Recherche fondamentale

1 312 poissons zèbres sur 2 920 vont être tués parce qu'ils ne portent pas le bon génotype, les 1 608 autres étant gardés pour la reproduction, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certains individus issus de douze des trente lignées créées subissent une biopsie de moins de deux minutes, seul geste invasif prévu, suivie d'un isolement de moins de trois jours. Les adultes ne servent qu'à produire des embryons, dont le développement externe permet l'imagerie à haute résolution sur le vivant. Le porteur présente ce modèle comme permettant la transgenèse "sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur", dans un projet qui prévoit la mise à mort de 1 312 poissons au tri génotypique.

Objectifs

Notre projet vise à caractériser les mécanismes gouvernant la mise en place du système olfactif en utilisant le poisson zèbre Danio rerio comme organisme modèle. Afin de pouvoir étudier les cascades moléculaires et génétiques en action au cours du développement de cette structure, il nous faut altérer ou visualiser l'activité de gènes d'intérêt. Nous utilisons la transgénèse et la mutagenèse dirigée pour établir des lignées mutantes ou transgéniques stables. Nos recherches se focalisent sur la mise en place précoce du système olfactif dont les évènements interviennent avant 5 jours de développement embryonnaire. Nous génèrerons 30 nouvelles lignées pour visualiser les étapes précoces de la formation de notre structure d'intérêt et pour analyser le rôle de ces gènes candidats dans la mise en place précoce du système olfactif.

Bénéfices attendus

Le projet nous permettra d’établir de nouvelles lignées transgéniques et mutantes qui nous servirons à mieux comprendre la mise en place de l’organe sensoriel olfactif. De plus ces lignées seront accessibles à toute la communauté scientifique pour comprendre plus largement le rôle des molécules d’adhésion jonctionnelle, d'enzymes ou pour établir un modèle poisson zèbre de développement des neurones dopaminergiques impliqués dans de nombreux processus et pathologies.

Procédures

Certains individus issus de 12 lignées générées, pourront subir une biopsie. Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.

Impact sur les animaux

Les animaux générés par transgénèse seront observés et sélectionnés dès le 1er jour, ainsi toutes malformations du développement seront écartées rapidement. Ils seront suivis journalièrement, afin de détecter le plus précocement possible tous signes de souffrances, et ce sur 2 générations. Les individus issus de certaines lignées mutantes homozygotes, pourront présenter précocement des signes cliniques liés à l'âge. Le prélèvement de tissu invasif peut provoquer un stress lié à la manipulation (quelques secondes) et à l'isolement (

Devenir

Les animaux n'ayant pas le bon génotype seront mis à mort. Les autres animaux seront conservés à des fin de reproduction.

Remplacement

Des recherches ont montré que le poisson zèbre possède 71 pourcents de gènes similaires aux gènes humains parmi lesquels 86 pourcents sont liés à des maladies humaines, cela en fait donc un très bon modèle pour comprendre le développement de l’organe olfactif et la modélisation des maladies humaines. De plus, le fait que les œufs de cette espèce soient transparents et accessibles la rend plus intéressante pour l’injection, le suivis du développement embryonnaire et l’imagerie sur le vivant. C’est pourquoi notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre. L’espèce animale et notamment l’organisme entier utilisé ne peut donc être remplacée. Cela nécessite une approche in vivo sur l’animal.

Réduction

L'équipe s'intéresse uniquement à des processus embryonnaires. Par conséquent, les poissons adultes gardés au laboratoire sont consacrés uniquement à la reproduction et ne sont soumis à aucune expérimentation. Le nombre d'individus hébergés correspond au nombre minimal nécessaire au maintien des lignées et à la production d'œufs nécessaires à notre expérimentation. Nous prenons soin de faire évoluer nos protocoles expérimentaux afin de réduire le nombre d’individus hébergés dans l’animalerie. Notamment, l’amélioration récente de nos techniques de mutagénèse, nous a permis de réduire drastiquement le nombre de fondateurs nécessaires à l’établissement de nouvelles lignées. Nous utilisons les individus hétérozygotes comme "contrôles équivalents" pour avoir dans un même croisement d'individus hétérozygotes tous les génotypes d'intérêt pour nos expérimentations. Enfin, nous pouvons générer des individus adultes porteurs de transgènes et de mutations pour réduire le nombre d'adultes utilisés dans nos expérimentations.

Raffinement

Tout est fait dans ce projet pour que nos adultes soient dans les meilleures conditions pour pouvoir se reproduire afin que nous obtenions nos précieux embryons. De plus, nous utilisons principalement des méthodes non invasives d'imagerie de l'embryon en temps réel sur du vivant pour comprendre la formation de l'organe sensoriel olfactif à l'aide de lignées transgéniques fluorescentes qui marquent le territoire olfactif et les différentes populations cellulaires qui le composent.

Choix des espèces

Notre équipe s’intéresse à comprendre les mécanismes génétiques et morphomètriques régissant la mise en place du système olfactif dont la perturbation peut conduire chez l’Humain à des pathologies allant de la stérilité à l’anosmie. L’utilisation d’une approche in vivo sur un animal vertébré est nécessaire pour comprendre ces processus dynamiques et complexes. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages dont la possibilité de procéder à de l'imagerie « in vivo » à haute résolution grâce à la transparence de ses embryons. Ce modèle, permet également aisément et de façon non-invasive, le recourt à la transgénèse ainsi qu’à la mutagénèse dirigée pour établir les lignées mutantes ou transgéniques stables nécessaires à la dissection des processus moléculaires impliqués. De plus, contrairement, aux autres modèles génétiques vertébrés, les poissons ont un développement embryonnaire externe, ce qui permet d'avoir accès à ses embryons facilement, et surtout sans sacrifier l'animal ni lui infliger de douleur. L'ensemble de nos processus développementaux d'intérêt et donc de nos expérimentations se déroulent entre le stade 1 cellule (oeuf) et 4 jours après la fécondation, stade auquel les larves de poissons zèbre ne sont pas encore autonomes. En effet, la mise en place du système olfactif s'effectue entre 12 heures post fécondation (hpf) et 36hpf. Les adultes sont utilisés uniquement à des fins reproductives.

Sensibilisées au beurre d'arachide puis exposées à l'allergène, 2 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélèvement des intestins, de la rate, des ganglions et du sérum. L'administration intragastrique répétée peut léser l'œsophage et le foie, la réaction allergique provoque diarrhée, douleurs abdominales, hypothermie et perte de poids, et les souris génétiquement modifiées utilisées, dépourvues de défenses immunitaires efficaces, peuvent développer des difficultés respiratoires. Le porteur écarte l'apprentissage d'une prise volontaire de beurre d'arachide, qui éviterait le gavage, au motif qu'il demanderait une phase d'entraînement importante et ne garantirait pas les quantités administrées. La rubrique censée décrire les procédures ne dit rien du protocole de sensibilisation ni du nombre d'expositions, elle recopie la liste des effets indésirables.

Objectifs

L’allergie alimentaire et l’anaphylaxie (réaction allergique généralisée, rapide et potentiellement mortelle) qui peut en résulter représentent un problème majeur de santé publique, en raison de leur sévérité potentielle et de l’augmentation constante de leur prévalence. En Europe, on estime qu’environ 3-6 % des adultes et 6-13 % des enfants sont concernés. L’anaphylaxie induite par l’arachide se caractérise le plus souvent par une atteinte gastro-intestinale (vomissements, diarrhée, douleurs abdominales), associée à des manifestations cutanéo-muqueuses (angio-œdème), respiratoires (bronchospasme) et cardiovasculaires (hypotension), pouvant évoluer vers une perte de conscience et, dans certains cas, conduire au décès après ingestion de l’allergène. Les modèles murins d’allergie alimentaire constituent des outils essentiels pour l’étude des mécanismes de l’anaphylaxie et de la sensibilisation allergique. Afin de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques, il est crucial de caractériser avec précision les déterminants génétiques, moléculaires et cellulaires impliqués dans ces allergies alimentaires. L’objectif de ce projet, est d’établir et caractériser un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide (beurre d'arachide), pour mieux comprendre les mécanismes immunologiques impliqués dans la sensibilisation, la réaction allergique, ainsi que les paramètres physiopathologiques associés. Dans un second temps, ce modèle permettra de tester des candidats médicaments et des stratégies thérapeutiques innovantes afin d’évaluer leur efficacité contre l’allergie à l’arachide. Le projet s’articule en 3 procédures autour des objectifs spécifiques suivants : 1. Mise en place du modèle d’allergie alimentaire: o Établir un protocole reproductible de sensibilisation et de provocation allergique avec des extraits/ou beurre d’arachide o Identifier les doses optimales, les fréquences d’administration et les conditions favorisant une réponse allergique robuste et spécifique à l’arachide. 2. Etude de l’efficacité de composés à visée thérapeutique . 3.Etude des voies de signalisation et caractérisation immunologique du modèle.

Bénéfices attendus

L’allergie alimentaire à l’arachide est l’une des plus sévères et potentiellement mortelles, notamment en raison de son caractère persistant à l’âge adulte et du risque élevé de choc anaphylactique. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif, et la prise en charge repose exclusivement sur l’éviction alimentaire et la gestion des urgences. Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples : • Mieux comprendre les mécanismes immunologiques impliqués dans la sensibilisation et les réactions allergiques à l’arachide. • Disposer d’un modèle animal validé permettant de tester des candidats médicaments, des stratégies d’induction de tolérance, de désensibilisation, ou d’immunothérapie innovante. • Identifier des biomarqueurs prédictifs de la sévérité de l’allergie ou de la réponse au traitement. Ces avancées contribueront à l’amélioration de la prise en charge des patients allergiques, à la réduction des hospitalisations liées aux chocs allergiques, et au développement de thérapies ciblées mieux tolérées.

Procédures

L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire (5x maximum, et 1x/semaine) peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. L'administration intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’oesophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre.

Impact sur les animaux

Ce modèle induit des douleurs inflammatoires à l'animal liées au développement de la pathologie par exemple diarrhée, douleurs abdominales comme chez l’homme. La douleur pourra générer une hypothermie et/ou une perte de poids. L'administration par voie intragastrique peut entraîner chez les animaux des lésions au niveau de l’œsophage et du foie, ainsi qu’un stress important lié à la manipulation répétée. L’administration de traitement par injections répétées pourra provoquer de petits hématomes au niveau du site de la piqûre. La contention de l'animal ainsi que la piqure de l'aiguille pour l'injection des traitements et le prélèvement submandibullaire peuvent induire une douleur légère, de courte durée (quelques secondes) et un stress. LA PERIODE COURTE DE JEÛNE PEUT INDUIRE UN STRESS.Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée (diarrhée, mobilité réduite, difficultés respiratoires), car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin d'effectuer des prélèvements qui permettront d’analyser différents paramètres immunologiques et histologiques nécessaires à la validation du modèle et l’analyse de l’effet des différentes molécules et thérapies testées.

Remplacement

La mise en place d’un modèle murin d’allergie alimentaire à l’arachide implique nécessairement l’utilisation d’un organisme entier. En effet, les mécanismes allergiques requièrent une complexité physiologique et immunologique qui ne peut être reproduite in vitro à ce jour. Néanmoins, une stratégie active de remplacement partiel a été intégrée dans la conception du projet : • Avant de démarrer les phases in vivo, une caractérisation biochimique poussée des extraits /ou beurre d’arachide est effectuée in vitro, afin de valider les lots expérimentaux et limiter les tests sur animaux. • Des cultures cellulaires primaires ou lignées humaines sont utilisées pour tester in vitro la réactivité aux extraits. Ces approches permettent d’optimiser la qualité des extraits et de prédire leur capacité à induire une réponse immunitaire. Cependant, le déclenchement et l’étude fine de la réaction allergique, de l’inflammation intestinale in situ et des paramètres cliniques systémiques nécessitent une approche in vivo. Aucun substitut ne permet actuellement d’évaluer de manière fiable les conséquences physiopathologiques complètes d’une exposition répétée à un allergène alimentaire chez l’humain.

Réduction

Une attention particulière est portée à la réduction du nombre d’animaux utilisés tout au long du projet. Cette réduction repose sur une planification expérimentale rigoureuse, sur l’analyse statistique en amont, et sur l’exploitation optimale des données récoltées. Plusieurs mesures concrètes de réduction sont mises en oeuvre : 1. Tests pilotes préalables : Un petit nombre d’animaux (n=5-10) sera utilisé dans une phase préliminaire pour identifier les doses optimales d’allergène, les modalités de sensibilisation et les fenêtres de provocation les plus pertinentes. Cela évitera les essais multiples à grande échelle. 2. Calcul de puissance statistique : Les effectifs animaux par groupe sont justifiés par une analyse de puissance (power analysis) permettant d’atteindre une significativité statistique avec un minimum d’animaux (généralement 5-10 par groupe selon les variables mesurées). 3. Utilisation de groupes partagés : Certains groupes témoins (souris naïves ou sensibilisées mais non provoquées) peuvent être communs à plusieurs sous-expériences si les conditions restent identiques. Cela limite le nombre total de groupes expérimentaux. 4. Approche longitudinale sur les mêmes individus : Chaque souris est suivie au cours du temps (avant et après sensibilisation, puis provocation), ce qui permet des comparaisons intraindividuelles et donc une meilleure sensibilité statistique, réduisant les besoins d’effectifs supplémentaires. Optimisations des prélèvements par animal : Lors des mises à mort pour toutes les expériences, tous les tissus et fluides biologiques seront récoltés (intestin, rate, ganglions, sérum), permettant d’optimiser les paramètres mesurés. L’ensemble des protocoles est conçu pour limiter le recours aux animaux tout en assurant la validité scientifique.

Raffinement

Le projet intègre de nombreuses mesures de raffinement visant à minimiser la douleur, le stress, et les souffrances potentielles des animaux, tout en améliorant la qualité des données scientifiques obtenues. Les mesures principales ci-dessous listées seront mises en oeuvre: Sélection des méthodes les moins invasives possibles : o La voie intragastrique est privilégiée à la voie intrapéritonéale lorsque possible. o L’utilisation d’aiguilles fines, la réduction du nombre d’injections, et le recours à des formulations douces sont privilégiés. Nous n'envisageons pas de faire un apprentissage d'administration du beurre d'arachide de manière volontaire sans passer par l'administration intragastrique car cela demande une étape d'entrainement importante avant de pourvoir réaliser ce geste et de garantir la quantité prise par administration. Les souris en expérimentation sont observées tous les jours pour identifier d’éventuels effets indésirables et d’éventuels signes de souffrance. MODIFICATION LORS DE LA MISE EN PLACE DE LA COURTE PERIODE DE JEÛNE, LES SOURIS SERONT PLACEES DANS DES CAGES PROPRES AFIN DE LIMIITER LA COPROPHAGIE QUI METTRAIT EN PERIL LA PHASE DE JEÛNE. Nous proposons donc une procédure de suivi utilisant une grille de score avec définition d'un point limite adapté à nos procédures avec mise à mort immédiate. Les souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet pourront présenter un phénotype dommageable du fait de leur sensibilité plus élevée aux infections opportunistes, car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Si nous sommes amenés à en utiliser, elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes manipulations pendant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris s'il y a lieu).

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce la plus pertinente pour ce projet en raison de sa réponse immunitaire bien caractérisée et de sa forte sensibilité aux allergènes alimentaires. Certaines souches de souris sont particulièrement adaptées pour modéliser la sensibilisation à l’arachide et les réactions allergiques. La souris permet une reproductibilité expérimentale élevée, un suivi longitudinal individuel, et offre un accès à de nombreux outils immunologiques et génétiques (anticorps, lignées transgéniques). Les animaux sont utilisés au stade adulte, de 7 à 16 semaines à l'arrivée afin de disposer d’organes avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).

Soumis à une biopsie musculaire sur le flanc gauche, puis à une seconde sur le flanc droit trois semaines plus tard, 25 bars communs vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Entre les deux prélèvements ils sont maintenus en hypoxie constante ou en oxygénation normale, puis placés douze heures dans un tunnel de nage avant la mesure de leur performance. Le porteur affirme qu'il est impossible de remplacer les poissons, seule l'expérimentation permettant selon lui d'observer les réponses physiologiques et comportementales dans des conditions fluctuantes. Tous sont tués à l'issue, pour prélever leurs tissus et déterminer leur sexe.

Objectifs

A cause du changement climatique, les phénomènes hypoxiques, durant lesquels la concentration en oxygène diminue, sont de plus en plus fréquemment rencontrés dans le monde marin, notamment à cause du réchauffement global des océans et des vagues de chaleur. Les poissons présentent des degrés de tolérance variables à l’hypoxie (au manque en oxygène), notamment en fonction de la durée et de l’intensité de ces épisodes hypoxiques. Ce projet a pour objectifs de mesurer les conséquences d’une exposition chronique à l’hypoxie sur le métabolisme énergétique et le comportement du bar commun, et de mesurer comment l’hypoxie affecte la relation entre le métabolisme cellulaire et le comportement de nage des poissons. Grâce à ce projet, les changements du comportement et du métabolisme cellulaire face à différentes conditions environnementales seront mesurés à plusieurs reprises chez les mêmes individus, afin de mesurer l’évolution temporelle des réponses physiologiques et comportementales des organismes. De plus, l’établissement de la relation entre comportement et métabolisme est essentiel pour mieux appréhender les effets du changement climatique à différentes échelles biologiques, et pour mieux prédire les effets futurs des changements globaux sur les organismes aquatiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra tout d’abord de parfaire la technique de la biopsie pour mesurer le métabolisme cellulaire à plusieurs reprises chez les mêmes individus, et ainsi permettre un suivi temporel de chaque individu. Cela permettra au long terme de mettre en place des protocoles expérimentaux pour un suivi du métabolisme énergétique sur des espèces non modèles, comme des espèces sauvages. De plus, l’établissement de profils physiologiques et comportementaux face à l’hypoxie permettra de mieux comprendre les stratégies mises en place par les individus à différentes échelles biologiques pour faire face aux stress environnementaux.

Procédures

Une étude préliminaire permettra de moduler la durée minimale requise pour que la biopsie cicatrise entièrement et pour que le poisson puisse effectuer une performance de nage à la suite de la biopsie. La durée préétablie est fixée à 7 jours post-prélèvement, en se basant sur de la littérature publiée. Les poissons subiront une biopsie musculaire sur le flanc gauche afin d’étudier les réponses des poissons face à cette intervention, et attester de leur bonne récupération et de la bonne cicatrisation de la zone biopsiée, avant d’effectuer une performance de nage. Les poissons inclus dans le projet principal seront marqués sous anesthésie, grâce à l’implantation d’une puce en intramusculaire. Après quoi une première biopsie musculaire sera effectuée après anesthésie sur le flanc gauche de chaque poisson, afin de mesurer leur métabolisme musculaire. Trois semaines plus tard, après que les poissons auront été exposés à différentes conditions environnementales (normoxie [conditions normales en oxygène] ou hypoxie constante [diminution en oxygène]), une deuxième biopsie sur le flanc droit sera effectuée, puis 7 jours plus tard (ce temps de récupération pourra être modulé en fonction des résultats de l’étude préliminaire), la performance de nage des poissons sera mesurée. Les individus seront ensuite mis à mort afin de prélever leurs tissus pour des analyses a posteriori, et afin de déterminer le sexe des poissons.

Impact sur les animaux

A la suite des biopsies, les effets indésirables pourraient être l’apparition d’infections au niveau des zones biopsiées. Une augmentation du stress due à la manipulation des poissons (mise en place dans le tunnel de nage) pourrait également être visible au niveau comportemental (diminution de l’activité, diminution de la prise alimentaire). La fatigue associée à la mesure de la performance de nage est transitoire, d’une durée inférieure à 5 minutes.

Devenir

Tous les individus seront mis à mort afin de collecter leurs tissus pour des analyses a posteriori et déterminer leur sexe.

Remplacement

A l’heure actuelle, il est impossible de remplacer les poissons car seule l’expérimentation sur animaux permet d’étudier les réponses physiologiques et comportementales des organismes dans des conditions environnementales stressantes et fluctuantes. Cette vision, allant de la cellule à l’individu en entier, permet d’étudier de façon globale les interactions complexes entre les différents niveaux biologiques.

Réduction

L’identification de chaque individu permet un suivi individuel et temporel, en limitant ainsi le nombre d’individus requis. Cependant, nous avons gardé un groupe témoin (en conditions normales en oxygène ou normoxie) en plus du groupe expérimental (en hypoxie constante), ce qui permettra d’estimer la part de variabilité au sein des individus au cours du temps dans des conditions contrôles (donc en normoxie).

Raffinement

Toute manipulation des poissons sera faite avec le port de gants. Lors de l’implantation du marqueur, les poissons seront anesthésiés et analgésiés, puis seront replacés individuellement dans leur bassin d’origine après avoir complètement récupéré. Lors de la biopsie au niveau du muscle sur la ligne latérale, le poisson sera placé sur une alèze humide qui recouvrira également sa tête. La plaie sera recouverte d’un pansement hydrorésistant et désinfectant pour limiter les risques de surinfection et améliorer le processus de cicatrisation. Lors de la manipulation des poissons pour la mise en place de la mesure de performance de nage, les poissons recevront une sédation légère au préalable de leur sortie de l’eau, de leur mesure, et de leur placement dans le tunnel de nage. Le temps d’acclimatation dans le tunnel de nage sera ensuite de 12h avant le début de la mesure de la performance de nage. Le tunnel de nage sera placé dans une salle spécifique sans passage afin de limiter les nuisances sonores, et il sera recouvert d’une bâche noire afin de limiter les nuisances visuelles pendant la période d’acclimatation mais aussi durant la mesure de la performance de nage et pendant la récupération suivant la mesure. Avant d’être replacé dans leur bassin d’origine après la mesure de performance de nage, les poissons récupèreront durant 2h dans le tunnel à une vitesse réduite de courant (0,5 longueurs de corps par seconde). Tout au long du projet, les poissons seront surveillés quotidiennement afin de vérifier des changements potentiels de leur comportement, indices de leur bien-être (activité, alimentation, poids).

Choix des espèces

Le bar commun est une espèce emblématique de la côte Atlantique française, qui est essentielle sur les plans écologique et économique. Comprendre les réponses métaboliques et comportementales du bar face à des variations de la disponibilité en oxygène permettra de mieux caractériser sa résilience face à ces stress environnementaux. Les animaux seront étudiés au stade jeune adulte, avec une taille adaptée aux tunnels de nage que nous avons à disposition aux laboratoires.

Gavées quotidiennement pendant 42 jours avec un retardateur de flamme, ou injectées au douzième jour de gestation avec un médicament de référence, 30 rattes ouvrent ce projet qui utilise 362 rats au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Leurs 300 petits subissent des tests d'activité de 72 heures, d'anxiété de 10 minutes et d'interactions sociales de 30 minutes, puis une séance d'imagerie cérébrale sous anesthésie après injection d'un traceur radioactif, avant d'être tués à 10, 21 ou 80 jours pour prélèvement des tissus. Les portées de plus de dix ratons sont réduites, les surnuméraires étant tirés au sort puis placés dans une autre portée ou tués. Les 32 rats du test de sociabilité et les 30 mères restent en vie et pourront être réaffectés à d'autres projets.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique se caractérisent par des difficultés de communication et des comportements répétitifs. La génétique n'explique que 25 % des cas, ce qui suggère que des facteurs environnementaux, comme les polluants chimiques, jouent un rôle important. Les retardateurs de flamme sont identifiés comme substances préoccupantes en raison de leurs effets toxiques pour le cerveau. Des recherches précédentes ont montré que l'exposition à un de ces polluants pendant la gestation et la lactation provoque des comportements autistiques et des altérations cérébrales chez les jeunes rats, comparables à celles observées dans un modèle d’autisme induit par un médicament utilisé comme modèle de référence. Ces dommages comprennent une inflammation du cerveau et des changements dans la façon dont les cellules nerveuses communiquent entre elles. Pour étudier plus en détail ces effets, ce projet visera à utiliser une technique d'imagerie chez des jeunes rats exposés à ce polluant ou au médicament de référence. Un traceur sera utilisé pour mesurer l'activité métabolique du cerveau afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux associés à ces troubles. Des prélèvements seront effectués à plusieurs âges afin de suivre l’évolution de cette activité et de l’inflammation au cours de la maturation cérébrale et de l’installation des comportements de type autistique. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs, l’animalerie 1/2 sera en charge de la mise en place du modèle animal et l’animalerie 2/2 de l’imagerie cérébrale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre les effets d’un polluant chimique sur le développement du cerveau. Il permettra d’identifier, à l’échelle du cerveau entier, les régions et les fonctions cérébrales pouvant être altérées après une exposition, ainsi que les liens possibles entre ces différentes modifications. Les connaissances obtenues contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans les Troubles du Spectre Autistique. À plus long terme, ces résultats pourront soutenir la mise en place de mesures de prévention adaptées, en particulier pour les populations les plus vulnérables telles que les femmes enceintes et les jeunes enfants.

Procédures

Femelles gestantes : Administration quotidienne par gavage (1 minute) du polluant ou de l’huile servant de contrôle pendant 42 jours, couvrant les périodes de gestation et de lactation. Injection (30 secondes) du médicament de référence induisant des troubles du spectre autistique ou du contrôle (eau injectable) une seule fois au 12ème jour de gestation. Descendants : La réalisation des tests comportementaux pour évaluer les niveaux d’activité (1 fois, 72 heures), d’anxiété (1 fois, 10 minutes) et d’interactions sociales (1 fois, 30 minutes). Imagerie cérébrale : Une séance d'imagerie cérébrale sous anesthésie (1 fois, 30 minutes) après administration d’un traceur radioactif (1 fois, 5 minutes d’anesthésie), pour mesurer l’activité métabolique cérébrale.

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables attendus sont les suivants : Pour les femelles gestantes : La piqure d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale du médicament de référence entraine un stress physique mineur et une douleur légère de courte durée (1 fois). L’administration du polluant par gavage (42 fois) et l’habituation à la technique (7 fois) entraine un stress physique mineur de courte durée. Pour les descendants : L’existence d’un phénotype comportemental de type autistique entraine un risque d’anxiété accru. - La réalisation des tests comportementaux (3 tests) entraine un stress physique mineur. - L’anesthésie entraine une stress physique mineur de courte durée et un risque léger d’hypothermie. - La mise à jeun des animaux avant les imageries entraine un risque d’hypoglycémie.

Devenir

En cas de portées trop nombreuses (supérieures à 10 ratons), celles-ci seront réduites en plaçant des ratons surnuméraires tirés au sort dans d’autres portées d’effectifs plus faibles (< 10) ou en les euthanasiant. Dans ce cas, les tissus seront prélevés pour des analyses. L’ensemble des rats nés dans cette étude (300) sera euthanasié à 10, 21 ou 80 jours de vie pour analyses des tissus. Enfin les 32 rats ayant participé aux tests de sociabilité ainsi que les femelles ayant servi à la reproduction (30) seront maintenus en vie et pourront être réaffectés à d’autres projets.

Remplacement

L'utilisation d'animaux est essentielle pour reproduire la complexité des Troubles du Spectre Autistique observés chez l'Homme. Le modèle d’autisme utilisé dans ce projet est reconnu et validé chez les rongeurs, il permet de créer des troubles comportementaux et cérébraux similaires à ceux observés chez l'Homme. Les deux modèles qui seront utilisés (celui exposé au polluant objet de l’étude et le modèle de référence des troubles du spectre autistique) permettront d’utiliser l'imagerie cérébrale pour étudier les effets d'un polluant et comprendre le lien avec le développement de l’autisme. Cette imagerie nécessite l'étude de l'activité cérébrale d'animaux vivants.

Réduction

Compte-tenu des objectifs de l’étude (développement de Troubles du Spectre Autistique chez la descendance par exposition maternelle à un polluant), la portée doit être considérée comme l’unité statistique. Le nombre d’animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, ce projet inclura un total de 30 rat femelles gestantes ainsi que leurs descendants. Chaque portée sera limitée à 10 ratons, soit 300 jeunes. À ce nombre il convient d’ajouter 32 rats (16 femelles et 16 mâles) qui seront utilisés dans le test de sociabilité. Ce protocole impliquera donc au total 362 animaux. Parmi ces animaux, 54 réaliseront des tests comportementaux puis 37 réaliseront les analyses d’imagerie. Les autres ratons des portées seront utilisés pour prélever des tissus et réaliser des analyses ultérieures.

Raffinement

Dans l’EU1/2, les femelles gestantes et allaitantes seront hébergées avec leurs petits jusqu'à 21 jours après la naissance. Ensuite, les jeunes rats resteront ensemble sans leur mère entre 21 et 28 jours pour maintenir leurs liens sociaux. À 28 jours, les rats seront séparés par sexe. Les tests comportementaux seront effectués durant la nuit, période d'activité naturelle des rats. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être en accord avec une grille de score adaptée, et manipulés par un personnel entraîné afin de réduire le stress. À 50 jours, les rats seront transportés dans des cages prévues à cet effet vers l'animalerie de la plateforme d'imagerie EU2/2, et hébergés avec des conditions similaires à leur habitat précédent pour minimiser les perturbations. Les examens d’imagerie seront réalisés sous anesthésie générale, en suivant des protocoles rigoureux adaptés à chaque animal. Le radiotraceur sera injecté par du personnel qualifié, avec des doses précises. Pendant l’imagerie, l'anesthésie sera surveillée en temps réel pour assurer la sécurité des animaux. Après la procédure, les rats seront surveillés attentivement dans un environnement calme pour une récupération rapide et sans complications. Après la décroissance de la radioactivité, les animaux seront transportés dans des cages prévues à cet effet pour retourner dans l’EU1/2.

Choix des espèces

Les caractéristiques comportementales du rat, en particulier du point de vue du comportement social font que cette espèce est à privilégier pour l’étude du comportement et l’induction des modèles de Troubles du Spectre Autistique par le médicament de référence ou l’exposition au polluant. Les femelles pour la reproduction seront utilisées au même stade de maturité (11–12 semaines) que dans les études antérieures, afin d’assurer la comparabilité des résultats. Les descendants seront étudiés à différents stades : 10, 21 et 80 jours après la naissance. L’évaluation des modifications métaboliques au moyen de la technique d’imagerie cérébrale aura lieu à 60 jours de vie postnatale. Les âges postnataux de 10 et 21 jours ont été choisis car ils correspondent à une période clé du développement cérébral chez les rongeurs, marquée par une forte formation de connexions entre les neurones, juste avant leur réorganisation autour de 21 jours. La période de 60 à 80 jours correspond quant à elle à une période où les comportements de type autistique sont pleinement établis.

Capturés à l'épuisette, anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour être génotypés, 124 poissons médaka juvéniles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 74 d'entre eux et modéré pour 50. Les femelles ainsi triées passent jusqu'à trente heures immergées dans une solution contenant un marqueur de division cellulaire, ce qui peut modifier leur nage, leur ventilation et leur prise alimentaire. Tous les poissons seront tués, une cinquantaine de femelles pour que leurs ovaires soient prélevés et fixés. Le porteur écrit n'avoir besoin que de dix femelles pour l'analyse finale, les autres poissons étant utilisés pour la mise au point des conditions et pour le tri par sexe.

Objectifs

Chez les poissons femelles, les ovaires produisent des ovocytes (cellules reproductrices femelles) tout au long de la vie. Ces ovocytes se développent à partir de cellules précoces regroupées dans des zones spécifiques de l’ovaire, où elles se multiplient puis se transforment progressivement en ovocytes. Cependant, la manière dont ces cellules se divisent et contribuent à la formation des ovocytes reste encore mal comprise. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre comment ces cellules se multiplient dans l’ovaire du poisson médaka. L’étude sera réalisée chez de jeunes poissons, à un stade où l’organisation de l’ovaire commence à être visible. Le médaka est un modèle largement utilisé pour étudier la reproduction chez les poissons.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment fonctionne l’ovaire chez les poissons femelles médaka et comment leur capacité à produire des ovules est maintenue tout au long de la vie. En étudiant la division des cellules reproductrices dans l’ovaire à un stade précoce du développement, ce travail permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes à l’origine de la reproduction continue chez les poissons. Le poisson médaka est un modèle particulièrement adapté pour ce type d’étude, car il permet d’observer ces phénomènes directement dans un organisme vivant. Les résultats obtenus contribueront ainsi à une meilleure compréhension générale de la biologie de la reproduction chez les vertébrés. Par ailleurs, la reproduction est un élément clé de l’élevage des poissons. La capacité des femelles à produire des ovules en quantité et en qualité suffisantes conditionne directement le succès de l’aquaculture. En améliorant les connaissances sur le fonctionnement de l’ovaire et sur la production d’ovules chez les poissons femelles, ce projet pourra, à terme, contribuer à une meilleure maîtrise de la reproduction des espèces élevées, et ainsi présenter un intérêt pour des espèces d’importance en aquaculture.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à deux types d’interventions. La première consiste en un prélèvement très limité de nageoire caudale réalisé lors du génotypage, afin d'identifier les femelles nécessaires à l'étude. Cette procédure sera effectuée sur 124 poissons vivants, sous anesthésie générale, et sera de très courte durée (environ 2 minutes par poisson). La seconde intervention correspond au prélèvement des ovaires chez environ 50 femelles, après une immersion de 30 heures maximum dans une solution contenant un marqueur de la division cellulaire, suivie d’une euthanasie réalisée conformément à la réglementation en vigueur. Ces prélèvements permettront d'analyser l'activité proliférative au sein du tissu ovarien.

Impact sur les animaux

D’après les données disponibles dans la littérature, notamment chez le médaka à des stades juvéniles comparables, aucune altération majeure de l’état général ou du comportement n’a été rapportée suite à ce type de traitement. Toutefois, cette procédure peut être associée à certains effets indésirables : - ceux liés au stress de la manipulation lors de la capture à l’épuisette des poissons, qui est très rapide ; - ceux liés au prélèvement de nageoire caudale effectué lors du génotypage afin de sélectionner uniquement les femelles. Ce prélèvement, d’une surface inférieure à 2 mm2, sera réalisé sous anesthésie ; - ceux liés à l’exposition temporaire au composé dans l’environnement aquatique. Les nuisances attendues correspondent principalement à un stress aigu pouvant s’accompagner de modifications comportementales transitoires (activité locomotrice, ventilatoire, prise alimentaire, …). Ces effets resteront limités dans le temps et ne devraient pas excéder la période d’exposition (maximum 30h). Les poissons seront surveillés régulièrement tout au long des procédures, et toute anomalie comportementale ou signe de souffrance entraînera l’arrêt immédiat de la procédure pour les poissons concernés. Aucun effet pathologique tardif ou durable n’est attendu, les poissons étant euthanasiés rapidement après la balnéation, aussi bien lors des phases de mise au point que lors de l’expérimentation finale

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement et la fixation des tissus pour les analyses prévues.

Remplacement

L’objectif du projet est d’étudier la prolifération des cellules germinales ovariennes dans un organe fonctionnel et intact. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant de reproduire de manière pertinente l’organisation tridimensionnelle de l’ovaire, les interactions entre cellules germinales et cellules somatiques, ainsi que les régulations systémiques impliquées dans l’activité ovarienne. Les approches in vitro ne permettant pas de réaliser l’analyse de la prolifération dans des conditions physiologiques, l’utilisation d’animaux vivants est donc indispensable pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre de poissons utilisés dans ce projet sera limité au strict nécessaire. Lors de la phase préalable de mise au point, une expérience pilote, suivie si nécessaire de quelques essais supplémentaires permettant d’optimiser les conditions de balnéation avec un marqueur de la division cellulaire, sera réalisée sur des lots de taille réduite (n=8 femelles obtenues à partir du sexage de n=20 poissons par condition testée). Les conditions expérimentales retenues à l’issue de cette optimisation seront ensuite appliquées, dans une seconde phase, à un seul lot de poissons (n=10 femelles obtenues à partir du sexage de n=24 poissons), destiné à l’analyse de la prolifération des cellules germinales ovariennes. Cet effectif est justifié par le retour d’expérience de l’équipe en imagerie 3D de l’ovaire, montrant qu’en raison de la variabilité interindividuelle observée, un effectif d’au moins 10 femelles est nécessaire pour obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Concernant le sexage des poissons par génotypage, le prélèvement de nageoire caudale sera effectué sous anesthésie générale afin de limiter la douleur et le stress liés à la manipulation. Les manipulations seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, en limitant au maximum la durée de contention des animaux. Pour l’étude de la prolifération des cellules reproductrice de l’ovaire, un marquage par balnéation avec un marqueur de la division cellulaire sera utilisé. Cette méthode, peu invasive, permet un marquage systémique des cellules en division. Les conditions expérimentales seront établies à partir de protocoles déjà décrits dans la littérature chez des médaka juvéniles dans des conditions comparables, pour lesquels aucune altération majeure de l’état général des poissons n’a été rapportée. Les poissons seront régulièrement surveillés pendant la balnéation, et toute anomalie comportementale entraînera l’arrêt immédiat de la manipulation pour les poissons concernés. Des points limites adaptés seront appliqués tout au long du protocole. Tout poisson présentant des signes persistants de détresse ou d’altération de l’état général, tels qu’un déséquilibre de nage, une perte de réactivité, une hyperventilation, une altération marquée du comportement ou de l’alimentation, sera immédiatement euthanasié. Enfin, à l’issue de la balnéation, les poissons seront rapidement euthanasiés afin de permettre le prélèvement des ovaires pour les analyses prévues.

Choix des espèces

Le poisson médaka est un modèle couramment utilisé pour l’étude de la reproduction chez les poissons. Sa petite taille, sa reproduction régulière et la bonne connaissance de sa biologie en font une espèce particulièrement adaptée à l’étude du fonctionnement de l’ovaire. Les conditions d’élevage de cette espèce sont bien maîtrisées au sein des installations, ce qui permet de travailler dans des conditions stables et de limiter le nombre d’animaux nécessaires Les animaux seront utilisés à un stade juvénile d’environ 50 jours après la fécondation. À ce stade, les structures ovariennes sont suffisamment développées pour permettre l’étude de la multiplication des cellules reproductrices.