Recherche fondamentale

Un choc anaphylactique aux curares est déclenché chez 5 440 souris génétiquement modifiées pour porter des récepteurs humains aux anticorps, avec deux prélèvements de sang obtenus par section du bout de la queue. Les procédures sont classées en souffrance modérée et toutes les souris sont tuées, le résumé se bornant sur ce point à deux mots, "mise à mort". Le projet cherche les mécanismes cellulaires d'une réaction dont le porteur rappelle qu'elle tue 4,1 % des patients qui la subissent en France malgré l'adrénaline. La rubrique des effets attendus ne mentionne, elle, que le stress de la contention et la douleur de la piqûre, sans un mot sur le choc lui-même.

Objectifs

Le choc anaphylactique est l’expression la plus sévère des réactions d’hypersensibilité immédiate. La période périopératoire est associée à un risque particulièrement élevé de choc anaphylactique. C'est particulièrement le cas pour les curares, qui sont utilisés en anesthésie pour provoquer un relâchement musculaire, en agissant sur la jonction neuro-musculaire, ce qui empêche les muscles de se contracter. Le choc anaphylactique impliquant un curare est associé à une mortalité élevée, estimée à 4,1% en France, et ce, malgré une reconnaissance rapide de la réaction et l’administration très précoce d’adrénaline, le traitement de référence. Ceci indique que les mécanismes de l’anaphylaxie aux curares ne sont pas encore bien identifiés. L'objectif est de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’anaphylaxie aux curares, ce qui permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour traiter cette pathologie.

Bénéfices attendus

Le présent projet a pour but d’identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires de l’anaphylaxie aux curares. Ces travaux pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter l’anaphylaxie aux curares et en réduire la mortalité.

Procédures

Les procédures sont de sévérité modérées et seront réalisées dans le strict respect des règles mises en place pour veiller au bien-être des animaux. Les animaux vigiles subiront un stress au moment de l'anesthésie, lors de la contention de l'animal, mais ce geste n'est pratiqué que par des expérimentateurs habilités à le réaliser (donc rapidement). Une douleur peut être ressentie au niveau du site de piqure de l’aiguille lors de l’injection de l’anesthésiant (durée 5 s). Tous les autres gestes invasifs sont réalisés sur souris anesthésiées : il s’agit des traitements administrés par injection: soit 48h, soit 24h, soit 30 min ou 5 min avant le début des mesures. Ces injections ont une durée de 10s. Il s’agit également d’un prélèvement de petit volume de sang réalisé à deux reprises (durée de 15 s) espacées de 24h.

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles subiront un stress au moment de l'anesthésie, lors de la contention de l'animal. Une douleur peut être ressentie au niveau du site de piqure de l’aiguille lors de l’injection de l’anesthésiant. Une douleur peut être ressentie à l’extrémité de la queue après section pour prélèvement sanguin.

Devenir

mise à mort

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’anaphylaxie sont difficiles, voire impossible à étudier chez l’homme, vue l’imprévisibilité de l’évènement et sa rareté. De plus, l’anaphylaxie est un phénomène multifactoriel qui implique plusieurs types de cellules sanguines (basophiles, neutrophiles, monocytes, plaquettes) et tissulaires (mastocytes, macrophages) et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, la paroi vasculaire et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro, tant sur le plan des identités en jeux que sur le plan temporel. La compréhension des processus physiopathologiques intégrés est donc pratiquement impossible chez l’homme et le recours à des études in vivo chez l’animal s’avère nécessaire. Occasionnellement, des études in vitro seront réalisées sur du sang de souris ou sur cellules isolées (plaquettes, neutrophiles). Cependant, elles ne pourront représenter à elles seules la pathologie étudiée.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum afin d’obtenir des données statistiquement significatives. Le n a été calculé par une analyse de puissance. Il s’agit de 4 animaux/groupe. Le maximum de prélèvements sera réalisé sur une même souris (organes, sang, liquides broncho-alvéolaires).

Raffinement

Le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, la pathologie étudiée et d’en tirer le maximum d’information. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales: - Au moins 72h avant la procédure, les animaux sont répartis par groupes et mis dans les cages (tout en respectant les groupes sociaux) qu’ils occuperont tout au long du processus.

Choix des espèces

Le recours à l’étude in vivo chez l’animal est nécessaire, car l’anaphylaxie est un phénomène multifactoriel qui implique plusieurs types de cellules sanguines et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, la paroi vasculaire et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro, tant sur le plan des identités en jeux que sur le plan temporel. Pour comprendre les mécanismes de l’anaphylaxie nous utilisons des souris modifiées génétiquement, dites «humanisées » pour l’expression du récepteur FcER1 des IgE ou pour le récepteur FcGRIIA (CD32A) pour les IgG. Les techniques de transgénèse sont maîtrisées chez la souris et ces souris sont disponibles au laboratoire. Ces modèles animaux nous permettent d’étudier in vivo les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’anaphylaxie. Le modèle d’anaphylaxie active ou médié par les IgE pratiqué chez la souris non transgénique, fait consensus dans la communauté scientifique car il représente fidèlement l’anaphylaxie survenant chez l’homme. Les animaux sont utilisés au stade adulte, entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

Jusqu'à seize prises de sang dans la joue sur animal vigile, réparties sur vingt-quatre semaines : 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse du cœur et des organes. Une partie subit une chirurgie de trente minutes provoquant un infarctus du myocarde, avec douleur postopératoire et mobilité réduite pendant huit heures. L'objectif est de mettre au point un anticorps ciblant une population immunitaire, à administrer chez des patients en phase aiguë d'infarctus. Le porteur retient la souris parce qu'elle se reproduit vite et donne beaucoup de petits, et parce que les lignées mutantes voulues n'existent que chez elle.

Objectifs

L’incidence de l’insuffisance cardiaque consécutive à un infarctus du myocarde (IM) est en augmentation constante et la mortalité à moyen et long termes reste élevée, ce qui constitue un enjeu médical et sociétal majeur. Si la prise en charge aigüe a permis de diminuer la mortalité dans les premiers jours, les conséquences chroniques de la perte de fonction cardiaque restent importantes et sont associées à une perte de qualité de vie et un coût conséquent pour la société. Notre projet a pour but de développer un outil thérapeutique à utiliser en clinique à la suite d'un infarctus du myocarde afin de limiter l'atteinte cardiaque. A cette fin, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées pour développer un anticorps ciblant une population immunitaire particulière. Nous traiterons des souris avec cet anticorps pour confirmer son effet en condition non pathologique. Pour valider son efficacité, nous l'utiliserons dans des modèles de souris soumises à un infarctus du myocarde induit chirurgicalement sous anesthésie générale. L’analyse consistera à étudier la fonction cardiaque, le remodelage cardiaque et la réponse inflammatoire post-infarctus.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à limiter les dommages tissulaires après un infarctus du myocarde et par conséquent, réduire la mortalité post-infarctus et limiter le développement de l’insuffisance cardiaque. Ce développement d'un nouveau traitement à utiliser en phase aiguë de l'infarctus du myocarde et visant à réduire les dommages et le remodelage cardiaque présente de nombreux avantages potentiels, permettant d’améliorer la qualité de vie des patients, diminuer les ré-hospitalisations, réduire les coûts de santé et diminuer la morbidité.

Procédures

Une partie des animaux va subir des prélèvements sanguins répétés par voie submandibulaire, étant vigile. Ces prélèvements sont d'une durée inférieure à 1 minute. Il y aura jusqu'à 16 prélèvements, espacés au minimum d'une semaine et répartis sur une durée allant jusqu'à 24 semaines. Une partie des animaux va subir une chirurgie de 30 min au cours de laquelle un infarctus du myocarde est réalisé sous anesthésie générale. Un minimum de quatre injections sous-cutanées d’analgésiques (durée inférieure à 30 secondes pour chaque injection) sont prévues, dont une en préopératoire. A différents temps après l’opération, une échocardiographie non-invasive indolore sera réalisée sous anesthésie générale, d’une durée maximale de 15 minutes. Une partie des animaux va subir une injection intraveineuse d'une durée maximale de 30 seconde sous anesthésie générale. Une autre partie des animaux va subir deux injections par voie intraveineuse d'une durée maximale de 30 secondes sous anesthésie générale, espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l’expérimentation : inconfort lié à la préhension et contention des animaux, potentielle douleur au point d'injection, stress lié à l'anesthésie, stress/potentielle douleur lors de la pose de la bague à l'oreille pour identification; douleur au site de prélèvement dans les cadre des prélèvements sanguins répétés. Effets de la chirurgie : douleur post-opératoire, mobilité transitoirement réduite suite à l'anesthésie (8 heures).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des analyses histologiques ou d'inflammation dans le coeur et les organes.

Remplacement

Afin de respecter le principe des 3R, les anticorps seront générés en utilisant des lignées cellulaires. Par ailleurs, les différents clones seront au préalable caractérisés sur des cellules afin pré-sélectionner les clones les plus intéressants à tester chez la souris. Ces modèles animaux représentent une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes survenant au cours de l’infarctus du myocarde. En effet, ces événements sont des phénomènes complexes impliquant un grand nombre de types cellulaires, ce que des modèles artificiels ne pourraient pas permettre de recréer dans leur entièreté. Nous voulons étudier chez l'animal, le phénomène de réparation tissulaire consécutif à une atteinte cardiaque. Ces modèles murins pré-cliniques sont également un préalable absolument nécessaire et indispensable pour la validation des stratégies thérapeutiques afin de les mettre en application chez des patients présentant un infarctus du myocarde.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation de ce projet a été calculé au plus juste. En utilisant des calculs de puissance pour déterminer la taille minimale suffisante des groupes expérimentaux, nous obtenons une taille d’échantillon de 15 souris par groupe. En tenant compte des aléas inhérents à la procédure chirurgicale, nous estimons une taille de groupe à 20 animaux. Les résultats seront analysés à l'aide des tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre d’animaux, nous analyserons plusieurs paramètres sur le même animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cages enrichies dans l’animalerie où les conditions d'hébergement et d'élevage sont standardisées et contrôlées durant toute la vie des souris. Par ailleurs, il y aura un enrichissement complémentaire dans certains cas particuliers. La souffrance animale sera réduite au maximum par l'utilisation d’anesthésie générale et d’analgésie adaptées, et par l’établissement et l'application de points limites stricts et spécifiques au projet. Les animaux feront l’objet d’une surveillance régulière et renforcée par les expérimentateurs confirmés et par le personnel technique qualifié de l’animalerie pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être. Les grilles de score de suivi des points limites seront remplies sous contrôle de la personne responsable de la mise en oeuvre du projet.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude des maladies cardiovasculaires. De plus, c’est le seul modèle dans lequel ont été générées les lignées mutantes que nous souhaitons étudier. La souris permet de garantir l’homogénéité des résultats et la possibilité de surveiller le développement des complications vasculaires dans un espace de temps raisonnable. Grace à ces modèles murins, nous pourrons obtenir rapidement des résultats très importants pour notre projet, ce qui ne serait pas le cas avec une autre espèce qui prendrait beaucoup plus de temps à se reproduire et où le nombre de naissance serait nettement moins important. Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 8 à 10 semaines minimum et chez lesquelles le système cardio-vasculaire est arrivé à maturité.

Repris d'un projet en cours pour éviter d'en commander de nouveaux, les rats témoins non malades rejoignent ici une cohorte de 560 individus soumise à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placés à quatre semaines dans une atmosphère à 10 % d'oxygène pendant trois semaines consécutives pour reproduire l'altitude, ils reçoivent une injection abdominale par jour, subissent deux anesthésies pour échocardiographie puis un cathétérisme cardiaque, avant d'être tués pour le prélèvement des poumons et du cœur. Le porteur qualifie les effets de cette hypoxie prolongée de bénins, au motif que seule la phase précoce de la maladie est étudiée. Il affirme par ailleurs que trois modèles animaux complémentaires sont "indispensables" pour établir la preuve de concept, alors que les résultats de départ viennent d'échantillons pulmonaires humains et de cultures cellulaires.

Objectifs

L'hyperTension Artérielle Pulmonaire (HTAP) est une maladie qui affecte les petits vaisseaux du poumon qui vont s'épaissir par un processus appelé remodelage vasculaire pulmonaire. Cette altération va imposer un effort au cœur qui à terme va aboutir à une insuffisance cardiaque. Bien que les mécanismes restent encore méconnues, il est maintenant établi que les protéines osseuses morphogénétiques joue un rôle important dans ce remodelage vasculaire pulmonaire. Cependant, les connaissances autour du mode de fonctionnement de ces protéines dans les petits vaisseaux du poumon sont très limitées. C'est pourquoi nous souhaitons étudier leurs rôles dans l'HTAP et tester l’efficacité de molécules ciblant ces protéines pour lesquelles nous avons trouvé une efficacité sur des cellules de vaisseaux pulmonaires en culture.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet seront multiples et devraient permettre non seulement de mieux comprendre le rôle des protéines présentes dans les petits vaisseaux du poumon, mais aussi leur contribution au développement de l'HTAP. De plus, ce projet permettra de tester l'efficacité de certaines molécules ciblant ces protéines pour lesquelles de premiers résultats in vitro sont encourageants.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés pour effectuer une échocardiographie afin de valider le modèle avant les traitements (temps : 5 min/ rat). En fin de traitement les animaux seront à nouveaux anesthésiés afin de mesurer tous les paramètres nécessaires à l'étude (échographie et cathétérisme). Les rats seront en hypoxie à 10% d’oxygène pendant 3 semaines consécutives afin de mimer l’air ambiant en altitude. Les traitements effectués seront en intrapéritonéales et seront de la fréquence suivante : 1 fois par jour pendant 2 semaines pour la procédure 1 ; 1 fois par jour pendant 3 semaines pour la procédure 2.

Impact sur les animaux

Les procédures appliquées à ce projet nécessitent d'effectuer 2 types d'injection chez le rat : 1 injection sous-cutanée et des injections intra-péritonéales pour les traitements ou du placébo. Ces injections induisent une douleur légère de courte durée limitée par l'application d'une crème lidocaïne. La contention nécessaire pour effectuer l'injection induit un stress de courte durée. Également, deux anesthésies gazeuses (isoflurane) seront pratiquées sur l'animal : la première pour valider le modèle expérimental avant traitement par échographie, et la deuxième pour évaluer l'efficacité du traitement par échographie et cathétérisme. L'anesthésie nécessite une légère contention de l'animal pour le placer dans une cage d'induction et n'induit pas de douleur hormis un léger stress de courte durée. Le modèle implique une exposition à 3 semaines d'hypoxie (10% d'oxygène) afin de mimer l'effet de l'altitude. Ces effets seront bénins dans notre projet car nous étudierons la mise en place de la maladie en phase précoce.

Devenir

Des prélèvements d'organes (poumons et cœur) seront réalisés afin de valider l'efficacité des traitements dans les tissus biologiques. De plus, comme décrites dans notre demande, différentes expérimentations biologiques seront réalisées au laboratoire pour démontrer les mécanismes mis en jeu.

Remplacement

Nous avons obtenu des résultats sur des échantillons pulmonaires humains et des cultures de cellules qui indiquent une altération de voies de signalisation dans les cellules endothéliales HTAP et que celle-ci peuvent être restaurées sous l'effet d'une molécule spécifique. Dans l'objectif de valider l'importance de ce défaut sur la fonction cardiaque et sur le remodelage des petites artères pulmonaires, nous souhaitons restaurer ces voies dans 3 modèles complémentaires d'HTAP reconnus internationalement et conclure sur son potentiel thérapeutique. L'HTAP est une maladie multifactorielle où plusieurs organes sont impliqués dont le coeur et le poumon. C'est pourquoi, le recours à des modèles animaux, différents et complémentaires, sont indispensables pour établir une preuve de concept avec cette molécule.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d'animaux, nous avons choisi de cibler nos traitements sur les protéines de la voie ayant la plus forte dérégulation que nous comparons aux contrôles positifs et négatifs d'hypertension pulmonaire. De plus, les effectifs ont été calculés à l’avance et se basent sur nos études passées et celles récemment publiées autour de ce type de molécules. Le critère déterminant pour évaluer l'efficacité du projet est la mesure de la pression artérielle pulmonaire moyenne. Les données de ce projet seront traitées statistiquement à l'aide d'un logiciel spécifique. Egalement, nous réutiliserons les animaux non malades traîtés avec les différentes molécules d'un projet en cours pour ne pas réutiliser des rats similaires dans cette demande. Par ailleurs, les échantillons provenant d'animaux témoins non malades et témoins d'HTAP pourront être réutilisés pour d'autres projets de recherche en cours.

Raffinement

Les rats bénéficieront d'un enrichissement de milieu avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Pour la réalisation de la procédure, nous avons établi des points limites au moyen d'un score afin d'évaluer le bien-être animal. Les animaux seront donc suivis quotidiennement afin de veiller à ce bien-être et de prendre les mesures nécessaires développées dans la description de la procédure. Les rats seront anesthésiés 2 fois pour valider le modèle et les traitemants avec de l'isoflurane. Lors des traitements, une crème lidocaïne sera appliquée sur la zone où s'effectueront les injections.

Choix des espèces

Les rats sont des modèles standards d’études de maladies cardiovasculaires. Afin que nos résultats soient comparés aux travaux de la littérature dans ce domaine, des rats âgés de 4 semaines et pesant 100 grammes chacun seront utilisés.

Anesthésiées le temps de recevoir dans le rectum du TNBS dissous dans l'éthanol, qui déclenche une inflammation de l'intestin, les souris reçoivent ensuite des composés par gavage, dans l'eau de boisson ou par injection, et subissent des prises de sang au fil de l'étude. Sur cinq ans et 50 études, 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont des souris immunodéficientes au système immunitaire humanisé. Le porteur annonce une diarrhée qui peut être sévère, une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une anémie, auxquelles s'ajoutent les effets toxiques possibles des composés, issus de laboratoires académiques, de sociétés de biotechnologie et de l'industrie pharmaceutique. Toutes les souris sont mises à mort en fin de procédure.

Objectifs

La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.

Bénéfices attendus

Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.

Procédures

Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire d'établissement et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ.

Impact sur les animaux

Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées à la présence humaine régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL en routine, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. De plus, les prélèvements RO sont interdits et remplacés par des prélèvements à la veine saphène. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL.

Choix des espèces

Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Gavées tous les jours pendant un mois avec un glucocorticoïde de synthèse, une partie des 960 souris de ce projet développe la fonte musculaire que l'étude cherche à décrire. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et incluent aussi des injections répétées dans l'abdomen et un test d'agrippement, avec un risque de fausse route et d'irritation de la gorge lié au gavage. Le porteur affirme vouloir "anticiper toute souffrance inutile" et écrit dans la même rubrique n'avoir prévu ni anesthésie ni analgésique, tous les actes se faisant sur animal vigile. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, les animaux perdant plus de 20 % de leur poids en une semaine étant retirés du lot et tués avant.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

Un niveau de douleur jugé trop élevé déclenche la mise à mort anticipée, seuil que le porteur fixe au moyen d'une grille de score. 1 020 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue après un prélèvement sanguin intracardiaque. Une tumeur leur est greffée dans le rectum sous anesthésie générale, suivie de deux injections de chimiothérapie sur animal vigile, d'un gel immunostimulant administré par l'anus et d'un suivi par imagerie deux fois par semaine, la tumeur pouvant provoquer ulcères, douleurs et occlusion du côlon. Les groupes comptent vingt souris parce que le porteur anticipe 20 % d'échecs de greffe et jusqu'à 40 % de morts sous chimiothérapie seule, de sorte qu'il en reste dix à analyser.

Objectifs

La radiothérapie combinée à la chimiothérapie est chez le patient actuellement, le traitement de référence des cancers du rectum avant la chirurgie. Cependant, la radiothérapie est associée à d’importants effets secondaires (Incontinence urinaire, incontinence fécale...). Des travaux publiés récemment suggèrent que la chimiothérapie seule pourrait être une alternative à ce protocole de traitement. Cependant la guérison complète après traitement médical, qui permet alors d'éviter la chirurgie, est inférieure à 20%. La survie globale à 10 ans, liée à la récidive généralisée du cancer, est de 50%. En parallèle, il est démontré que l’immunothérapie améliorait la réponse du traitement sur des modèles de cancer colorectal. En effet, l’activation de l’immunité permettrait de majorer l’effet des traitements des cancers du rectum. C’est pourquoi nous souhaitons évaluer l’effet d’une immunothérapie locale associée à la chimiothérapie dans le cancer du rectum en remplacement de la radio-chimiotherapie. Pour valider notre hypothèse, nous souhaitons mettre en place un modèle de cancer du rectum chez la souris, et associer à la chimiothérapie une immunothérapie locale par administration intra rectale de notre immunogel. L'efficacité du traitement sera étudiée en suivant la croissance tumorale des tumeurs par imagerie optique et en échographie, en suivant la survie des souris, et en étudiant la réponse immunologique.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de définir et valider l’immunochimiothérapie pour améliorer le taux de guérison et diminuer le risque de développement de métastases du cancer du rectum. L’amélioration de cette guérison après traitement médical serait un argument en plus permettant d'avoir moins recours à la chirurgie. Le non recours à la chirurgie du rectum après une réponse complète aux traitements médicaux est au coeur des essais cliniques actuels sur les traitements du cancer du rectum, car elle permet de diminuer la morbidité et les séquelles liées à la chirurgie. Les résultats de cet essai préclinique pourront aboutir au design d’une étude clinique incluant l’immunothérapie locale aux standards de traitement du cancer du rectum chez l'Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure de greffe tumorale en début de chaque procédure, correspondant à une injection intra rectale de cellules tumorales. Cette injection se fera une fois par procédure et sera réalisée sous anesthésie générale. Pour le suivi de croissance tumorale par imagerie bioluminescente 2 fois par semaine, les souris seront anesthésiées par inhalation de gaz. Elles recevront également à ce moment une injection intrapéritonéale de luciférine. Les chimiothérapies administrées pendant le projet seront injectées vigile par voie intrapéritonéale. Les souris traitées recevront 2 injections de chimiothérapie. Les souris traitées par notre gel recevront une injection de gel par l'anus sous anesthésie générale. En cas d'échec de cette voie, le gel sera injecté directement dans la tumeur, par voie anale, sous anesthésie générale également. En cas de douleur au cours du projet, les souris recevront une analgésie par injection sous-cutané d'antalgique. Au moment de leur mise à mort, un prélèvement sanguin intracardiaque sera effectué. Ce prélèvement sera effectué sous sédation profonde par une injection intrapéritonéale de médicaments anesthésiants. Les souris seront par la suite mises à mort sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

La greffe de tumeur orthotopique pourrait être responsable de douleurs (ulcères, lésions) et de perte de poids. Les chimiothérapies incluent dans cette étude, peuvent entrainer chez l’Homme des mucites, des troubles du rythme cardiaque, des neuropathies périphériques. Les signes généraux de douleur, d’asthénie, de diarrhées ou de troubles de la mobilité seront particulièrement surveillés chez la souris après injection. De par sa localisation, on peut supposer que la tumeur pourrait-être responsable d’occlusion du côlon, malgré l’absence de description dans la littérature. Nous serons donc particulièrement attentifs à des signes de gonflement de l’abdomen, en plus des signes d’altération de l’état général.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mises à mort à l'issu de chaque procédure pour prélèvement et analyse anatomopathologique

Remplacement

Nous avons préalablement évalué par des expériences in vitro plusieurs formulations de gel pour ne tester chez l’animal que les formulations finales. A la suite de ces expériences in vitro, notre modèle doit maitenant être appliqué à l'animal pour tendre vers une approche clinique chez l'Homme. La modification de l'environnement de la tumeur, qui est particulièrement riche et complexe chez l'Homme et sur modèle animal, est la cible de notre traitement et ne pourrait être évalué uniquement in vitro.

Réduction

Le projet a été consciencieusement pensé et élaboré afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement satisfaisants. Le nombre d’animaux doit être de 12 souris par groupe pour les expériences qui présentent une faible variabilité. Cependant, pour l’étude de l’efficacité, nous nécessiterons l’utilisation de 20 souris par groupe car les expériences présentent une variabilité importante particulierement lié aux reponses à la chimiothérapie. Ce nombre est calculé selon notre expérience et la littérature et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. En effet, il est nécessaire de prévoir 20 animaux par groupe pour avoir des données statistiquement analysables car d’après notre expérience la prise tumorale pour la tumeur primaire et secondaire est de 80% et sa mortalité de 8%. La mortalité à distance de la chimiothérapie seule est de 40% dans la littérature. Considérant cela, il restera, dans le pire des cas, 10 animaux par groupe ce qui permettra d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. De plus, l'utilisation de l'imagerie optique et plus ou moins de l’échographie nous permet de réaliser en temps réel le suivi de l’évolution tumorale. Ces techniques non invasives nous permettront ainsi de réduire au maximum le nombre d'animaux.

Raffinement

Nous nous attacherons à réduire au maximum la souffrance des souris. Nous utiliserons l’imagerie optique, non invasive et non traumatisante, pour évaluer l’efficacité du traitement. L’implantation des tumeurs, ainsi que l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille d'évaluation de la douleur adaptée à ce projet a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence, son comportement, révélateurs du niveau de douleur. Des antalgiques sont prévus en cas de nécessité et un niveau de douleur trop élevé entraînera la mise a mort anticipée de l'animal. Chez la souris anesthésiée, tout signe de douleur (mouvement soudain, vocalisation) induira un arrêt de la procédure, une analgésie et une nouvelle induction de l’anesthésie. Une surveillance du volume tumoral 2 fois par semaine et du poids tous les 2-3 jours sera assurée après les implantations de tumeurs. Après l’anesthésie, la souris sera placée dans une cage thermostatée le temps du réveil et de la récupération post interventionnelle et post examen d’imagerie. Plus généralement, un animal peut être isolé de ses congénères s’il y a présence de blessures. Les blessures seront le cas échéant désinfectées à la vetedine. Enfin, des points-limites généraux avec l’établissement d’une grille d’évaluation regroupant les critères relatifs au bien-être tout le long de l’étude ont été établis.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé dans la littérature pour les études de vaccination antitumorales. De plus, une première preuve de concept a été réalisée avec cette espèce, cela est donc plus cohérent pour la poursuite de nos expériences. Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines car leur système immunitaire est adéquat et suffisamment développé à cet âge-là.

640 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trente-cinq injections dans l'abdomen sur animal vigile et passant jusqu'à quatre semaines isolée en cage calorimétrique. Une partie porte une mutation qui reproduit la progéria humaine, avec chute des poils, disparition de la graisse sous-cutanée et rides, ce que le porteur déclare sans effet sur leur bien-être. Les prises de sang se font également sur animal vigile, l'anesthésie modifiant la protéine étudiée, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le bénéfice avancé, valider une piste thérapeutique contre une maladie qui tue les enfants atteints vers treize ans, reste au conditionnel, tandis que les injections et l'isolement sont, eux, programmés.

Objectifs

La progéria est une maladie qui reste indétectable à la naissance, mais elle commence à se manifester très tôt, souvent dès la première année de vie. Les enfants affectés présentent des signes qui évoquent un vieillissement prématuré et accéléré, tels que la rareté des cheveux (alopécie), une peau fine, ridée, dépourvue de graisse, ainsi que des ongles peu développés. Par ailleurs, ces enfants connaissent une croissance lente, des problèmes osseux et musculaires, et un retard dans la pousse des dents. Ils souffrent également de douleurs articulaires et font face à des problèmes cardiovasculaires, mais il est important de noter que leurs capacités intellectuelles ne sont généralement pas affectées. Malheureusement, le pronostic de cette maladie est très sombre. Le décès survient en général entre l'âge de 6 et 20 ans, principalement à cause de problèmes cardiovasculaires, comme l'athérosclérose, une dégénérescence des artères, des crises cardiaques ou des accidents vasculaires cérébraux. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. Nous souhaitions démontrer que, dans des modèles de souris appropriés, l'inhibition d’une protéine par différentes méthodes (neutralisation de la protéine par des anticorps monoclonaux de haute affinité ou par des auto-anticorps polyclonaux), pourrait retarder le vieillissement prématuré dans des modèles murins de la progéria de Hutchinson-Gilford.

Bénéfices attendus

La progéria provoque un vieillissement prématuré du patient. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. C’est pourquoi il est important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet nous permettra de valider dans plusieurs modèles précliniques une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la progéria.

Procédures

Un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille sera effectué sur les animaux pour génotypage à raison de quelques secondes par animal effectuée sur animal vigile. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présentent un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle. Les symptômes n’apparaissent qu’aux alentours de la dixième semaine. Toutes les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (injection au niveau de l’abdomen de quelques secondes) (entre 4 et 35 au maximum sur animal vigile) et à un isolement (pour un maximum de deux fois deux semaines soit un total de 4 semaines) en cage calorimétrique. Les prélèvements sanguins (quelques secondes par prélèvement, volume de prélèvement relativement faible pour analyse moléculaire) seront effectués sur animal vigile (anesthésie modifiant les paramètres de la protéine étudiée). A l’issue de la période de maintien ou en cas d’atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les sites des injections ou des prélèvements sanguins pourraient s’infecter. Les manipulations ainsi que le passage en cage calorimétrique pourraient stresser les animaux. Toutes les souris seront soumises à un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille, à des injections intrapéritonéales, à des prélèvements sanguins et à être isolées (pour un maximum de 2 fois deux semaines) en cage calorimétrique. Ces injections et ces prélèvements sanguins entrainent un stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d'injection ou de prélèvements. Les isolements peuvent être une source de stress. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présenteront un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique de la progéria.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 640 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 20 souris (10 femelles et 10 males) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Il y aura une vigilance accrue si les animaux ont les mi-clos ou fermés ou s’ils sont isolés. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Infectées par le paludisme puis exposées quarante-cinq minutes durant aux piqûres de moustiques, une partie des 860 souris de ce projet est utilisée pour faire circuler le parasite entre rongeur et insecte. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, avec un affaiblissement et une anémie liés à l'infection, et des prises de sang tous les un à deux jours sur animal vigile. Le porteur présente pourtant cette production de parasites comme "une solution de remplacement", au motif que les sporozoïtes ainsi obtenus alimentent des cultures cellulaires qui auraient sinon exigé davantage d'animaux. Toutes sont tuées, les unes sous anesthésie au moment du prélèvement terminal destiné aux stocks congelés, les autres pour éviter qu'elles n'atteignent les points limites de l'infection.

Objectifs

L'objectif du projet est de produire des sporozoïtes de Plasmodium, les formes transmises par le moustique de l'agent du paludisme, à l'aide de modèles murins d'infection par Plasmodium yoelii et Plasmodium berghei. Les sporozoïtes produits serviront à des études in vitro en modèles cellulaires des stades pré-érythrocytaires de ces parasites. Ces études in vitro sont nécessaires pour mieux comprendre la biologie de ces parasites et les mécanismes d'infection, et pour évaluer l’activité de nouvelles molécules antipaludiques ou optimiser l’activité de molécules existantes. Les modèles d’études in vitro reposent sur l’infection de cellules hépatiques par des sporozoïtes isolés à partir de moustiques Anopheles préalablement infectés à partir de souris infectées. Ces modèles d’infection in vitro de cellules hépatiques par les parasites de rongeur P. yoelii et P. berghei reproduisent de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permettent d’étudier le rôle de facteurs parasitaires ou de l’hôte au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés, ainsi que d’évaluer l’efficacité de molécules à visée antiplasmodiale.

Bénéfices attendus

Le paludisme, avec près de 250 millions de cas annuels et plus de 600 000 décès, pour la plupart des enfants de moins de cinq ans, reste un problème majeur de santé publique. Ce projet, nécessaire pour assurer la production régulière des lots de sporozoïtes requis pour les études in vitro menées dans le laboratoire, devrait permettre d'améliorer nos connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, afin de définir des cibles thérapeutiques et vaccinales innovantes et de permettre l’évaluation de l’activité de molécules à visée antiplasmodiale dans le but d’élaborer ou d’optimiser de nouveaux traitements antipaludiques.

Procédures

Un premier groupe d'animaux est engagé dans des protocoles de production de parasites pour la congélation, destinés à l'infection standardisée d'autres souris. Ces animaux seront soumis à une injection intra-veineuse unique d’une suspension de sporozoïtes de Plasmodium (durée d'environ 15 secondes, sous anesthésie gazeuse), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang tous les 1 à 2 jours à partir du 4ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 7 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement soumis à un ultime prélèvement de sang, sous anesthésie et analgésie, pour la constitution des stocks de parasites cryopréservés (acte unique, durée 10 minutes), et euthanasiés avant leur réveil à l'issu de ce prélèvement. Un autre groupe d'animaux sera engagé dans des protocoles de transmission du parasite plasmodium aux moustiques. Ces animaux seront soumis une à injection intrapéritonéale de parasites (1 injection unique de parasites issus des stocks cryopréservés/standardisé, préparés à partir du premier groupe d'animaux ; durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), puis seront soumis à des prélèvement d'une goutte de sang par jour à partir du 3ème jour post inoculation des parasites, pendant au maximum 3 jours (durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Ces animaux seront finalement exposés à des piqûres de moustiques pour transmettre les parasites aux moustiques (acte unique réalisé sous anesthésie et analgésie, durée 45 minutes), puis euthanasiés avant leur réveil.

Impact sur les animaux

Stress lié à la préhension/contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour la constitution des cryostocks de parasites dans le cadre de ce projet, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Ce projet vise à produire les parasites au stade sporozoïtes, nécessaires à des expérimentations in vitro pour étudier les stades préérythrocytaires du paludisme. Il s’agit d’une solution de remplacement puisque les expériences menées in vitro à partir de chaque lot de sporozoïte produit permettent de collecter de façon très robuste et reproductible de nombreuses données pour lesquelles il aurait été nécessaire d’utiliser un bien plus grand nombre d’animaux si l’on avait cherché à collecter ses données à partir d’expériences menées in vivo, chez la souris. En particulier, l’utilisation de systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires et hépatocytes primaires) permet d‘analyser l'infection des cellules du foie par les parasites provenant des moustiques infectés. Si quelques protocoles décrivent la production axénique des sporozoïtes de Plasmodium, ils ne permettent malheureusement toujours pas de produire des sporozoïtes complètement matures et infectieux. Les protocoles décrivant la production des sporozoïtes de Plasmodium de rongeurs reposent de plus sur l’utilisation de gamétocytes (formes sexuées mâles et femelles), donc de stade sanguin, pour lesquels il n’existe pas de méthode de culture continue in vitro, et requièrent donc leur production chez l’animal.

Réduction

Au total ce projet utilisera 860 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires à la constitution des stocks de parasites et à l’infection des lots de moustiques nécessaires à la production des sporozoïtes destinés aux études in vitro sur 5 ans. Ces protocoles de production de parasites n'impliquent pas de tests statistiques. Le calcul des effectifs d'animaux nécessaires s'appuit sur une expérience de l'équipe acquise depuis plus de vingt ans dans la réalisation de ces protocoles.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères (2 à 5 par cage) dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur ou le stress (inoculation de parasites par injection intraveineuse et expériences de transmission aux moustiques notamment). La présence de points limites définis permet d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection, en particulier lors de l’infection par le parasite de rongeur Plasmodium berghei, les souches de Plasmodium yoelii n’engendrant quant à elles que peu de symptômes. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

Le modèle d'infection chez la souris par les parasites de rongeur Plasmodium yoelii et P. berghei reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites du genre Plasmodium, responsables du paludisme chez l'Homme. Ce modèle permet l'infection du foie par les sporozoïtes (la forme infectieuse du parasite transmise lors de la piqure d'un moustique infecté), une croissance parasitaire sanguine et la transmission de ces parasites aux moustiques pour la production de sporozoïtes infectieux selon le même schéma que ce qui est décrit chez l'Homme. L’infection in vitro de cellules hépatiques par des sporozoïtes de ces espèces parasitaires représente un modèle pertinent pour étudier la biologie des stades précoces du paludisme dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et vaccinales, et d’évaluer l’activité de molécules à visée antipaludique dans le but de développer de nouveaux médicaments. Dans ce projet, des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures sont utilisées, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.