Recherche fondamentale

7 656 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections intrapéritonéales d'anticorps répétées et des prélèvements sanguins dont un prélèvement terminal, pour étudier l'immunosurveillance anti-tumorale. Le porteur décrit une tumeur pouvant se nécroser en son centre et des points limites censés arrêter les atteintes avant un stade avancé. Les retombées annoncées pour les patients restent renvoyées à terme, tandis que le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" à la souris pour l'étude in vivo de ces mécanismes.

Objectifs

Dans le domaine complexe de la biologie humaine, la lutte contre le cancer est un combat permanent qui exige un arsenal d'approches innovantes. Parmi celles-ci, le concept d'immunosurveillance est apparu comme un gardien essentiel dans la lutte contre les tumeurs malignes. L'immunosurveillance fait référence à la capacité innée du système immunitaire à reconnaître et à éliminer les cellules anormales, y compris celles qui ont un potentiel cancéreux. Ce mécanisme de défense naturel constitue une ligne de défense cruciale, détectant et éradiquant les cellules indésirables avant qu'elles ne se transforment en tumeurs à part entière. On ne saurait trop insister sur l'importance de l'immunosurveillance dans la lutte contre le cancer. Contrairement aux traitements traditionnels du cancer qui ciblent souvent la tumeur elle-même, l'immunosurveillance s'attache à donner aux défenses de l'organisme les moyens d'identifier et d'éliminer les menaces cancéreuses. Toutefois, ce processus n'est pas sans faille, car les cellules cancéreuses peuvent échapper à la détection immunitaire grâce à diverses stratégies. Il est donc urgent d'améliorer et d'affiner les mécanismes d'immunosurveillance afin de garantir une défense plus efficace contre le cancer. L'amélioration de l'immunosurveillance implique une approche multidimensionnelle. En outre, il est essentiel de démêler l'interaction complexe entre le système immunitaire et les microenvironnements cancéreux. En comprenant comment les tumeurs manipulent leur environnement pour échapper à la détection, nous pourrons développer des stratégies pour contrer ces tactiques et renforcer l'immunosurveillance. Ainsi, l'objectif de ce projet est de déterminer comment les cellules tumorales échappent à leur éradication par le système immunitaire et de déterminer si le ciblage de ces voies représente une option thérapeutique prometteuse.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à terme de proposer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients souffrants de cancers.

Procédures

Les souris seront rasées sur un des flanc (environ 30 secondes, réalisé sur souris vigile avec du matériel spécifique) et recevront une injection unique en sous-cutanée de cellules cancéreuses. Chaque injection prendra environ 5 minutes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles. Une partie des souris recevra une injection intrapéritonéale d'anticorps tous les 2 jours pendant 2 semaines ou deux fois par semaine pendant 2 semaines. Chaque injection prendra environ 30 secondes et sera réalisée sur des souris vigiles. Pour ¼ des animaux, un prélèvement sanguin sera réalisé en cours de procédure et toutes subiront un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvements prendront environ 1 minute par souris. Un dernier groupe de souris recevra 4 injections intrapéritonéales sur 4 jours (une par jour). Chaque injection prendra environ 30 secondes par souris et sera réalisée sur des souris vigiles.

Impact sur les animaux

Lors d'injections intrapéritonéales répétées, il peut y avoir une inflammation au point d'injection. En ce qui concerne l'aspect et la taille de la tumeur, la tumeur peut présenter un trou en son centre. Avant l’arrivée aux points limites, les animaux pourraient subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection d’immunothérapies. Nous avons une grande expertise de ces modèles. Nous savons que la croissance tumorale n’entrainerait des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, absence de toilettage, une prostration et/ou une agitation), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…) qu’à un stade avancé de du développement de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes et tumeurs et ainsi réaliser les études in vitro nécessaires à savoir analyser la composition cellulaire (cytométrie, immuno-histochimie) et biochimique de la tumeur.

Remplacement

Comme notre projet repose sur l’influence de l’expression de gène tumoraux sur le dialogue entre système immunitaire et les cellules cancéreuses, il n’existe pas à ce jour d’autre alternative que l’utilisation des souris pour l’étude in vivo des mécanismes moléculaires et des interactions complexes impliqués.

Réduction

Bien qu’il n’existe à ce jour pas de méthode de remplacement pour réaliser ces études, notre expérience des modèles utilisés nous permet de définir le nombre de souris minimum à utiliser afin d’être statistiquement significatif, grâce à l'utilisation de méthodes statistiques adaptées. De plus nous avons conçu le projet de façon à ce que les procédures soient réalisées les unes après les autres. En cas de résultats non concluant de la procédure initiale, les procédures suivantes ne sont pas réalisées, ce qui réduira le nombre d’animaux prévus dans ce projet. Enfin aucun effet hormonal n’a été décrit à notre connaissance dans ce modèle. Cela nous permettra de limiter notre étude exclusivement aux femelles, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé pour ce projet.

Raffinement

Une grande importance sera accordée au bien-être des souris. En termes de raffinement, les souris sont hébergées en groupe avec de l'eau stérilisée par filtration, des aliments à volonté et un enrichissement systématique du milieu par diamond twist et igloo rouge. Leur suivi permet de détecter tout signe de souffrance, de détresse et ainsi la prise immédiate des mesures adéquates grâce à l’application de points limites adaptés à la pathologie du lymphome B. La notion d’enrichissement du milieu des rongeurs utilisés est familière aux demandeurs. Tous les participants à ce projet sont dûment qualifiés et ont validé les compétences requises pour les manipulations proposées. D’autre part, afin de minimiser l’inconfort des procédures concernées nous alternerons les sites d’injections en intra-péritonéal, utiliserons des aiguilles très fines adaptées aux injections répétées afin de minimiser/s’affranchir de problème lié à l’injection et nous utiliserons également une tondeuse spéciale rongeurs.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale relativement proche phylogénétiquement de l’homme, et est le modèle de choix utilisé par la communauté scientifique pour étudier les acteurs moléculaires et cellulaires impliqués dans le cancer. De plus, la souris présente plusieurs avantages comme un cycle de vie relativement court, une natalité importante et un modèle facile à élever. Les modèles utilisés sont les modèles les mieux adaptés pour étudier la réponse antitumorale. Nos souris seront âgées de 6 à 20 semaines car c’est durant cette période que le développement tumoral est optimal.

4 032 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du foie leur est greffée ou induite, puis traitée par échauffement de nanoparticules sous anesthésie, avec injections et imageries répétées et un transport entre deux établissements, pour évaluer une thérapie localisée du cholangiocarcinome. Le porteur situe le bénéfice pour les patients au conditionnel, des doses plus faibles et moins d'effets toxiques. Il affirme qu'il n'est pas possible de recréer in vitro la complexité d'un organisme entier et que le passage par l'animal est un passage obligé avant tout transfert à l'homme.

Objectifs

Les cancers hépatobiliaires, en particulier le cholangiocarcinome (CCA) sont difficiles à traiter. Le développement de la nanomédecine permet d’envisager des traitements anticancéreux mieux ciblés, plus efficaces et avec de moindres effets secondaires par rapport aux traitements conventionnels. L’utilisation de nanoparticules activables à distance par un rayonnement lumineux dans le proche infrarouge permet de contrôler l’action thérapeutique à la fois dans le temps et dans l’espace. Le projet propose l’évaluation d’une thérapie anticancéreuse localisée par échauffement de nanoparticules sous rayonnement électromagnétique non ionisant, (lumière dans le proche infrarouge ou champ magnétique alternatif) en association ou non avec une immunothérapie ou une thérapie ciblée anti-EGFR. Cette évaluation sera réalisée sur un modèle murin après injection sous cutanée de cellules murines de cancer de CCA. L’échauffement de la tumeur sera modulé par la puissance du laser/champ magnétique et réduit aux zones d’accumulation des nanoparticules. On visera une hyperthermie modérée (43°C à 45°C pendant 30 min, répétée 2 ou 3 fois à 24h d’intervalle au moins) de manière à moduler thermiquement le microenvironnement tumoral et le rendre plus permissif aux chimiothérapies. L’évolution de la masse tumorale sera suivie par échographie, modalité qui est intégrée au module d’Imagerie Photoacoustique. L’imagerie permettra un suivi longitudinal de la biodistribution/dégradation/élimination de nanoparticules utilisées, en complément des caractérisations ex vivo. L’objectif final est d’identifier les nanomatériaux de meilleur potentiel thérapeutique associé une biodistribution favorable, biodégradable et sans effet indésirable à long terme. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs. Le développement du modèle (implantation des tumeurs) est réalisé dans un autre centre (établissement 1), les traitements par hyperthermie et le suivi échographique sont réalisé dans notre établissement (établissement 2). Aucun animal n'est ajouté au décompte global du projet.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de développer des stratégies thérapeutiques loco-régionales pour traiter le cholangiocarcinomes qui présentent une toxicité moindre en comparaison aux traitements anticancéreux systémiques. Ce projet pourrait donc permettre d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients en combinant une thérapie loco-régionale et systémique en administrant des doses plus faibles de drogues, réduisant les effets systémiques toxiques secondaires.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de cancers du foie et à leurs traitements. Les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Pour cela, une première partie des animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales ectopiques, sous la peau (injection sous-cutanée sur animal vigile ou anesthésié). Une seconde partie des animaux subiront une injection hydrodynamique (injection intraveineuse animal vigile) de vecteurs plasmidiques afin d’induire une tumeur dans le foie (moins d’une minute). Les animaux seront ensuite impliqués dans différents traitements seul ou en combinaison : traitement par nanohyperthermie sous anesthésie, injection intraveineuse ou intrapéritonéale (1 à 40 minutes maximum selon les traitements). Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale (20 minutes maximum). Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses. Les animaux seront transportés 1 fois de l'établissement 1 vers l'établissement 2 par un transporteur agréé.

Impact sur les animaux

La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet qui vise à trouver des traitements innovants du cholangiocarcinomes. Les traitements mis en œuvre devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possibles effets secondaires mais qui restent très limités (inflammation locale et toxicité hépatique et/ou biliaire). Les animaux seront transportés 1 fois de l'établissement 1 vers l'établissement 2 par un transporteur agréé.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=4032) seront euthanasiés dans notre établissement à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.

Remplacement

Un système vivant est nécessaire pour tester des nouvelles stratégies antitumorales in vivo. C’est un passage obligé demandé par les industries pharmaceutiques ou les compagnies de valorisation (pour dépôt de brevet) avant un éventuel transfert à l’Homme. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la croissance tumorale. L’effet antitumoral et la dégradabilité de nanoparticules utilisées in vivo seront au préalable testés et optimisés in vitro sur des modèles cellulaires 2D ou 3D ou encore dans des milieux mimant l’environnement biologique (remplacer).

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Au total ce projet impliquera 4032 souris immunocompétentes ou immunodéficiences en fonction des questions scientifiques. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. L’utilisation de cette technique d’imagerie non invasive combinée à la mutualisation de tissus pour les caractérisations ex vivo permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude (réduire).

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Ainsi, l’hébergement, les soins et l’ensemble des procédures expérimentales sur les animaux seront effectués dans le respect du bien-être animal avec la définition de points limites au-delà desquels l’expérience sera interrompue (raffiner). Le transport des animaux est réalisé par un transporteur agréé, dans un véhicule adapté et agréé, les animaux diposent d'alimentation et de gel d'eau pendant le transport, et celui-ci est effectué dans la journée.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est le modèle classique des expériences et études en cancérologie ; sa taille et son poids autorisent en outre d’utiliser de faibles quantités de composés cytotoxiques. La disponibilité de souches consanguines exprimant de façon stable des phénotypes immuno-supprimés permet de réaliser des xénogreffes de tumeurs humaines sans avoir recours à une suppression immunitaire iatrogénique. La disponibilité de souris non immunodéprimées permet également de réaliser des greffes syngéniques avec des cellules tumorales de la même espèce permettant ainsi d’étudier le système immunitaire et de tester des drogues anti-tumorales basées sur l’utilisation d’anticorps. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche Athymic Nude-Foxnu. Nous utiliserons également les souris C57BL/6J pour les greffes syngéniques (pour greffer sous la peau des cellules cancéreuses murines) et pour induire une tumeur dans le foie par injection hydrodynamique de vecteurs plasmidiques dans la veine de la queue. Justification du stade : Les animaux sont utilisés au stade adulte (5-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

480 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué et une inflammation ou une infection intestinale induite, avec jeûnes prolongés, gavages, injections, prélèvements sanguins et pose d'une pompe sous la peau, pour étudier si la résistance à l'insuline fragilise la barrière intestinale. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais conclut que la complexité des dialogues entre organes impose le recours à l'animal.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) la sécrétion d’hormones et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinale et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Sur animaux vigiles : 240 animaux: (1 mise a jeun de 16h, 6 à 7 contentions de 45 secondes pour 1 administration orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 2 à 3 injections de produit de 45 secondes), 240 animaux : (1 mise à jeun de 4h, 1 mise a jeun de 16h, 7 à 8 contentions de 45 secondes pour 2 administrations orale de produit, 3 prélèvements de sang (2 caudal de 30 secondes, 1 mandibulaire de 1 minute) et 3 à 9 injections de produit de 45 secondes). Sur animaux anesthésiés : 240 animaux (un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)). 240 animaux (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique (20min par souris) et un prélèvement sanguin (30 secondes par souris)).

Impact sur les animaux

L’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Les souris rendues diabétiques présenteront une augmentation de leur prise hydrique et de leur volume urinaire. Les incisions cutanées chirurgicales peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des bactéries pathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

498 rongeurs, souris et rats, vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du cartilage leur est implantée sous anesthésie, puis suivie par imagerie, la croissance tumorale pouvant perturber la locomotion et l'accès à la nourriture, pour évaluer deux molécules ciblant les macrophages associés aux tumeurs dans le chondrosarcome. Le porteur situe le bénéfice pour les patients à long terme. Il indique que des essais sur cellules ont déjà été menés mais que la culture cellulaire ne reproduit pas la complexité du tissu tumoral, rendant selon lui l'évaluation animale inévitable.

Objectifs

Le chondrosarcome, ou tumeur maligne du cartilage, représente 20 % des tumeurs malignes osseuses et se place en deuxième position, en termes de fréquence, après l’ostéosarcome. Caractérisé par un microenvironnement peu favorable, le chondrosarcome est radio- et chimio-résistant. Actuellement, le seul traitement efficace est la chirurgie. Dans le cadre d’un nouveau projet de recherche, notre unité s’intéresse à la présence de cellules immunitaires dans le tissu tumoral et plus particulièrement aux « macrophages associés aux tumeurs », ou TAMS qui jouent un rôle important dans le développement de la tumeur et la résistance à la chimiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons évaluer l’intérêt de deux molécules ayant un impact sur les TAMs. Les évaluations seront réalisées dans deux modèles de chondrosarcome chez le rongeur (un chez la souris et un chez le rat).

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de juger de la pertinence de stratégies thérapeutiques ciblant les macrophages associés aux tumeurs dans la prise en charge du chondrosarcome pour, à plus long terme, améliorer la prise en charge de cette pathologie chez le patient.

Procédures

Induction du modèle d’étude sous anesthésie. La durée de l'intervention dépend du modèle : 3 à 4 minutes d'anesthésie pour le modèle souris et 10 minutes d'anesthésie pour le modèle rat. Les examens d'imagerie permettant de suivre la volume tumirol se dérouleront sous anesthésie. La durée de l'anesthésie dépendra de l'examen et durera entre 10 minutes et 1h30.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait perturber la locomotion ce qui pourrait gêner la prise de nourriture. Des solutions pourront alors être apportées telles qu’un accès facilité à la nourriture et à la boisson. De plus, les injections répétées des traitements pourraient être à l’origine d’un stress chez les animaux. Pour éviter cela, une période d’habituation sera systématiquement réalisée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en vue des analyses histologiques du tissu tumoral.

Remplacement

Des études préliminaires sur cellules ont déjà été réalisées et les résultats semblent prometteurs. Toutefois, la culture cellulaire ne représente pas totalement la complexité du tissu tumoral. Ainsi, une évaluation chez l’animal est donc inévitable pour juger de façon optimale l’effet des molécules étudiées.

Réduction

Du fait de l’hétérogénéité des tumeurs propre à l’expérimentation chez l’animal, un nombre de 6 animaux par stade a été défini pour les analyses histologique. Ce nombre est le nombre d’animaux minimal permettant une analyse statistique puissante. D’autre part, l’imagerie est une méthode qui permet de réaliser un suivi longitudinal sur un même animal ce qui permet une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, hébergement en groupe pour les souris ou par 2 pour les rats, enrichissement de milieu, surveillance quotidienne). De plus, des injections d’antalgiques pourront être appliqués si besoin.

Choix des espèces

Les rongeurs sont classiquement utilisés en expérimentation animale notamment en cancérologie. L’évaluation des molécules sera réalisée sur un modèle souris et un modèle rat. En ce qui concerne le modèle souris. Il s’agit d’une tumeur d’origine humaine implantée sur un animal immunodéprimé. Des études préliminaires ont été réalisées au sein du laboratoire et ont permis de valider la pertinence du modèle. Pour ce qui est du modèle rat, il s’agit d’une tumeur de rat implanté sur un rat. Ce modèle est largement utilisé dans la littérature pour l’étude du chondrosarcome. Concernant les rats, ils seront commandés à 150 g (3-4 semaines) et les souris à 4 semaines afin de permettre le développement tumoral qui est relativement long (3 à 4 semaines chez le rat, jusqu'à 8 semaines chez la souris).

736 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une amputation de l'extrémité de la queue sert au génotypage, puis un virus est injecté sous anesthésie, un régime gras est imposé douze semaines, avec gavages de glucose, injections d'insuline, sept prélèvements de sang à la queue et trois jours d'isolement en cage calorimétrique, pour étudier le rôle d'un dérivé lipidique du foie dans le diabète de type 2. Le porteur situe les retombées au conditionnel, l'identification de possibles cibles thérapeutiques. Il justifie la souris par le fait que l'homme partagerait 95 % de son génome avec elle et que le diabète de type 2 y serait bien reproductible.

Objectifs

Chez les personnes en bonne santé, l'équilibre entre la production du glucose et son utilisation est finement contrôlé. Lorsque la glycémie atteint un seuil critique, les cellules beta pancréatiques sécrètent de l'insuline qui a pour action de diminuer les concentrations circulantes de glucose en facilitant son stockage, principalement dans le muscle squelettique et le foie, tout en inhibant sa production par le foie. En cas d'obésité, lorsque l'action tampon du tissu adipeux pour stocker les acides gras est altérée, les tissus non adipeux comme les cellules musculaires, hépatiques et beta pancréatiques, accumulent des acides gras et cette accumulation conduit à un phénomène appelé lipotoxicité et finalement au diabète de type 2. Au cours de l'obésité, les acides gras ectopiques accumulés dans les tissus non adipeux sont métabolisés sous forme de dérivés de de dérivés lipidiques spécifiques. Alors que le rôle de certains de ces lipides dans le développement du diabète de type 2 est bien établi, l'effet d'autres sphingolipides dérivés des céramides sur la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. la relation d'autres lipides avec la résistance à l'insuline et le diabète de type 2 n’est pas bien caractérisée. Des études ont montré que ces derniers auraient un effet positif ou négatif sur la lipotoxicité selon les tissus. Les objectifs du projet sont donc au nombre de deux. D'une part, il s'agit d'étudier l'impact de la modulation des concentrations de ces lipides sur les tissus périphériques tels que les tissus adipeux, muscles squelettiques, cœur et cellules bêta pancréatiques au niveau métabolique durant l'obésité. D'autre part, nous essaierons de déterminer l'effet de la modulation des concentrations de ces lipides sur les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement de l'insulino-résistance dans le diabète de type 2.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’ouvrir de nouvelles perspectives pour lutter contre le développement d’une résistance à l’insuline des tissus périphériques en comprenant mieux les mécanismes intracellulaires mis en jeu en réponse à la modulation de certains dérivés lipidiques hépatiques. Ces informations seront précieuses pour contrôler le développement de l’insulinorésistance dans le foie, et donc le diabète de type 2. Elles pourraient permettre notamment l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques, préalable au développement de molécules susceptibles de combattre le diabète de type 2.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions. Les animaux sont pucés dès l’âge d'une semaine et un bout d'extrémité de la queue de moins de 0,5 cm est prélevé entre 7 et 10 jours après la naissance pour génotypage. Une injection intraveineuse d'un virus adénoassocié sous anesthésie durant quelques secondes. La mise en place d’un régime hyperlipidique durant 12 semaines. Un gavage au glucose pour le test de tolérance au glucose sur animal vigil durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d’insuline pour le test de sensibilité à l'insuline sur animal vigil durant quelques secondes. 7 prélèvements sanguins à la queue de 1 à 10 µL sur animal vigil lors des tests de tolréance au glucose et sensibilité à l'insuline durant quelques secondes. Une injection intrapéritonéale d'un mélange d'anesthésique et analgésique pour anesthésie durant quelques secondes. Un isolement de la souris pour mesures calorimétriques individuelles pendant 3 jours. Un placement en tube de contention pour mesure de la masse corporelle qui dure moins de 2 minutes. Les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires en fonction des besoins expérimentaux.

Impact sur les animaux

Le prelèvement d'un bout d'extrémité de la queue pour génotypage peut entrainer une douleur de courte durée. L'anesthésie gazeuse peut entrainer une perte de chaleur et un stress thermique. La mise à jeun des animaux pendant 4 heures lors des tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent être stressant et entrainer une légère faim. Le gavage de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent aussi être stressant à cause de la contention de l'animal. L'injection d'insuline lors du test de tolérance à l'insuline peut induire une douleur de courte durée au niveau de la piqûre de l'aiguille et une hypoglycémie. Le prélèvement du sang à la queue pour mesurer la glycémie des animaux est un geste peu stressant pour l’animal. Une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue peut entrainer un léger inconfort et une douleur de courte durée. Les mesures de masse grasse et maigre par l'analyseur peuvent entrainer un stress lors de la contention de la souris dans le tube de l'appareil. La mise en cages calorimétriques pour 3 jours afin d’évaluer l’apport alimentaire et hydrique ainsi que la consommation métabolique de O2 et production de CO2 peuvent entrainer un stress à cause de l'isolement d'une souris par cage.

Devenir

A l’issue des différents actes, les animaux seront euthanasiés par deux méthodes réglementaires différentes en fonction des analyses à réaliser sur les organes/prélèvements.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les conséquences métaboliques d’une modulation de la concentration hépatique d'un dérivé lipidique chez la souris. Il s’agit d’un projet de physiologie intégré dans lequel tous les organes de régulation de l’homéostasie glucidique sont impliqués. C’est la raison pour laquelle le modèle de souris a été privilégié. Il serait difficile de mener à bien ce projet en utilisant qu’un seul modèle cellulaire car nous pensons que la modulation de la concentration hépatique du dérivé lipidique aura des conséquences intrahépatiques, mais sûrement aussi sur le métabolisme lipidique et glucidique d’autres tissus périphériques tels que les muscles squelettiques, les cellules beta pancréatiques et les tissus adipeux.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre une significativité statistique, nous avons utilisé un programme informatique pour calculer le nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats significatifs d’un point de vue statistique. Nous nous sommes basés sur des résultats obtenus précédemment sur la mesure des variables. De plus, nous utiliserons un test statistique adapté à notre étude pour déterminer si des différences existent entre les groupes des animaux après traitement ou régime. Nous utiliserons 736 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Pour atténuer le stress de la manipulation des souris dans le temps, le même expérimentateur effectue toutes leurs pesées régulières afin que les souris soient familiarisées au même expérimentateur. Quand vient l’heure des injections, nous gardons les animaux dans un environnement calme avec le minimum de personne dans la pièce pour éviter tout stress additionnel et inutile aux souris. Si un animal reste prostré dans sa cage pendant 48h maximum, ou montre une anomalie importante de la qualité du poil on ne le laisse pas souffrir et il est euthanasié. Les animaux sont observés tous les jours, y compris le week-end. Une grille de suivi sera mise en place avec comme contrôle une pesée hebdomadaire des animaux. Pour une souris sous régime normal, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. Idem, pour une souris sous régime gras, une perte de poids de 20 pour cent entre 2 suivis hebdomadaires consécutifs sera considérée comme point limite et entrainera l’euthanasie de la souris. L'injection de virus adénoassocié est réalisée sous anesthésie et analgésie. Durant toute anesthésie, les animaux seront gardés sous une lampe chauffante pour éviter toute perte de chaleur. Des protocoles d’enrichissement de l’environnement de l’animal sont mis en place avec notamment la présence de nids végétaux et de tunnels.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris C57B6J génétiquement modifiées de 6 semaines, âge où les animaux sont sevrés et pubères et sont dans les conditions métaboliques stables. Le fait que l’homme partage 95 pour cent de son génome avec celui de la souris valide l’utilisation de cet animal. De plus, le diabète de type 2 est une pathologie humaine bien reproductible chez la souris.