Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Identification des mécanismes compensatoires du Csf1 dans la survie des macrophages
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une biopsie de la queue à la naissance et des administrations de tamoxifène par gavage, une partie d'entre elles étant en outre irradiées aux pattes avant une greffe de moelle osseuse et un prélèvement sanguin rétro-orbital. L'objectif est de comprendre comment les macrophages survivent lorsque les fibroblastes produisent moitié moins de Csf1, une question de recherche fondamentale sur l'immunité. Les retombées thérapeutiques annoncées, de nouvelles cibles contre des maladies comme l'ostéopétrose, restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que ces mécanismes ne peuvent être étudiés qu'in vivo et juge la souris "cruciale".
Objectifs
Les macrophages sont des cellules immunitaires présentes dans divers tissus, tels que la peau et le pancréas. Ils ont pour rôle d'ingérer les débris cellulaires et les agents pathogènes. La survie des macrophages dans les tissus dépend de la présence de Csf1, une cytokine produite par les cellules environnantes. Sans Csf1, le macrophage n'est pas capable de survivre et disparaît de manière permanente et complète du tissu ciblé. Des résultats préliminaires du laboratoire ont montré que la survie des macrophages pancréatiques et cutanés dépend du Csf1 produit par les fibroblastes. En effet, lorsque les fibroblastes ne produisent plus de Csf1, tous les macrophages pancréatiques et cutanés disparaissent. Cependant, si nous bloquons seulement la moitié de la production de Csf1 par les fibroblastes (ce qui signifie qu'ils produisent seulement la moitié de la quantité habituelle de Csf1), les macrophages pancréatiques et cutanés survivent normalement. L'objectif de ce projet sera donc de comprendre les mécanismes compensatoires mis en place au sein du pancréas et de la peau pour permettre la survie des macrophages avec seulement la moitié de Csf1 produit par les fibroblastes. Ce projet nous permettra ainsi d'approfondir notre compréhension des interactions entre les fibroblastes et les macrophages dans les tissus, ainsi que des mécanismes permettant aux macrophages de survivre dans des conditions de carence en Csf1.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à comprendre comment les macrophages parviennent à survivre avec une quantité réduite de Csf1. Cela pourrait permettre le développement de nouvelles approches thérapeutiques. En effet, les souris avec une mutation dans le gène Csf1 ont une quasi-absence de tous leurs macrophages. Ces souris présentent des symptômes tels que nanisme, surdité, infertilité, ostéopétrose et une mortalité élevée quelques semaines après la naissance. Cependant, l'injection de Csf1 à ces souris permet de rétablir en grande partie le nombre de macrophages présents dans les tissus ainsi que les pathologies associées. De plus, chez des souris de 2 mois avec des fractures fémorales, l'administration de Csf1 perturbe la cicatrisation et semble induire une ostéopétrose. En revanche, la régénération osseuse chez les souris âgées a pu être ramenée à des niveaux normaux uniquement en stimulant l'activation des cellules souches du squelette et bloquant le Csf1. Ces résultats mettent en évidence l'importance de réguler finement les niveaux de Csf1 dans les tissus. Ce projet permettrait ainsi d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies liées à une perturbation de la signalisation du facteur Csf1, comme l'ostéopétrose. De plus, ce projet vise à développer des outils pour manipuler les macrophages que ce soit au cours de contexte physiologiques et pathologiques.
Procédures
Procédure 1 : 846 souris seront tatouées, et un morceau de queue sera prélevé 7 à 10 jours après leur naissance. 162 souris seront réutilisées pour les procédures 2 et 3. Procédure 2 : 90 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine puis mises à mort après un mois. Procédure 3 : 72 souris seront traitées au tamoxifène par voie orale 2 fois à intervalle de 1 semaine. 1 mois après, les souris seront irradiées pour dépléter la moelle osseuse endogène puis injectées par voie intra-veineuse avec des cellules de moelle osseuse exogène pour reconstitution, puis mises à mort 2 mois après la greffe. Ces mêmes souris seront prélevées par voie rétro-orbitale 1 fois avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
- Une biopsie de la queue sera réalisée sur les animaux entre 7 et 10 jours après leur naissance. À cet âge, la perception de la douleur dans la queue par la souris est encore considérée comme faible, voire nulle, car le réseau neuronal de cette partie est encore sous-développé (nuisances légères). - L'administration de tamoxifène par voie orale, à l'aide d'une canule à embout flexible peut entrainer un léger inconfort et du stress pour la souris pendant l'administration qui dure environ 10 secondes ( nuisances légères). - Les animaux subiront une irradiation partielle des pattes arrières ainsi qu'une injection intraveineuse pour transplantation de moelle osseuse. Pendant toute la durée de l'irradiation ainsi que l'injection de moelle osseuse, les animaux seront maintenus sous anesthésie (envrion 15min au total) et ne ressentiront donc aucune douleur. L'anesthésie des animaux engendrera un stress à court terme des animaux, de plus, après l'irradiation, les aimaux se retouvent avec un système immunitaire incomplet pendant 15 jours augmentant ainsi le risque d'infection durant cette période. Les animaux seront ainsi plus vulnérables. Enfin l'injection intraveineuse, bien que faite sous anesthésie, entrainera une légère lésion pouvant entrainer un inconfort à court terme de la souris. L'ensemble de ces actes entraineront donc des nuisances considérées comme modérées.
Devenir
A l'issue des procédures les animaux sont mis à mort afin de prélever les organes.
Remplacement
La complexité des interactions entre les cellules stromales des organes, telles que la peau et le pancréas, et les macrophages ne peut être étudiée efficacement à l'aide de modèles in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des modèles animaux pour ce projet. En effet, comprendre comment les macrophages peuvent s'adapter en présence de niveaux réduits de Csf1 produits par les fibroblastes ne peut être réalisé qu'in vivo puisque les facteurs compensatoires mis en place pour la survie des macrophages peuvent provenir non seulement des fibroblastes, mais également d'autres types cellulaires présents dans ce microenvironnement. L'utilisation d'un modèle in vitro ne permet pas de refléter la complexité et la dynamique de cet environnement, qui joue un rôle crucial dans le maintien des macrophages pancréatiques ou cutanés. De même, l'étude du renouvellement des macrophages au sein des tissus requiert l'utilisation de modèles animaux, car les signaux permettant la migration des monocytes à travers les tissus et leur différenciation en macrophages ne peuvent être reproduits in vitro
Réduction
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour nos expérimentations. Le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été calculé sur http://Biomath.info/power/ttest.htm en prenant en compte des facteurs tels que la puissance statistique (Probabilité d’obtenir un résultat significatif même avec une faible différence = 80%), le niveau de risque acceptable (probabilité de se tromper et de conclure à une différence significative alors qu'il n'y en a pas = 5%) et l'écart de moyennes attendu entre les groupes expérimentaux et contrôles (différence attendue entre les groupes = 40%). Dans le cadre de cette étude, les accouplements seront faits pour permettre que toutes les femelles soient utilisées pour les expériences concernant ce projet, et que les mâles puissent être utilisés pour d’autres projets du laboratoire. Ceci permettra d’utiliser tous les animaux générés dans les élevages.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des environnements enrichis afin de satisfaire leur instinct grégaire, de favoriser les comportements naturels et limiter l’agressivité. Les conditions d'hébergement des souris respectent la directive 2010/63/UE : - Les cages utilisées permettent l'hébergement de 5 souris adultes d'un poids supérieur ou égal à 30 g (souris âgées de plus de 6 semaines). Dans chaque cage du coton pour confectionner des nids et des igloos seront introduits. Enfin, le statut EOPS de notre animalerie permet de minimaliser les variabilités dues au stress ou à des infections. Par ailleurs, la mise en place de points limites précoces, prédictifs et adaptés à chaque procédure, basés sur une observation quotidienne des animaux, de l’évolution de leur poids, de leur apparence et de leur comportement au cours de chaque procédure permettra de prendre les mesures adéquates pour limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux.
Choix des espèces
L´espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés, et leur utilisation dans ce projet est cruciale pour répondre aux questions scientifiques posées. Les souris seront utilisées à partir de l’âge de 6 semaines puisque nous nous intéressons au rôle compensatoire du Csf1 sur les macrophages à l’âge adulte et non au cours du développement.
Développement de modèles d’infection rénale et intra-péritonéale à bactéries bioluminescentes chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
416 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie sous anesthésie pour être infectés par des bactéries rendues luminescentes, puis des séances d'imagerie répétées sous anesthésie, avant d'être tués pour dénombrer les bactéries dans leurs tissus. Le porteur indique une perte de poids et une possible prostration liées à l'infection, et présente ce projet pilote comme un préalable à l'étude de nouveaux antibiotiques. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire ces infections et rend l'étude "indispensable".
Objectifs
La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des rechutes sont observées, associées au développement de résistances. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des schémas thérapeutiques est donc nécessaire afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. L’évaluation de l’efficacité de ces nouveaux schémas thérapeutiques est indispensable in vivo chez l’animal infecté avant d’envisager d’éventuels essais cliniques chez l'Homme. Ce projet pilote va nous permettre la mise en place de deux modèles d’infections bactériennes, une infection intrapéritonéale (péritonite) et une infection intra-rénale (pyélonéphrite) à deux entérobactéries (E. Coli et K. pneumoniae) majeures dans l’apparition de l’antibiorésistance. Pour ce faire, l'infection est provoquée en utilisant des bactéries qui ont été modifiées en laboratoire pour être luminescentes. La quantité de luminescence mesurée par un appareil d'imagerie devrait être proportionnelle à la concentration bactérienne ; c'est ce qui sera vérifiée grâce à cette étude. Cette mise en place permet de définir les paramètres optimaux de chaque infection d’un point de vue scientifique (concentration bactérienne adéquate pour maintenir une infection sur plusieurs jours sans traitement antibiotique) et d’un point de vue éthique concernant le bien-être animal (infection provoquant des signes cliniques légers). L’objectif de ce projet pilote permettra de raffiner les procédures et de réduire le nombre d’animaux dans le projet final qui portera sur l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques d’une nouvelle combinaison d’antibiotiques chez le rat infecté par une infection à entérobactérie. Raffiner à l’aide de l'imagerie (bioluminescence) qui est un outil de suivi non invasif de l’infection.
Bénéfices attendus
A court terme, le projet pilote permettra de mettre au point 2 modèles d'infection et 1 méthode d'imagerie pour le suivi des infections. A long terme, ces modèles et méthode seront utilisés dans un projet plus vaste visant à étudier de nouvelles stratégies antibiotiques, avec un bénéfice direct pour les malades souffrant d'une infection résistante aux antibiotiques.
Procédures
Tous les animaux recevront 2 fois par jour une injection d'antalgique en condition vigile par voie sous cutanée. Le nombre d'injection sera de 2 à 8 injections ( durée de 30 secondes maximum). Le jour de l'infection, chirurgie sous anesthésie générale et locale avec imagerie (bioluminescence) durée totale de l'anesthésie de 20 minutes pour tous les animaux. Les jours suivants l'infection, imagerie pour mesure de la bioluminescence pour les rats mâles : - 4 anesthésies sur 4 jours consécutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 3 anesthésies sur 3 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 2 anesthésies sur 2 jours consecutifs : durée 10 min pour 96 animaux. - 1 anesthésie : durée 10 min pour 96 animaux. Pour les 32 animaux femelles, le nombre d'anesthésie pourra varier de 1 à 4 en fonction des résultats obtenus chez le rat mâle.
Impact sur les animaux
Anesthésie : un inconfort léger lors de la phase de réveil de l’anesthésie est attendu. Actes chirurgicaux : une légere douler est attendue post-chirurgie réduit au maximum avec une couverture antalgique adéquate. Infection : une perte légère de poids inférieure 5 pour cent est à prévoir au cours du développement de l’infection, une prostration ou une perte de mobilité transitoire jusqu'à 24 heures post-infection peut survenir.
Devenir
Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne par comptage direct et établir une corrélation avec l'imagerie.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de modèles in vitro ou in silico permettant de reproduire ces modèles d’infections et permettant de mimer l’apparition de mutations bactériennes in vivo. Cette étude pré-clinique in vivo est donc indispensable à une éventuelle transposition chez l’homme. Le développement de ces modèles est la première étape de ce projet transversal d’amélioration de l’utilisation des antibiotiques en association dans le traitement des infections sévères.
Réduction
Ce projet correspond à une étude pilote pour un projet futur ainsi, seul le nombre minimum d'animaux nécessaire à l'analyse statistique des résultats sera utilisé. Ce nombre a été déterminé par un test statistique . Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux et d’étudier la variabilité inter-sexe, les études des modèles d’infection seront effectués seulement sur les mâles. Une approche progressive de l'évaluation du choix de l'inoculum sera mise en place : Le 1er inoculum testé sera l'inoculum avec la concentration la plus faible, si l'infection ne se maintient pas pendant 4 jours et/ou n'est pas quantifiable par méthode d'imagerie, un second inoculum sera testé à une concentration bactérienne supérieure. Si ce deuxième inoculum ne permet toujours pas d'avoir une infection stable pendant 4 jours, l'inoculum le plus concentré sera évalué . Le nombre d'animaux indiqué dans ce projet est donc un nombre maximal. Une fois qu’un inoculum bactérien unique et une durée unique d’infection seront définis, une étude de variabilité inter-sexe sera réalisée sur des femelles permettant ainsi de reduire le nombre d'animaux dans ce projet pilote.
Raffinement
Les rats suivent une acclimatation de 10 jours et sont élevés dans des cages standards sur portoir ventilé avec enrichissement (tunnels pour se cacher et des batonnets à ronger) limités à 2 animaux par cage. Les techniques chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et sur planche thermostatée avec analgésie opératoire et postopératoire : cette couverture antalgique sera maintenue en continue sur toute la durée du projet. Une grille de suivi du bien-être animal est mise en place pour suivre 2 fois par jour les animaux tout au long du projet. Des points limites gradés, suffisamment précoces et bien identifiés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettant d'agir rapidement pour améliorer le bien être .
Choix des espèces
La lignée "Sprague-Dawley" est une lignée de rats non-consanguins permettant d’obtenir une variabilité génétique inter-individuelle qui permet de se rapprocher de la variabilité inter-individuelle présente lors d'études cliniques. De plus, cette lignée n'est pas une lignée génétiquement modifiée. Dans la littérature , cette souche a été utilisée pour développer des modèles d'infection similaires à ceux presentés dans ce projet. Les animaux seront agés de 8 semaines ce qui leur garantit une maturité physiologique notamment de leur système immunitaire pour résister à l’infection.
Mise au point et utilisation d’un modèle expérimental d’inflammation cérébrale dans des souris immunodéficientes humanisées.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
358 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent des injections intraveineuses, une injection dans le cerveau et des injections répétées dans l'abdomen, ainsi que des prélèvements de sang, avant d'être tuées pour analyser les organes touchés. Le porteur met au point un modèle d'inflammation cérébrale médiée par des lymphocytes humains, présenté comme une alternative à l'usage de primates. Il affirme que cette étude animale est "la seule" à pouvoir valider son hypothèse.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de mettre au point un modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par des lymphocytes T humains. Une fois le modèle mis au point, nous pourrons questionner le rôle d’une autre population lymphocytaire présentant in vitro un caractère cytotoxique et que nous avons trouvé accumulé dans le sang, le liquide céphalorachidien et les zones inflammatoires de patients atteints de maladie neurodégénérative. In fine, nous évaluerons une thérapie à base d’anticorps pouvant spécifiquement cibler cette population lymphocytaire agressive.
Bénéfices attendus
Les bénéfices seront doubles : (1) mise au point d’un nouveau modèle d’inflammation cérébrale chez la souris, médié par les lymphocytes T humains qui permettra de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant particulièrement les cellules humaines. (2) évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant une population lymphocytaire exacerbant les signes d’inflammation cérébrale chez l’homme.
Procédures
Les souris anesthésiées seront injectées en intraveineuse (i.v.), cet acte est rapide (
Impact sur les animaux
Effet de l’injection en i.v. et de la prise de sang sur les souris=> stress lié à l’anesthésie. Effet de l’injection i.p. =>stress lié à la contention. Effet lié à l'induction de l'anesthésie profonde pour l’injection intracérébrale sur les souris => stress lié à la contention. Douleurs post-opératoires potentielles minorées par des antalgiques =>stress lié à la contention pour l'injection d'antalgiques.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre une analyse des organes cibles de la maladie induite.
Remplacement
In vitro, nous avons observé une accumulation de cellules immunitaires particulières dans des d’échantillons biologiques de patients atteints de sclérose en plaque (sang, liquide céphalorachidien, coupe de cerveau). Cette observation nous amène à émettre l'hypothèse qu’elles pourraient avoir un rôle délétère dans la maladie. Cette étude chez l’animal est la seule à pouvoir nous permettre de répondre à l’hypothèse dans sa complexité et à valider la stratégie thérapeutique envisagée sans avoir recours aux grands animaux.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Deux études pilotes sont envisagées afin d'établir le protocole expériemental dans lequel seront évaluées nos hypothèses. Les procédures de cette DAP ne seront envisagées que si (1) les études pilotes sont validées et si (2) les GO/No GO inclus à la fin des expérimentations conduisent à des GO permettant de continuer l'étude pour vérifier les hypothèses. Enfin, les groupes ont été constitués grace au travail récent de scientifiques ayant présentés leurs résultats dans des journaux spécialisés et sujets à une évaluation par les paires. Les expériences pilotes et les GO/No GO permettront ainsi de réduire au strict nécessaire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées, avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. Afin de réduire la douleur un certain nombre d’actes se feront sous anesthésie, sur tapis chauffant et le suivi clinique régulier des souris (surveillance du poids, aspect clinique général, administration d'antalgique) nous permettra de palier à la douleur éventuelle. Le bien-être des animaux est surveillé tout au long de l’étude avec une évaluation quotidienne des signes généraux.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes (NSG) sont des souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre et dans lesquelles peut se développer un système immunitaire humain après injection de cellules immunitaires humaines. On parle alors de souris humanisées. Le modèle expérimental proposé ici : l’humanisation de souris immunodéficientes (mâles et femelles) de 8-12 semaines de vie par l'injection de lymphocytes T CD4 +/- T CD8 humains est le seul qui nous permette de confirmer in vivo le pouvoir aggravateur des cellules CD8-NK-Like. Ces souris humanisées sont des modèles alternatifs à l'utilisation de primates pour tester des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Rôle de l’interleukine 28 dans le rejet aigu d’allogreffe sous CTLA4-Ig
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une greffe de peau sous anesthésie, puis des injections répétées et des prélèvements de sang, l'isolement en cage après la chirurgie ajoutant un facteur de stress. Le porteur présente une étude pilote sur l'effet d'une molécule intestinale sur le rejet de greffe et mentionne, parmi les retombées attendues, le dépôt d'un brevet. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'observer la complexité du rejet à partir des seuls échantillons de patients.
Objectifs
La transplantation d’organes est le seul traitement de certaines pathologies, elle augmente de plusieurs années la durée de vie des patients. Cependant, le système immunitaire du patient reconnaît l'organe greffé comme étranger ce qui provoque un rejet de l'organe. Plusieurs traitements sont utilisés pour contrer le système immunitaire et donc le rejet. Les traitements historiques de prévention du rejet de greffe présentent de nombreux effets secondaires, ils réduisent l'espérance de vie des patients. Un des derniers traitements développés présente moins d'effets secondaires que les traitements historiques, mais il est moins efficace pour prévenir certains rejets spécifiques. Le risque de subir un rejet avec ce traitement semble relié à l'environnement des patients et leur microbiote. Le microbiote est l’ensemble des bactéries présentent naturellement sur et dans le corps humain. Il influence la fonction des organes et cellules, il peut provoquer la production de certaines molécules. Ce projet a pour objectif d'évaluer l'effet d'une de ces molécules sur le rejet de greffe. Cet effet étant totalement inconnu, cette étude sera une étude pilote. Dans un modèle de greffe de peau de souris, nous analyserons la durée de greffe et l'effet de cette molécule sur les systèmes immunitaire et digestif.
Bénéfices attendus
Les informations obtenues permettront de préparer une étude sur l’effet d’une molécule, produite par l’intestin sous l’influence de bactéries. L'influence de cette molécule sur le rejet de greffe n'est, à ce jour, pas connue. A partir du sang de patients, nous avons obtenu des résultats montrant un lien entre ces bactéries, une molécule produite par l’intestin et le risque de rejet. Il nous est nécessaire d'obtenir des informations sur ; la durée de greffe en présence de cette molécule, l’effet de cette molécule sur l’intestin, les globules blancs et sa persistance dans le sang selon la façon dont elle est donnée aux souris. Ces informations nous permettront de construire d’autres expériences s’intéressant à l’effet de la modification des bactéries de l’intestin sur le rejet de greffe et à l’effet de l’absence de cette molécule sur le rejet. Cette étude nous permettra de mieux comprendre les causes du rejet de greffe des patients traités par un nouveau traitement ayant moins d’effet secondaire que les traitements historiques. Ces résultats permettront de mettre au point un test pour déterminer quels patients feront plus probablement un rejet de greffe avec ce nouveau traitement et ne donner ce traitement qu’aux patients les moins à risque. Ces résultats pourraient aussi permettre de mettre au point des traitements, qui ajouté au traitement du rejet, limiterait le rejet de greffe. Enfin ces résultats nous permettraient de déposer un brevet.
Procédures
Nous réaliserons une greffe de peau sur 42 souris, la chirurgie durera 30 min par animal. Les animaux recevront un ou deux traitements dans l'abdomen ou sous la peau ; tout les 2 jours pendant une semaine puis deux fois par semaines pendant 2 semaines (7 souris) ou tous les jours pendant 3 semaines (21 souris) ou recevront les deux types d'injection (14 souris). Les injections dureront moins d'une minute chacune. Les 42 souris seront soumises à deux prélévements de sang, à une semaine d'intervalle. Chaque prélévement durera entre 3 et 5 minutes.
Impact sur les animaux
La réalisation d'une greffe de peau peut provoquer une douleur et un stress. Les animaux seront également seuls en cage après la chirurgie ce qui peut provoquer un stress. La répétition des injections est un autre élément de stress pour les animaux. Les traitements utilisés dans cette étude ne sont pas décrits comme toxique ou douloureux.
Devenir
Mise à mort pour analyse.
Remplacement
Nous avons obtenu des résultats à partir du sang de patients. Mais il n'est pas possible d’observer toute la complexité du rejet de greffe à partir de ces échantillons. Le rejet de greffe est le résultat des échanges entre de nombreuses molécules et cellules. Des expériences de greffe de peau sur des souris permettront de valider les observations faites sur le sang des patients greffés. Ces expériences permettent de donner aux souris le même traitement que celui reçu par les patients et d’observer les effets de la molécule, ajoutée au traitement, sur les organes et les cellules des animaux. Nous pourrons aussi observer la durée de vie de cette molécule dans le corps.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux utilisé dans cette expérience au maximum. Nous avons calculé que 42 souris seront nécessaire pour nos observations et nous avons réduit le nombre d'animaux contrôles. Cette étude est une étude pilote, car aucune expérience de greffe de peau n'a été réalisée avec ce traitement jusqu'à présent. Grâce à cette étude pilote nous obtiendrons des données qui serviront à calculer le nombre d'animaux nécessaire pour de prochaines expériences. Nous prélèverons du sang aux souris toutes les semaines en même temps que l'observation de la greffe, pour limiter le nombre d'animaux utilisé. Nous ferons l’expérience sur la moitié des souris pour chaque groupe dans un premier temps. Puis nous analyserons les résultats avant de faire l’expérience sur le restant des souris uniquement si nécessaire.
Raffinement
L'environnement des souris sera enrichi par des refuges, de la cellulose, des cylindres de coton tout au long de la vie des animaux. Les animaux seront en groupe jusqu'à la greffe de peau puis ils seront isolés. Les souris seront anesthésiées pour la greffe de peau et elles recevront un anti-douleur au moment de la greffe. De l'alimentation humide sera mise au fond de la cage après la greffe. La douleur sera estimée tous les jours après la greffe grâce à une grille de notation de la douleur et du stress. Si les animaux montrent des signes de douleur, ils recevront un anti-douleur plusieurs fois par jour et une alimentation humide au fond de la cage si besoin. Toutefois si une douleur se poursuit plus de deux jours ou si la souris perd plus de 20% de son poids ou si la greffe est rejetée, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle de greffe de peau de souris est utilisé par de nombreux groupes de recherche depuis de plusieurs années. Ainsi nos résultats pourront être utilisés par d'autres groupes de recherche. Nous pourrons également les utiliser comme contrôles dans de futures expériences. Les animaux seront utilisés à un âge de 2-3 mois car le traitement du rejet est plus efficace sur les animaux jeunes.
Validation de l’efficacité anti-tumorale d’un CAR-T cell IL-1RAP en traitement des syndromes myélodysplasiques (2/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
300 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales par voie intra-osseuse et un myélogramme transtibial, gestes que le porteur décrit comme provoquant une douleur importante justifiant l'anesthésie, avant d'être tuées à trois semaines. Le porteur teste des lymphocytes CAR-T contre un état préleucémique et indique le développement possible d'une anémie. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro cette maladie avec tous ses composants.
Objectifs
Ce projet vise à valider in vivo l’efficacité d’une approche par immunothérapie (CAR-T cells) pour traiter les syndromes myélodysplasiques (état préleucémique) en utilisant un modèle murin humanisé de syndromes myélodysplasiques. Il s'agit d'un projet multi-site qui se déroulera dans 2 animaleries différentes. Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de confirmer l'efficacité anti-tumorale des CAR-T cells contre les cellules myélodysplasiques dans un modèle in vivo de syndromes myélodysplasiques et en cas de résultats positifs de débuter un essai thérapeutique clinique. En effet, il y a peu d’alternative thérapeutique pour les patients réfractaires aux traitements de première ligne.
Procédures
1) Injection intratibiale des cellules tumorales sous anesthésie et analgésie (30 s). 2) Entre 1 mois et 3 mois post greffe : Confirmation prise de la prise de greffe par mesure de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min). Réalisation d'un myélogramme par voie transtibiale sous anesthésie et analgésie (30 s) si absence de bioluminescence. 3) Injection intracaudale à J0 du traitement et des différents véhicules (5 min). 4) J7 et J15 prise de sang par ponction veine mandibulaire pour monitoring in vivo par CMF de l'expansion des CAR-T cells (2min) 5) Mesures de la luminescence par imagerie in vivo sous anesthésie générale (5 min) à J7, J10, J14 et J21. 6) A J21 post injection du traitement les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les injections et les prélèvements sanguins vont engendrer une douleur légère et de courte durée. La ponction et l'injection médullaire transtibiale va engendrer une douleur importante le temps du geste justifiant une anesthésie générale avec analgésie. Le développement du syndrome myélodysplasique peut entrainer un inconfort en rapport avec l'anémique.
Devenir
Certains animaux issus de la procédure d’élevage entreront dans la procédure d’expérimentation s’ils ont l’âge requis pour la procédure de xénogreffe au moment de la disponibilité du matériel biologique nécessaire à la xénogreffe. Tous ces animaux atteignant le point-limite et/ou maintenus aprés la dernière imagerie seront finalement mis à mort pour les analyses biologiques invasives nécessaires à l'exploitation optimale des résultats. Les autres animaux (surnuméraires, ayant dépassé l’âge pour la réalisation de la xénogreffe ou vieux reproducteurs) seront euthanasiés.
Remplacement
Il est impossible, à l’heure actuelle, de reproduire de manière in vitro une hématopoïèse clonale complète d'un syndrome myélodysplasique avec tous ses composants et leurs interactions pourétudier l’efficacité anti-tumorale de lymphocytes T modifiés. Par ailleurs, aucun modèle mathématique ou informatique ne permet actuellement d’évaluer également cette réponse.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires à cette étude a été réduit au minimum sur la base des besoins imposés par les tests statistiques que nous utiliserons. De fait, un nombre de 300 souris sera nécessaire.
Raffinement
L'ensemble des procédures pouvant s'accompagner d'une douleur/angoisse modérée, tous les efforts seront entrepris pour réduire au minimum de douleur, souffrance ou angoisse ressentie par les animaux. C'est pourquoi nous surveillerons l'état de santé des animaux tout au long des expériences afin de pouvoir intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de douleur, de souffrance ou d'angoisse. La greffe des cellules souches humaines sera réalisée par voie transtibial de même que les myélogrammes sous anesthésie générale injectable. Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. Les personnels impliqués ont des compétences validées pour les manipulations des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement stérile (isolateur) dans un environnement enrichi et contrôlé et observés quotidiennement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. Les différents gestes chirurgicaux et les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie générale. La méthode de mise à morts des animaux est réglementaire. Les animaux seront transportés dans des cages stériles prévues pour cet usage avec enrichissement de l’environnement et tout sera mis en œuvre pour limiter la durée de transport entre les 2 sites.
Choix des espèces
Il a été démontré que les souris avec ce profil particulier d'immunodépression permettent une meilleure prise de greffe des cellules souches hématopoïétiques humaines. Autre avantage de ces souris, elles n'ont pas besoin d'être préparées à la greffe par un conditionnement par irradiation ou une chimiothérapie. Ce conditionnement peut augmenter la létalité de la procédure. Souris entre 8 à 10 semaines de vie. Du fait du délai de prise de greffe (entre 1 à 3 mois), l'injection doit se faire précocement.
Thérapie génique pour la maladie de Willebrand
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections et des prélèvements de sang répétés, une partie subissant un test de saignement par section des trois derniers millimètres de la queue avant la mise à mort. Ces souris génétiquement modifiées expriment très peu du facteur étudié pour reproduire la maladie de Willebrand, le porteur cherchant à raccourcir la protéine pour une thérapie génique. Il affirme qu'il est "indispensable de faire appel à un organisme vivant entier".
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines et l'absence de l'une ou l'autre de ces protéines va conduire à des pathologies hémorragiques congénitales. La plus fréquente de ces pathologies est causée par l'absence d'une protéine circulant dans le sang et qu'on pourrait tout à fait envisager de remplacer par une approche de thérapie génique. Le problème principal est que la séquence d'ADN qui permet de produire cette protéine est trop grande pour rentrer dans les vecteurs biologiques actuellement disponibles pour aller livrer la protéine au site cellulaire désiré. Le but de notre projet va donc consister à tester s'il est possible de retirer ou remplacer des parties de notre protéine d'intérêt tout en préservant sa fonction normale. Cette approche permettrait ainsi de faire rentrer l'ADN de cette protéine dans un vecteur standard et donc de pouvoir enfin proposer une approche de thérapie génique aux patients.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur le facteur Willebrand en déterminant quelles régions/domaines de cette protéine sont les plus importantes pour sa fonction. A long terme, le projet contribuera à rendre la thérapie génique possible pour les patients souffrant de la pathologie hémorragique congénitale la plus fréquente.
Procédures
Les souris seront soumises à plusieurs interventions pendant la durée de la procédure: 1) 1 injection qui dure 5 secondes 2) 1 ou plusieurs prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse. En cas de plusieurs prélèvements ceux-ci seront espacés de 2 mois et leur nombre maximum sera de 4. Ces prélèvements durent entre 5 et 10 secondes. 3) 1 injection finale qui va durer 5 secondes pour anesthésier les animaux. Les deux gestes suivants seront réalisés sur ces souris anesthésiées: 4) Soit un prélèvement sanguin terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires ou un test de saignement consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent expérimenter une douleur transitoire de courte durée pendant et après l’injection intra-veineuse et après le prélèvement sanguin.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires. La ré-utilisation des animaux n'est pas possible du fait de la procédure subie dans le présent projet .
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, faisant intervenir de nombreux acteurs, que ce soit les cellules sanguines, les protéines qui circulent dans le sang mais aussi la paroi des vaisseaux sanguins. Actuellement les tests disponibles qui ne font pas appel aux animaux, même s’ils se sont beaucoup améliorés depuis quelques années, ne permettent pas de reproduire l’intégralité de ce processus. Il est donc indispensable de faire appel à un organisme vivant entier.
Réduction
Nous avons séparé le projet en deux procédures successives afin de pouvoir identifier rapidement les protéines les plus efficaces et donc n'en tester que quelques-unes (ou même pas du tout) dans une la seconde procédure bien plus longue. D'autre part, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. Les souris seront surveillées 3 fois/semaine pendant la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne sont pas en souffrance (visible par leur aspect et comportement). Des point limite précoces ont été anticipés et mis en place et seront appliqué en cas de signes évidents de douleurs importantes. Si ces points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés par les méthodes réglementaires.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à un modèle murin déjà développé qui a prouvé sa pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui expriment seulement une quantité très faible de la protéine étudiée et chez lesquels il sera donc aisé de voir une augmentation de cette protéine après traitement. Pour une des procédures nous utiliserons des animaux adultes des deux sexes. Par contre, pour l'autre procédure, nous serons limités à des animaux adultes de sexe mâle exclusivement car chez les rongeurs, la thérapie génique est 5-10 fois moins efficace chez les femelles. Des souris adultes (8 - 16 semaines) seront utilisées.
Évaluation de l’effet thérapeutique d’un facteur régulateur de l’immunité innée dans le cancer oral.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules cancéreuses dans la langue puis des traitements répétés, la tumeur linguale provoquant une perte de poids et des difficultés à s'alimenter, avant leur mise à mort pour analyses. Le porteur teste une molécule d'immunothérapie contre le cancer oral et prévoit une hydratation systématique pour limiter la déshydratation. Il affirme que l'étape animale est "indispensable" et qu'un "organisme vivant intégré" est nécessaire avant tout essai chez l'humain.
Objectifs
L’immunothérapie est une approche thérapeutique qui agit sur le système immunitaire d’un patient pour lutter contre sa maladie. Dans le cas du cancer, elle ne s’attaque pas directement à la tumeur, mais stimule les cellules immunitaires impliquées dans sa reconnaissance et sa destruction. Dans certains cas cette thérapie n’est pas suffisante pour induire des réponses antitumorales et traiter la totalité des patients. Cependant, d’autres voies du système immunitaire peuvent jouer un rôle critique dans le traitement du cancer. La compréhension des mécanismes activés dans ces voies ainsi que la détermination des cellules immunitaires impliquées est nécessaire. Dans notre équipe, nous avons travaillé sur les mécanismes de stimulation d’une voie de signalisation, récemment identifiée, de l’immunité innée. Cette voie induit des réponses antitumorales efficaces en synergie avec l’immunothérapie et potentiellement avec la chimiothérapie pour détruire les tumeurs. Dans ce projet, nous évaluerons l’effet thérapeutique, d’une molécule qui active cette voie de signalisation, dans différents types de cancer oraux. Cette étape de développement préclinique est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement afin d’envisager une application thérapeutique en clinique chez l'homme.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie par activation de notre voie d’intérêt permet de cibler et de tuer les cellules tumorales. Néanmoins, elle représente deux limites i) elle n’a pas permis de cibler tous les types de tumeurs, ii) elle induit des effets toxiques chez les patients. Nous proposons donc une stratégie pour contrer ces limites et améliorer les capacités à cibler les cellules tumorales, tout en limitant les effets secondaires. Une meilleure compréhension du mécanisme d’action sous-jacent peut également contribuer à l'avenir au développement de méthodes thérapeutiques encore plus efficaces.
Procédures
Des cellules tumorales seront injectées par voie intra-linguale aux animaux anesthésiés (1 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Puis certaines de ces souris recevront ensuite le traitement par voie intra-tumorale ou sous-cutanée dans le palais de la bouche sous anesthésie (3 fois au cours de l’expérience, durée de l’anesthésie : 10 minutes). Deux prélèvements de sang seront réalisés, le premier 3h après l’administration des traitements puis le second, 17 jours après (durée du geste inférieur à 30 secondes). Certaines souris recevront également un traitement directement dans l’abdomen à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines (durée du geste inf à 10 sec)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration de cellules tumorales par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non toxique et non douloureux dans un site sensible sur des animaux anesthésiés. L’un des effets attendus de ces essais est la perte de poids due au développement de la tumeur dans la langue et aux difficultés à s’alimenter Ces effets se manifesteront de façon croissante au cours de l’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie intra-linguale seront celles liées à l’injection d’un produit non douloureux dans un site sensible sur animaux anesthésiés. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale seront celles liées à la piqûre elle-même (douleur de courte durée) Lors des prélèvements sanguins, une légère douleur liée à la piqure est attendue. Cette douleur sera de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour des analyses post mortem sur des organes ex vivo.
Remplacement
Les approches thérapeutiques décrites dans ce projet découlent de résultats obtenus in vitro à l’aide de lignées cellulaire en culture. De plus, ces techniques in vitro nous ont également permis de mieux comprendre certains mécanismes d’action de nos molécules d’intérêt Néanmoins, malgré les méthodes alternatives in vitro auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation du modèle animal reste indispensable pour la suite du projet avant d'envisager une application clinique chez l'homme en immunothérapie. Une étape passant par un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré est nécessaire. Cette étape est indispensable pour tester les mécanismes de régulation et d’action, ainsi que la toxicité éventuelle de ce traitement.
Réduction
Les expériences de croissance des lignées de cellules tumorales in vivo, en particulier, ont été récemment établies dans notre institut et nous utilisons ces connaissances pour planifier nos expériences. Nous savons également que nous pouvons nous attendre à une croissance homogène des lignées de cellules tumorales in vivo, ce qui nous permet de limiter à 6 le nombre de souris par groupe d'expériences selon l’objectif des expériences. Nous suivrons la croissance des tumeurs dans la bouche à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui nous permet de garder les animaux sous surveillance pendant toute la durée de l'expérience. Le nombre de souris par groupe est ajusté au minimum selon que ce sont des expériences de mise au point ou des expériences de test d'efficacité de traitements afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Les analyses des populations de cellules immunes ou la comparaison des tailles de tumeurs à des points de cinétiques précis seront évaluées à l'aide des tests non paramétriques Anova et Kruskal Wallis. Si les résultats de la procédure 1 ne sont pas concluants, tout sera arrêté et donc les autres procédures ne seront pas réalisées.
Raffinement
Dans le cas des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés spécifiquement au moins deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur et appliquer les points limites décrits dans la procédure correspondante et selon la grille de score fournie en annexe. Si besoin, les souris seront surveillées quotidiennement en fonction de l’évolution tumorale. Nous pèserons également les souris pour s’assurer qu’il n’y ait pas de perte de poids ou prise de poids anormale traduisant un mal-être. Une hydratation systématique par injection de Ringer Lactate sera mise en place pour prévenir toute déshydratation induite par le développement de tumeurs dans la bouche. Nous travaillons avec des personnes ayant une grande expérience avec les souris et reconnaissant rapidement les comportements et signes de douleur et d’inconfort. Nous agirons en fonction de la grille de score jointe au document. Des soins complémentaires seront apportés si nécessaire tels que des analgésiques. Des compléments alimentaires seront mis à disposition dès la greffe des tumeurs pour habituation et afin de faciliter la prise alimentaire. Toutes les souris seront anesthésiées lors des manipulations et recevront des analgésiques pour les gestes douloureux.
Choix des espèces
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide notamment de lignées cellulaires en culture. Après la démonstration in vitro et avant d'envisager une application clinique chez l'Homme en thérapie anti-cancéreuse, l'évaluation préclinique de ces traitements est nécessaire dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris. Cette étape est indispensable pour tester l'efficacité, le mécanisme d'action ainsi que la toxicité éventuellement associée à ce type de traitement. La souris est aussi le modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins, et de la disponibilité de souches murines parfaitement définies. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques, permettant d'identifier des cibles précises pour la thérapie. Par ailleurs, il existe un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées qui sont disponibles. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (entre 6 semaines et 6 mois) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux. De plus, cet âge est adapté pour générer des modèles de tumeurs par la greffe de lignées de cellules tumorales. Pour chaque protocole expérimental on utilisera des groupes d’animaux d’âge identique. Enfin, l’âge adulte permet d’étudier un système immunitaire mature.
Etude de l’impact de l’utilisation des biomatériaux dans la greffe de neurones corticaux issus de cellules souches humaines dans le traitement de lésions corticales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une lésion du cortex moteur et une greffe de neurones humains associés à un biomatériau, puis des pesées et des tests moteurs sur plusieurs mois, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur indique appliquer un jeûne de quinze heures avant le test de préhension de nourriture pour motiver les animaux. Il affirme qu'il n'est "pas encore possible" de modéliser un cerveau de mammifère in vitro et présente le recours aux modèles animaux comme "essentiel".
Objectifs
Du fait de la très faible capacité du cerveau à s’autoréparer, les traumatismes craniens sont dévastateurs. La lésion du cortex moteur est une caractéristique commune de nombreuses conditions neuropathologiques telles que les tumeurs, les lésions (traumatisme, accident vasculaire cérébral) ou les maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique, ataxies scérébeleuses, maladies de Huntington, d'Alzheimer...). Afin de pallier les capacités de régénération limitées du cerveau adulte, il est nécessaire de développer des stratégies thérapeutiques. La transplantation neuronale a été explorée comme une approche potentielle permettant de rétablir les fonctions cérébrales en remplaçant les neurones perdus par de nouveaux neurones. Il est déjà démontré que des neurones issus de cellules souches, transplantés dans des cerveaux de souris, peuvent efficacement rétablir des connexions spécifiques après une lésion corticale. Une réparation des réseaux neuronaux est donc possible chez la souris, mais l'efficacité de cette approche doit encore être améliorée avant de pouvoir être envisagée chez l'Homme. Dans cette étude, nous souhaitons coupler la greffe de neurones humains avec l'utilisation d'un biomatériau naturellement présent dans l'organisme: l'acide hyaluronique. Des tests de comportement permettront d'examiner l'effet sur la récupération motrice des animaux et de comparer l'effet du biomatériau sur la réparation du cerveau.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d'étudier l’effet d’un biomateriau sur la réparation des réseaux neuronaux après transplantation de nouveaux neurones chez le rongeur. Ce biomatériau peut être utilisés pour fournir un support structurel, libérer des facteurs de croissance, ou encore promouvoir la régénération tissulaire dans la zone lésée du cortex cérébral. Les potentiels effets du biomatériau incluent la réduction de l'inflammation, la promotion de la cicatrisation, la restauration des connexions neuronales et la récupération des fonctions altérées à la suite de lésions du cerveau. A plus long terme, les bénéfices attendus de ce projet sont le développement de thérapie clinique chez l'Homme autour de la transplantation cellulaire combinée à des biomateriaux, afin d’améliorer la qualité et la fiabilité des transplantations et ainsi améliorer la prise en charge des patients souffrants de lésions cérébrales suite à des traumatismes crâniens ou des AVC.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : -intervention 1 : chirurgie craniale : 1 fois (10 minutes par animal, 160 animaux); -intervention 2 : chirurgie craniale avec greffe de neurones : 1 fois (10 minutes par animal, 120 animaux); -intervention 3 : chirurgie craniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 40 animaux). Sur animaux vigiles : - au maximum une soixantaine de pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (une fois à 2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 160 animaux); -au maximum 10 sessions de 2 tests de comportement moteur (15 minutes par souris et par test, 160 animaux).
Impact sur les animaux
Suite à l’anesthésie générale et la chirurgie cranienne, les effets indésirables attendus sont la douleur liée à la chirurgie minimisés par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie, ainsi qu'une légère perte de poids transitoire. La lésion du cortex moteur entraine potentiellement une légère diminution de la capacité de préhension de la patte antérieur gauche. L’acte de pesée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire. Un jeûne de 15 heures sera réalisé avant le test de préhension de nourriture afin que les animaux soient motivés à récupérer les boulettes de nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet afin de récupérer le cerveau pour des études neuroanatomiques.
Remplacement
L’impact de la composition du biomatériau utilisé dans cette étude a été testé au préalable dans un modèle in vitro. Ceci permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la possibilité de la réparation du cerveau lésé sur le plan neuroanatomique et fonctionnel. Les symptômes cliniques des traumas crâniens qui nous intéressent concernent la motricité. De ce fait, la nécessité de modèles animaux apparait essentielle à l’étude de cette pathologie. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. De nos jours, il n’est pas encore possible de modéliser un cerveau de mammifère in-vitro ou in silico, qui nous permettrait d’étudier l’effet bénéfique de la transplantation sur la motricité.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux nécessaires en expérimentation tout en s'assurant d'en avoir le nombre suffisant pour avoir une étude interprétable sur le plan statistique par l’utilisation d'un test statistique approprié. Ceci a permis de déterminer un nombre de 10 animaux avec la moitié de mâles et la moitié de femelles.
Raffinement
Durant toute l’expérimentation, le bien-être des animaux sera respecté en réduisant au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou le stress. Les conditions d’élevage et d’hébergement seront optimisées (hébergement en groupe dans des locaux adaptés avec enrichissement du milieu adapté à l'espèce : matériel de nidification et tunnel). Les souris ont un phénotypes dommageable (immunodéficience), mais ce phénotype ne s'exprime pas dans nos conditions d'hébergement. Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale avec analgésie et contrôle de la température corporelle. De plus, elles seront réalisées par un binôme compétent et expérimenté, permettant ainsi de réduire l’angoisse des animaux et de contribuer à leur bien-être. Durant toute la procédure, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien de leur état de santé (alimentation, apparence, comportement) à l'aide d’une grille de score. Des points limites adaptés et gradés et un arbre décisionnel comprenant des critères d'arrêt de souffrance ont été définis en amont de la réalisation du projet.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée pour les modèles animaux dans le domaine des neurosciences. En effet, il est possible de mimer chez la souris les lésions du cortex moteur qui peuvent survenir chez l'Homme dans différentes situations (accident de la route, traumatisme crânien, AVC...). Nous utiliserons des souris âgées de 3 mois au début de cette étude. Nous souhaitons travailler sur des souris adultes matures ce qui correspond à l'âge où le développement biologique est passé, mais pas encore affecté par le vieillissement.
Barrière immunitaire aux produits de thérapie génique : mécanismes et nouvelles stratégies d’évitement chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Injectées de cellules immunitaires puis d'un vecteur de thérapie génique dérivé d'un virus adéno-associé, 4 610 souris seront toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Selon les parties du projet s'ajoutent une injection sous la peau ou dans le derme, des injections intrapéritonéales répétées d'agents immunomodulateurs, jusqu'à 15 pour le méthotrexate, et des prises de sang répétées, jusqu'à 9 en six mois dans la première partie. Le projet vise à comprendre la réaction immunitaire contre ces vecteurs, que le porteur dit "bien tolérés chez l'homme" et dont plusieurs ont déjà reçu une autorisation de mise sur le marché, et à mettre au point des co-traitements pour l'atténuer. Les prises de sang, mandibulaires, se font "sur animal vigile", sauf exception rétro-orbitaire sous anesthésie générale, et le porteur range l'"anesthésie préalable" parmi ses mesures de raffinement pour ces prélèvements.
Objectifs
Les vecteurs dérivés de virus adéno-associés (AAV) sont les plus utilisés en thérapie génique dans le traitement des maladies génétiques. Ces vecteurs sont bien tolérés chez l’homme, et leur bénéfice thérapeutique est tel que plusieurs d’entre eux ont reçu des autorisations de mise sur le marché. Cependant, quelques barrières subsistent et viennent limiter leur efficacité et leur utilisation. L’une d’entre elles est la barrière de la réponse immunitaire. En effet, notre système immunitaire a pour fonction de préserver l’intégrité de l'organisme en éliminant les éléments qui viendraient perturber trop fortement l’équilibre maintenu avec notre environnement. Il est ainsi logique que l’administration du vecteur de thérapie génique d’origine virale, puisse pâtir d’une réponse immunitaire qui tente de contrôler voire d’éliminer le produit injecté. Fort heureusement, certaines stratégies basées sur la modification des composants du vecteur ainsi que sur l’utilisation de médicaments immunomodulateurs visant à réduire la réponse immunitaire, peuvent atténuer ces effets immuns délétères en induisant une tolérance immune permettant ainsi un bénéfice thérapeutique pour le patient. Toutefois, ces stratégies sont encore mal maîtrisées. Afin d’élargir l’application de ces traitements au plus grand nombre de patients et de maladies génétiques différentes, notre projet vise, chez la souris, à caractériser certains paramètres impliqués dans l’établissement d’une tolérance immune à l’encontre des vecteurs AAV et à développer des co-traitements immunomodulateurs plus efficaces et moins toxiques pour le patient. Plus spécifiquement, nous étudierons à l’aide de différents modèles de souris les cellules de l’immunité que sont les lymphocytes T et B, et le rôle du ciblage par les vecteurs AAV de certains tissus tels le foie ou le muscle dans la balance immunité/tolérance.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de clarifier certains aspects de la tolérance immunitaire vis à vis des vecteurs AAV en disséquant les réponses lymphocytaires qui sont induites de manière différentielle en fonction du tissu et des cellules ciblées par le vecteur. Il permettra aussi de définir les caractéristiques du vecteur AAV qui peuvent diminuer la réponse immunitaire, et idéalement, induire une tolérance robuste. Enfin, il permettra de proposer de nouveaux traitements immunosuppresseurs adaptées à ces traitements AAV innovants. Comme nous l’avons fait depuis 20 ans, les résultats que nous obtiendrons seront rapidement publiés dans des revues internationales afin de renforcer la connaissance de la communauté scientifique sur le sujet et, le cas échéant, d’accélérer le passage en phase préclinique de certains vecteurs AAV développés par notre institution ou par d’autres.
Procédures
__ Partie 1 du projet : Les souris receverons deux injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, suivie après 24 heures par 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire). Les souris seront ensuite suivies sur une période allant de 2 semaines (avec 2 prélèvements de sang), à 6 mois (avec 9 prélèvements de sang). __Partie 2 Les souris receverons trois injections: 1x injection de cellules immunitaires par voie intraveineuse, 1x injection du vecteur médicament AAV après 24 heures (intraveineuse ou intramusculaire), et 1x injection après quelques semaines (voie sous-cutanée ou intradermique). Les prélèvements de sang seront bimensuels pour le 1er mois (2x); ensuite mensuels. Leur nombre total sera défini par le temps de suivi qui sera choisi en fonction des résultats de la partie 1. __Partie 3 Les souris receverons trois injections : 1x Injection de cellules immunitaires au niveau de la veine caudale, 1x injection du vecteur médicament AAV (veine caudale ou voie intramusculaire), 1x Injection de cellules à tolériser au niveau de la veine caudale. Prélèvements de sang hebdomadaires sur 1 mois (4x), puis plus espacées jusqu’à la fin. __Partie 4 Les souris receverons d’abord deux injections : 1x Injection de lymphocytes (intraveineuse), 1x injection du vecteur médicament AAV (intraveineuse ou intramusculaire) Avant ou après l’injection du vecteur, injections répétées par voie intrapéritonéale d’agents immunomodulateurs. Le nombre de ces injections variera en fonction des agents. Par exemple : 3 à 5 fois/ semaine pendant 1 à 3 semaines pour le methotrexate (3 à 15x en tout). Prélèvements de sang mensuels sur 6 mois (6x). __Partie 5 Mêmes interventions que les parties 1 à 4, mais réalisés sur des males.__ Injections intraveineuses (veine caudale), intrapéritonéales et sous-cutanées effectuées sur animal vigile, durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques pratiqués (injections intraveineuse, sous-cutanée, intrapéritonéale, prélèvement de sang) pourraient conduire à de faibles nuisances pour l’animal, tel qu’un stress léger et une douleur aigue de très courte durée. Les administrations intramusculaires et intradermique, sous anesthésie légère, seront sans douleur. Lors de nos études précédentes, aucun effet indésirable ou toxicité n’ont été observés chez les animaux traités par les vecteur-médicaments AAV ou des cellules immunitaires
Devenir
L’étude de la réponse immunitaire passe par l’analyse des populations lymphocytaires dans différents tissus (sang, rate, ganglions, foie…) et l’analyse de l’efficacité du traitement par rAAV (sur les muscles notamment). L’analyse de ces tissus (sauf le sang) ne peut se faire que sur animaux préalablement mis à mort. De ce fait, dans chaque procédure, les animaux seront tous mis à mort.
Remplacement
Les réponses immunes sont la résultante d’interactions complexes impliquant de multiples types cellulaires et se déroulant dans plusieurs organes (rate, ganglions lymphatiques, moelle osseuse, foie, muscle etc…) et avec des cinétiques particulières. Ainsi, seuls les animaux sont capables de mimer la complexité de la réponse immune et il n’existe pour le moment aucune méthode substitutive.
Réduction
(1) Afin d’utiliser un minimum d’animaux nous permettant de répondre à la problématique posée, nous avons utilisé une approche statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir un résultat significatif. Ce nombre est respecté pour chaque procédure. (2) Dès que possible, nous effectuerons un suivi longitudinal de la réponse immune par prélèvement de sang sur les mêmes individus. Sur x point de temps, cela réduit le nombre d’animaux utilisés d’un facteur x. (3) De plus, sur les mêmes individus, nous analysons le maximum de tissus des animaux post-mortem afin de collecter le maximum d’informations sur chaque animal. (4) Dans la plupart des procédures, nous avons évité de répliquer les groupes contrôles en testant les vecteur-médicaments AAV deux par deux. Ceci réduit le nombre total de souris contrôles d’un facteur 2. Il n’est pas possible de tester plus de 2 vecteurs à la fois pour des raisons pratiques de lourdeur expérimentale.
Raffinement
De manière générale, les expérimentateurs qui travailleront sur ce projet ont en plus de leurs formations plusieurs années d’expériences quant à la manipulation des souris. Ils sont donc très sensibilisés au bien-être animal, ce qui permet de facto de limiter stress et angoisse des animaux afférents par exemple aux simples gestes de contentions. Durant les expériences, nous utiliserons des méthodes expérimentales adaptées par exemple lors des prélèvements de sang (anesthésie préalable, application éventuelle d’une compresse pour stopper d’éventuels saignements) ou lors de l’administration des produits (administration d’anesthésiques préalable pour les injections intramusculaires et intradermiques, suivi vigilant de l’état des animaux). Il est à noter que ces types d’injection classiques sont pratiquées chez l’homme sans anesthésie, ni administration d’analgésique. L’endormissement plus ou moins profond de l’animal permet la réalisation du geste expérimental sans que celui-ci ne bouge et puisse se blesser. Après toute intervention, les animaux seront quand même observés avec attention de façon quotidienne. Si des signes d‘inconfort ou de douleur venaient à apparaitre, l’animal sera surveillé plus fréquemment et pesé. En absence d’amélioration sur une semaine, ou en cas de perte de poids supérieure à 20% du poids initial, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain, faisant du modèle murin le modèle de référence pour les analyses des complexes réponses immunes, se déroulant via de nombreux types cellules et dans divers organes. Il bénéficie en outre de l’existence de nombreuses souches modifiées pour des éléments du système immunitaire, permettant d’en analyser le rôle. Chez la souris, le système immunitaire est considéré comme adulte à partir de 6 semaines d’âge. Nous utiliserons donc majoritairement des souris jeunes adultes de 6-12 semaines pour étudier les réponses immunes d’organismes adultes. Les souris seront analysées et/ou euthanasiées entre 6 semaines et 6 mois afin d’évaluer les réponses immunitaires précoces et tardives, respectivement. Le cas échéant, des évaluations à plus long-terme pourraient être menées.
Plaquettes synthétiques dans les maladies hémorragiques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
466 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, près de la moitié étant opérée sous anesthésie sans réveil. Une partie subit un test de saignement consistant à sectionner les trois derniers millimètres de la queue sous anesthésie et à mesurer le sang perdu pendant trente minutes, avant la mise à mort. Ces souris génétiquement modifiées reproduisent des maladies hémorragiques, le porteur voulant tester des plaquettes synthétiques. Il affirme que la coagulation "nécessite absolument un organisme vivant entier" et qu'aucun test disponible ne peut l'éviter.
Objectifs
La coagulation sanguine représente l'ensemble des mécanismes mis en jeu lors d'une blessure, aboutissant à la formation d'un caillot sanguin qui va permettre l'arrêt du saignement en réparant le ou les vaisseau(x) sanguin(s) lésés. Ce processus fait intervenir de nombreuses protéines, appelées facteurs de coagulation. Il existe plusieurs maladies hémorragiques congénitales caractérisées par un défaut dans l'un ou l'autre de ces facteurs. Bien que des traitements efficaces soient d'ores et déjà disponibles, l'amélioration de ces traitements et l'amélioration de la qualité de vie des patients reste d'actualité. Nous proposons de tester un nouveau traitement basé sur la transfusion de plaquettes sanguines synthétiques, ce qui représenterait un traitement universel quel que soit le facteur de la coagulation qui fait défaut. Le but du projet est donc de démontrer l'efficacité thérapeutique de différentes sortes de plaquettes synthétiques dans des modèles souris reproduisant trois types différents de pathologies hémorragiques.
Bénéfices attendus
A court-terme, les résultats de cette étude vont améliorer nos connaissances sur le type de plaquettes sanguines synthétiques qui seraient les plus efficaces pour pallier à l'absence des facteurs de coagulation. A long terme, le projet contribuera à améliorer l'arsenal thérapeutique pour les patients souffrants de pathologies hémorragiques, permettant une approche plus personnalisée des traitements adaptés à chacun(e).
Procédures
Les souris seront soumises à 5 interventions maximum mais la plupart des animaux ne subiront qu'une partie de ces gestes: 1) 3 injections espacées d'au moins 2 jours. Chaque injection va durer 5 secondes. 2) 1 prélèvement sanguin deux semaines après la dernière injection. Ce prélèvement va durer 10 secondes 3) Trois semaines plus tard: 1 injection qui va durer 5 secondes pour anesthésier les animaux. Les deux gestes suivants seront réalisés sur ces souris anesthésiées: 4) 1 injection qui va durer 5 secondes 5) Soit un prélèvement sanguin terminal suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires ou un test de saignement consistant à couper les 3 derniers millimètres de la queue de la souris et à mesurer la quantité de sang perdu en 30 minutes, suivi d'une euthanasie par les méthodes réglementaires.
Impact sur les animaux
Les 3 injections répétées espacées de 2 jours peuvent être associées à une légère douleur transitoire, de courte durée. Le prélèvement sanguin peut être associé à une douleur moyenne et une légère hémorragie, nécessitant d'exercer un point de compression. Au cours du test de saignement qui est réalisé sous anesthésie pendant 30 minutes, il se peut que des souris montrent des signes de réveil. Une nouvelle dose d’anesthésiant sera alors injectée (20% de la dose initiale au maximum).
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires et le constat de mort sera établi par des signes évidents de mort. La ré-utilisation des animaux n'est pas possible puisque les animaux sont euthanasiés en fin de procédure en raison du volume sanguin prélevé ou perdu. De plus, des tissus seront recueillis après l'euthanasie pour analyse.
Remplacement
Le système de la coagulation est complexe, et nécessite absolument un organisme vivant entier pour pouvoir être reproduit de manière pertinente. Actuellement, il n'existe pas de tests adaptés qui pourraient éviter le recours à l'animal.
Réduction
Une partie des tests sera fait sur du sang prélevé à partir des souris traitées par les plaquettes synthétiques. Ces tests nécessitent moins d'animaux car ils sont plus reproductibles que ceux conduits directement chez l'animal. Seul le test de temps de saignement sera fait chez les animaux, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. D'autre part, une analyse mathématique de puissance a permis d'établir le plus petit nombre d'animaux nécessaires au projet tout en s'assurant d'obtenir des résultats robustes et fiables.
Raffinement
Les procédures utilisées se feront dans le cadre adapté d'un hébergement agréé, respectant au maximum le bien-être des animaux avec un enrichissement du milieu (morceaux de bois à ronger, filaments de papier kraft pour faire un nid), en limitant la souffrance par le respect des méthodes d’anesthésie et d'analgésie. L’ensemble des expériences seront effectuées par une personne habilitée à expérimenter sur animaux Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure afin de s'assurer qu'elles ne montrent pas de signe de réveil ce qui se traduirait par un renforcement immédiat de l'anesthésie.
Choix des espèces
Ce projet fait appel à des modèles murins déjà développés qui ont prouvé leur pertinence dans de nombreuses publications scientifiques. Il s'agit d'animaux génétiquement modifiés qui sont déficients pour différents facteurs de la coagulation, reproduisant ainsi les pathologies humaines. Pour ce projet, uniquement des animaux adultes des deux sexes seront utilisés, représentant au mieux la population humaine susceptible de souffrir de ces pathologies.
Diffusion de molécules à l’oreille interne par sonoporation sur modèle ovin
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Des brebis de 2 à 3 ans subissent une mastoïdectomie, ouverture chirurgicale de l'os situé derrière l'oreille, et reçoivent du gadolinium dans l'oreille interne, par ultrasons d'un côté et par injection de l'autre, sous une anesthésie de trois heures dont deux d'imagerie. Une seconde anesthésie de 30 minutes permet de prélever du liquide de leur oreille interne. Au total, 14 brebis, dont 2 en réserve en cas de problème, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme effets néfastes, le porteur ne cite que le stress de la contention et un possible hématome à la jugulaire, écrit qu'il n'est "pas à prévoir de conséquences particulières" après la première anesthésie, et se fixe pour objectif de vérifier "l'absence de retentissement sur la fonction auditive". Toutes les brebis sont pourtant tuées à l'issue, mise à mort qu'il justifie par une "perte de la fonction auditive irréversible", des "vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale" et une "paralysie faciale empêchant une alimentation normale".
Objectifs
L'objetif principal de notre projet vise à étudier la diffusion de momlécules de gadolinium au sein de l'oreille interne en comparant les injections transtympaniques classiques versus l'utilisation d'ultrasons. Les objectifs secondaires sont de vérifier l'absence de retentissement sur la fonction auditive après la réalisation des séances de ces techniques et à distance (J7 de la délivrance), une conservation de l'quilibre et de la symétrie du visage, et l'absence d'altération de la composition des liquides de l'oreille interne suite à ces procédures.
Bénéfices attendus
Si les résultats du projet sont démontrés, c'est-à-dire une amélioration de la diffusion du gadolinium à l'oreille interne par sonoporation (avec ou sans microbulles chargées) avec absence d'effets indésirables à court et long terme, cela permettra de proposer un nouveau mode de diffusion chez l'Homme. Cette méthode permettrait d'obtenir une meilleure diffusion le long de la cochlée et des concentrations plus élevées d'agents thérapeutiques au sein de la cochlée. Par la suite, il sera nécessaire de développer une sonde spécifique pour l'Homme, de réaliser de nouvelles expérimentation avec d'autres molécules. Cependant, cette étape préliminaire reste indispensable à la poursuite du projet. Cette voie de délivrance par sonoporation à l'oreille interne pourrait par la suite avoir un rôle thérapeutique notamment pour traiter certaines atteintes de l'oreille interne comme la surdité brusque, la maladie de Menière où actuellement les injections transtympaniques sont privilégiées. Il pourrait aussi s'agir d'une voie de délivrance dans le cadre de la thérapie génique pour les surdités d'origine génétique.
Procédures
La majorité des actes auront lieu sous anesthésie générale, il s'agit de la mesure des seuils auditifs, de l'abord chirurgical avec la délivrance de molécule, de l'imagerie et du prélèvement de liquide de l'oreille interne. La durée de la première anesthésie générale sera de 3H (1H de chirurgie et 2 H d'imagerie). La seconde anesthésie générale durera 30 minutes, il sera effecué le prélèvement de liquide de l'oreille interne au cours de cette chirurgie.
Impact sur les animaux
Les brebis incluses subiront deux anesthésies générales. Lors de la première, il sera effectué une mastoïdectomie avec délivrance de molécules. Il n'est pas à prévoir de conséquences particulières suite à cette anesthésie. Lors de la seconde, il sera effectué un prélèvement de périlymphe. La contention effectuée pour l'induction des 2 anesthésies peut engendrer du stress pour l’animal, et l'injection de produit anesthésiant par voie intraveineuse à la jugulaire peut provoquer un hématome.
Devenir
L'ensemble des brebis seront euthanasaniées suites aux procédures compte tenu de la perte de la fonction auditive irréversible, de vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale et d'une paralysie faciale empêchant une alimentation normale. Ainsi ces pertes de fonctions auront un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis.
Remplacement
Des études pré-cliniques chez l'animal sont nécessaires afin de s'assurer de la bonne diffusion des molécules utilisées suite à la sonoporation au sein de l'oreille interne. L'utilisation de modèles animaux autorise aussi la vérification de l'absence d'évènements indésirables, et le prélèvement de liquide de l'oreille interne. Cette étude permettra de s'assurer de la supériorité de la sonoporation pour la diffusion du gadolinium au sein de l'oreille interne et de vérifier l'absence de déficit (auditif, vestibulaire ou de la fonction faciale). Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico à ce jour.
Réduction
Sur la base d'une étude statistique et bibliographique, notre étude nécessite l'inclusion de 12 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque brebis sera son propre témoin avec un côté où il sera effectué une délivrance de gadolinium par sonoporation et un autre une délivrance par injection en regard de la fenêtre ronde pour vérifier l'hypothèse d'une meilleure diffusion par sonoporation. L'hypothèse d'une amélioration de la diffusion de 60% +/- 30 % du gadolinium par la sonoporation sera vérifiée par un test statistique approprié, ainsi que l'absence de baisse des seuils auditifs. Le calcul d'effectif indique qu'un groupe de 6 sera suffisant pour confirmer cette hypothèse. En métabolomique (pour l'analyse de la périlymphe), il n'existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant nos précédentes études sur le sujet ont montré que l'inclusion de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant des analyses statistiques adaptées. Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte était le faible volume prélevé qui a été résolu par validation de la technique d'analyse. Ainsi, nous estimons que 12 brebis incluses au total serait raisonnnable pour ne pas augmentrer le nombre d'animaux tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient. 2 animaux supplémentaires seront prévus en cas de problème.
Raffinement
Anesthésie : les animaux arriveront la veille de la 1ère anesthésie, et seront mis à jeun 15h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène véhiculant l’isoflurane pour obtenir un relachement musculaire suffisant avant intubation. Chirurgie et Per-imagerie - Anesthésie : Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Les animaux sont logés en cases collectives sur paille, et manipulés dans le calme. Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur peropératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. La réalisation d'une anesthésie locale à base permettra de minimiser la douleur per opératoire. Ces injections seront être renouvelées en cas de douleur de l'animal . Une table chauffante sera utilisée pendant la durée de l'anesthésie générale pour éviter tout épisode d'hypothermie. La douleur post-opératoire sera aussi monitorée avec l'échelle visuelle en pièce jointe et l'analgésie revue en cas de douleur.
Choix des espèces
La brebis est l'animal que nous désirons utiliser pour ces recherches sur l'oreille interne car elle présente un spectre auditif comparable à l'Homme et une anatomie de l'oreille interne semblable à l'Homme en terme d'anatomie et de dimensions. La chirurgie de la brebis est comparable à celle de l'homme pour l'accès à l'oreille interne. Le sexe féminin est à privilégier compte tenu des difficulté d'accès à l'oreille interne chez le bélier. En effet, l'épaisseur de la corticale du bélier rend le fraisage difficile et très long. Enfin, le volume de liquide endocochléaire prélevé chez la brebis est comparable au volume qu'il est possible de prélever chez l'Homme rendant possible les études en métabolomique sur ce liquide. Les animaux utilisés seront âgés de plus d'un an car à cet âge, la maturation du système auditif est atteinte. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.
Propriétés biomécaniques des ostéodermes des squamates
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
24 individus de plusieurs espèces de lézards, dont des pythons royaux et des scinques, vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Sous anesthésie, ils reçoivent le collage de jauges de mesure et de marqueurs métalliques, puis sont filmés en radiographie pendant qu'ils mangent. Le porteur indique que quinze individus seront replacés chez des particuliers après retrait du matériel, tandis que les neuf autres seront tués puis scannés pour construire un modèle numérique du crâne. Il affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet de mesurer la déformation de ces os chez l'animal vivant.
Objectifs
Les lézards présentent une diversité d’ostéodermes (plaques osseuses à l'intérieur de la peau) impressionnante et inégalée. Certaines espèces sont presque entièrement couvertes de cette armure osseuse dermique alors que d’autres en sont complétement dépourvues. Au sein même des groupes qui présentent une couverture importante en ostéodermes, on observe une grande diversité de formes, de compositions et de positionnement (certains se chevauchent, d'autres non). Malgré l’attrait évident que les ostéodermes représentent pour les biologistes et les ingénieurs dû au diversité de structures et de formes soumis à des millions d'années de sélection naturelle, leur anatomie a été décrite pour une poignée d’espèces seulement. Que dire alors de leurs propriétés biomécaniques qui restent complétement inconnues à ce jour ? Ces structures méritent pourtant une attention particulière car leur évolution a surement été cruciale dans la colonisation de nouvelles niches écologiques par de nombreuses espèces de lézards. Elles pourraient en effet conférer des avantages importants : offrir une protection contre les attaques de certains prédateurs ou d'autres individus de la même espèce voir contre les morsures de certaines proies, facilité la thermorégulation, constituer des réserves de calcium essentielles à la production des œufs, absorber une partie de l’énergie transmise aux os lors de la prise de nourriture ainsi réduisant le risque de fracture des os crâniens.
Bénéfices attendus
Ces formes et organisations constituent probablement des solutions élégantes e efficaces à un certain nombre de problèmes précis car elles résultent de processus adaptatifs ayant agi pendant des millions d’années permettant d'optimiser ces structures pour leur fonction. Identifier les liens entre formes et fonctions au niveau des ostéodermes de lézards pourrait s’avérer très utile, par exemple, pour produire des casques et armures adaptés à différentes fonctions comme démontré dans des études précédentes.
Procédures
Pour comprendre la fonction de ces structures on mesure la déformation de ces structures osseuses dans différents comportements tels que la locomotion ou encore la prise alimentaire. Pour pouvoir réaliser des mesures précises on doit coller avec de la colle chirurgicale des petits instruments (moins de 0.5% du poids de l'animal) capable de mesurer la déformation des ostéodermes pendant que l'animal montre son comportment habituel. On implante également des petits marqueurs métalliques (moins d'un millième de gramme) pour pouvoir quantifier les mouvements de ces structures osseuses. Trois individus de 5 espèces seront utilisés dans une première procédure et 3 autres individus de 3 espèces seront utilisés dans une deuxième procédure. Chanque procédure nécessite une seule anesthésie. Pour le première procédure on utilisera 3 individus des espèces suivantes : Orvet des Balkans, Scinque à langue bleue, Gerrhosaure Africain, Lézard ocellé, Python royal. Pour la deuxième procédure ou on va mesurer la déformation des os du crâne on utilisera que 3 individus des espèces suivantes : Orvet des Balkans, Scinque à langue bleue, Python royal. Les enrégistrements des animaux en train de manger ou de se mouvoir seront d'une duréu de 15 à 20 minutes. L'implantation est les mesures sous anesthésie dure une heure au maximum.
Impact sur les animaux
Pour étudier le lien entre la déformation des structures osseuses et les forces induites par la prise alimentaire ou la locomotion les animaux subiront les étapes suivantes : - Anesthésie chirurgicale de courte durée (max. 1h) pour insertion de marqueurs métalliques (chaque marqueur pèse mois d'un millième de gramme) et implantation des jauges de contraintes (3 sur 3 mm, moins de 1 g), préalablement aux examens d’imagerie. Mise à jeun la veille. Un antalgique sera administré par injection après l'opération. Légère parte de poids potentiel suite à l’anesthéise (moins de 1 % du poids de l'animal). Une perte de poids de 5 % est normal pour ces type d'animaux. Au delà d'une perte de poids de 10% la procédure est arrêtée et l'animal est euthanasié. - 10 examens d’imagerie (acquisition en cinéradiographie ; 3 examens par jour maximum) de 90 secondes pendant qu’ils mangent leurs aliments habituels. Il est attendu que les animaux subissent un stress suite à l'achat et à la modification de leur lieu de vie dans les premiers jours après être hébergé dans leur nouveau terrarium. L’anesthésie réalisée pour insérer les marqueurs risque de causer des légères troubles d'alimentation le lendemain ainsi que des douleurs faibles (irritation de la peau) le lendemain et le surlendemain. Une perte de poids de moins de 1% du poids totale est possible. Après leur rétablissement, deux jours après l'anesthésie, les animaux seront de nouveaux sujets à un stress lors de leur déplacement pour les acquisitions de données de cinéradiographie (environnment inhabituel, bruit du générateur à rayon X). La présence des marqueurs et les jauges n'est pas douloureux et ne gène pas les animaux pendant leur comportements quotidiens. Des études précédentes avec implantation des jauges sur l'os ont montrées aucun trouble de l'alimentation, ni de perte de poids chez d'autres espèces de lézards.
Devenir
Etant donné que la procédure 1 est de gravité légère et que les animaux se remettent très bien de ce type d'intervention, les animaux seront replacés (après enlèvement des jauges et marqueurs ; les jauges tombent automatiquement dès la première mue une semaine à 10 jours après la pose) chez des particuliers ayant des formations nécessaires pour l'hébergement de ces animaus (ex. certificat de capacité). Les animaux seront gardés en stabulation pendant aux moins 1 mois avant des les replacer pour assurer leur santé (absence d'infection, comportement normal, prise alimentaire normal) et bonne cicatrisation. Les 9 animaux utilisés dans la procédure 2 seront euthanasiés et CT scanné permettant d'obtenir des moèles 3D des individus. Ces modèles serviront au developpement d'un modèle numérique du système crânien de ces lézards.
Remplacement
Aucune méthode alternative permettant de comprendre le rôle fonctionnel et mécanique permet de substituer l'utilisation d'animaux vivants pour les mesures de déformation des ostéodermes. Une étude sur des animaux morts issus des collections a été fait au préalable mais a montré la limite de cette approche.
Réduction
Les cinq espèces sélectionnées pour ce projet ont été déterminée pour capturer la variation morphologique et écologique chez les lézards. Ceci permettra de mettre en lien les différences de forme des ostéodermes avec des potentiels différences fonctionnels. Le nombre d'animaux (n = 15 +9) a été réduit au maximum en utilisant 3 individus par espèce afin de pouvoir caractériser la variation morpholique et fonctionnelle des ostéodermes au sein d’une espèce ainsi que de faire une comparaison entre espèces.
Raffinement
Des mesures de déformations sur des spécimens morts des collections ont été fait au préalable. Les résultats in vivo serviront à la validation des mesures faites sur spécimens morts et des modèles biomécaniques numériques permettant en suite de limiter l'utilisation des animaux vivants pour ce type d'étude. Un comportement normal de prise de nourriture et de locomotion étant indispensable au bon déroulement de nos expérimentations. C’est notamment pour cette raison que nous avons choisi des méthodes d'hébergement, de soins et d’expérimentation réduisant fortement toute douleur ou souffrance que pourraient ressentir les animaux. Chaque espèce sera héberge dans des conditions approprié suivant son écologie (point chaud adapté, présence des lampes UV, abris et substrat adapté et nourriture adapté en fonction de l'écologie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les expériences permettant de détecter rapidement des signes de douleur ou de souffrance. La douleur est minimisée en appliquant les jauges de contrainte sous anesthésie suivi par une l'administration d'un antalgique post-opératoire. Des points limites strictes, adaptés à chaque espèce, seront appliqués et impliquent des critères de comportement (diminution ou augmentation d’activité, refus de boire ou de manger) et de perte de poids adapté à chaque espèce. Si une souffrance est constatée les expériences seront arrêtées immédiatement et l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Les espèces ont été sélectionnées pour leur diversité morphologique et écologique ainsi que leur appartenance à des groupes phylogénétiques différents. Les animaux seront issus de lélevage en captivité dès possible.