Recherche fondamentale

1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés

Procédures

Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection intracérébrale, une déplétion du microbiote par un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques dans l'eau pendant douze jours, puis un test de motivation alimentaire. Le porteur indique que la chirurgie peut causer douleur, infection et perte de poids et que le traitement peut induire une inflammation intestinale modérée. Il présente cette étude comme une "preuve de concept" préalable à des travaux chez l'humain et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ces mesures neuro-comportementales.

Objectifs

L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmente chez la souris la consommation d'aliments appétents. Néanmoins, les substrats et mécanismes neurobiologiques sous-jacents ne sont pas bien connus. Dans cette étude nous nous intéressons à l'insula, une structure cérébrale responsable de la perception du goût et des saveurs qui reçoit également des signaux viscéraux permettant l'interoception (perception de l'état interne). Les résultats issus de ce projet nous permettrons de tester l'hypothèse selon laquelle le microbiote et les signaux associés influencent le comportement alimentaire à travers des mécanismes dépendant de l'activité de l'insula.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal sur l’activité cérébrale (en particulier celle de l'insula) en réaction à des stimuli alimentaires. Cette étude « preuve de concept » chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire ou chez l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections intracérébrales sous anesthésie générale par chirurgie stéréotaxique (au maximum 1 chirurgie par animal). Le microbiote intestinal des souris sera déplété par prise volontaire dans l'eau de boisson (prise quotidienne) d'un cocktail d'antifongique/antibiotiques pendant 12 jours. La motivation alimentaire des animaux sera testée lors d'un test comportemental dédié (au maximum 2 tests d'1h par animal).

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut engendrer de la douleur pendant la chirurigie et en post-opératoire ainsi que des infections ou une perte de poids. Ces effets indésirables sont prévenus par une couverture analgésique appropriée en péri- et post-opératoire et le respect des conditions d’asepsie. L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. La durée de ce traitement a été limitée à une durée minimale permettant une dépletion efficace du microbiote intestinal.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. L'analyse de l'expression du traceur neuronal et du marqueur de réactivité neuronale nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux.

Remplacement

L'activité cérébrale peut être étudiée dans divers modèles incluant par exemple des modèles cellulaires complexes récapitulant une partie de son organisation et de ses fonctions comme les organoïdes. Néanmoins, cette étude comprend des mesures neuro-comportementales et ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, l'activité cérébrale qui sous-tend les comportements émerge d'une organisation anatomo-fonctionnelle cérébrale complexe et de l'intégration de signaux provenant d'organes périphériques que seul le modèle animal permet d'explorer. Aucun autre modèle à l'heure actuelle ne peut récapituler ces processus et permettre ces mesures neuro-comportementales. Cette étude nécessite donc l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point et de détecter des différences neuro-comportementales entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages contenant un objet leur permettant de se mettre à l’abri et des carrés de cotons ou des sticks en papier pour réaliser un nid. Afin de limiter la douleur et l’inconfort pouvant être générés par la chirurgie stéréotaxique, l’asepsie sera respectée lors de la chirurgie pour limiter le risque d’infection et un protocole adapté de gestion de la douleur sera utilisé en péri- et post-opératoire. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Pour limiter le stress des animaux, l’administration du cocktail d’antibiotiques/antifongiques est réalisée dans l’eau de boisson (prise volontaire). Les prélèvements pour l’analyse histologique et la densité du microbiote sont post-mortem.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.

1 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation puis de une à neuf injections, avec induction de tumeurs, pour étudier le rôle de sous-types de cellules dendritiques dans l'immunothérapie du cancer. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent entraîner une perte d'appétit et de poids et que l'irradiation peut causer amaigrissement et diarrhée. Il qualifie d'"indispensable" le recours à la souris et renvoie les retombées thérapeutiques pour les patients à un horizon futur.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un processus de mort cellulaire qui déclenche une réponse immunitaire. Lorsqu'une cellule meurt de manière immunogène, elle libère des signaux moléculaires qui attirent les cellules du système immunitaire, comme les cellules dendritiques qui jouent un rôle central. Actuellement, différents sous-groupes de cellules dendritiques ont été identifiées mais, à ce jour, leur rôle n’est pas encore clair. Les objectifs de ce projet sont : 1) Découvrir et comprendre quels sous-types de cellules dendritiques sont les plus importants pour garantir un meilleur effet avec la thérapie immunogène anticancéreuse. 2) Etudier comment les chimiothérapies immunogènes et l’immunothérapie affectent les bons sous-types de cellules dendritiques et montrent un meilleur traitement contre le cancer que les autres. Cette recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l'efficacité des approches thérapeutiques immunogènes contre le cancer par amorçage du potentiel des cellules dendritiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Les recherches dans ce projet peuvent avoir un impact significatif sur le développement de traitements plus personnalisés et efficaces contre le cancer en exploitant le potentiel des sous-populations spécifiques de DC dans la thérapie immunogène. Voici quelques-uns des avantages attendus de ce projet : 1) En étudiant comment la déplétion sélective de certaines sous-populations de DC affecte la réponse immunitaire, nous pourrions parvenir à une compréhension plus approfondie du rôle spécifique de ces cellules dans la thérapie immunogénique du cancer. Cela permettrait de mieux cibler les interventions thérapeutiques pour maximiser leur efficacité ; 2) En comprenant comment les différentes sous-populations de DC interagissent avec la chimiothérapie et l'immunothérapie, nous pourrions optimiser la combinaison de ces approches pour une meilleure réponse immunitaire et une plus grande efficacité dans le traitement du cancer ; 3) Ces recherches pourraient révéler des sous-populations spécifiques de DC qui sont essentielles pour une réponse immunitaire efficace. Cela ouvrirait la voie à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront une irradiation (durée 14 minutes) suivie d'une injection (durée 2 minutes) sous anesthésie locale. Suivant les lots, les souris pourront avoir entre 1 et 9 injections (durée 2 minutes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (préhension, injections) peuvent induire du stress chez l'animal. La croissance tumorale et les traitements (la chimiothérapie et l'immunothérapie) peuvent entraîner une perte d'appétit et une perte de poids. L’irradiation peut induire des atteintes modérées de la santé avec amaigrissement et diarrhée transitoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.

Remplacement

L'utilisation de la souris dans la recherche sur la chimiothérapie et l'immunothérapie est indispensable car les maladies traitées par perfusion et immunothérapie, particulièrement le cancer, sont des affections complexes impliquant des interactions entre de multiples voies biologiques et des cellules. Les souris sont des modèles animaux qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec les humains, permettant ainsi de comprendre les mécanismes biologiques et les réponses aux traitements dans un système vivant complet. Les DCs sont d'une complexité biologique considérable, et leur fonctionnement et leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires sont encore en cours de découverte. Donc l'utilisation de modèles in vivo dans la recherche sur la biologie des cellules dendritiques est indispensable pour obtenir des informations approfondies sur leur fonction, leur rôle dans la réponse immunitaire, leur contribution aux maladies et leur potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés ; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail comme expliqué dans chaque procédure. De plus, toutes les expériences reposant sur la reconstitution de la moelle osseuse seront réalisées avec des moelles osseuses cryoconservées au lieu de les extraire de nouveaux animaux donneurs, ce qui réduit de moitié le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront en environnement enrichi et stimulant pour les animaux en expérimentation, avec suffisamment d'espace, de matériel et d'interactions sociales, pour améliorer leur bien-être (sizzlenests, tunnels, maisons). Les protocoles expérimentaux sont rigoureux, optimisés et validés, et minimisent la souffrance animale et les manipulations inutiles, tout en fournissant des résultats scientifiquement valides. Le personnel de recherche est formé en continu afin de réduire le stress et l'inconfort des animaux. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Un suivi quotidien est mis en place pour s'assurer de la santé des animaux et mettre en place des mesures correctrices quand c'est nécessaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions seront réalisées sous anesthésie locale ou générale et raffinées (utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...).

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, et pratiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

1 191 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse, quatre gavages, des prélèvements de sang et l'implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie, pour reproduire une myélofibrose que 100 % des animaux développent. Le porteur indique que la maladie provoque une splénomégalie, une perte d'appétit et un amaigrissement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut réunir ces paramètres et conclut à la nécessité de la souris pour étudier la maladie dans un "organisme dans sa globalité".

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération excessive des cellules myéloïdes tels que les globules rouges, les mégacaryocytes (donnant naissance aux plaquettes) et des granulocytes et peuvent aboutir au développement de leucémies, dont la plus grave est caractérisée par les mutations dans des gènes régulant la production de plaquettes. Elle conduit à une amplification anormale de plaquettes dans la moelle osseuse qui vont s’activer et libérer différents cytokines et facteurs de croissance. Ces derniers vont agir sur les cellules stromales de la moelle osseuse ce qui conduira à la production de collagène en excès et à une dégénerescence par fibrose. Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace dans cette maladie, à l'exception de la greffe de moelle osseuse. Chez les patients atteints de cette maladie, les meiilleurs traitements sont inefficaces.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace de la myélofibrose. Ici nous proposons un nouveau modèle préclinique au développement de la MF rapide et homogène (100% d'animaux développent la maladie contre 60% avec les modèles précédemment décrits) qui nous permettra non seulement de décrypter les mécanismes physiopathologies de la maladie mais aussi de tester des drogues identifiées pendant une pédiode courte et sur un nombre d'animaux diminué car ce nouveau modèle est très reproductible. Les bénéfices potentiels sont le développement de traitements pour cette pathologie grave.

Procédures

Gavages 4 fois, durée 1 minute. Irradiations: 1 fois (13 minutes) et greffes (durée 5 minutes), sous anesthésie générale. Prélèvements de sang (nombre 3), durée 2 minutes sous anesthésie générale. Injections des médicaments (1 ou 2 injections) durée 1 minute, anesthésie locale. Implantation de pompes osmotiques, durée 8 minutes, une fois, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le gavage induit une contrainte légère. Les irradiations suivies de greffe induisent une contrainte modérée pour les animaux: fatigue transitoire, possibilité de diarrhée transitoire. Les injections et les prélèvements de sang induisent une contrainte légère et transitoire du fait de la préhension des animaux. L'implantation de pompes osmotiques est une peite chirurgie légère qui est très bien tolérée. Le modèle proposé conduit au développement de la myélofibrose accompagnée de la diminution de cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse et leur augmentation au niveau de la rate (splénomégalie). Les animaux peuvent présenter des signes cliniques du fait de la perturbation de la formule sanguine, avec perte d'appétit et amaigrissement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les organes hématopïétiques.

Remplacement

Le développement de la myélofibrose survient dans un environnement qui nécessite la présence de différentes cellules, les cellules hématopoïétiques porteuses de la mutation causale de la maladie, différents types de cellules de l'environnement qui seront activées après la libération de cytokines par les cellules hématopoïétiques et le confinement de la moelle osseuse. Il est impossible de réunir ces paramètres in vitro. De plus, la maladie ne touche pas uniquement la moelle osseuse, on observe la splénomégalie et la fibrose au niveau de la rate. Seuls les traitements de souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de NMP permettront d’analyser leur efficacité dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot a été minimisé et s'est basé sur la littérature et l’expérience du laboratoire sur ce modèle de maladie. Le nombre indiqué ne sera atteint que si tous les médicaments présentent un effet sur la myélofibrose. Si un médicament n'a pas d'effet, le test sera arrêté précocément.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance clinique quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Une alimentation adaptée sera ajoutée dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites précoces seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...).

Choix des espèces

L'utilsiation de souris nous permets dans un temps très court l'obtention d'un nombre d'animaux à expérimenter. Nos modèles miment parfaitement les pathologies humaines (Thrombocytémie Essentielle et Polyglobulie De Vaquez) qui mènent à la myélofibrose. Ce sont donc de bons modèles, statistiquement solides et probant pour les études proposées. Ces souris modèlisent au plus près les conditions pathologiques humaines. Le modèle conduit à un développement rapide de la myélofibrose et ceci de façon très homogène ce qui permet de réduire le nombre d'animaux et le temps de traitement.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite de la leishmaniose viscérale par injection intrapéritonéale, puis reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours de molécules candidates. Le porteur indique que la voie d'administration peut provoquer des réactions au point d'injection et prévoit de tuer toutes les souris pour prélever leur foie et leur rate. Il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la leishmaniose dans sa complexité, ce qui rend selon lui l'expérimentation animale 'incontournable'.

Objectifs

Leishmania infantum est un de agents majeurs des leishmanioses viscérales (avec L. major). Les leishmanioses viscérales (LV), également appelées kala-azar, sont mortelles dans plus de 95% des cas en absence de traitement. Elles se caractérisent par des poussées irrégulières de fièvre, une perte de poids, une hépatosplénomégalie et une anémie. La plupart des cas sont observés au Brésil, en Afrique de l’Est et en Inde. On estime que 50 000 à 90 000 nouveaux cas de LV surviennent chaque année dans le monde et que seuls 25% à 45% de ces cas sont notifiés à l’OMS. Les LV demeurent l’une des principales maladies parasitaires à haut potentiel d’épidémie et de mortalité. En 2018, plus de 95 % des nouveaux cas signalés à l’OMS provenaient de 10 pays : Brésil, Chine, Éthiopie, Inde, Iraq, Kenya, Népal, Somalie, Soudan et Soudan du Sud. La leishmaniose viscérale est endémique dans la Région Européenne (au sens de l’OMS), en 2018, plus de 200 cas y ont été signalés (pour l’essentiel sur le pourtour méditerranéen). Ce nombre augmente, en parallèle aux pressions migratoires et au réchauffement climatique et par ailleurs une forte prévalence est retrouvée chez les canidés domestiques dans le pourtour méditerranéen. Le traitement de la leishmaniose dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels la forme de la maladie, les affections concomitantes et l’espèce parasitaire. La leishmaniose est une maladie qui peut être traitée et guérie, mais qui requiert un système immunitaire compétent car les médicaments n’éliminent pas entièrement le parasite de l’organisme, ce qui induit un risque de rechute en cas d’immunosuppression. Par ailleurs, les traitements de choix ont une forte toxicité. Des résistances aux traitements courants se développent progressivement dans les zones d’endémie. Les besoins pour de nouvelles molécules actives sont donc pleinement justifiés. Avant toute tentative de maturation de telles molécules vers un nouveau médicament à usage humain ou vétérinaire, il est indispensable, au-delà des essais in vitro, d’avoir des données de bases sur leur activité in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet envisagés à long terme sont de : - Permettre le développement d’un médicament vétérinaire capable de traiter les animaux de compagnie (leishmaniose canine en particulier), servant de réservoir parasitaire et présentant donc un risque zoonotique de transmission humaine opportuniste, particulièrement dans les départements français de l’arc méditerranéen. - Permettre le développement d’un médicament à usage humain permettant d’améliorer le traitement de maladies parasitaires rares et négligées. - Permettre de mettre à jour une molécule tête de série pour le développement de dérivés d’hémisynthèse (molécules naturelles modifiées par synthèse chimique afin d'améliorer leurs propriétés pharmacodynamiques et/ou pharmacocinétiques) encore plus actifs, à l’instar de la benzyl pénicilline, tête de série de toutes les pénicillines et céphalosporines utilisées comme antibiotiques humains et animaux depuis des décennies.

Procédures

Tous les animaux infestés recevront l'inoculum de parasites par voie intrapéritonéale (100 microL) en 1 seule injection sur environ 1 min d'intervention. Tous les animaux traités le seront par injection intrapéritonéale (100 microL) à raison d'1 injection par jour durant environ 1 min et ce, pendant 10 jours. Les animaux témoins, c'est-à-dire non infestés et non traités, ne subiront aucune intervention.

Impact sur les animaux

La voie d'administration, intrapéritonéale, est susceptible d'engendrer des réactions au niveau du point d'injection (dépôts de fibrine).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leur foie et leur rate postmortem.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude est envisagé après de nombreuses études réalisées in vitro sur ces 2 molécules (tests sur lignée d'amastigotes axéniques de Leishmania infantum, modèle in vitro de leishmanies intramacrophagiques, tests sur macrophages, et lignées cellulaires cancéreuses (HepG2) et non cancéreuses (cellules VERO). Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la leishmaniose dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour l’analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Par ailleurs, uniquement 2 molécules (1 molécule naturelle et 1 molécule de synthèse) actives in vitro, sélectionnées à partir de 2 projets de recherche différents, seront testées afin de mutualiser les groupes de souris contrôle (1 groupe non traité non infesté, 1 groupe infesté non traité et 2 groupes infestés et traités par 2 doses de traitement de réference, soit au total une réduction de 20 souris comparativement à 2 essais in vivo indépendants). De plus, le fait de tester le traitement de référence sur ce modèle lors de la phase préliminaire, permettra, en cas d'inefficacité dudit traitement, d'avorter l'essai in vivo des molécules à tester.

Raffinement

Les méthodes d’analyses choisies permettent l’étude simultanée d’un grand nombre de paramètres (paramètres cliniques (scores de poids, et de comportement) et charge parasitaire mesurée par 2 techniques). Ceci conduit à réduire la variabilité expérimentale et le nombre de techniques à réaliser, donc le nombre d’animaux à utiliser. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit. Le bien-être animal sera donc une priorité mise en oeuvre par le suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de zootechnie qui évaluera l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, comportement, prostration, perte de poids, piloérection, présence de blessures). L'enrichissement et le développement de l'aspect social du groupe seront ménagés. L'expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé de l'animal selon les points limites et les critères d'arrêt définis dans les procédures afin de limiter la douleur, la souffrance ou l'angoisse de l'animal. Par ailleurs, le modèle proposé (évaluation de l’activité des molécules 18 jours après l’inoculation), permet de ne pas entrainer l’apparition de symptômes (hépato-splénomégalie, anorexie, asthénie) douloureux pour les animaux. En effet, en l'absence de traitement, les symptômes apparaissent 30 à 45 jours après inoculation, la leishmaniose étant une parasitose chronique. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours, ainsi que le matériel traité non consommé, seront conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible au collectif, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Par exemple, les prélèvements sanguins effectués pourront servir à l'évaluation pharmacocinétique des molécules testées.

Choix des espèces

Dans le cadre de la confirmation, in vivo, de l’efficacité de molécules actives sur les leishmanies, l’utilisation de souris, qui ne sont pas l’hôte usuel de ces parasites, est consensuelle dans la collectivité scientifique. Les souris utilisées seront des souris balb/c femelles en raison de leur moindre agressivité, diminuant ainsi le stress des animaux. Les souris sont utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge (ou environ 20-25 g pour une souris). C’est le meilleur compromis pour la qualité de l’inoculation et la présence d’un système immunitaire mature.

Selon les lots, des souris reçoivent deux fois par semaine dans l'abdomen un agent qui provoque une fibrose du foie, un régime gras de 4 ou 12 semaines, une injection de bactéries, une injection de virus pour rétablir l'expression d'un gène ou une chirurgie pour injecter des cellules dans un vaisseau, et presque toutes une prise de sang de 500 microlitres sous anesthésie, "avec ouverture de la souris". 5 235 souris vont être utilisées, dont des souris de 20 à 24 mois, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, et la déclaration les classe toutes en souffrance modérée, y compris le lot opéré "sans réveil". Le porteur cite une prise de poids qui peut limiter la mobilité des souris soumises au régime gras et une perte de poids sous l'agent qui agresse le foie, puis affirme que la fibrose, la cirrhose et le foie gras ainsi provoqués sont "indolores" et "n'affectent pas l'état général des souris". Pour les infections bactériennes, il juge les périodes d'observation "trop courtes pour causer des souffrances".

Objectifs

Le vieillissement de la population mondiale est un problème de santé publique majeur. À mesure que les gens vieillissent, de nombreux organes de leur corps commencent à fonctionner moins bien, ce qui augmente le risque de maladies liées à l'âge. Une des choses qui se passe lorsque nous vieillissons, c'est que la paroi de notre intestin devient plus perméable, ce qui provoque une inflammation dans tout notre corps, un phénomène que l'on appelle "inflammaging". Cette inflammation est impliquée dans de nombreuses maladies qui surviennent avec l'âge, notamment les problèmes de foie et les infections. Le foie joue un rôle essentiel dans la régulation de l'inflammation et de l'immunité, car il filtre le sang provenant de l'intestin et contient des cellules spéciales qui combattent l'inflammation. Cependant, le foie lui-même peut être affecté par le vieillissement, ce qui peut contribuer à l'inflammation générale dans le corps et au développement de maladies liées à l'âge. Des recherches récentes ont montré que, chez la souris, le foie est l'organe qui accumule le plus de cellules "vieillissantes" au fil du temps. Parmi les cellules du foie, les cellules qui bordent les vaisseaux sanguins semblent être particulièrement touchées par ce processus de vieillissement. L'objectif de ce projet de recherche est d'étudier comment le vieillissement des cellules du foie affecte les maladies liées à l'âge, en mettant l'accent sur les infections et les problèmes de foie comme la stéatohépatite non alcoolique (NASH, maladie du foie gras) et la fibrose. À terme, cette recherche pourrait aider à développer de nouvelles thérapies qui ciblent spécifiquement le foie pour lutter contre l'inflammation liée à l'âge et prévenir certaines maladies liées au vieillissement.

Bénéfices attendus

L’impact du vieillissement du foie, en particulier des cellules endothéliales et des hépatocytes (cellules majoritaire du foie), sur les maladies liées à l’âge, n'a pas encore été étudié. Les maladies chroniques du foie sont très courantes, avec environ 700 000 cas de maladie hépatique sévère (cirrhose) estimés en France. La stéatohépatite non alcoolique (maladie du foie gras) est l'une des principales causes de ces maladies, mais il n'existe actuellement aucun traitement efficace. De manière plus générale, les mécanismes sous-jacents à l'évolution des maladies du foie vers la cirrhose et ses complications, notamment le cancer du foie, demeurent mal compris. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques. Ce travail se distingue par son choix de se concentrer sur les deux populations cellulaires les plus touchées par le vieillissement dans le foie. Le foie joue un rôle clé dans la gestion des agents pathogènes circulants du système digestif, les interactions avec le système immunitaire et la régulation de l'inflammation générale. En identifiant les altérations des processus immunitaires résultant du vieillissement et susceptibles d'augmenter la vulnérabilité aux infections et aux maladies du foie, il devient possible d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles. De plus, le foie étant un organe facilement accessible, cela ouvre des perspectives prometteuses en termes de futurs traitements.

Procédures

Les procédures seront réalisées sur des lots d’animaux : - Un lot d’animaux subira une chirurgie sans réveil avec anesthésie générale afin de récupérer les cellules du foie et de les analyser. (15 minutes). - Un lot d’animaux subira une chirurgie avec anesthésie générale et réveil afin d'injecter des cellules dans un vaisseau (20minutes). - Un autre lot d’animaux subira une inoculation de virus afin de rétablir l'expression d’un gène (10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris recevra une injection de bactéries afin d'étudier l'effet du vieillissement du foie sur la lutte contre l’infection.(10 secondes avec contention de la souris). - Un lot de souris sera soumis à un régime gras pendant 4 ou 12 semaines. - Un lot de souris subira des injections 2 fois par semaine dans le ventre d’un agent induisant une fibrose hépatique (10 secondes avec contention de la souris). Pour presque toutes les procédures, les animaux auront un prélèvement de sang (500 µl) sous anesthésie générale. (10 minutes avec ouverture de la souris et prélévement de sang)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : * Pour les modèles d'infections bactériennes, il est important de noter que les périodes d'observation sont trop courtes pour causer des souffrances aux animaux, comme cela a été démontré dans de récentes études. Cependant, en cas d'effets indésirables, ils se manifestent généralement par une légère fièvre. * Dans le modèle de régime riche en graisses (modèle de la maladie du foie gras), les effets sur les souris incluent une prise de poids importante, ce qui peut limiter leur mobilité, ainsi qu'une croissance accrue des dents. De plus, le changement initial de régime alimentaire peut causer du stress aux souris pendant les premiers jours. * En ce qui concerne le traitement avec un agent agressant le foie, il peut initialement entraîner une perte de poids chez les souris, suivie d'une reprise de poids. Parmi les autres effets indésirables possibles, on peut citer des douleurs temporaires lors de l'injection intrapéritonéale (dans le ventre) et un éventuel stress initial lié à la nouveauté de la procédure, qui devrait diminuer avec le temps. * Il est essentiel de noter que la fibrose hépatique ou la cirrhose induite par l'agent agressant le foie et la maladie du foie gras induite par le régime riche en graisses sont indolores et n'affectent pas l'état général des souris, comme cela a été confirmé dans d'autres études, en accord avec notre propre expérience.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'étudier les organes et notamment le foie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier l'impact du vieillissement du foie sur l'ensemble du corps et sa réaction face aux infections qui touchent les personnes âgées, qui sont plus sensibles que les personnes jeunes (infections virales telles que la COVID-19 ou la grippe, ou infections bactériennes telles qu'E. Coli). Des expériences in vitro (sur des cellules) seront réalisées afin de caractériser le foie vieillissant. En revanche, pour étudier l'effet du foie sur le développement des infections, nous sommes obligés de passer par un modèle animal. Les modèles animaux permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques, comme celles que nous proposons.

Réduction

Malheureusement, il n'existe pas de cellules saines commerciales à prolifération illimitée (cellules immortalisées) permettant de se passer du modèle animal. Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables grâce à des outils statistiques. Les groupes seront mixtes (autant de mâles que de femelles). Travailler sur des souris provenant d'une même lignée permettra d'éviter les différences de réaction dues à la variation entre chaque individu et ainsi permettra de limiter le nombre de souris.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien-être des animaux : surveillance quotidienne par le personnel technique de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (bâtonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien-être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée. Des points limites représentant un seuil de douleur inacceptable adapté à chaque procédure ont également été définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce (ici, la souris) permet d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Les souris génétiquement modifiées permettent de mettre en évidence le rôle ou l'implication d'un processus donné dans un type cellulaire précis dans le développement de pathologies liées à l'âge. De plus, il existe de nos jours de nombreux outils adaptés à la souris (anticorps...) nécessaires à cette étude. Enfin, les infections bactériennes et les maladies hépatiques étant des maladies multifactorielles, la proximité de la souris vis-à-vis de l'Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables inhérentes à l'espèce animale utilisée. S’agissant d’un projet sur le vieillissement, les souris non mutées seront utilisés à deux âges : - entre 20-24 mois pour être représentatif de patients de plus de 75 ans = « âgés » - des souris de 3 mois pour les controles « jeunes ». Pour les modèles génétiquement modifiés, ils reflétent un vieillisement accélérés seulement dans les cellules que l'ont souhaite étudier et le début des protocoles se fera à partir de 6 mois car il a été montré dans la littérature que ces souris montrent un vieillissement acceleré à partir de 6 mois.