Recherche fondamentale

Une chirurgie du cerveau de 20 minutes avec pose d'électrodes pendant une heure, quatre jours d'électroencéphalogramme enregistré jour et nuit, et des tests de comportement chaque mois pendant une semaine au plus : 918 souris, issues notamment de deux lignées présentées comme reproduisant la maladie d'Alzheimer, vont passer par ces étapes. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées à l'issue par une dose létale d'anesthésique. L'équipe veut corriger par thérapie génique l'hyperexcitabilité du cerveau associée à la maladie, en faisant exprimer aux souris une protéine altérée chez les patients, et émet l'hypothèse que ce traitement pourra s'appliquer un jour à des personnes à risque, avant les premiers symptômes. Le texte ne nomme ni cette protéine, ni les deux lignées, ni les tests de mémoire, décrits seulement comme des séances d'une dizaine de minutes répétées trois fois, à côté d'une heure de déplacement libre dans une arène.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer demeure à ce jour incurable. Il y a une urgence à approfondir nos connaissances sur les mécanismes et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Parmi l’ensemble des symptômes retrouvés chez les patients, le plus connu est la perte de mémoire qui s’aggrave au cours du temps. Il y a une hyperexcitabilité du cerveau, fréquemment associé à de l'épilepsie qui aggravent la pathologie. Notre étude a pour objectif de développer une nouvelle stratégie thérapeutique afin de corriger cette hyperexcitabilité. Cette approche de thérapie génique pourrait être envisagée en clinique humaine. Nous induirons chez l'animal l'expression d'une protéine qui est altérée chez les patients,et nous analyserons l’activité cérébrale, et la mémoire. L’analyse des cerveaux permettra de mesurer l'efficacité sur les différents marqueurs de la pathologie.

Bénéfices attendus

Nous pourrons valider l’efficacité de la thérapie pour corriger l’hyperexcitabilité cérébrale dans le cadre de la maladie d’Alzheimer dans un but préventif ou curatif. Nous pourrons comparer aux techniques utilisées par d’autres laboratoires qui, ne sont pas envisageables en clinique humaine., Nous émettons l’hypothèse que notre thérapie génique pourra être effectuée sur les personnes à risque avant que les premiers symptômes ne se déclarent et que la pathologie ne soit trop avancée. Enfin, cette étude permettra de mieux connaître les mécanismes sous-jacents à l’hyperexcitabilité cérébrale présente dans la maladie d’Alzheimer

Procédures

les animaux auront 2 injections ( moins d'une minute) pour l'anesthésie et l' analgésie suivie d' une chirurgie cérébrale (durée 20 minutes) et en parallèle mise en place d'électrodes (1 heure). Les électroencéphalogrammes seront enregistrés 24h sur 24h pendant 4 jours sur les animaux se déplaçant librement. Les animaux seront testés en comportement tous les mois sur une durée maximum d'une semaine pour laisser un temps de repos entre 2 tests de comportement. Les tests durent environ 10 minutes et sont renouvelés 3 fois pour les tests de mémoire et pour l'étude des mouvements, la durée est d'une heure en libre circulation dans une arène. En fin de procédure les animaux seront euthanasiés sous analgésie avec une dose létale d'anesthésique.

Impact sur les animaux

Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress. Les chirurgies cérébrales peuvent engendrer des douleurs post-opératoires, une perte d’appétit menant à une perte de poids, ou encore à un stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue chaque procédure

Remplacement

Notre étude portant sur l’hyperexcitabilité cérébrale, et ayant des mesures de mémoire et d’activités épileptiques, il est indispensable de travailler sur des modèles in vivo de la maladie d’Alzheimer. En effet, des lignées cellulaires ou des échantillons de cerveaux de patients ne nous permettrait pas de valider la stratégie thérapeutique que nous souhaitons développer.

Réduction

Pour estimer le nombre d’animaux nécessaire, nous nous sommes basés sur les expériences réalisqées précédemment au laboratoire. Nous avons également eu recours à notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences réalisées précédemments au laboratoire montrent que les procédures expérimentales réalisées sous anesthésie et analgésie impactent peu le bien-être animal. Les effets post opératoires sont traités par une analgésie dès le réveil de l'animal et le lendemain de l'opération. De nombreux critères ont été mis en place afin de détecter/évaluer toute forme de détresse des animaux qui entraineront l'arrêt de la procédure si nécessaire

Choix des espèces

Nous choisissons de travailler avec la souris en raison des nombreuses simililtudes au niveau des processus physiologiques avec l’Homme. Par ailleurs, de nombreux modèles ont été développés afin de récapituler certains des changements pathologiques et cognitifs associés à la maladie d'ALzheimer. Notre étude comprend l’utilisation de deux modèles à des âges pour lesquels ils présentent des symptomes plus ou moins avancés Les animaux (mâles et femelles) utilisés sont âgés de 3 ou 5 mois au début du protocole. - 3 mois : correspond à l’âge où la pathologie commence à se déclarer au niveau cérébral de par la production de peptides amyloïdes. De plus, nos expériences réalisées précédemment au laboratoire démontrent une efficacité de notre thérapie à cet âge. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet préventif de notre traitement. - 5 mois : c’est un âge où la pathologie au niveau cérébrale est bien implantée et où les animaux présentent des déficits cognitifs. Le début du protocole à cet âge permet donc de tester l’effet curatif de notre traitement.

20 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une tumeur colorectale humaine greffée sous la peau, elles reçoivent un peptide radiomarqué au fluor-18 puis passent en imagerie sous anesthésie, avant une ponction cardiaque terminale. L'objectif est d'évaluer la distribution de ce traceur pour le diagnostic du cancer du côlon. Le porteur affirme que les résultats in vitro sont insuffisants et qu'un modèle animal porteur de tumeur est "indispensable".

Objectifs

On estime, en 2018, à plus de 43 000 le nombre de nouveaux cas de cancer colorectal en France. Il s'agit du troisième cancer le plus fréquent et du deuxième cancer en termes de mortalité, avec plus de 17 000 décès par an en 2018. Le cancer du côlon est guérissable dans plus de 90% des cas lorsqu'il est diagnostiqué tôt. Ainsi, le diagnostic précoce de ces cancers est un enjeu majeur afin d'établir un traitement le plus tôt possible et par conséquent avoir un impact direct sur la survie du patient. Même s'il existe des tests biologiques de plus en plus performants, l'imagerie médicale, si elle est optimisée, reste un outil performant et quasi non invasif pour la détection précoce de ces cancers. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés au récepteur de la neurotensine qui est exprimé au niveau du cancer du côlon (lignée HT 29). Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament radiopharmaceutique ciblant le récepteur de la neurotensine utilisé en routine. Dans ce projet préclinique, 1 peptide radiomarqué au fluor-18 sera étudié sur 20 souris porteuses de tumeurs du colon (lignée HT-29).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une avancée en recherche préclinique sur la thématique des radiothéranostiques (diagnostiques et thérapeutiques). Si cet analogue de la neurotensine donne de bons résultats in vivo en imagerie PET, nous pourrons envisager une étude thérapeutique plus poussée (TRT : Targeted Radiotherapy) en utilisant ce même ligand radiomarqué avec un radionucléide thérapeutique tel que le Lutétium-177.

Procédures

Les différentes interventions sur les 20 souris Balb/c nude sont les suivantes : - 1 xénogreffe sous-cutanée de cellules tumorales (cancer colorectal) sur le flanc droit (5 min) - 2 Injections intraveineuses au niveau de la queue sous anesthésie gazeuse pour les 20 souris (5 min) - 2 imageries de 20 min sous anesthésie gazeuse - 1 ponction cardiaque terminale sous anesthésie gazeuse 3% (5min)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues seront : 1) l'inoculation des tumeurs au niveau du flanc droit pouvant engendrer un stress 2) une pousse de tumeur trop importante ou une nécrose potentielle de la tumeur peut entrainer une gêne localisée 3) les anesthésies pour les imageries ([18F]FDG et du radiopeptide étudié) peuvent impactées la souris. 4) la mise à mort en fin d'étude.

Devenir

A la fin de la procédure, les 20 souris seront mises à mort. Le sang et les organes seront prélevés pour un comptage radioactif et analyses immunohistochimiques ultérieures.

Remplacement

Les résultats in vitro ne sont pas suffisants pour valider le devenir de l’analogue de la neurotensine radiomarqué in vivo. L’utilisation de modèles animaux porteurs de tumeurs avec une forte expression du récepteur à la neurotensine est indispensable pour déterminer la faisabilité d’un ciblage oncologique par le peptide radiomarqué.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possibles. Pour l'étude de l'analogue de la neurotensine radiomarqué avec un radioisotope dédié au diagnostic PET, il est nécessaire de visualiser la biodistribution in vivo et d’identifier les organes présentant une forte expression des récepteurs à ce neuropeptide. Pour cette étude, un modèle murin présentant une xénogreffe sous-cutanée d'une lignée de cancer humain du colon sera utilisé. La présence du récepteur à la neurotensine sur cette lignée a été validée in vitro. La saturation de tous les récepteurs cibles par la neurotensine froide injectée en large excès (groupe dit de "blocking") permet une non fixation du peptide radioactif. Pour cette étude de validation de la biodistribution du radiopeptide, un t-test sera réalisé avec un nombre minimum de 10 souris xénogreffées par condition. Ce nombre permet de prendre en compte une pousse tumorale hétérogène. Ainsi, 10 souris seront injectées avec le radiopeptide seul et un groupe dit "blocking" incluant 10 souris injectées avec le radiopeptide + un large excès de neurotensine "froide".

Raffinement

Les souris étant immunodéprimées, celles-ci sont logées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes à l’intérieur des salles de stabulation de l’animalerie de recherche agréée où l’ambiance est parfaitement contrôlée (hygrométrie, température, ventilation, bruit). De plus les cages sont équipées d’enrichissement pour limiter le stress. Les souris immunodéprimées sont hébergées dans des cages ventilées adaptées au maintien d'un statut sanitaire exempt d'organismes opportunistes et pathogènes (SOPF). Une limitation du nombre de souris par cage est également requise. Les animaux sont nourris ad libitum et toute manipulation invasive sera précédée d’une anesthésie générale sous isoflurane 2%. Nous avons choisi des points limites clés qui permettent de prévenir une détérioration de l’état clinique générale de l’animal dans le but d’éviter une quelconque souffrance. Les points limites sélectionnés sont les suivants : perte de poids supérieure à 20%, déshydratation, immobilité de plus de 1h (signe d’une douleur aigüe), ulcération et limitation de la taille de la tumeur. Si un des points limites est atteint l'animal sera sorti de l'étude et la décision sera prise par le vétérinaire soit de soigner l'animal soit de l'euthanasier par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Le modèle souris est communément utilisée en oncologie. La Balb/c nude est une souris d’une souche consanguine immunodéprimée et sans poil qui en fait l’un des meilleurs modèles pour la xénogreffe sous-cutanée de tumeur humaine. Des souris femelles seront utilisées pour cette étude car moins agressives que les mâles (moins de risques de blessures au niveau de la tumeur). Les souris seront réceptionnées à 8 semaines et mises en quarantaines pendant 2 semaines. Les études seront initiées à 10 semaines de développement. L’induction des tumeurs se fera à 10 semaines. A ce stade de développement, la souris est une jeune adulte. Les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes. Lorsque les tumeurs atteindront un volume minimum de 150 mm3, l'étude de biodistribution pourra être initiée.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à deux injections intra-péritonéales par jour pendant dix jours sur animal vigile, puis un prélèvement de sang intra-cardiaque avant l'euthanasie pour récupérer organes, rate et ganglions. L'objectif est de tester des inhibiteurs d'une protéine, qui font l'objet d'un dépôt de brevet, pour la greffe de poumon. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et "le seul modèle préclinique adapté".

Objectifs

BOB1 est un facteur de transcription exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associée au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. Notre hypothèse est que BOB1 est un déterminant transcriptionnel qui contrôle les réponses immunes allogéniques après greffe de poumons. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de modifier le programme transcriptionnel des lymphocytes activés et fournir un bénéfice thérapeutique pour la prévention et le traitement des dysfonctions chroniques du greffon. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique. Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune spécifique d’un alloantigène, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Ces souris développent une réponse immune complète (humorale et cellulaire) spécifique d’un alloantigène que nous pouvons quantifier. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique et innocuité in vivo chez la souris. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une allogreffe de poumons.

Bénéfices attendus

D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.

Procédures

Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 2 minutes, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intrapéritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.

Remplacement

Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, des tests statistiques adequats sont utilisés et le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.

224 rats prédisposés au syndrome métabolique vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent par gavage de la dioxine TCDD, un polluant reconnu cancérigène, sont soumis à un test d'effort sur tapis roulant avec choc électrique et à des imageries, avant une intervention cardiaque terminale qui les tue tous. L'objectif est de voir si une exposition chronique à faible dose aggrave le dysfonctionnement cardiaque. Le porteur affirme que les cultures et modèles ex vivo sont "inadéquats" et que les procédures ont un "caractère de stricte nécessité".

Objectifs

L'exposition aux polluants organiques persistants (POP) est un problème majeur de santé publique (OMS 2019), notamment en tant que facteur de risque de maladies cardiovasculaires. Les dioxines, et en particulier la 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) sont parmi les POP les plus toxiques et persistants qui sont rejetés dans les écosystèmes en tant que sous-produits de divers processus de combustion et industriels. Malgré des politiques restrictives de réduction des émissions de POP les populations humaines continuent d'être chroniquement exposées aux dioxines car elles persistent des centaines d'années dans les sols et les sédiments, contaminant ainsi la chaîne alimentaire. Les dioxines sont lipophiles, s'accumulent dans les tissus adipeux et persistent pendant de nombreuses années dans l'organisme. L'exposition aux POP a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques et de décès. Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition subchronique à une forte concentration de TCDD induit une légère hypertrophie cardiaque et une hypertension. Cependant, il est encore inconnu si l'exposition chronique et à faible dose de TCDD exacerbe le dysfonctionnement cardiaque chez l'Homme et les modèles animaux prédisposés aux cardiomyopathies, ainsi que les mécanismes sous-jacent à la cardiotoxicité induite par la TCDD. Ainsi, les objectifs de notre projet sont : 1) de déterminer si la toxicité cardiovasculaire d'une exposition chronique et une faible dose de TCDD est exacerbée dans un modèle murin prédisposé aux cardiomyopathies, 2) d'identifier les voies moléculaires affectées par l'exposition chronique à la TCDD, avec un accent particulier sur Aryl Hydrocarbon Receptor, dont l’activité est modulée par le TCDD et 3) de tester les effets d’antagonistes synthétiques de l'AHR sur les effets cardiotoxiques de la TCDD.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à ce que les résultats de ce travail permettent de démontrer puis de déterminer le rôle du récepteur AHR dans les dysfonctions cardiaques et vasculaires et endothéliale lors d’une intoxication par la dioxine. Ceci permettra ainsi de nouvelles opportunités pour le développement d’approches thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis à 4 manipulations interventionnelles de classe légère non invasives : - exposition par gavage à la TCDD et à l'antagoniste des récepteurs AHR pour une durée d'environ une minute par animal par semaine - echocardiographie environ 20 minutes par animal - IRM environ 45 minutes par animal - mesure de pression à la queue environ 10 minutes par animal. Les animaux seront soumis à 2 manipulations expérimentales de classe modérée : la capacité d'exercice environ 15 minutes par animal, et l'évaluation de la fonction rénale environ 3h par animal. Enfin les animaux seront soumis à une manipulatiob expérimentale de classe sans réveil d'une durée d'environ 20 minutes par animal. Les prélèvements (coeur, reins et aorte) se feront après la mise à mort de l'animal.

Impact sur les animaux

Concernant la TCDD, il a été démontré que l'exposition à une très forte concentration de TCDD a des effets cancérigènes notamment au niveau hépatique après plusieurs semaines d'exposition. Nous nous attendons également à retrouver un effet délétère au niveau cardiovasculaire après plusieurs semaines d'exposition. Pour la MANIP 1, qui correspond à l'administration de la TCDD par gavage, aucun effet indésirable ou nuisance ne sont attendus. Pour les MANIP 2, 3 et 4 (echocardiographie, IRM et mesure de pression à la queue), la température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à une table chauffante. Les animaux retrouveront conscience sur la plaque chauffante et seront ensuite replacés dans leurs cages. Pour la MANIP 5 (évaluation de la capacité d'exercice), lorsque le degré de fatigue est atteint et/ou que l'animal a des difficultés à rester sur le tapis roulant (indépendamment de la délivrance du choc électrique), l'animal sera retiré du tapis de course et le temps de course sera enregistré à la seconde près. Les rats seront habitués à cette mesure en la subissant une fois par jour pendant 3 jours consécutifs avant les mesures d’effort de base.

Devenir

Tous les animaux resteront en vie à l'issue de chaque manipulations expérimentales, excépté pour l'évaluation de l'hémodynamique intracardiaque qui sera une intervention terminale entrainant la mise à mort de tous les animaux à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les expériences in vivo ne peuvent pas être remplacées pour la bonne réussite de ce projet. En effet, ce projet se propose d’étudier, dans le contexte pathologique du syndrome métabolique, les effets cardiovasculaires et rénaux d’une exposition à la dioxine et/ou de l’antagoniste du récepteur AHR dans des conditions de physiopathologies intégrées, autrement dit, chez des rats représentant les caractéristiques observées chez l’Homme : une hypertension artérielle, une insuffisance rénale et un diabète. L’utilisation de cellules ou de modèles expérimentaux ex vivo est par conséquent inadéquate pour répondre de façon pertinente aux questions posées dans le cadre de ce travail. Ainsi, les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Sur la base des données historiques depuis 30 ans obtenues avec des agents pharmacologiques chez des rats atteints d'insuffisance cardiaque chronique sur le remodelage cardiaque et l'hémodynamique, nous avons effectué une simulation satistique pour chaque paramètre obtenu chez les animaux non traités. Sur ces bases nous estimons que le nombre d’animaux nécessaire est de 224 rats.

Raffinement

Après leur arrivée dans l’animalerie, les rats resteront une semaine en période d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Les rats seront hébergés pour groupe de 3 par cage afin de permettre des interactions avec leurs congénères. Le milieu de la cage sera également enrichi de carton pour leur permettre de réaliser des nids. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Différents paramètres seront évalués incluant le comportement (mobilité, activité normales et toilettage) ainsi que l’état physique (état de la peau, de la fourrure et des yeux, vitesse et profondeur de la respiration). Leur prise de poids sera également notée régulièrement. En présence de signes de souffrance légère une administration de buprénorphine 0,03 mg/kg par voie sous cutanée pourra être réalisée. En présence de signes de souffrance sévère ou de détresse constituant un point limite (perte de poids > 10%, paupières fermées, léthargie, comportement de retrait, vocalisations, température corporelle diminuée > 5ᵒC), l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L'exposition aux TCDD a été associée à un risque accru de développer une hypertension, une obésité, une résistance à l'insuline et un diabète de type 2, et donc un risque accru de maladies cardiaques. Les rats Zucker fa/fa seront donc un modèle idéal pour évaluer les effets de la TCDD sur des individus prédisposés aux cardiomyopathies. Les rats Zucker fa/fa ou Lean (contrôle) utilisés seront des rats matures de 12 semaines ayant au moment de l'inclusion dans l’étude un syndrome métabolique. Ils auront 24 semaines au moment de leur mise à mort. La durée du protocole impliquera soit 3 soit 12 semaines d’exposition à la TCDD avec ou sans antagoniste du récepteur AHR pour pouvoir observer l’impact de la TCDD sur le système cardiovasculaire. Le choix du rat et son âge se justifie par l’expérience du laboratoire obtenue avec les différents modèles de syndrome métabolique au cours des derniers 15 années, utilisés pour évaluer les effets cardiovasculaires des nouveaux traitements pharmacologiques en collaborations avec des industries pharmaceutiques.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former 24 étudiants de Master par an. Chaque animal subit une injection stéréotaxique d'une neurotoxine dans le cerveau pour léser les neurones dopaminergiques, un modèle de la maladie de Parkinson, avec posture anormale et troubles moteurs possibles, avant des tests comportementaux. Le porteur affirme qu'un modèle drosophile n'apporte qu'un "tout petit complément" et que la formation aux gestes "est essentielle" tant que l'expérimentation sur rongeurs reste autorisée. Il présente cette pratique comme une réduction "indirecte" du nombre d'animaux, les gestes étant acquis avant les stages de recherche.

Objectifs

L’objectif du projet est de répondre à des besoins d’enseignement supérieur scientifique dans le domaine des neurosciences développementales s’adressant à des étudiants sélectionnés et de niveau Master 2. Ces approches expérimentales sont importantes pour la suite de leur formation universitaire, en premier lieu dans le cadre de la réalisation de leur master puis pour la plupart de leur thèse de doctorat. Il est à noter qu’en début de cours ; les étudiants reçoivent des informations théoriques sur l’expérimentation animale, les règles éthiques afin de les sensibiliser aux problèmes éthiques et au choix des modèles expérimentaux.

Bénéfices attendus

Ce projet éducatif représente un axe d’apprentissage important pour la compréhension par de futurs neurobiologistes du rôle des neuromédiateurs et en particulier celui de la dopamine et du système dopaminergique dans les comportements locomoteurs. En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et dans le cadre de maladies psychiatriques, dégénératives ou neurodéveloppementales. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale. Cette intervention ne dure pas plus d’une heure. Ils seront également soumis à des tâches comportementales de courte durée (session unique de 30 à 60 minutes).

Impact sur les animaux

La chirurgie et les expériences de comportement sont des procédures de sévérité modérée. Les nuisances et effets indésirables qui pourraient apparaitre sont des signes de douleur se caractérisant par une posture anormale, une absence de toilettage, des défauts de comportements moteurs du fait de l’injection, des défauts dans le comportement exploratoire. Une perte de poids et une absence de récupération rapide, normalement attendue, en deux semaines maximum sont aussi des effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés car il est nécessaire de réaliser des études histologiques sur les tissus à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Dans le cadre du cours, l’analyse du système dopaminergique et de son implication dans des petites tâches comportementales très basiques est réalisée à partir d’un modèle chez la drosophile. Toutefois les informations apportées ne peuvent être qu’un tout petit complément à celles réalisées chez le mammifère et présentées dans ce projet qui couvre une large partie du cours. Le cerveau de la drosophile est petit pour uniquement 100000 neurones au total. Le cerveau de souris en comprend 4 millions, uniquement dans le cortex. La qualité des études comportementales et l’apprentissage ne peut être équivalent. Il est à noter que ce cours s’initie par un enseignement théorique sur l’expérimentation animale par un vétérinaire expert, évoquant en détail tous les problèmes éthiques liés à l’expérimentation animale et chez la souris en particulier. Des enseignements par vidéos sont également utilisés lorsque possible mais sans altérer la qualité d’apprentissage. Tant que l’expérimentation sur rongeurs sera autorisée en recherche développementale, la formation des étudiants aux gestes réalisés eux-mêmesest essentielle. Ceci s’appliquera dans le contexte du stage qu’il vont ensuite entreprendre permettant également une réduction « indirecte » d’animaux, les gestes et la manipulation ayant été déjà été acquis et ceci dans d’excellentes conditions avec un encadrement très soutenu pour la vérification de tous les gestes. Dans le cas contraire, par faute de pratique, ce sont les expériences de recherche qui seront à refaire avec des conséquences importantes de par la nécessité de statistiques pour des résultats à publier. Dans le cadre du cours, les analyses statistiques sont évaluées avec des résultats des sessions des années précédentes.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à son minimum pour les 24 étudiants qui suivent annuellement le cours. Chaque animal est exploité pour tous les niveaux d’expérience ce qui réduit le nombre total d’animaux utilisés. L’injection unilatérale de neurotoxique permet aussi de pouvoir utiliser le côté du cerveau non lésé comme contrôle et permet de réduire ainsi de moitié le nombre d’animaux utilisés pour les études en histologie. Ce projet pourra utiliser des animaux surnuméraires d'une activité d'élevage.

Raffinement

Tous les efforts techniques sont mis en œuvre pour minimiser au maximum toute douleur et tout inconfort de l’animal à l’éveil. La qualité des études comportementales en dépend également. Le nombre d’animaux est réduit à son minimum pour les 24 étudiants qui suivent annuellement le cours. Chaque animal est exploité pour tous les niveaux d’expérience ce qui réduit le nombre total d’animaux utilisés. Des points limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance aux animaux. De la même façon, des analgésiques en pré- et postopératoire sont utilisés pour éviter toute douleur pouvant être associées aux chirurgies.

Choix des espèces

En Neurobiologie, les modèles animaux sont utilisés lorsqu’aucune alternative n’est disponible. Par exemple, des biopsies cérébrales ne peuvent pas être envisageables contrairement à d’autres tissus. Les modèles animaux permettent d’étudier un processus spontané ou induit, présentant un ou plusieurs aspects communs avec un phénomène équivalent chez l’humain. Ceci est de fait particulièrement utile en Neurobiologie et dans le cadre de maladies psychiatriques, dégénératives ou neurodéveloppementales. Il est donc important dans le cadre d’une formation d’étudiants au domaine des Neurosciences d’aborder ces aspects et de les initier aux expérimentations sur animaux. C’est aussi la possibilité de les sensibiliser directement aux aspects éthiques liés à l’expérimentation animale par un enseignement très adapté. Le modèle murin est le plus adapté pour illustrer les concepts à enseigner. Les animaux sont utilisés adultes (12 semaines). Ce stade est justifié par la nécessité d’avoir un cerveau mature, et expérimentalement de pouvoir injecter selon des coordonnées stéréotaxiques précises et bien connues.

200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont placés en cage individuelle jusqu'à 48 heures pour recueillir urines et excréments malgré leur nature sociale, subissent des prélèvements sanguins répétés, puis sont tués pour prélever l'intestin et les organes. L'objectif est de mesurer la digestibilité des protéines d'un régime végétarien selon l'âge. Le porteur affirme qu'aucun modèle n'intègre l'ensemble des interactions entre alimentation, intestin et organes, et invoque une recommandation de la FAO sur l'usage du rat.

Objectifs

Les protéines végétales sont généralement de moins bonne qualité que les protéines animales car elles sont notamment moins digestibles, c’est-à-dire que suite à leur ingestion une plus faible partie est assimilée par l’organisme. Cela est dû à la présence dans les végétaux de composés spécifiques diminuant la digestibilité des protéines. Les régimes végétariens ont néanmoins des effets bénéfiques, notamment sur la flore intestinale dont les interactions avec les aliments peuvent influencer le fonctionnement du tube digestif, dont la digestion des nutriments. Cependant les effets à long terme de la consommation d’un régime essentiellement à base de plantes sur la digestion restent en grande partie inexplorés. Dans le contexte de la transition nutritionnelle vers des régimes plus végétalisés, il est important d’étudier si les composants alimentaires végétaux de l’alimentation améliorent ou au contraire altèrent la digestion et la physiologie intestinale. Cela permettra de déterminer si une consommation élevée d’aliments d’origine végétale entraîne une diminution générale de la digestibilité des protéines ou si une adaptation de la capacité digestive a lieu, permettant une optimisation de l’assimilation des protéines végétales. Cela est d’autant plus important pour les populations ayant des besoins spécifiques en protéines et pour qui les capacités digestives peuvent être diminuées, comme les personnes âgées. Ce projet a ainsi pour objectif de comprendre l’influence d'une alimentation riche en aliments végétaux sur l’assimilation par l’organisme des protéines végétales tout au long de la vie adulte. Pour cela, nous évaluerons les effets aigus et chroniques d'un régime riche en aliments végétaux sur la digestibilité des protéines et acides aminés d’une source protéique végétale, le métabolisme des protéines et la physiologie digestive en fonction de l’âge chez le rat.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet apporteront de nouvelles connaissances sur la digestibilité des protéines végétales et son évolution avec le vieillissement. L'effet des aliments d'origine végétale sur l’assimilation des acides aminés sera déterminé à l'échelle du repas et du régime alimentaire, aux différents stades de la vie adulte. Cette approche globale permettra de considérer la composition complexe des aliments d'origine végétale et d'explorer l'équilibre entre les effets négatifs et bénéfiques des différents composants sur la santé intestinale et la digestion. Cela permettra de fournir des opportunités uniques pour comprendre comment les régimes à base de plantes ont un impact sur la physiologie de l'intestin et la digestion des protéines. En outre, nos résultats fourniront des données importantes sur la digestibilité des protéines et des acides aminés chez les individus âgés, qui n'est pratiquement pas documentée à l'heure actuelle. Ce projet aidera à comprendre les changements physiologiques de l'intestin impliqués dans la diminution des capacités de digestion liée à l'âge. De telles informations sont essentielles pour mieux estimer les besoins en protéines et acides aminés et développer des stratégies nutritionnelles pour prévenir une possible inadéquation entre les apports et les besoins dans la population générale et âgée. L’ensemble des résultats de ce projet permettront de soutenir une promotion éclairée d'un régime alimentaire plus sain et durable.

Procédures

Durant l’ensemble du projet, les animaux seront pesés régulièrement (3 à 5 fois/semaine). Des régimes omnivores et végétariens répondant aux besoins des rats seront donnés aux animaux. Trois prélèvements sanguins sur animal vigile sont réalisés lors du projet sur l’ensemble des rats, avec du matériel spécifique afin de limiter la durée et le stress engendrés par ce geste ; la durée ne dépasse pas 5 minutes par prise. L’ensemble des animaux recevra également 30 minutes avant la mise à mort des animaux, une injection réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes. Pour 104 rats, afin de collecter leurs urines et fèces, les rats sont placés 3 fois pendant le projet pour une durée limitée (48 h) dans des cages individuelles spécifiquement conçues pour ces recueils. Pour 104 rats, une anesthésie gazeuse brève est réalisée 3 fois au cours du projet afin d’évaluer des paramètres de composition corporelle dans un appareil d’imagerie.

Impact sur les animaux

Les animaux sont hébergés en cage individuelle en permanence ou ponctuellement selon la procédure. En effet, pour évaluer la digestibilité des protéines et des acides aminés, il est nécessaire de mesurer précisément la prise alimentaire et de collecter les urines et fèces. Les animaux doivent donc être placés dans des cages individuelles et cela peut induire un stress lié à l’isolement car les rats sont des animaux vivant habituellement en groupe. Les prélèvements sanguins sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure car la détermination de la digestibilité des protéines ainsi que l’évaluation des effets d’un régime végétarien sur la physiologie digestive nécessitent la collecte des contenus de l’intestin et de différents organes.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier l’impact d’une alimentation végétarienne sur la digestibilité des protéines, le métabolisme des protéines et la physiologie digestive en fonction de l’âge. Cette approche globale nécessite d’utiliser des modèles animaux, permettant de faire varier l’alimentation à l’échelle du repas ou du régime, de prendre en compte les adaptations de l’organisme et l’effet de l’âge. Aucun modèle ne peut intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, l’intestin et les organes associés.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé à 16 rats (8 mâles et 8 femelles) /groupe à partir de données comparables déjà publiées afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre eux à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages sont en plexiglas transparent permettant le plus d’interactions visuelles entre les animaux et elles sont enrichies avec des tunnels en plexiglas opaque. Lorsqu’ils sont hébergés en cage individuelle sur une durée supérieure à 48 h, les animaux sont regroupés (entre animaux de même sexe et de même âge), tous les jours de la semaine (hors week-end) durant 2 h par jour dans des cages collectives (2-5 animaux par cage en fonction de leur âge/poids). Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’exploration et d’interaction sociale. Les prises de sang sont réalisées par un personnel expérimenté sur cet acte technique avec du matériel spécifique, ce qui permet de limiter le temps et le stress engendré. De plus, l’animal est habitué à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées quotidiennes afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Le régime alimentaire et le système digestif du rat présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. Ainsi, l’Organisation des Nations unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO) préconise de spécifiquement utiliser l’être humain, le porc ou le rat pour l’évaluation de la digestibilité des protéines (critère principal du projet). Des rats mâles et femelles jeunes (5 semaines), d’âge moyen (10 mois) et âgés (18 mois) sont inclus car nous étudions l’effet de l’âge.

1432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen, dont un agent pro-inflammatoire qui peut faire perdre 10 à 15 % du poids, subissent un régime obésogène et des tests de tolérance au glucose et à l'insuline par incisions répétées de la queue, avant un prélèvement de sang terminal. L'objectif est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes limitent l'inflammation cérébrale via la microglie et freinent l'obésité. Le porteur renvoie le bénéfice, une "nouvelle possibilité de lutte contre l'obésité", au conditionnel et conclut qu'aucun modèle in vitro ne remplace la souris pour ces échanges entre organes.

Objectifs

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. L’inflammation est un facteur qui favorise l’apparition de l’obésité. L’hypothalamus est la région du cerveau impliquée dans les régulations métaboliques. Les cellules immunitaires responsables de l’inflammation dans le cerveau s’appellent cellules microgliales. In vitro les hormones thyroïdiennes ont un effet anti-inflammatoire dans ces cellules. L’objectif de ce projet est d’abord de verifier qu’in vivo aussi les hormones thyroïdiennes sont capables de limiter l’inflammation provoquée par un agent bactérien ou un régime trop gras, via leur action dans la microglie. Puis nous évaluerons l’importance de ces hormones dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime obésogène.

Bénéfices attendus

L’obésité est un problème de santé publique mondiale. Trouver des mécanismes capables de limiter la prise de poids en réponse à des régimes trop gras est nécessaire. Les hormones thyroïdiennes ont cette propriété mais ne peuvent pas être utilisées en tant que telles car elles provoquent aussi des effets indésirables. Il est donc nécessaire de comprendre comment elles peuvent avoir cette action. Cette étude permettra de déterminer si cibler le pouvoir anti-inflammatoire des hormones thyroïdiennes dans l’hypothalamus constitue une nouvelle possibilité de lutte contre l’obésité

Procédures

L’ensemble des animaux évoqués sont vigiles sauf indication contraire Dans la première expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Toutes les souris sont ensuite injectées dans l’abdomen (1 fois, 15s) et analysée après 0, 1 ou 5 jours. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans la deuxième expérience certains animaux seront nourris pendant 15 jours avec de la nourriture pauvre en iode et avec un traitement bloquant la production d’hormone thyroïdienne. Après les 10 premiers jours, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1fois/jr, 15 secondes, 5 jours). Puis L’alimentation normale sera remplacé par un régime obésogène pour 3 ou 7 jours) pour certains des animaux. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s) Dans une troisième expérience, l’ensemble des animaux recevra des injections dans la cavité abdominale (1 fois/jr, 15s, 5 jr). Pour certains, le régime alimentaire normal sera remplacé par un régime obésogène (2 mois). Toutes les souris seront soumises à un test pour mesurer leur capacité à utiliser du glucose administré en gavage (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée 5 fois dans une goutte de sang issue d’une légère incision à la queue (1 incision, 5s par prélèvement). Après une semaine toutes les souris seront soumises à un autre test sanguin pour mesurer leur capacité à utiliser le glucose en réponse à une injection d’insuline dans la cavité abdominale (1 fois, 15 s). L’évolution de la glycémie sera mesurée comme après gavage au glucose. 2 injections en sous-cutanée sont réalisées avant la mise à mort à 30 mn d’intervalle avec un analgésique et un anesthésique (2 fois 15s) pour permettre le prélevement de sang terminal et l’injection intracardiaque pour fixation des tissus (1 fois, 30s)

Impact sur les animaux

Ne travaillant que sur les mâles et les animaux mutants et contrôles issus d’une même portée devant être répartis dans les différents groupes expérimentaux (nourriture), certains peuvent être isolés pendant l’ensemble de la procédure. Une douleur temporaire peut apparaitre suite aux injections quotidiennes d’hormones ou de tamoxifène 5 jours d’affilées. Il y a aussi un risque d’inflammation de la cavité péritonéale suite à ces injections répétées. Les prélèvements à la queue dans les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent provoquer une douleur plus légère. Après l’injection de LPS (procédure 1), la perte de poids peut être importante (entre 10 et 15% du poids pré-injection) le premier jour pour remonter en suite. Pour la procédure 3, sous le régime obésogène les animaux peuvent prendre beaucoup de poids. Cette forte prise de poids peut s’accompagner de difficulter à se déplacer. Lors des tests de tolérance à l’insuline, les souris peuvent se retrouver en hypoglycémie

Devenir

L’ensemble des animaux est mis à mort pour prélèvements des tissus à analyser par histologie ou biologie moléculaire ou pour récupérer des cellules

Remplacement

Nous avons déjà étudié et pu établir l’effet anti-inflammatoire de l’hormone thyroïdienne in vitro. Le but ici est de comprendre l’impact de cet effet anti-inflammatoire dans un contexte physiologique d’inflammation et son impact sur les conséquences métaboliques de cette inflammation L’hypothalamus est une région du cerveau qui présente une grande diversité cellulaire. Les différents types cellulaires interagissent entre eux pour élaborer les réponses physiologiques adaptées. Les outils génétiques nous permettent aujourd’hui d’inhiber sélectivement la signalisation thyroïdienne dans un type cellulaire donné chez la souris, ici la microglie. Aucun modèle in vitro ne peut se substituer au modèle animal, pour ce type d'études physiologiques qui impliquent la communication entre différents organes, en réponse à différentes conditions physiologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été réduit au maximum pour permettre l’obtention de résultats significatifs. 6 animaux (mâles) par condition expérimentale en fin d’expériences sont nécessaires et suffisants. En effet les effets de l’hypothyroïdie sont variables d’un animal à l’autre. Pour certaines expériences, on augmente le nombre d’animaux à 8 par groupe car dans ces expériences des animaux devront peut-être être retirés avant la fin suite à l’atteinte de points limites. Cette étude est aussi séquentielle : l’ensemble des expériences proposées ne seront pas forcément menées à bien. En particulier, nous n’étudierons l’importance des hormones thyroïdiennes dans la microglie pour l’apparition de l’obésité en réponse à un régime riche en gras que si les premières études montrent que les hormones thyroïdiennes régulent l’inflammation dans l’hypothalamus.

Raffinement

Autant que possible, les animaux sont maintenus en groupes sociaux à deux ou trois animaux par cage pour limiter le stress. Si les animaux viennent à être séparés suite à des blessures, ou pour permettre la ventilation des animaux dans les différents groupes, on leur procurera un enrichissement dans leur cage. Nous veillerons au bien être et la bonne santé des animaux tout au long des expériences, en leur effectuant des visites trois fois par semaine, en vérifiant leur poids, et observant que leur comportement soit normal. Des lotions antiseptiques seront appliquées en cas de blessure Lorsque des injections quotidiennes doivent être faites dans l’abdomen nous changeons chaque jour le site d’injection pour minimiser les risques d’inflammation. Lorsqu’une perturbation importante des animaux est attendue, comme la perte de poids après injection de l’agent pro-inflammatoire, la fréquence de la surveillance des animaux est augmentée à deux fois par jours jour. La nourriture obésogène a tendance à rancir, elle est donc renouvelée deux fois par semaine. L’insuline peut faire chuter le taux de glucose sanguin. Lors des tests de tolérance à l’insuline, on veille à ce que ce taux ne descende pas en dessous d’un seuil critique. Si ce seuil est atteint l’animal est immédiatement injecté avec du glucose Des analgésiques et anesthésiques sont utilisés pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins et des derniers traitements avant la mise à mort des souris.

Choix des espèces

Les rôles des hormones thyroïdiennes chez la souris sont très similaires à ceux chez l’homme. Chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique et contrôlent la température. La souris est un modèle de choix pour les manipulations génétiques et les expériences de physiologie. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats à ceux obtenus par d’autres équipes de recherche et d’autre part de disposer du matériel nécessaire pour réaliser les expériences. Nous utilisons des souris adultes car nous ne voulons pas d’interférence entre les processus de croissance et métaboliques.

6 vaches laitières vont être utilisées, puis conservées pour le troupeau et réutilisables, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à deux vagues de chaleur artificielles atteignant 35°C en chambre climatique, avec six prélèvements de sang à la queue et des prélèvements de lait, pour étudier la stabilité thermique du lait. Le porteur indique que le stress thermique entraîne un inconfort, une hausse de la respiration, de la sudation et du besoin de boire, et une baisse possible de la production laitière. Il affirme qu'il est impossible de se passer des vaches puisque l'étude porte sur le lait qu'elles produisent, projet destiné aux éleveurs et à l'interprofession laitière.

Objectifs

Les laits de consommation subissent des traitements thermiques de type UHT pour permettre leur conservation dans le temps ou des ultrafiltrations pour concentrer certains éléments d’intérêt. Certains laits, pour des raisons mal déterminées, ne supportent pas ces traitements et floculent, soit immédiatement, soit lors de leur conservation en briques. Une meilleure compréhension des causes de la variabilité des instabilités du lait entre systèmes d'élevage des vaches laitières pourrait aider à cibler des leviers par lesquels les problèmes d’instabilité des laits pourraient être limités au niveau des élevages. La France subit ou risque de subir de plus en plus de vagues de chaleur extrême associées au changement climatique. Les effets de ces stress thermiques sur l’instabilité des laits ont été peu documentés. Un effet via les perturbations acido-basiques induites au niveau de l’organisme des animaux pourrait être à l'origine d'une instabilité des laits. Pour des températures entre 5 et 28°C, la vache laitière n'a pas de difficulté de régulation de sa température corporelle, du moins si l'humidité relative est modérée. Par contre, avec des températures supérieures à 25°C, on constate des chutes rapides et importantes d’ingestion et de production laitière. L’objectif de l'expérimentation sera de caractériser finement les effets de deux vagues de de chaleur successives, telles qu’on peut les anticiper en France, sur la stabilité thermique des laits (aptitude à supporter les traitements UHT), en lien avec des paramètres sanguins.

Bénéfices attendus

Nous allons mieux connaître les mécanismes physiologiques déterminant la stabilité thermique des laits afin de résoudre les problèmes qui se posent sur le terrain. Nous pourrons valoriser ce travail auprès des éleveurs et de l'interprofession laitière. Nous participerons à l'identification de biomarqueurs de stabilité thermique dans le lait afin d'aider les éleveurs à mieux gérer ce problème car la stabilité thermique est un paramètre difficile à mesurer en routine à ce jour, bien que les conséquences de sa chute soient importantes dans les unités de transformation laitière.

Procédures

Les vaches seront exposées à deux périodes de vagues de chaleur modérées reproduites artificiellement en chambres climatiques. Chaque période durera une semaine. Chaque jour, la température s'élèvera graduellement à partir de 7 h du matin pour atteindre 35 °C à 12 h. Elle restera à 35°C jusqu'à 19 h, puis descendra rapidement à 19°C, température qui sera atteinte vers 20 h et qui restera constante toute la nuit. Les vaches laitières auront une prise de sang à la queue toutes les semaines pendant 6 semaines, soit 6 prises de sang. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache. Le prélèvement de lait consiste à prélever 2 L de lait dans le bidon qui a recueilli la totalité du lait issu de la traite des vaches. La traite va durer un dizaine de minutes.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température dans les traitements TC de fortes températures ambiantes va induire une adaptation physiologique des vaches à la chaleur. L'ampleur de la hausse de température va être controlée pour mimer deux vagues de chaleur modérées, proches du seuil défini par Météo France pour la température (https://meteofrance.com/changement-climatique/observer/changement-climatique-et-vagues-de-chaleur) et courtes (7 jours). Le stress thermique va par définition entrainer un inconfort et une adaptation physiologique consistant en une hausse de la fréquence respiratoire, de la sudation et un besoin accru d’abreuvement. Il peut aussi entrainer une baisse de la production laitière et une baisse d’ingestion, au moins sur les heures les plus chaudes de la journée. La prise de sang est peu douloureuse et dure peu de temps (quelques secondes). Toutefois, la peau peut être légèrement sensible lorsque l'aiguille la traverse. Le volume de sang prélevé est très faible par rapport au volume sanguin total d’une vache.

Devenir

Les animaux n’ayant subi aucune intervention invasive, ni traitement susceptible d’avoir des effets importants sur leur santé et/ou survie seront conservés afin de participer au renouvellement ultérieur du troupeau et pourront être réutilisés dans de nouveaux essais. Ceci se fera sous la responsabilité du responsable des installations expérimentales. Le suivi sanitaire régulier par le vétérinaire traitant permettra de garantir que ceci soit effectivement possible.

Remplacement

L'expérimentation concerne directement la qualité du lait. Il est donc impossible de se passer des vaches laitières qui produisent ce lait.

Réduction

Le schéma expérimental sera un schéma en double inversion. Les 6 vaches laitières seront réparties dans 2 salles climatisées et elles recevront chacune deux fois les régimes de température décrits. Ce nombre de 6 vaches impliquées est un bon compromis entre la nécessité de maximiser la puissance statistique et nos capacités expérimentales en termes de remplissage de salles climatisées. Les expériences passées avec ce type de schéma montrent qu'un groupe de 6 vaches produira des réponses adaptatives à la hausse des températures envisagées dans ce projet suffisantes pour être mises en évidence à travers une comparaison des périodes entre elles sur les paramètres cibles suivants : production laitière, température corporelle, fréquence respiratoire. Les données seront analysées par analyse de variance.

Raffinement

L'expérimentation est basée sur le lait. Les seuls actes invasifs sont des prises de sang (6 au cours des 6 semaines d'expérimentation). Leur nombre est vraiment faible. Ces prises de sang seront réalisées à la queue, partie de l'animal peu douloureuse. Les vaches seront bloquées au cornadis comme au moment de l'alimentation, donc sans subir aucun stress lié à ce blocage qui est habituel. Les vaches seront maintenues dans un environnement d’élevage habituel aux conditions de température près. Ces conditions sont adaptées à leurs besoins comportementaux et sanitaires, et elles ne seront jamais en isolement social. Les prélèvements et la surveillance des animaux se feront par des personnes compétentes et habilitées. Les points limites pour arrêter l’expérimentation pour certaines vaches qui ne s’adapteraient pas aux hausses de température seront une baisse durable d'ingestion (25% par rapport à la période de référence), un rythme respiratoire supérieur à 120 respirations/min (mesuré par observation) ou une température rectale matinale des vaches avant le démarrage de la phase de montée en température des salles hors de la gamme physiologique (> 39°C).

Choix des espèces

Vache laitière de race Prim’ Holstein. Il s’agit de la race de vache laitière la plus répandue dans le monde. Les résultats de ce projet ont vocation à être diffusés au niveau international. Les vaches laitières seront des vaches adultes en milieu de lactation (vêlages compris entre fin août et fin septembre). Au cours de l’expérimentation, ces vaches seront à différents stades de gestation.