Recherche fondamentale

À 11 semaines commencent les tests, répétés toutes les cinq semaines pendant dix mois : réflexes visuels sur écrans, imagerie de l'œil, équilibre sur barre rotative, force de préhension sur grille, activité en cage individuelle, suspension par la queue. 48 souris porteuses d'une mutation reproduisant une maladie neurodégénérative infantile sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir de huit mois elles perdent la vue et la capacité de se déplacer, et le porteur arrête le protocole à dix mois, âge auquel il indique que les animaux deviennent trop atteints pour passer les tests. Toutes sont tuées pour prélever les tissus.

Objectifs

Ce projet porte sur l’étude d’une maladie rare et grave du cerveau qui touche de jeunes enfants. Les enfants atteints commencent à perdre leurs capacités motrices (comme marcher ou tenir des objets), leurs capacités visuelles, puis leurs capacités intellectuelles, dès l’âge de deux ans. Ils décèdent souvent avant l’âge de dix ans, car il n’existe pas encore de traitement pour traiter cette maladie. La maladie est causée par une modification d'un gène, qui fabrique une protéine entrant dans la composition du lysosome, un organite qui évacue les déchets des cellules. Quand ce système ne fonctionne plus, des déchets s’accumulent dans les cellules, ce qui les abîme, en particulier dans le cerveau. Pour mieux comprendre comment cette maladie évolue et pourquoi elle provoque ces dégâts, nous voulons étudier une souris porteuse d’une version similaire de la maladie. Cette souris, encore jamais décrite dans les publications scientifiques, présente les mêmes symptômes que les enfants malades : elle perd peu à peu ses capacités à bouger, ses capacités visuelles et ses capacités cognitives et nerveuses, puis meurt prématurément. Nous allons notamment observer son comportement et sa vision, afin de mieux comprendre le développement de la maladie. Les tests réalisés seront : une évaluation des réflexes visuels à l’aide d’écrans, un test ophtalmique avec une imagerie de l’œil, un test d’équilibre avec une barre rotative, un test de force et de préhension à l’aide d’une grille, une observation de l’activité dans une cage individuelle et un test neurologique par suspension par la queue. Ce travail fait suite à une première étude qui s’était intéressée à ce qui se passe dans les cellules et qui avait commencé à tester une première piste de traitement en laboratoire.

Bénéfices attendus

Cette étude va nous aider à mieux comprendre cette maladie rare (la céroïde lipofuscinose neuronale de type 7) chez la souris. Après avoir testé en laboratoire un traitement Invitro (sur des cellules porteuses de cette maladie), nous voulons maintenant observer comment les symptômes apparaissent et évoluent chez les animaux. Cela nous aidera à savoir à quel moment il serait le plus efficace de commencer un traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une batterie de tests de comportement et de vision non invasif durant 10 mois. Une série de tests s’étalant sur deux semaines sera répété toutes les 5 semaines afin d’évaluer la progression de la maladie. La série de tests est adaptée, au cours du temps, à la progression attendue de la maladie. Un test de vision sera effectué une fois à l'âge de 20 semaines nécessitant une anesthésie par injection et l'application d'un collyre afin de dilater la pupille. Les tests comportementaux que subiront les animaux sont : un test d'évaluation de la vision (20 min, 2 fois), un test de force (15 min, 5 fois), un test de coordination (15 min, 4 fois), un test neurologique (1 min, 5 fois), un test d'activité (2h, 5 fois). Lorsque plusieurs tests sont prévus la même semaine, un temps de repos d’un minimum de 24 heures entre les tests sera prévu afin de permettre à l’animal de récupérer et d’obtenir des résultats fiables. MODIFICATION: Une biopsie d’oreille (ear punch) sera pratiquée à l’aide d’un puncher (outil adapté et spécifiquement conçu pour cette opération). Cette biopsie est nécessaire afin de vérifier le génotypage (caractérisation génétique) des animaux du projet.

Impact sur les animaux

L'accumulation des tests de comportement pourrait induire un stress léger. Un léger stress des animaux pourra résulter de l'anesthésie ainsi que des deux injections nécessaires à celle-ci. MODIFICATION: La biopsie d'oreille est réalisé sur animal vigile et peut produire une douleur. Le geste est rapide et ne produit pas de douleur persistante.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de collecter les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une première étude a été réalisée sur des cellules de souris de la lipofuscinose céroide neuronale de type 7 pour étudier cette maladie et tester une possibilité de traitement. Cependant, l'étude présente a pour objectif l'observation des modifications du comportement, l'apparition de symptômes, ne peuvent être réalisé que sur un organisme complet. Le modèle murin est idéal pour étudier l’impact d'une maladie neurodégénérative chez les mammifères en raison de leur similarité biologique avec l’humain et de leur développement rapide.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Notre étude étant réalisé sur des animaux développant un phénotype dommageable à partir de 8 mois, un tableau de suivi sera mis en place à ce moment pour tous les animaux. Ce tableau établit un score sur base de paramètre tel que la perte de poids, l'apparence physique, le comportement à distance et le comportement à la manipulation. Selon les résultats des scores, les animaux pourront être retirés de l'étude voir être euthanasiés selon l'état d'avancement des symptômes observés. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Les animaux disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris comme modèle d'étude est particulièrement pertinente en raison de sa similitude génétique avec l'humain, de la possibilité de manipulations génétiques précises et de son utilisation largement validée dans la recherche sur les maladies neurodégénérative telle que celle de ce projet mais aussi Alzheimer par exemple. Le modèle murin de lipofuscinose céroïde neuronale avec lequel nous avons choisi de travailler récapitule assez bien les phénotypes observés dans la pathologie humaine. Les symptômes de la maladie (baisse de la vision, paralysie progressive) apparaissent tout le long de la vie de l'animal jusqu'à 11 mois d'âge, âge auquel les animaux sont trop atteints pour les tests expérimentaux. L'étude commencera à 11 semaines d'âge, âge auquel les animaux ont une taille suffisante pour passer les tests de comportement. Elle se prolongera jusqu'à 10 mois car l'apparition des symptômes de paralysie commencent vers 8 mois et se terminera à 10 mois soit avant que les symptômes ne soient trop importants pour le bien-être des animaux.

Dépourvues de poils et immunodéficientes, les souris nude sont retenues parce que leur peau réagit plus fort et s'observe sans obstacle. 24 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un gel est appliqué sur leur dos cinq fois par semaine pendant 28 à 56 jours, avec cinq prélèvements de sang sous la mâchoire sur animal vigile, et le porteur annonce des démangeaisons et de petites plaies superficielles. Toutes sont tuées pour analyser la peau et les organes, l'absence d'effet indésirable chez ces souris devant constituer un "indicateur rassurant" sur la sécurité de la formulation.

Objectifs

Les traitements anticancéreux ciblés bloquent certaines voies cellulaires essentielles à la croissance tumorale. Leur inhibition a permis des progrès importants dans plusieurs cancers, mais ces mêmes voies sont indispensables au bon fonctionnement de la peau. Leur blocage fragilise les cellules cutanées, entraînant rougeurs, sécheresse, démangeaisons ou lésions, parfois assez sévères pour nécessiter une réduction ou une interruption du traitement. Un anticorps récent, utilisé dans certains cancers du poumon accentue ces effets en perturbant deux voies essentielles à la fois. Les solutions actuelles (hydratants, anti‑inflammatoires, antibiotiques en cas de surinfection) soulagent surtout les symptômes sans agir sur la cause biologique, d’où une efficacité limitée. Le projet vise à restaurer localement l’activité d'une voie spécifique grâce à un gel contenant un composé capable de l’activer. Déjà utilisé en cancérologie sous une autre forme, ce composé pourrait aider la peau à fonctionner normalement sans réduire l’efficacité du traitement anticancéreux général. Cette approche innovante cherche à corriger la cause des lésions cutanées, afin de réduire les réactions, améliorer le confort et éviter les interruptions de traitement. L’objectif est d’évaluer la tolérance cutanée de cette nouvelle formulation en application répétée. Il faut vérifier qu’elle n’entraîne ni irritation, ni altération progressive de la peau, ni effet général indésirable. L’étude sera menée chez des souris dépourvues de poils (« nude »), permettant une observation précise de la peau. Le gel sera appliqué pendant 28 à 56 jours pour simuler un usage prolongé. Une évaluation finale vérifiera l’absence de toxicité locale ou générale. En résumé, ce projet doit déterminer si une application locale d’un composé connu peut protéger la peau des effets secondaires des thérapies ciblées et faciliter la poursuite des traitements anticancéreux.

Bénéfices attendus

Sur le plan clinique, la mise au point d’une formulation topique efficace pourrait améliorer significativement la qualité de vie des patients sous thérapies en réduisant la sévérité des toxicités cutanées. Elle permettrait également de maintenir une bonne adhésion au traitement tout en limitant les interruptions de traitement. Celle-ci offrirait une alternative thérapeutique ciblée, sûre, adaptée au circuit hospitalier avec un potentiel de transfert rapide en préparations magistrales. À terme, ce développement pourrait s’inscrire dans une stratégie standardisée de prise en charge des effets secondaires cutanés des thérapies ciblées, notamment dans les centres de lutte contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis uniquement aux interventions suivantes : Application topique du gel ou Application du gel placebo, 5 fois/semaine pendant 28 à 56 jours (20–40 sec, vigile). L’animal est maintenu brièvement pour exposer la zone dorsale. . – Mesure de l’épaisseur cutanée si nécessaire (moins de 1 min, vigile). 4. Prélèvements sanguins Réalisation de 5 prélèvements (J0, J7, J14, J28, J42). Durée : 1–2 min par prélèvement. Conditions : animal vigile avec anesthésie locale (lidocaïne 5 min avant la ponction). Voie : sous mandibulaire (≤ 7,5 % du volume sanguin total par semaine).

Impact sur les animaux

La réalisation de tests pharmacologiques peut engendrer plusieurs types de nuisances pour les souris, principalement liées à l’administration des traitements. Le suivi implique des manipulations hebdomadaires, pouvant induire un stress léger à modéré, particulièrement lors des premières manipulations. Une habituation progressive est toutefois généralement observée, réduisant cet impact au fil du temps. L’administration des traitements (par voie cutané) est susceptible de provoquer un inconfort temporaire, associé à une douleur légère à modérée. Au cours de l’étude, une perte de poids légère à modérée peut être observée, généralement inférieure à 15 %, constituant un indicateur indirect d’un état de mal-être transitoire. Enfin, des effets secondaires tels que des démangeaisons cutanées ou l’apparition de petites plaies superficielles peuvent survenir, occasionnant un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur les tissus cutanés.

Remplacement

Les expériences préliminaires ont été entièrement réalisées in vitro, notamment à l’aide de modèles cellulaires et de tissus cutanés reconstruits. Toutefois, la poursuite du projet nécessite une validation sur un organisme vivant complet, pour plusieurs raisons essentielles. La peau est un organe hautement complexe, dont la réponse dépend d’interactions dynamiques entre les cellules épidermiques, le derme, le système vasculaire, les mécanismes inflammatoires, ainsi que les phénomènes de réparation tissulaire. Ces interactions ne peuvent pas être reproduites intégralement in vitro. Les modèles animaux permettent de recueillir des informations indispensables sur la tolérance cutanée, la réactivité inflammatoire, la diffusion locale de la formulation, et d’éventuels effets systémiques, éléments impossibles à évaluer correctement sur des modèles cellulaires seuls. De plus, l’application topique chronique doit être étudiée dans un organisme vivant afin de tenir compte : • de la variabilité biologique interindividuelle, • du microenvironnement cutané réel, • des mécanismes intégrés de cicatrisation, • et des interactions entre organes et systèmes physiologiques, notamment dans les réponses au stress tissulaire. Ainsi, bien que les méthodes in vitro aient été utilisées au maximum pour réduire le recours à l’animal, la phase actuelle du projet nécessite une validation in vivo afin d’assurer la pertinence, la robustesse et la sécurité des résultats dans un contexte biologique complet.

Réduction

En amont de cette étude, nous avons optimisé la formulation de l’encorafénib par des approches alternatives à l’expérimentation animale. La solubilisation, la diffusion cutanée et l’efficacité ont été évaluées à l’aide de cellules de Franz, d’explants de peau et de modèles d’épithélium reconstruit. À l’issue de ces expérimentations, deux formulations topiques d’encorafénib ont été retenues sous forme de gel à différentes concentrations. Un gel placebo sera également préparé et utilisé comme contrôle négatif. Afin d’optimiser l’utilisation des souris tout en garantissant une rigueur scientifique, nous avons affiné nos calculs statistiques. Chaque groupe expérimental comprendra 8 souris, un nombre déterminé par une analyse de puissance, permettant de détecter une toxicité. À la fin de chaque étude, des prélèvements de peau et d’organes seront effectués pour des analyses approfondies (notamment protéomiques). Grâce à cette combinaison de modèles in vitro et à l’optimisation des protocoles expérimentaux, nous réduisons significativement le nombre d’animaux utilisés, tout en maintenant la fiabilité et la pertinence des résultats obtenus.

Raffinement

Après l'arrivée des souris, elles sont mises en quarantaine pendant une semaine afin de s'habituer à leur nouvel environnement. Le poids des souris est également suivi afin de détecter les signes précoces de souffrance. Si une souris perd 10 % de son poids initial, du diet gel est ajouté dans sa cage. Si la perte de poids dépasse 15 %, le traitement est automatiquement interrompu jusqu'à ce qu'elle récupère. Durant cette période d'observation, nous vérifions leur alimentation, leur posture et leur comportement général afin de détecter tout signe de détresse. Des points limites précoces ont été definis et seront strictement appliqués. Si une souris semble souffrir, elle recevra un médicament contre la douleur et on vérifiera son alimentation. Un enrichissement des conditions d’hébergement est effectué en ajoutant dans les cages d’animaux des accessoires (cachettes et des matériaux pour construire un nid…) afin de réduire le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité à l‘animal. Ces améliorations de vie permettent aux souris de conserver des comportements naturels, et de bien-être dans ce type d'hébergement.

Choix des espèces

L’étude sera conduite chez des souris nude. Celles-ci ont été choisies en raison de l’absence de pilosité qui va faciliter l’application des formulations topiques et l’évaluation directe des effets cutanés. De plus, leur statut immunodéficient en fait un modèle particulièrement sensible pour l’évaluation de la tolérance cutanée. Ainsi, l’absence d’effets indésirables observés chez ces animaux constituerait un indicateur rassurant concernant la sécurité des formulations étudiées. Des souris âgées de 5 à 9 semaines seront utilisées pour standardiser la procédure et ainsi réduire la variabilité intra-expérience. Par ailleurs, l’utilisation de souris âgées de 5 à 9 semaines permet d’améliorer le taux de prise des greffes.

Des femelles gestantes reçoivent une injection, leurs nouveau-nés sont gavés deux fois puis biopsiés de la queue entre le cinquième et le onzième jour pour repérer une mutation, et à quatre semaines trois gavages supplémentaires suivent. À l'âge adulte viennent cinq prélèvements de sang, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. 520 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le porteur signale des ulcérations au point d'injection, une perte de mobilité des membres postérieurs, des raideurs de la patte et un essoufflement pour certains lots. Toutes sont tuées à la fin du projet pour analyse post-mortem, le porteur affirmant que la culture cellulaire ne reproduit pas fidèlement le fonctionnement des ganglions lymphatiques.

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré (MODIFICATION DEBUT : notamment la différenciation des fibroblastes, cellules structurantes du ganglion. FIN MODIFICATION). Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. MODIFICATION DEBUT : 3 gavages sur souris vigile de 4 semaines (durée moins d’une minute), soit un gavage par jour tous les 2 jours. FIN MODIFICATION. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. MODIFICATION DEBUT : Une nouvelle lignée de souris génétiquement modifiée sera utilisée pour étudier le rôle des fibroblastes, cellules structurantes du ganglion. FIN MODIFICATION. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.

Jusqu'à deux heures d'IRM sous anesthésie par semaine, plus une échographie de vingt à trente minutes, pour chacune des 368 souris suivies en imagerie. 408 souris au total portent une tumeur osseuse greffée dans la patte arrière et vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser la tumeur. Elles reçoivent jusqu'à six injections de chimiothérapie, d'immunothérapie, d'anti-angiogénique ou de sérum salé sur animal éveillé, et sont transportées entre deux établissements. Le porteur annonce une gêne à la marche quand la tumeur grossit, des difficultés respiratoires en cas de métastases pulmonaires, et compte sur ces images pour repérer plus tôt, chez les patients, les traitements qui ne fonctionnent pas.

Objectifs

L’ostéosarcome est un cancer des os rare mais agressif, qui survient principalement chez les enfants et les jeunes adultes. Malgré des traitements lourds (chimiothérapie, chirurgie), les options thérapeutiques n’ont que peu évolué depuis 50 ans. Aujourd’hui, il est crucial de trouver des moyens pour détecter plus tôt si un traitement fonctionne ou non, afin d’éviter des thérapies inefficaces et d’adapter rapidement la prise en charge. Ce projet a pour but d’évaluer si des techniques d’imagerie non invasives (échographie et IRM) peuvent aider à suivre l’évolution des tumeurs d’ostéosarcome en temps réel. Ces examens permettraient d’évaluer des changements dans la microstructure de la tumeur (taille, vascularisation, rigidité) et d’identifier des signes précoces de résistance aux traitements. L’objectif final est d’améliorer la prise en charge des patients en personnalisant les thérapies selon la réponse de leur tumeur. L’étude utilisera des modèles expérimentaux de tumeurs chez la souris, ce qui permet de contrôler et de reproduire les expériences avant d’envisager des essais cliniques chez l’humain. Les mesures d’imagerie seront comparées à des analyses réalisées après l’expérience sur les tissus, afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance aux traitements. L’objectif de ce projet est donc de suivre l’évolution d’un ostéosarcome chez la souris au cours du temps et d’évaluer la réponse à différents traitements à l’aide de techniques d’imagerie non invasive. L’étude vise à mieux comprendre la dynamique tumorale et à identifier des marqueurs précoces de réponse, tout en limitant le recours à des mises à mort intermédiaires. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont doubles : 1. Pour les patients : Actuellement, il faut attendre plusieurs semaines et réaliser des biopsies ou des chirurgies pour savoir si un traitement contre l’ostéosarcome est efficace. Grâce à ces nouvelles méthodes d’imagerie, les médecins pourraient détecter en quelques jours si une tumeur répond au traitement, et ainsi adapter la thérapie plus rapidement pour chaque patient. 2. Pour la recherche : En comprenant mieux comment la résistance aux traitements se développe, ce projet pourrait aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et à concevoir des stratégies pour contourner cette résistance. À terme, cette approche pourrait réduire la durée des traitements inefficaces, améliorer la qualité de vie des patients, et augmenter leurs chances de guérison.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Implantation tumorale : 408 souris recevront une injection sous-cutanée de cellules tumorales dans la patte arrière, sous anesthésie générale à l’isoflurane. L’injection dure environ 10 à 20 secondes ; la durée totale d’anesthésie est d’environ 5 à 10 minutes. Cette intervention est réalisée une seule fois par animal. Traitements expérimentaux : Les 408 souris recevront des injections de traitement (chimiothérapie, immunothérapie, anti-angiogénique ou solution saline), administrées par voie intrapéritonéale (IP) ou intraveineuse (IV), au maximum 2 fois par semaine pendant la durée de l’étude (jusqu’à 3 semaines, soit un maximum de 6 injections par animal). Chaque injection dure environ 10 à 30 secondes. Les injections sont réalisées sur animaux vigiles par du personnel qualifié, selon des techniques limitant le stress et l’inconfort. Examens d’imagerie : Parmi ces animaux, 368 souris bénéficieront d’examens d’imagerie pour le suivi tumoral. • Échographie : réalisée sous anesthésie générale, durée 20 à 30 minutes, au maximum une fois par semaine. • IRM : réalisée sous anesthésie générale, durée 60 à 120 minutes selon les séquences acquises, au maximum 1 fois par semaine. Chaque séance d’imagerie comprend l’induction anesthésique, l’examen et le réveil surveillé (ou anesthésie sans réveil lorsque requis par l’analyse séquentielle). Surveillance : Les 408 souris feront l’objet d’un suivi au minimum deux fois par semaine (poids, comportement, état général), renforcé si nécessaire. Chaque observation dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Pour cette étude, des souris développeront une tumeur osseuse au niveau de la patte, afin de reproduire les caractéristiques de l’ostéosarcome humain. Les animaux pourront ressentir : Un inconfort et un stress temporaire lors de l’implantation de la tumeur, réalisé sous anesthésie et des manipulations pour le suivi de la pousse tumorale et les injections de traitements. Les procédures d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées et prolongées, pouvant entraîner une fatigue temporaire. L’injection de certains agents de contraste peut provoquer un léger inconfort, mais ces substances sont rapidement éliminées par l’organisme et ne présentent pas de risque durable. Un stress léger lié aux manipulations régulières (pesées, mesures de la tumeur) et aux examens d’imagerie, qui nécessitent une anesthésie gazeuse. Une gêne à la marche si la tumeur grossit, mais des aménagements (nourriture accessible, cages adaptées) seront mis en place pour leur bien-être. Les animaux peuvent également être exposés à un stress environnemental, lié au transport entre les installations et aux manipulations pour les mesures et pesées régulières. Dans certains cas rares, l’apparition de métastases pulmonaires pourrait provoquer des difficultés respiratoires.

Devenir

À la fin de l’étude, tous les animaux seront mis à mort de manière indolore. Cette étape est indispensable pour pouvoir analyser précisément la tumeur. Les tissus prélevés après le décès permettront d’étudier en détail les effets des traitements au niveau biologique. Ces résultats seront comparés aux images obtenues pendant l’étude (échographie et IRM) afin de mieux comprendre l’évolution de la tumeur et l’efficacité des traitements.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, des études ont été réalisées uniquement sur des cellules cultivées en laboratoire, en deux et trois dimensions. Ces expériences ont permis de développer et tester les méthodes d’imagerie et d’identifier les paramètres les plus importants pour analyser les tumeurs. Ces travaux in vitro ont ainsi remplacé de nombreuses expérimentations animales exploratoires, réduisant le nombre d’animaux nécessaires. Cependant, les modèles cellulaires ne reproduisent pas la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant : ils ne possèdent pas de vaisseaux sanguins fonctionnels, d’interactions avec le système immunitaire ni l’organisation complète des tissus. Or, ces éléments sont essentiels pour mesurer correctement les paramètres d’imagerie envisagés dans ce projet. Pour que les méthodes d’imagerie soient pertinentes et applicables au suivi thérapeutique chez l’humain, il est donc nécessaire de les valider dans un modèle animal vivant, reproduisant fidèlement la physiologie tumorale. Ainsi, bien qu’aucune alternative complète ne permette de remplacer l’expérimentation animale, cette approche progressive permet de limiter le nombre d’animaux utilisés et d’optimiser leur utilisation. Cette stratégie respecte le principe de remplacement en expérimentant d’abord sur des modèles in vitro avant de passer à l’in vivo.

Réduction

Des études préliminaires sur des cellules en laboratoire ont permis de différer l’utilisation des animaux et de réduire leur nombre au strict nécessaire. Ces travaux ont aidé à définir précisément les paramètres à étudier, de sorte que seules les questions ne pouvant pas être résolues autrement soient testées chez l’animal. Le nombre d’animaux a été fixé pour garantir des résultats fiables tout en restant le minimum nécessaire pour évaluer l’intérêt des techniques d’imagerie utilisées. Le projet utilise un modèle tumoral déjà étudié en culture cellulaire, ce qui permet de cibler les expériences in vivo et d’éviter des ajustements ultérieurs susceptibles d’augmenter le nombre d’animaux. Ce projet est organisé de manière séquentielle ce qui permet d’observer l’évolution des tumeurs à différents moments au sein d’un même groupe, sans multiplier les groupes expérimentaux. Les résultats des premières étapes sont utilisés pour ajuster les étapes suivantes, limitant ainsi la duplication des expériences. Les tissus prélevés seront analysés pour plusieurs paramètres, maximisant l’information obtenue par animal.

Raffinement

La nourriture des animaux sera facilement accessible, notamment déposée au fond des cages si des difficultés de déplacement sont observées. Le protocole d’injection des tumeurs et d’imagerie est réalisé sous anesthésie générale avec analgésie adaptée, en utilisant les techniques les moins invasives possibles afin de réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort. Le suivi des animaux est régulier et cinétique, basé sur des critères précis (poids, mobilité, comportement, respiration, tumeur) permettant de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir avant l’apparition de complications avancées, telles que les métastases pulmonaires. Si nécessaire, le protocole sera arrêté et l’animal mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Les examens d’imagerie se déroulent également sous anesthésie, avec surveillance continue de l’état général et de la respiration. La température corporelle est maintenue à l’aide de dispositifs adaptés pour assurer une récupération optimale (tapis ou lit chauffant). En cas d’anesthésies prolongées, des mesures de soutien, comme la réhydratation et une surveillance renforcée pendant le réveil, seront mises en place.

Choix des espèces

Le modèle d'ostéosarcome établi chez des souris immunocompétentes est décrit depuis plus de 10 ans, et ses caractéristiques (implantation, évolution, réponse à la chimiothérapie) sont bien connues. Les ostéosarcomes sont particulièrement résistants aux traitements conventionnels. Il est donc important de pouvoir valider de manière précoce si une thérapie est efficace ou non afin d’en changer si besoin. Le modèle d’ostéosarcome murin utilisé est obtenu par greffe de cellules murines chez des souris immunocompétentes. L’évolution de ce modèle et sa réponse à des thérapies conventionnelles sont bien connues. De plus, nous avons une bonne maîtrise de ce modèle et une première validation ex vivo des mesures de paramètres ultrasonores liés à la microstructure. Les souris utilisées auront 5 semaines. C’est l’âge minimal pour effectuer les greffes. Les traitements commencent 10 jours après la greffe et se poursuivent pendant 3 semaines à raison de 2 traitements par semaine ce qui amène les animaux à un âge de 12 semaines maximum

Pour mettre au point un modèle de migraine déclenchée par le stress, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent deux heures par jour immobilisées dans un tube, trois jours de suite, puis reçoivent sous la peau une injection d'une molécule qui déclenche la crise. La douleur de la tête est mesurée en piquant le visage avec des filaments semi-rigides, deux fois par semaine jusqu'à ce que la sensibilité revienne à la normale, et jusqu'à cinq prélèvements de sang sont faits à la queue sur animal éveillé. Le porteur qualifie ce stress de "modéré et temporaire, soigneusement contrôlé dans le temps", et prévoit de tuer l'animal en dernier recours si un antalgique ne suffit pas.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer et valider un modèle chez la souris permettant de mieux comprendre la migraine. Ce modèle cherche à reproduire un phénomène observé chez les patients : après un épisode de stress ou une première crise, le système nerveux devient plus sensible, ce qui peut favoriser le déclenchement de nouvelles crises, même en réponse à des stimuli habituellement sans effet. Plus précisément, ce projet vise à déterminer si un stress modéré mais répété peut entraîner cette augmentation durable de la sensibilité, et si l’administration ultérieure d’une faible dose d’une molécule impliquée dans la migraine, peut déclencher des signes caractéristiques d’une crise. L’étude permettra également d’évaluer les effets du stress sur la sensibilité à la douleur au niveau de la tête ainsi que sur certains comportements liés à l’anxiété. Le développement de ce modèle constitue une étape importante pour mieux comprendre les mécanismes de la migraine et, à terme, identifier de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet permettra de développer et valider un modèle expérimental chez la souris, plus proche de ce qui est observé chez les patients migraineux. Ce modèle aidera à mieux comprendre comment un stress modéré peut rendre le système nerveux plus sensible et favoriser l’apparition de crises de migraine. À moyen terme, ce modèle constituera un outil important pour étudier les mécanismes biologiques impliqués dans la migraine, ainsi que les circuits du cerveau impliqués dans la perception et la modulation de la douleur. À plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait contribuer au développement de nouvelles approches thérapeutiques et à l’identification de nouvelles cibles pour le traitement, afin de proposer des alternatives aux patients qui ne répondent pas aux traitements actuels.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 5 : Stress modéré : les animaux seront placés dans des tubes adaptés qui leur permettent de respirer normalement et d’éviter toute blessure. Chaque séance durera 2 heures et sera répétée pendant trois jours consécutifs. Mesure de la sensibilité à la douleur au niveau de la tête : cette évaluation sera réalisée avant le stress, après chaque séance, le lendemain, puis deux fois par semaine jusqu’à ce que la sensibilité revienne à la normale. Chaque mesure dure environ 30 minutes. Injection sous-cutanée d’une molécule capable de déclencher une crise de migraine ou d’une solution contrôle : chaque injection prend moins de 2 minutes. Prélèvements sanguins : réalisés au niveau de la veine de la queue, ces prélèvements permettent de prélever le sang plusieurs fois (jusqu’à 5 fois) sur des animaux vigiles, mis en contention dans des tubes adaptés. Prélèvement vaginal : sera réalisé le jour de l'injection de la molécule déclenchant une migraine. Il se fera sous anesthésie gazeuse, et durera moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur survient après l’injection mais n’empêche pas l’animal de se déplacer normalement. Lors des tests de sensibilité avec des filaments semi rigides, l’animal retire sa tête ou son visage, ce qui indique une douleur modérée. L’animal peut éviter cette stimulation car il n’est pas immobilisé, et chaque stimulation dure moins de 3 secondes. Le protocole de stress induit un stress modéré et temporaire, soigneusement contrôlé dans le temps. Cette procédure est courte et conçue pour minimiser au maximum l’inconfort des animaux.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation de souris afin de développer et valider un modèle réaliste de migraine. Les mécanismes étudiés, notamment la façon dont le cerveau devient plus sensible après un stress et comment certaines molécules peuvent déclencher des crises, ne peuvent pas être reproduits avec des modèles informatiques ou des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable pour obtenir des résultats fiables et pertinents.

Réduction

Le nombre de souris dans chaque groupe a été déterminé grâce à des calculs statistiques afin d’obtenir des résultats fiables, tout en utilisant le moins d’animaux possible. Ces calculs tiennent compte du niveau de certitude souhaité pour les résultats et s’appuient aussi sur nos expériences précédentes et sur la variabilité habituellement observée dans ce type d’étude. L’étude sera réalisée sur des souris mâles et femelles. Chez les femelles, les différentes phases du cycle hormonal seront prises en compte pour vérifier si elles influencent les résultats. Si l’on observe que les résultats sont similaires entre mâles et femelles et que le cycle hormonal n’a pas d’effet, les données pourront être regroupées. Cela permettra de réduire le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront hébergées dans des cages enrichies avec des matériaux pour faire leur nid, par petits groupes de cinq. Elles auront accès librement à la nourriture et à l’eau. Les cages seront maintenues dans une animalerie où la température et l’humidité sont contrôlées, et la litière sera changée une fois par semaine. Si une souris devient agressive envers les autres, elle sera placée seule pour éviter les blessures. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de vérifier leur état général et leur comportement (par exemple l’aspect du pelage, la posture ou une éventuelle agitation). Une attention particulière sera portée à l’apparition de signes inhabituels afin de détecter rapidement toute atteinte au bien-être des animaux et d’adapter leur prise en charge si nécessaire. Si un animal présente des signes de douleur pendant l’expérience, un médicament antalgique sera administré pour la soulager. Si son état ne s’améliore pas, la vétérinaire responsable sera consultée. En dernier recours, si l’état de l’animal ne s’améliore pas malgré les soins, il sera mis à mort selon une procédure adaptée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Nous utilisons des souris, une espèce largement utilisée en neurosciences et dans les études sur la douleur. Leur cerveau et leurs circuits nerveux sont suffisamment similaires à ceux des humains pour permettre l’étude de la vulnérabilité aux crises de migraine. Cette souche peut également être modifiée par des techniques génétiques ou virales, ce qui est utile pour notre projet. Les animaux auront entre 7 et 12 semaines, un âge correspondant à l’état adulte chez la souris.