la période critique du cortex visuel pour identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables du pic de plasticité au cours du développement du cerveau chez la souris.
Bénéfices attendus
Premièrement, le projet vise à comprendre les mécanismes qui préside à la plasticité très forte du cerveau au cours de la maturation du cerveau chez les mammifères (enfance chez l’humain), ce qui a un intérêt majeur en recherche fondamentale. Deuxièmement, nos expériences modéliseront chez la souris une condition pathologique courante chez l'homme. Les cataractes congénitales entraînant des entrées visuelles inégales pendant l'enfance peuvent provoquer l'amblyopie, une condition qui affecte deux à cinq pour cent de la population, dans laquelle la vision à travers un œil, "l'œil paresseux", est faible bien que l'œil lui-même soit parfaitement sain. Si le traitement précoce de l'amblyopie ou de l'œil paresseux est généralement simple et consiste à utiliser des lunettes ou des cache-œil, l'amblyopie ne peut pas être traitée chez les enfants de plus de 10 ans. L'application des travaux fondamentaux sur la période critique de la plasticité du cortex visuel pourrait permettre de traiter l'amblyopie chez les adolescents et les adultes. Troisièmement, ce projet aborde des questions de plasticité cérébrale qui ont un impact au-delà du développement du cortex. Des périodes critiques existent dans de nombreuses zones du cerveau et peuvent reposer sur des mécanismes communs. La découverte, ici dans des modèles murins, de voies par lesquelles des fenêtres de plasticité accrue pourraient être rouvertes chez les adultes pourrait avoir des implications pour la réparation des lésions cérébrales et la récupération sensorielle. Enfin, les périodes critiques de plasticité élevée sont aussi des périodes de vulnérabilité pour le cerveau en développement. Une perturbation précoce des expériences sensorielles ou sociales appropriées entraînera des circuits mal câblés qui réagiront de manière sous-optimale aux expériences normales à l'avenir. Il est probable que de telles perturbations sous-tendent des troubles neurodéveloppementaux tels que l'épilepsie, l'autisme et la schizophrénie.
Procédures
Pour un premier groupe d’animaux, une chirurgie sans réveil sous anesthésie sera réalisée, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs (5 minutes). Pour un second groupe d’animaux, une chirurgie du cerveau sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie (45 minutes) soit au stade néonal, soit au stade juvénile, soit au stade adulte. Une à deux semaines après cette chirurgie, une chirurgie sans réveil sous anesthésie sera réalisée permettant les prélèvements et analyses ultérieurs (5 minutes). Pour un troisième groupe d’animaux, une chirurgie du cerveau sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie (45 minutes) soit au stade néonal, soit au stade juvénile, soit au stade adulte. Une à deux semaines après cette chirurgie, une chirurgie par suture d’un œil sous anesthésie générale et analgésie (10 minutes) sera réalisée. Après un à trois jours de fermeture d’un œil, une chirurgie sans réveil sous anesthésie sera réalisée, permettant les prélèvements et analyses ultérieurs (5 minutes).
Impact sur les animaux
La fermeture d’un œil affectera la vision des souris pendant 36 à 72h. Dans le cadre de la chirurgie, des nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation et à des difficultés de mouvements. Un cannibalisme des petits par la mère peut, dans de rares cas, survenir après chirurgie chez le nouveau-né. Des douleurs postopératoires et un stress sont aussi possibles après chirurgie. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire.
Devenir
Pour chaque procédure, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
L’étude de l'impact de la fermeture d’un œil sur le fonctionnement du cortex nécessite de d'utiliser des animaux. En effet, l’interaction entre circuits neuronaux du cortex, circuits neuronaux des voies visuelles et exposition à des stimuli lumineux résulte de processus de développement complexes qui ne peut pas être modélisés in vitro. Ainsi, le modèle animal n’est pas remplaçable pour ce projet. Cependant, notre laboratoire, dans le cadre de projets portant sur le même thème (bases neurobiologiques de la plasticité du cerveau) utilise aussi des modèles de cellules pour des caractérisations d’effets génétiques.
Réduction
La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Sur la base de résultats d’expériences utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes grâce au calcul de puissance. Au total, 1620 animaux sont inclus dans le projet.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont hébergés dans des pièces dans lesquelles la température, l’hygrométrie, et le cycle de lumière (12/12) sont contrôlés, et ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans une pathologie humaine. Ce choix est aussi dicté par la possibilité d’effectuer chez la souris des manipulations qui permettent de cibler une population neuronale à un point précis du développement prénatal. Les souris impliquées dans l’étude du développement neuronal sont des souris jeunes à des stades de développement qui permettent d’étudier les conséquences de la modification d’expression de gènes sur les propriétés des connexions entre neurones à trois stades de développement qui permettent d’étudier la période de plasticité accrue du cortex : les souris seront incluses en procédure soit avant cette période (souris entre 1 et 7 jours), soit pendant cette période (souris entre 14 et 17 jours), soit après cette période (souris entre 40 et 100 jours).
Édition génomique par CRISPR Cas9 pour traiter les cardiomyopathies liées aux mutations du gène LMNA, dans un modele murin Lmna p.H222P homozygote.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris sont tuées à six mois d'âge, avant l'insuffisance cardiaque qui frappe 80 % d'entre elles vers dix mois chez les mâles et douze chez les femelles. 120 souris porteuses d'une mutation du gène LMNA vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. À deux jours de vie, encore éveillées, elles reçoivent une injection intraveineuse d'outils d'édition génomique, puis passent une échocardiographie sous anesthésie chaque mois pendant six mois, l'anesthésie pouvant provoquer une hypothermie et, plus rarement, une défaillance cardiorespiratoire. Le porteur annonce des répercussions "majeures" en santé humaine pour une maladie sans traitement, tout en fixant l'objectif immédiat à la démonstration chez la souris d'une correction déjà obtenue sur des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines.
Objectifs
Ce projet a pour but l’évaluation de l’effet bénéfique de la correction de la mutation des lamines (protéines fibreuses) chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Il a été démontré que cette approche était un moyen de corriger le défaut génétique sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) différenciées en cardiomyocytes, porteurs de la mutation des lamines étudiées. Il est nécessaire de réaliser cette approche sur un modèle murin avec la même mutation afin de prouver ce concept en in vivo.
Bénéfices attendus
Correction génique et phénotypique pour les souris traitées. Ce projet peut aboutir à la première démonstration du bénéfice de la correction du génome sur l'atteinte cardiaque dans la cardiomyopathie due à des mutations du gène LMNA. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible.
Procédures
1) Injection intraveineuse à l'âge de 2 jours dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en une dizaine de secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 6 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse est une modalité d’administration peu invasive et facile à mettre en oeuvre, elle peut tout de même engendrer un stress et une faible douleur de courte durée chez le nouveau-né. La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive, mais l'anesthésie peut induire une hypothermie et dans de rare cas une défaillance cardiorespiratoire. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dûs à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée. Notre connaissance approfondie de l’histoire naturelle du développement de ce phénotype permet de déterminer précisément la progression de l’atteinte cardiaque et en particulier l’âge (10 mois pour les males et 12 mois pour les femelles) auquel 80pourcents des souris entrent en insuffisance cardiaque. Afin d’éviter toutes douleurs liées à l’insuffisance cardiaque, dans ce projet, les souris sont euthanasiees à 6 mois d'âge. Il peut egalement y avoir une inflammtion au site d'injection de nos AAV. Cependant cela n'a pas ete observé dans d'autres protocoles en place dans notre centre de recherche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (thérapie génique et suivi par échocardiographie). Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie causée par des mutations d'un gène spécifique. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote toutes les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie humaine liée aux mutations du gène étudié.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Néanmoins, 24 animaux par groupe (5 groupes pour un total de 120 souris) seront malgré tout nécessaires pour permettre une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier ds cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de lésions). Nous avons des mesures mises en place pour réduire la douleur pendant la procédure expérimentale (avec des points limites adaptés)
Choix des espèces
La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Nous utilisons une souche sur laquelle la mutation Lmna a été dérivée. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie liée aux mutations d'un gène spécifique. Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Les souris seront utilisées à deux jours de vie en pré-symptomatique, pour une injection intraveineuse de nos outils de correction génique. Les souris seront ensuite maintenues pour 6 mois car cela permet d'observer l'apparition et l'évolution de phénotype avant l'apparition des premiers symptomes. Le phenotype devient dommageable à 6 mois.
Développement du faisceau corticospinal dans des modèles murins : rôle des gènes de mouvements miroirs congénitaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souriceaux nouveau-nés sont endormis par le froid, dans un gant posé au contact indirect de la glace, puis tués. Sur les femelles gestantes, une ouverture de l'abdomen de 45 minutes sous anesthésie permet d'introduire du matériel génétique dans les embryons. 2 396 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance léger pour 1 344 d'entre elles et modéré pour 1 052, alors que le porteur affirme que les points limites sont respectés "de manière à éviter toute souffrance des animaux" et annonce dans le même document que certaines lignées présenteront peut-être une difficulté à se nourrir ou une absence de poche de lait dès la naissance. Toutes sont tuées, les surnuméraires nées avec le mauvais génotype, les femelles ayant porté les embryons manipulés, les souris dont le cerveau est prélevé pour analyse, et les mâles isolés pour les accouplements contrôlés qui ne peuvent plus réintégrer un groupe.
Objectifs
Le syndrome des mouvements miroirs congénitaux (MMC) induit chez le sujet un mouvement incontrôlé d'une main qui mime le mouvement volontaire réalisé par la main opposée. Les personnes présentant des mouvements miroirs ne sont pas capables d'effectuer des tâches motrices unimanuelles pures, comme écrire et ont des difficultés pour les tâches bimanuelles nécessitant un contrôle indépendant des deux mains, comme ouvrir un pot de confiture. Il s'agit d'une maladie génétique rare dans laquelle les mouvements miroirs sont la seule manifestation clinique. Trois gènes sont connus à ce jour pour être impliqués dans cette maladie mais leur rôle n'est pas clairement identifié. L’objectif de ce projet sera d'identifier le mécanisme par lequel ils influent sur l'apparition de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra des avancées importantes dans la compréhension des mécanismes de mise en place des axones des neurones impliqués dans le contrôle des mouvements volontaires et des fonctions dans le système nerveux central d’une protéine impliquée dans la réparation de l’ADN (constitutant principal des chromosomes). A plus long terme et au-delà des connaissances fondamentales sur le développement du système permettant la réalisation des mouvements volontaires, nous espérons clarifier la pathogenèse des Mouvements en Miroir Congénitaux (MMC) et proposer de nouvelles hypothèses de travail pour la recherche clinique dans le champ des maladies du mouvement. En effet, l'étude de modèles animaux et cellulaires reproduisant les défauts génétiques impliqués dans les MMC clarifiera la pathogenèse de ce trouble. Cela est important car il n'existe actuellement aucun traitement, et certains patients ont une incapacité significative dans les activités de la vie quotidienne, des douleurs aux membres supérieurs, une inhibition psychosociale et une perte d'estime de soi en raison de la maladie. Enfin, l’étude des mutations Mouvements Mirroirs de la protéine connue pour son rôle dans la réparation de l’ADN pourrait également intéresser le domaine de la réparation de l'ADN et du cancer.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles entre leur 7ème et leur 10ème jour de vie postnatale pour l'identification génétique. Ce geste sera réalisé une seule fois et n’excèdera pas 2 minutes par animal. Une chirurgie au niveau abdominale de femelles gestantes, suivie de l'introduction de matériel génétiques dans les embryons sera réalisée une seule fois. Cette procédure chirurgicale s'effectue sous analgésie et anesthésie gazeuse générale et n'exède pas 45 minutes. Les nouveau-nés recevront un antalgique avant d’être profondément endormis par hypothermie dans la glace (contact indirect) puis euthanasiés. Certains mâles seront isolés entre deux accouplements. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Lors de la génération des animaux expérimentaux, l’isolement des mâles pour la réalisation des accouplements contrôlés pourra générer un stress. Le prélèvement de l’extrémité de la queue, pour connaitre le patrimoine génétique des animaux, peut générer une légère et brève douleur. L’anesthésie par le froid chez les jeunes même sous analgésie pourra générer un stress. Les procédures de chirurgie peuvent provoquer une hypothermie pendant l'anesthésie et une douleur pendant 24/48h. Certains animaux des nouvelles lignées présenteront peut-être un phénotype dommageable soit à la naissance (difficulté à se nourrir, absence de poche de lait), soit concernant leur locomotion.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet soit parce que ce sont : i) des animaux surnuméraires (génération de mauvais génotypes pour avoir les animaux avec les génotypes d’intérêt pour notre étude), des femelles ayant généré des animaux expérimentaux (E16 ou animaux électroporés), iii) des animaux expérimentaux pour l’analyse de leur cerveau, ou enfin des mâles qui ont été isolés et ne peuvent donc plus réintégrer un groupe de mâles.
Remplacement
Les neurones impliqués dans ce syndrome et qui contrôlent les mouvements volontaires ont leur corps cellulaire dans le cortex et leur axone va jusque dans la moelle épinière. Pendant le développement, ces axones traversent de nombreuses régions du cerveau. Il n’est pas possible d’étudier un faisceau qui traverse d’aussi nombreuses régions dans des modèles de culture cellulaire. Une fois les acteurs déterminés, nous étudierons les mécanismes moléculaires à l’aide de modèles de cultures cellulaires pour limiter le nombre d’animaux utilisés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 2396 animaux. Des expériences préliminaires ont permis d’estimer à 10 le nombre d’animaux par génotype (calcul de puissance) pour obtenir des résultats statistiquement concluants. La composition des groupes d'animaux a été optimisée en restreignant leur effectif tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement concluants. Par exemple dès que nous aurons obtenus le nombre de 10 petits par génotype et par âge dans une condition, nous n’effectuerons plus de nouveaux accouplements contrôlés. Pour réduire le nombre d’animaux dont l’expression des gènes d’intérêt aura été modifié, nous utiliserons la technique d’électroporation (au lieu de générer de nouveaux modèles murins).
Raffinement
Les animaux sont sous la supervision de zootechniciens soigneurs et du vétérinaire désigné. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE. Dans le cas des mâles isolés pour les accouplements contrôlés, des bâtonnets à ronger seront ajoutés à l'enrichissement déjà présent. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les portées des 5 nouvelles lignées seront surveillées plus spécifiquement dans les premiers jours postnataux (présence de lait dans l’estomac) et au moment de la mise en place de la locomotion (P12-P15) pour détecter un éventuel phénotype dommageable. Les petits présentant des signes cliniques seront systématiquement euthanasiés. Les 2 manipulations pour l’identification et le prélèvement de l’extrémité de la queue des animaux sont réalisées au même moment pour limiter le nombre de manipulation. Concernant la procédure chirugicale, les femelles ne sont séparées que le temps de la procédure et de la récupération post-opératoire. Pendant la chirurgie, l’animal est sous anesthésie générale et placé sous un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. L’animal reçoit une injection d’un analgésique et d’un anesthésique local pour prévenir la douleur pendant et après la chirurgie. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les animaux sont placés dans une cage de réveil posée sur un tapis chauffant. Lorsque l’animal a récupéré, il réintégre sa cage d’origine. Son comportement est surveillé. Il reçoit une nouvelle dose d'analgésique 6 à 8h après son réveil. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience, notamment le jour de la mise bas afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation. Les nouveaux nés seront surveillés. En cas de rejet par la mère, ils seront euthanasiés. Les souriceaux endormis par le froid ne seront pas en contact direct avec la glace, ils seront dans un gant et recevront au préalable une injection d’analgésique.
Choix des espèces
Les souris sont des rongeurs, et comme les écureuils, elles utilisent leurs deux pattes avant pour effectuer des tâches complexes, comme manipuler de la nourriture. Les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins chez les souris sont similaires à ceux que nous avons chez les humains. L’étude de ces neurones chez la souris représente un bon modèle pour mieux comprendre le syndrome des mouvements en miroir. Chez les souris, nous pouvons créer des modèles génétiques spéciaux qui nous permettent de comprendre comment certains gènes influencent certaines parties de leur cerveau. Ces modèles sont utiles car ils nous aident à éviter des mutations génétiques trop graves, tout en nous permettant d'analyser précisément comment un gène particulier fonctionne dans une région spécifique du cerveau. Dans cette étude, nous réaliserons des expériences d'injection chez l'embryon, au moment où les neurones qui contrôlent les mouvements volontaires fins sont produits dans le cerveau. En parallèle, des souris femelles ou mâles seront étudiées à 3 stades. Pendant la période embryonnaire, moment où les premiers axones du faisceau que nous étudions traversent des régions importantes du cerveau pour leur développement. Juste après la naissance l’âge où ces premiers axones traversent la ligne médiane et arrivent dans la moelle épinière. A l’âge adulte entre 3-4 mois. Les animaux reproducteurs auront entre 3 et 12 mois (maximum).
Caractérisation du foie et de ses fonctions dans deux modèles de souris déficientes en myotubularine
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Trop faibles pour atteindre la nourriture placée en hauteur dans leur cage, les souris mâles privées de myotubularine développent une faiblesse musculaire généralisée qui gêne leurs déplacements. 850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 798 d'entre elles et modéré pour 52. Elles subissent l'ablation d'un bout de queue pour génotypage, deux à six prélèvements de sang sous anesthésie, puis une perfusion intracardiaque qui les tue en moins d'une minute, pour chercher des anomalies du foie que les patients atteints de myopathie myotubulaire présentent dans 91 % des cas. Deux lignées sont utilisées, l'une privée de la protéine dans tout le corps et dont l'espérance de vie ne dépasse pas six à huit semaines, l'autre seulement dans le foie, retenue parce qu'elle vit assez longtemps pour laisser à l'atteinte hépatique le temps de se développer.
Objectifs
La myopathie myotubulaire est une maladie congénitale liée au chromosome X, affectant les garçons et caractérisée par une faiblesse musculaire généralisée et une insuffisance respiratoire. Les patients meurent prématurément dans les premières années de vie, généralement suite à un arrêt respiratoire. Cette myopathie est due à des mutations dans un gène exprimant une protéine, la myotubularine qui est présente dans l’ensemble du corps humain. Des maladies du foie et des voies biliaires ont notamment été reportées pour 91% des patients. Un modèle murin de la myopathie myotubulaire a été créé avec une absence d’expression de la protéine dans l’ensemble des tissus. De prime abord, il ne montre pas de signe apparent d’une dysfonction au niveau de la structure du foie. Cependant, des analyses plus approfondies doivent être réalisées pour détecter certaines anomalies du foie. De plus, l’espérance de vie de ces souris ne dépassant pas 6 à 8 semaines, à cause de leur insuffisance respiratoire, il est possible que la pathologie hépatique ne se soit pas suffisamment développée pour être détectable au niveau structurel. Nous disposons d’un autre modèle murin n’exprimant pas la myotubularine spécifiquement dans le foie qui nous permettra de caractériser la fonction hépatique sur une période plus longue, à différents âges, puisque l’espérance de vie de ces animaux ne sera pas affectée. Dans ce projet, nous souhaitons donc étudier les problèmes qui peuvent survenir dans le foie sur les deux modèles de souris et ce, par des analyses d’enzymes hépatiques, des analyses de la structure du foie et des analyses biologiques.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier et de caractériser des atteintes hépatiques dans un modèle existant de la myopathie myotubulaire ou dans un nouveau modèle spécifique pour mieux comprendre la pathologie hépatique observée chez les patients. Cela permettrait également d’identifier de nouveaux candidats thérapeutiques pour lesquels nous pourrions à l’avenir vérifier leur efficacité chez la souris, pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients.
Procédures
Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : environ 5 min par souris, 2 à 6 fois en fonction de l’âge à l’euthanasie. Injection intrapéritonéale d’anesthésiques et injection sous-cutanée d’analgésique pour certains groupes avant perfusion intracardiaque : moins de 1min, 1 fois pour ces deux types d’injection. Perfusion intracardiaque pour fixation des tissus : moins d’une minute avant la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un prélèvement d’un bout de queue associé au tatouage, pour identification et génotypage. Les nuisances que le modèle n’exprimant pas la myotubularine dans l’ensemble des tissus peut rencontrer sont liées à l’absence de la protéine dans les muscles squelettiques. Les mâles développeront une faiblesse musculaire généralisée, ce qui rendra difficile leur déplacement et l’accès à la nourriture située dans la partie supérieure des cages. Les injections intra-péritonéales, sous-cutanées ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère liée à la piqûre.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever le foie qui nous permettra de caractériser son état, sa fonction, sa structure, et des altérations biomoléculaires. Tous les animaux reproducteurs servant au maintien des lignées seront euthanasiés lorsque la reproduction ne sera plus efficace.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est indispensable pour caractériser l’atteinte hépatique observée chez les patients tels que les défauts de localisation de certaines molécules dans les différents compartiments du foie (canal biliaire par exemple), les défauts de structure de ces compartiments, ou encore les défauts de composition de la bile. Les organoïdes de foie que l’on pourrait développer ne possèdent pas à ce jour toutes les caractéristiques du foie : ils ne possèdent pas les structures anatomiques spécifiques comme les canaux biliaires, et par conséquent également il n’y a pas de flux biliaire. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à l’aide de calculs statistiques pour pouvoir observer des différences entre les animaux sains et mutés ou pour maintenir les lignées le long du projet. Pour la caractérisation des souris porteuses de la mutation uniquement dans le foie, trois âges d’euthanasie sont définis : 3 mois, 6 mois et 12 mois. Si dès 3 mois, l’atteinte hépatique s’est développée, nous étudierons l’évolution jusqu’à 6 mois.Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.
Raffinement
Afin de raffiner nos études, les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. En cours de protocole, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie rétro-orbitale ou mandibulaire, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse. Concernant les souris porteuses de la mutation dans l’ensemble des tissus, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 3 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. Un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès aux souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis.
Choix des espèces
Les souris porteuses de mutation dans le gène exprimant la myotubularine ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène responsable de la myopathie myotubulaire, de façon ubiquitaire ou spécifiquement dans le foie, ce qui en font les plus petits modèles animaux à caractériser pour la fonction hépatique. Les mâles n’exprimant pas la protéine dans l’ensemble des tissus ainsi que les animaux contrôles seront utilisés après sevrage, à l’âge de 3 semaines et seront euthanasiés à l’âge de 6 semaines. A ce stade, la pathologie s’est suffisamment développée pour permettre la caractérisation d’une éventuelle atteinte hépatique. Les animaux qui n’expriment pas la protéine dans le foie et les animaux contrôles, seront utilisés à partir de 2 mois et jusqu’à 3, 6 ou 12 mois pour observer une évolution des enzymes hépatiques dans le sang et laisser le temps aux souris de développer une atteinte hépatique que l’on caractérisera à partir de prélèvements post-mortem. Les animaux à 12 mois ne seront peut-être pas utilisés dans l’étude si l’atteinte hépatique s’est développée à 3 et 6 mois.
Évaluation de la fonction hépatobiliaire en réponse à des candidats médicaments et isolement des populations cellulaires hépatiques par perfusion in situ du foie de souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Tuées au cours d'une chirurgie de perfusion du foie dont elles ne se réveillent pas, 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Certaines portent un foie ou un système immunitaire humanisé, construit à partir d'hépatocytes humains ou de sang de cordon. Avant l'opération elles reçoivent pendant deux à trente semaines un régime gras et sucré, occidental hypercalorique ou déficient en choline, destiné à provoquer une stéatose ou une fibrose du foie, puis des candidats médicaments par gavage ou injection dont le porteur admet que certains peuvent être toxiques pour le foie. Il passe en revue lignées cellulaires, hépatocytes humains isolés, cellules souches et organoïdes, écarte chacun d'eux et conclut que la souris humanisée constitue un modèle "indispensable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments sur la fonction hépatobiliaire et d’isoler les différentes populations cellulaires hépatiques (= du foie) par une perfusion in situ du foie, chez des souris saines et pathologiques. Deux pathologies seront ciblées : le modèle de stéatose hépatique d’origine métabolique (maladie du foie gras) et le modèle de fibrose hépatique. Pour ce faire, nous pourrons travailler chez différentes souches de souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme) ou immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection). Les souris pourront présenter un système immunitaire humanisé à l’aide de cellules souches issues de sang de cordon humain ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique humain (PBMC), et/ou un foie humanisé à l’aide d’hépatocytes humains. Les tests fonctionnels pourront être réalisés et nous permettront d’évaluer directement au niveau de l’organe les effets de molécules à visée thérapeutique, administrées préalablement et/ou au moment de la perfusion, mais également leur métabolisation. Par ailleurs, l’isolement des différentes populations cellulaires hépatiques par cette méthode nous permettra non seulement de déterminer les effets cellulaires des candidats médicaments, mais aussi de congeler ou de mettre en culture des cellules pour une utilisation ultérieure (essais in vitro, transplantation chez de nouvelles souris).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’établir les effets fonctionnels de molécules à visée thérapeutique sur le foie, ainsi que leur métabolisation par cet organe, dans des modèles pathologiques d’intérêt. Par ailleurs, ce projet nous permettra d’isoler différents types cellulaires hépatiques en vue de leur utilisation ultérieure. L’utilisation de souris humanisées dans ce contexte permettra l’obtention de données particulièrement pertinentes, en offrant un modèle préclinique se rapprochant de la physiologie de l’espèce cible, l’Homme.
Procédures
Afin d’induire la stéatose, les régimes suivants pourront être administrés ad libitum pendant 2 à 30 semaines avant perfusion : - Diète enrichie en graisses et en sucre - Diète dite « western » (régime occidental hypercalorique) - Diète déficiente en choline (export des lipides du foie) et/ou méthionine (régulation de l’expression des gènes) L’administration de composés de recherche pourra être réalisée préalablement à la perfusion hépatique par voie entérale (gavage, incorporation dans l’alimentation ou dans l’eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire). L’administration des thérapies pourra également être réalisée directement pendant la perfusion, par incorporation dans la solution de perfusion, ou sur les cellules isolées. Une chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur les souris afin de perfuser le foie. Une seule chirurgie sera réalisée, sa durée minimale sera de 10min, le temps nécessaire à la mise en place de la perfusion. Le temps maximal sera fonction de l’objectif de la perfusion. Pour un isolement de cellules, il faudra compter environ 45min ; pour les tests de composés à visée thérapeutique, le temps sera adapté au cas par cas selon les données disponibles de pharmacocinétique/pharmacodynamique et de métabolisation hépatique de la molécule.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par les procédures préalables à la perfusion du foie (par ex. perte de poids en réponse à un régime). Par ailleurs, les composés médicamenteux expérimentaux administrés pourraient potentiellement exercer des effets secondaires hépatotoxiques (toxiques pour le foie) qui pourraient provoquer des nuisances. Chez la souris vigile, la douleur peut se manifester, entre autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Les animaux sont mis à mort car la procédure de perfusion du foie est terminale et ne permet pas leur réveil. Les animaux sont également euthanasiés avant la fin d’étude s’ils ont atteint les point limites éthiques prédéfinis ou sur demande du vétérinaire d'établissement.
Remplacement
Bien que des modèles in vitro de lignées cellulaires hépatiques existent, leur utilisation est limitée car ils ne permettent actuellement pas de refléter l’environnement hépatique avec le niveau de fidélité et de complexité nécessaire à une évaluation fiable et pertinente des effets d’un composé à visée thérapeutique, de ses potentiels effets secondaires et de sa métabolisation. Les hépatocytes humains fraîchement isolés, qui seraient le modèle le plus pertinent, bien que ne représentant qu’une seule population cellulaire, se dédifférencient rapidement après isolement et ne se maintiennent pas en culture. Les lignées cellulaires immortalisées ou dérivées de cellules souches pluripotentes induites en laboratoire (IPS), quant à elles, sont sujettes à des dérives génétiques et à l’activation d’oncogènes (gènes dont l'expression favorise la survenue de cancers). Enfin, les systèmes plus complexes et multicellulaires, tels que les organoïdes (culture de cellules en 3D) dérivés de cellules souches hépatiques, sont complexes à obtenir et présentent une variabilité liée au donneur de cellules souches. Par ailleurs, ces systèmes ne permettent actuellement pas de rendre compte du niveau de complexité fonctionnelle de l’organe et des interactions entre les multiples populations cellulaires présentes dans le foie (hépatocytes, cellules non-parenchymateuses, cellules du système immunitaire, …). À l’heure actuelle, la souris, et à plus forte raison la souris humanisée, constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total maximum de 2 500 souris sera utilisé sur une période de 5 ans, permettant de mener 50 études de 50 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. Par ailleurs, l’isolement de cellules hépatiques permettra, d’une part, leur cryoconservation pour de futurs essais in vitro et, d’autre part, leur mise en culture, sous forme d’organoïdes. Ces techniques participeront à la réduction du nombre d’animaux utilisés pour les futures études.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires (type gel nutritif enrichi en électrolytes et vitamines) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux (perte de poids), si leur utilisation n’est pas amenée à biaiser les résultats scientifiques de l’étude. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de coton. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids. Enfin, un protocole d’anesthésie-analgésie raffiné sera mis en place pour la conduite de la procédure de perfusion.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, âge de première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
Etudes biochimiques des mécanismes nucléaires impliqués dans la stabilité du génome à partir d’extraits dérivés d’œufs de xénope
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour produire des extraits protéiques servant à étudier la réparation de l'ADN dans les cancers, 96 xénopes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chaque femelle reçoit une injection hormonale sous-cutanée destinée à provoquer sa ponte, répétée jusqu'à trois fois par animal, à douze mois d'intervalle. Le porteur affirme qu'aucun autre système biochimique ne permet d'étudier la recopie de la chromatine chez les vertébrés et qualifie le recours à ces animaux d'"indispensable". 48 xénopes sont tuées après leur troisième injection, l'établissement invoquant le caractère invasif de l'espèce qui interdit de les faire sortir de la zone, les 48 autres restant en stabulation pour être injectées à nouveau dans une saisine ultérieure.
Objectifs
Le développement tumoral est caractérisé par une multiplication incontrôlée de cellules anormales dont les voies moléculaires de surveillance et de réparation de l'ADN sont altérées. L’étude fine de ces voies de signalisation est donc primordiale pour comprendre comment combattre les cancers et comment adapter des stratégies de lutte plus efficaces. Nous proposons de disséquer ces voies moléculaires par approche biochimique. Pour ce faire nous utilisons des extraits protéiques dérivés d’œufs de xénope qui ont la particularité unique de reproduire in vitro et de manière simplifiée, les mécanismes moléculaires de la division cellulaire propres aux cellules humaines.
Bénéfices attendus
La reproductibilité et la fiabilité expérimentale reconnues dans l’utilisation d’extraits protéiques issus d’œufs de xénope ont contribué et permettent encore des avancées majeures en santé humaine grâce à la découverte et la compréhension fonctionnelle de nouveaux acteurs de la prolifération et de la réparation de l’ADN. Ce projet s’inscrit dans cette dynamique de recherche fondamentale dans le but d’accroitre nos connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués dans les dysfonctionnements des voies de réparation de l’ADN et de la prolifération, à l’origine de la tumorogenesèse. Outre la diffusion des résultats obtenus dans des journaux scientifiques à libre accès, les études issues de ce système mèneront à plus long terme à l’identification de nouveaux outils de diagnostics et/ou pronostic du cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis à une seule intervention: l'injection sous cutanée d'hormone à l'aide d'une seringue hypodermique, dans le but d'induire la ponte de l'animal
Impact sur les animaux
Les nuisances potentielles attendus sur l’animal lors du présent projet seront observables de manière occasionnelle et résulteront de la contention ou de l’injection hormonale: L’utilisation d’une aiguille hypodermique entraine une douleur légère de courte durée et la contention un stress de l’animal.
Devenir
Les 48 xénopes utilisés les trois premières années du projet auront reçu les 3 injections hormonales maximales que nous avons fixés par aniaml. Ils seront donc euthanasiés (car l'espèce est invasive et ne peut quitter la zone). Les 48 animaux utilisés à partir de la deuxième moitié du projet auront moins de 6 ans et auront été injectés 2 fois seulement. Ils seront maintenus en stabulation et pourront être intégrés dans une saisine ultérieure après clôture du présent projet pour une nouvelle induction hormonale.
Remplacement
A ce jour il n’existe pas de système d’étude biochimique performant de la recopie de la chromatine chez les vertébrés, autre que les extraits ovocytaires de xénope. Le recours à ces animaux est donc indispensable. Grâce à ce système expérimental, les différentes étapes de la recopie de l’ADN et de la réponse aux dommages à l’ADN peuvent être étudiées dans leur compartiment spécifique, le noyau. En fait, ces extraits ont le pouvoir de reconstituer en toute synchronie, des noyaux fonctionnels après ajout d’ADN de spermatozoïdes, ainsi que les différentes étapes du cycle cellulaire.
Réduction
L’utilisation in vitro d’un modèle ovocytaire comme système d’étude permet de limiter le nombre d’animaux. Nos besoins en extraits protéiques ont été déterminés en fonction des expériences passées. Environ 2-3 millilitres d’extraits par mois seront nécessaires ce qui correspond à l’injection de 4 grenouilles. Par ailleurs, les œufs de xenopus laevis étant relativement gros par rapport aux autres espèces d’amphibiens, le choix de cette espèce contribue également à diminuer le nombre d’animaux utilisés. Enfin, durant le projet, les xénopes seront réutilisés 2 fois, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire.
Raffinement
Les animaux à injecter sont identifiés (présence d’une micropuce à radiofréquence sous cutanée), pesés puis ces données sont répertoriées. Elles seront utiles pour le suivi de chaque animal durant le projet : la quantitié et la qualité des œufs obtenus par animal seront ainsi archivées. Chaque individu possède donc un « carnet de santé ». Outre le suivi sanitaire, sa mise en place permet d’éviter des erreurs dans la rotation quant aux délais d’injection (12mois). En outre, si des animaux présentent des pertes de poids de plus de 10 % suite à une ponte précédente, ils ne seront pas réinjectés. L'injection est effectuée par un personnel formé à la contention des animaux. Le port de gants est obligatoire pour la manipulation douce des animaux dans le but de limiter l’abrasion de la couche de mucus protectrice naturellement présente sur la peau de l’animal. Pour faciliter le suivi après la ponte, les animaux injectés dans la même période sont placés ensemble dans des bacs de stabulation (avec enrichissement et alimentation vivante). Les animaux présentant des signes de perte d'appétit seront pesés régulièrement. Des visites journalières avec astreintes le week-end permettront d’assurer une surveillance régulière post-injection.
Choix des espèces
Seule l’espèce Xenopus laevis est hébergée dans l’animalerie. L'importance de cette espèce peut être présentée ainsi : une quantité d’oeufs importante et de grande taille (1 à 1,3mm), une synchronisation parfaite et naturelle à un stade précis de la division cellulaire, la proximité des propriétés physiologiques avec l'ovocyte humain. L’utilisation d’ovocyte pour la réalisation d’extraits protéique permet de limiter la sévérité des manipulations expérimentales sur l'animal. Ce modèle permet l’obtention rapide d’une grande quantité d’extraits protéiques qui ont le pouvoir de reconstituer in vitro les différentes étapes du cycle cellulaire. Les animaux utilisés doivent être sexuellement matures pour la production d’ovocyte
Étude de la régénération musculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 424 d'entre elles. Une toxine leur est injectée dans les muscles des deux pattes arrière sous anesthésie afin de détruire le tissu, précédée de cinq injections dans l'abdomen. Après la lésion, le porteur ajoute du paracétamol dans l'eau de boisson pendant quarante-huit heures, une mesure dont il dit lui-même avoir mesuré un "très léger bénéfice" sur l'activité volontaire des animaux. Il présente la culture cellulaire comme un préalable systématique, puis conclut que l'expérimentation reste "indispensable" pour replacer les mécanismes dans la physiologie du muscle entier.
Objectifs
Le muscle strié squelettique adulte régénère après un dommage grâce aux propriétés des cellules souches musculaires qui communiquent avec d'autres cellules comme les cellules de l'immunité, les fibroblastes et les cellules des vaisseaux. La coordination dans l'espace et dans le temps de ces interactions est essentielle pour une bonne régénération. Les mécanismes moléculaires contrôlant ces interactions sont encore mal connus. Le projet vise à étudier ces interactions cellulaires et moléculaires en induisant une lésion musculaire pour suivre la réparation du muscle chez la souris adulte.
Bénéfices attendus
Les bénéfices premiers du projet sont d'apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes de la régénération musculaire. Ces données seront utiles dans le futur pour comprendre les défaillances du processus de régénération dans des conditions physiologiques ou pathologiques particulières (vieillissement, myopathies, diabète, etc.)
Procédures
Les souris sont soumises à des injections intrapéritonéales (30 secondes) (5 fois) et à l’induction d’une lésion musculaire via une injection intramusculaire bilatérale de toxine (sous anesthésie) (procédure de 5 minutes) (1 fois)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues incluent: - un stress lors de la contention pour les injections intrapéritonéale - un stress lors du gavage - un stress lors du déplacement dans la boite d'anesthésie - Une diminution transitoire de l'activité spontanée après l'induction de la blessure musculaire
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement des organes
Remplacement
Le laboratoire a une longue expérience des essais in vitro par la culture cellulaire. Les questions scientifiques sont d'abord validées in vitro avant d'aborder l'expérimentation animale. Celle-ci est néanmoins indispensable pour d'une part observer les mécanismes cellulaires et moléculaires ex vivo et d'autre part les intégrer dans la physiologie du tissu musculaire dans l'organisme.
Réduction
- L'utilisation des animaux est strictement réduite au nombre nécessaire pour l'établissement des données expérimentales, à l'aide des analyses statistiques effectués précédemment pour ces procédures. - Les deux muscles des deux pattes arrière sont utilisées afin de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés - les tissus et cellules des animaux sont réutilisés grâce à un système de banking dans le laboratoire
Raffinement
Le raffinement inclut une procédure afin de définir la meilleure voie d'administration du tamoxifène tout en conservant l'efficacité permettant l'analyse génomique. Le raffinement à la suite de l'induction de la lésion bilatérale inclut l'addition de paracétamol dans l'eau de boisson pour 48h à la suite d'une étude que nous avons menée montrant un très léger bénéfice du paracétamol sur l'activité volontaire des animaux (roue d'activité). Une anesthésie générale est réalisée pour l’induction de la lésion musculaire.
Choix des espèces
La souris a un système musculaire et un processus de régénération musculaire proches de ceux de l'homme. Les animaux utilisés sont à l'âge adulte (8-12 semaines).