Recherche fondamentale

Infectées par voie intranasale sous anesthésie avec des souches mutantes de Mycobacterium bovis, l'agent de la tuberculose bovine, les souris reçoivent aussi une puce télémétrique et subissent une prise de sang chaque semaine. 264 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes, afin de préciser le rôle de trois gènes de virulence de la bactérie. Le porteur part de groupes de 24 souris pour en garder 6 au dernier jour, les autres étant mises à mort au fil du protocole quand elles atteignent les points limites, en général entre J21 et J35, avec perte de poids rapide et prostration. Il annonce une mise à mort "dès l'apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite", sans chiffrer ce seuil.

Objectifs

La tuberculose bovine est une pathologie majeure en santé animale. L'espèce mycobactérienne adaptée aux animaux, Mycobacterium bovis (Mb), est le principal agent pathogène responsable de la tuberculose bovine en Europe et au Royaume-Uni. C'est un pathogène zoonotique multi-hôtes capable d'infecter les ruminants (bovins, caprins, ovins), la faune sauvage et l'homme. Les programmes de surveillance et d’éradication, basés sur des campagnes de tests et l'abattage systématiques des bovins réactifs, n'ont pas permis d'éradiquer la tuberculose bovine (bTB). La bTB représente donc un risque direct pour les économies agricoles, la santé animale et humaine et la biodiversité dans les pays touchés. Il existe une hétérogénéité dans la réponse immunitaire de l'hôte à l'infection par Mb, ce qui influence directement le risque de transmission par les bovins infectés et la faune sauvage. Une meilleure compréhension des interactions hôte-pathogènes lors des infections à Mb est essentielle pour développer de nouvelles approches visant à éradiquer la tuberculose bovine. Le projet a pour objectif de comprendre comment Mb interagit avec le système immunitaire de l’hôte et comment cette bactérie module la progression et la transmission de la maladie. Pour cela, nous souhaitons identifier les gènes de Mb essentiel pour sa persistance et sa dissémination. Pour cela nous souhaitons i) Comparer la virulence de mutants de Mb (ii) Suivre la réponse immunitaire et le développement du granulome en réponse aux différents mutants.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous mettrons au point pour la première fois la vidéosurveillance d’animaux infectés en isolateur pour raffiner nos points limites (détection plus précoce de comportements). La validation du matériel, son installation, et de la méthode d’analyse permettra de proposer ce suivi pour nos prochains projets. Les résultats permettront de caractériser le rôle de 3 gènes de virulence pour la physiopathologie et la dissémination de Mb. Enfin, nous nous attacherons à une description exhaustive des réponses immunitaires chez les animaux infectés par les différentes souches.

Procédures

Pose de la puce d’identification et télémétrique : 1 fois et 1min/animal. Anesthésie par administration médicamenteuse par voie intrapéritonéale + infection par voie intranasale : 1 fois et 15 min/animal. Prise de sang : 1 fois par semaine et 3 min/animal/prélèvement. Pesée : bi hebdomadaire et 1min/pesée/animal. Les prises de sang peuvent engendrer un hématome et la contention peut engendrer du stress pour l’animal.

Impact sur les animaux

Une légère douleur localisée et un léger mal-être pendant quelques secondes après l’injection de la puce d’identification pourraient être observés. Nous savons par expérience que les souris sont sensibles aux infections mycobactériennes. Ces animaux sont plus susceptibles d'atteindre les points limites lors d'infections avec la souche M.bovis de référence. Nous pourrons observer une perte de poids assez rapide associée à une prostration des animaux. Afin d'assurer un bon suivi de ces animaux, une grille d'évaluation de bien-être des animaux a été mise en place basée sur une observation quotidienne et une pesée bi-hebdomadaire.

Devenir

L'ensemble des animaux du projet seront euthanasiés à la fin du protocole afin de permettre le prélèvement post mortem des organes (poumons, foie, rate, cerveau, ganglion médiastinal) et fluides biologiques (sang, urine et fèces). Ces prélèvements nous permettront d'effectuer l'ensemble des analyses souhaitées comme l'analyse de charge bactérienne, des lésions, du recrutement cellulaire ou de la sécrétion de médiateurs biochimiques.

Remplacement

A ce jour, aucun système in vitro ne permet de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants a été réalisé. Pour les données mesurées que ce soit le recrutement cellulaire, cytokines secrétées, nous obtenons une puissance de test pour un effectif de 6 animaux de 87% pour un test statisitique. Pour obtenir un groupe de 6 souris au dernier jour du protocole, nous savons qu’il nous faut partir d’un groupe de 24 animaux. En effet, tous les animaux ne réagissent pas pareil à l’infection, certains la contrôlent en formant des granulomes pulmonaires matures (25% des animaux), et les autres doivent être sacrifiés au fur et à mesure du protocole car ils atteignent les points limites (entre J21 et J35 classiquement). Chez ces animaux sensibles, des lésions désorganisées sont observables dans le poumon. En résumé, nos protocoles comprennent 24 souris, nous analysons les réponses immunitaires de deux groupes : les animaux résistants (5-6 souris) et sensibles (18-19 souris). Nous utilisons des souris consanguines dont la variabilité génétique est très faible. Nous utilisons des tests statistiques non paramétriques spécialement conçus pour comparer des groupes de petits effectifs. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène).

Raffinement

Les animaux seront élevés en communauté dans des cages enrichies avec du papier essuie tout, tunnel carton. Des visites des animaliers seront quotidiennes et la vidéosurveillance sera mise en place pour mieux suivre les souris. Les animaux seront 6 par cage de 530 cm2. Nous réduisons, et limitons au maximum l'inconfort, la douleur, pouvant être subie par les animaux. les animaux seront habitués en amont à la cellule d’expérimentation, une semaine avant le début de l’expérimentation Pour cela les animaux sont anesthésiés lors des infections et leur état général est suivi tout le long de l’expérimentation (poids, prostration…). Ainsi les animaux sont euthanasiés dès l’apparition des premiers signes de souffrance comme définis par le point limite. Après chaque prise de sang, une récompense positive alimentaire de type bouchée fruités ou rondelle de banane séchée ou popcorn sera réalisée.

Choix des espèces

Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser la complexité de la réponse immunitaire d'un organisme entier. De plus, les modèles murins d'infections mycobactériennes sont très bien établis et permettent de mimer la physiopathologie observée chez l'homme et le bovin. De plus le modèle murin permet une manipulation en animalerie A3 et nous avons à notre disposition de nombreux outils pour cette espèce. Le modèle murin nous offre la possibilité d’utiliser des souris génétiquement modifiées pour les voies de signalisation ou cytokines impliquées dans les réactions immunitaires. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 semaines (sexe indifférent). Pour ce projet, il nous faut des animaux ayant un système mature compétent pour cela il nous faut des animaux adultes mais pas trop âgées. De plus nous utilisons un modèle validé par la communauté scientifique.

288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Placées dans un dispositif générant des ondes 5G, elles subissent des dépilations et des anesthésies générales répétées pour des mesures cutanées, dont une exposition de la patte à une chaleur montant jusqu'à 44 degrés, afin d'évaluer l'effet des ondes de 3,5 et 26 GHz sur la peau saine et vieillissante. Le porteur qualifie les techniques de non invasives et indolores, la principale nuisance étant le risque de détresse respiratoire lié à la répétition des anesthésies. Il situe l'étude dans un contexte où "les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants" et où les autorités "souhaitent une mise en œuvre rapide".

Objectifs

La téléphonie mobile est en perpétuelle évolution pour répondre à une demande croissante des usagers. La cinquième génération (5G) d’infrastructures de communication est en phase de déploiement en France malgré un certain nombre de questions auxquelles la communauté scientifique tarde à apporter des réponses. Alors que la bande de 26 GHz couvrira les besoins de communication pour les objets connectés, ou des « hot spots » à très haut débit (arrêt de bus, quai de métro …), c’est la bande de fréquence autour de 3,5 GHz qui assurera la couverture en téléphonie mobile 5G (contre 2,6 GHz pour la 4G). L’effet sur les systèmes biologiques de ces fréquences de 3,5 GHz reste très mal connu et il n’est pas possible d’extrapoler de façon rigoureuse les résultats d’études scientifiques menées dans d’autres gammes de fréquence. L’augmentation de fréquence lors du passage de la téléphonie 4G à la 5G pourrait en théorie moduler d’éventuels effets biologiques. En effet, si la pénétration de l’onde dans les tissus est d’autant plus superficielle que sa fréquence est élevée, la puissance associée à l’onde augmente avec sa fréquence. Il est donc nécessaire d’évaluer précisément les conséquences biologiques d’une augmentation de fréquence sur les tissus exposés. Il est nécessaire d’étudier les effets des ondes électromagnétiques (OEMs) sur la peau, premier organe touché par les stress environnementaux et dont la fonction barrière est essentielle au maintien de l’intégrité de l’organisme. De plus, pour les fréquences à partir de quelques GHz, l’énergie des OEMs est presque entièrement absorbée dans les premières couches cutanées, notamment dans l’épiderme, et pénètre très peu en profondeur. Les données ne sont pas non plus suffisantes pour conclure à l’existence ou non d’effets sanitaires dans la bande de 26 GHz, aucune donnée d’exposition n’étant disponible à ce jour car les applications de type objets connectés sont encore à l’état de projet. L’objectif de ce projet est d’étudier les conséquences sur la peau d’une exposition chronique aux OEMs de 3,5 GHz, associée à une exposition ponctuelle aux OEMs de 26 GHz afin de mimer la situation que pourront rencontrer les populations utilisant la téléphonie mobile 5G dans leur vie quotidienne ainsi que, plus ponctuellement, des objets connectés dans leur vie professionnelle ou des stationnements sous la couverture de « hot spots ».

Bénéfices attendus

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’impact de l’exposition aux OEMs 5G dans la population générale, y compris chez des personnes dont la peau est fragilisée par le vieillissement, ce qui représente une part importante et croissante de la population française. Les enjeux commerciaux et financiers de la 5G sont importants et les autorités souhaitent une mise en œuvre rapide pour offrir des débits bien supérieurs à ceux actuellement disponibles avec le réseau 4G. Dans un contexte général de grande défiance des populations vis-à-vis des nouvelles technologies et d’inquiétude concernant leur potentiel impact sur la santé, l’attente de la société est forte envers les experts. Nous devons donc répondre à l’attente des populations en évaluant de façon rigoureuse et avec des modèles pertinents les effets biologiques de ces nouvelles fréquences. Il est donc d’un grand intérêt à la fois scientifique et de santé publique d’étudier les effets des OEMs, en particulier dans la gamme de fréquences de la 5G.

Procédures

Après une période d’acclimatation d’une semaine minimum dans une cage standard avec un enrichissement adapté à leurs besoins, les souris seront hébergées en groupe à l’intérieur d’un dispositif capable de générer des ondes de type 5G. Une période d’habituation à leur nouvel environnement (dispositif éteint sans ondes) sera ajustée à l’âge des souris (1 semaine minimum). Pour étudier les effets des ondes sur la peau, une dépilation de la partie basse du dos sera réalisée sous anesthésie générale induite par un gaz (1 à 3 min) 1 à 3 jours précédant les mesures fonctionnelles nécessitant une nouvelle anesthésie générale (anesthésie par injection pour une durée de 30 à 45 min). Afin de limiter le nombre d’animaux, ces 2 anesthésies consécutives seront répétées une deuxième fois pour dépiler à nouveau la zone si besoin et réaliser une 2ème série de mesures en respectant un minimum de 3 semaines entre les deux séries de mesures. L’anesthésie générale par injection (30-45 min) permettra de prélever du microbiote cutané en frottant un écouvillon sur les faces interne et externe des 2 oreilles (moins de 1 min/oreille) puis de réaliser séquentiellement des mesures non invasives pour évaluer la fonction barrière (moins de 1 min), les propriétés viscoélastiques (moins de 1 min), la perfusion sanguine (moins de 2 min) et la capacité des vaisseaux à se dilater en réponse à l’application locale d’une drogue vasodilatatrice (20 à 30 min) de la peau au niveau du dos. En même temps que la mesure vasculaire au niveau dos, une autre mesure vasculaire sera réalisée lors d’une exposition à une chaleur croissante (33 à 44°C ; +1°C/minute) au niveau d’un coussinet arrière pour évaluer les capacités de thermorégulation. Toutes les techniques utilisées sont indolores ; elles sont également utilisées chez l’homme. Afin de comparer l’effet des OEMs de type 5G sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, nous étudierons des souris à l’âge jeune (15 mois). La principale nuisance est liée à la répétition d’anesthésies générales, qui pourrait augmenter le risque de détresse respiratoire au réveil. Pour cela, chaque souris aura au maximum 2 séries qui nécessitent 1 anesthésie à l'isoflurane (dépilation environ 2 min) et 1 au thiopental (mesures fonctionnelles 45 min au maximum). Les deux anesthésies au thiopental seront espacées au minimum de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Toutes les techniques envisagées sont non invasives et utilisées dans les études cliniques. Aucune douleur n’est attendue. Sous anesthésie générale, l’exposition à un chauffage local (augmentation de la température de la peau de 33 à 44°C à +1°C/min) sur 1 coussinet (patte arrière) ne représente pas de nuisances particulières d’après notre expérience. Les souris prévues dans cette étude ne sont pas des souris transgéniques (pas de phénotype dommageable). Au cours du vieillissement, les souris peuvent perdre du poids et baisser leur température interne. Ces deux paramètres seront suivis au minimum 1 fois par semaine pour les souris âgées de 15 mois et plus.

Devenir

Mise à mort. En effet, plusieurs prélèvements terminaux seront réalisés à différentes durées d’exposition pour permettre des analyses tissulaires et moléculaires approfondies.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier les effets des OEMs sur plusieurs aspects fonctionnels de la peau (fonction barrière, fonction vasculaire, propriétés viscoélastiques), il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire l’intégrité fonctionnelle dans un modèle de peau in vitro, en particulier la réactivité vasculaire cutanée qui repose sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires.

Réduction

Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 288 afin d'étudier 16 souris à 3 types d'expositions, des 2 sexes, à 3 âges différents. Ce nombre maximal inclut la possibilité d’étudier un âge intermédiaire. L’étude débutera en comparant les effets des OEMs entre les souris âgées et les souris jeunes. En absence de différences, les souris d’âge intermédiaire ne seront pas utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux, 5 mesures (4 sur le dos et 1 sur une patte arrière) seront réalisées au cours d’une seule anesthésie et 2 séries de mesures par souris. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques adaptés aux petits groupes pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures. Nos expériences précédentes nous ont amené à conclure que 8 mesures au minimum étaient nécessaires pour chaque phase étudiée.

Raffinement

Une période d’habituation à leur changement d’environnement lié au dispositif qui va générer les ondes 5G sera respectée et adaptée en fonction de l’âge des souris (1 sem pour les souris jeunes, 2 sem pour les souris matures, et 3 sem pour les souris âgées). Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées 3 fois par semaine au minimum et pesées une fois par mois avant 15 mois puis plus régulièrement pour les animaux vieillissants (pesée et mesure de la température rectale hebdomadaires). Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Toutes les interventions et les mesures sur la peau seront réalisées sous anesthésie générale.

Choix des espèces

La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste largement utilisée pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède en effet une physiologie cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes approches techniques (laser Doppler, iontophorèse) ainsi que les autres explorations cutanées (propriétés viscoélastiques, perte insensible en eau, perfusion sanguine, microbiote), tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 10 semaines lorsque leur système sensoriel et vasculaire est développé. Afin d’étudier l’impact des OEMs sur la peau saine ou fragilisée par le vieillissement chronologique, les souris seront utilisées à 3 âges différents : à l’âge jeune (15 mois). La durée maximale de la procédure sera de 20 semaines, et l’âge des souris les plus âgées ne dépassera pas 22 mois en fin de procédure.

144 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à vingt-trois instillations intranasales d'allergène sous anesthésie et deux injections intra-péritonéales, avant des mesures respiratoires par trachéotomie, pour tester si le blocage d'une enzyme du métabolisme des acides gras réduit le remodelage bronchique dans un modèle d'asthme chronique. Le porteur indique que la sensibilisation peut provoquer une inflammation des voies respiratoires et une dyspnée. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution du remodelage bronchique et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique à un moment où tous les signes de l’asthme sont bien développés peut réduire les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.

Bénéfices attendus

Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis aux vingt-trois (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement).

Devenir

L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. Il est bien que l'asthme bronchique chez l’homme est une maladie multifactorielle, où les facteurs génétiques, l'âge, les conditions environnementales, l'ontogenèse et l'anamnèse de la maladie jouent un rôle important. Le contrôle de ces facteurs dans nos expériences avec des souris de laboratoire nous permettra de révéler l'effet physiologique réel du blocage du métabolisme des acides gras sur le développement des symptômes de la maladie. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Chez une partie des souris de chaque groupe, les paramètres du système respiratoire seront mesurés par pléthysmographie invasive. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce à la pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Dans la deuxième partie des souris de chaque groupe, nous étudierons les processus inflammatoires dans le lavage broncho-alvéolaire (BAL). Dans ce but, nous avons besoin 6 souris dans chaque groupe. Le nombre de souris à inclure a été réduit au maximum selon les tests statistiques définis.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes souris âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

1 824 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale puis un enregistrement de l'activité neuronale, de l'imagerie calcique et de l'optogénétique pendant une tâche comportementale opposant actions dirigées et habituelles, avant prélèvement du cerveau. Le porteur cite la chirurgie, l'euthanasie et l'isolement en cage individuelle comme sources de souffrance, sans détailler le contenu des tests comportementaux. La rubrique réduction avance 912 souris et 16 par groupe, chiffre inférieur au total de 1 824 déclaré, et présente ces travaux comme une étape "indispensable" contre la toxicomanie et les troubles compulsifs.

Objectifs

L’objectif principal du projet est double. Premièrement, développer et valider une tache comportementale pendant laquelle des souris libres de leurs mouvements performent des actions dirigées et habituelles. Deuxièmement, identifier et manipuler les réseaux neuronaux contrôlants les deux types d’actions. Ces objectifs seront atteints en combinant des approches comportementales, électrophysiologiques, d’imagerie calcique et d’optogénétiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont doubles. Premièrement, la compréhension des mécanismes neuronaux contrôlants les actions dirigées et habituelles, et leur interaction chez le même sujet est une étape indispensable pour dans le développent de nouvelles stratégies thérapeutiques des troubles psychiatriques comme la toxicomanie et les comportements obsessionnels compulsifs. Deuxièmement, nous pensons que notre approche nous permettra d’améliorer le phénotypage des actions dirigées et habituelles chez la souris. Les procédures de psychologie expérimentale actuellement utilisées allongent le temps d’expérience et le stress des animaux.

Procédures

Opérations chirurgicales : les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale d'une durée maximale de 1h15.

Impact sur les animaux

Les sources éventuelles de douleurs ou souffrance dans notre procédure : la chirurgie, l’euthanasie ainsi que l'isolement des animaux en cage individuelle.

Devenir

Euthanasie de l'ensemble des animaux à la fin de la procédure expérimentale afin de prélever le cerveau.

Remplacement

Le rat reste encore le modèle animal de prédilection pour étudier les fondements comportementaux et neuronaux du comportement instrumental. Cependant, les souris peuvent remplacer les rats. Les souris peuvent apprendre un comportement instrumental et faire une distinction claire entre les actions dirigées et habituelles. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris pendant qu’elles exécutent une tâche comportementale. Pour comprendre les mécanismes des circuits neuronaux contrôlant les actions instrumentales, nous devons utiliser des méthodes permettant de mesurer et de manipuler l'activité de neurones spécifiques avec des résolutions spatiales et temporelles élevées sur un cerveau intact et vivant. Il est impossible d’étudier des réseaux neuronaux avec des méthodes in vitro ou in silico. Il n'existe donc pas de méthodes alternatives.

Réduction

En calculant l’estimation de la variance observée avec ce type de données pour atteindre une signification statistique, nous avons besoin de 16 souris par groupes expérimentaux. La mise en œuvre de cette tache comportementale nous permettra l’étude de ces deux types d’action chez le même sujet, ce qui n’est pas le cas des taches comportementales classiques dans lesquelles actions dirigées et habituelles sont étudiées séparément avec des groupes expérimentaux distincts. Pour la réalisation de toutes les expériences de ce protocole nous utiliserons 912 souris.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la souffrance des animaux, nous appliquons systématiquement un traitement antalgique avant et trois jours suivant les actes chirurgicaux qui sont réalisées sous anesthésie gazeuse. L’évaluation du poids de l’animal est effectuée de façon journalière à partir du moment où il est isolé en cage individuelle et rentre dans la phase expérimentale. Ces mesures ont lieu lors de la manipulation journalière des animaux en même temps que la vérification de l’état général de l’animal. Ces mesures sont consignées dans un cahier d’expérience prévu à cet effet. Pour identifier les dommages et contraintes subis par l’animal, nous avons définis des points limites au nombre de 5. Ces cinq aspects évalués au cours de nos expériences nous aident à déterminer un point final à l’expérimentation. Chaque critère est évalué de 0 à 3 et si un critère obtient le score maximal, ceci induit un arrêt immédiat de l’expérience. Sur la base des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et les zootechniciens seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez les souris.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour les études comportementales. Son utilisation est généralisée dans le domaine des neurosciences et en particulier pour l’étude des circuits neuronaux impliqués dans les comportements instrumentaux. Les animaux seront utilisés entre 2 et 6 mois post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome humain, des gavages quotidiens pendant trois semaines et des injections d'anticorps, pour tester une cible thérapeutique contre le mélanome métastatique. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les déplacements et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer perte de poids et troubles respiratoires, la mise à mort intervenant à 2 cm³ de tumeur. Il vise une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et affirme que les méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes de la tumorigenèse.

Objectifs

Le mélanome cutané est un cancer de la peau agressif et malgré le développement de thérapies ciblées et d'immunothérapies, les patients diagnostiqués au stade métastatique ont toujours un mauvais pronostic. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles pour les tests de diagnostic précoce et pour les traitements de la maladie métastatique. Ce projet vise à démontrer que cibler une protéine exprimée de façon non conventionnelle par les cellules tumorales peut altérer la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour démarrer des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre la validation préclinique d'une nouvelle approche thérapeutique pour le mélanome cutané. Si les résultats obtenus confirment ceux des précédentes expériences in vitro, des essais de xénogreffes de tumeurs provenant de patients humains dans un modèle murin, pourront être envisagées. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d’immunothérapie lors d'essais précliniques, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections se font sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections d'anticorps (2 fois par semaine, 100 microlitres) ou de produit luminescent (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages (1 fois par jour pendant 3 semaines maximum). L’introduction d’une aiguille pour les différentes injections entraine une légère douleur au point d’injection mais qui est brève. L'injection de cellules tumorales va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés notamment problèmes respiratoires liés aux métastases sur les poumons.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Les tumeurs et métastases seront prélevées à des fins d'histologie pour étudier les marqueurs de cancer et la composition des tumeurs ainsi que pour d'autres analyses : séquençage d'ARNs, quantification protéique afin d'évaluer le résultat des différents traitements.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par un anticorps spécifique sur la croissance tumorale in vivo. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 200 réparti comme suit : 4 cohortes de 20 animaux injectés avec 4 lignées de cellules tumorales puis traités ou non avec l'anticorps et 3 cohortes de 40 animaux injectés avec 3 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec l'anticorps en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Les paramètres étudiés seront la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance et le développement des métastases pulmonaires. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes dont les cellules ont un potentiel d’invasion plus ou moins important. Leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique : il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires par différentes voies d'injection.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives que les mâles, elles seront hébergées en cohorte pour conserver l’interaction sociale. Les expérimentateurs établiront le contact avec les souris 8 jours avant le début de l’expérimentation les habituer à la manipulation et réduire leur angoisse. Les cages seront enrichies. Nous surveillerons quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine pour suivre la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. Nous adapterons la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées en fonction de la vitesse de croissance tumorale. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d’imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine.

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. La souris est un modèle reconnu dans la communauté scientifique pour la greffe de lignées cancéreuses humaines afin de tester des traitements potentiellement transférables en médecine humaine. Pour éviter le rejet des cellules humaines de mélanomes après injection, nous utiliserons des souris immunodéprimées NOD/SCID/IL2GammaR. Ces souris présentent un système immunitaire déficient et nécessitent des conditions d'élevage stériles. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétro-orbitale. La croissance tumorale ne devrait pas être impactée par l'âge des souris. Il est cependant préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes n'entravent pas leur capacité de mouvement.

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène pour inactiver un gène, puis des prélèvements réguliers de touffes de poils et de fèces pendant six mois, pour étudier le rôle des hormones somatotropes dans le maintien des tissus au cours du vieillissement. Le porteur qualifie ces gestes de peu invasifs et compare la douleur du prélèvement de poils à celle d'interactions entre souris. Il affirme que la souris est la seule espèce vertébrée permettant cette approche transgénique et qu'un "organisme entier" est "indispensable".

Objectifs

Vieillir en bonne santé est un objectif majeur de notre société. La découverte de traitements anti-âge efficaces ou de comportements nutritionnels mieux adaptés pourrait avoir un impact spectaculaire sur la santé publique, en réduisant les problèmes de santé liés à l'âge tels que la démence, les accidents vasculaires cérébraux et les maladies cardiaques. Cette découverte devrait permettre de maintenir une qualité de vie acceptable au sein d’une population de plus en plus vieillissante. Plusieurs caractéristiques d’un vieillissement en bonne santé ont été identifiées à ce jour. Notamment, au cours du temps, il est connu que les tissus constituant les organes s’altèrent et ont donc besoin d’être renouvelés voire remplacés. Ce maintien tissulaire dépend fortement de l’alimentation, qui peut être considérée comme le premier stress environnemental d’un organisme à travers l’action des nutriments sur les tissus. D’ailleurs, une restriction calorique montre en effet une meilleure longévité dans des modèles animaux. L’expression des hormones somatotropes qui participent à la détection des nutriments est diminuée lors de cette restriction alimentaire. Ces hormones somatotropes et leurs récepteurs cellulaires ont été clairement identifiées comme étant des facteurs qui influencent la durée de vie des mammifères. Elles ont de plus des rôles critiques dans le développement, la croissance et le métabolisme des organismes. Le blocage de cette régulation hormonale somatotrope conduit à une augmentation de longévité. Selon notre hypothèse, cet accroissement de longévité devrait s’appuyer sur un meilleur maintien des tissus au cours du vieillissement. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces hormones somatotropes dans le maintien et le renouvellement tissulaire au niveau de différents organes. Le rôle de ces récepteurs hormonaux dans le maintien tissulaire sera exploré dans des modèles où cette signalisation somatotrope est altérée. Notamment, nous ferons varier les taux de blocage du récepteur impliqué et nous suivrons le devenir des cellules inactivées au sein des tissus au cours du vieillissement par des mesures longitudinales des taux d’inactivation sur des souris transgéniques mutantes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment l’axe somatotrope influence le devenir des cellules souches responsables du bon maintien des tissus au cours du vieillissement. Cette étude ne peut être effectuée qu’in vivo sur des modèles animaux de mammifères proches de l’homme où les tissus/organes sont dans un contexte permettant à différents types de cellules d’interagir entre eux au cours du temps. L’aspect intégré du modèle est essentiel pour comprendre dans son ensemble les mécanismes gérant l’activité des cellules souches dans les processus de régénération et de maintien à l’équilibre des tissus constitutifs d’organes. L’évaluation du rôle du récepteur hormonal dans l’homéostasie tissulaire proposée ici sera bénéfique en santé humaine, car elle permettra de proposer des pistes dans la prévention d’une meilleure santé humaine dans notre population vieillissante.

Procédures

Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les souris seront injectées en intrapéritonéale avec contention sur animal vigile par trois doses différentes de tamoxifène afin d’induire l’inactivation du gène cible (environ 30 secondes par animal). Les poils et les fèces seront prélevés sur l’ensemble des animaux vigiles sur une période de 6 mois à raison d’un prélèvement par quinzaine, soit au total 14 prélèvements de touffes de poils et de crottes par souris (nombre maximum). Ces prélèvements ne durent pas plus de quelques minutes par animal (environ 2 minutes). A la fin de la période de maintien, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales de tamoxifène nécessaire pour induire le modèle implique une contention qui entraine un léger stress et une douleur de courte durée liée à l’injection. La récolte de fèces nécessite un isolement de quelques minutes qui peut également être source d'un léger stress mais n’a aucun impact sur le comportement global de l’animal. Le prélèvement de poils sera effectué par prise de petites touffes avec une pince plate et sera espacé d’au moins deux semaines. Ce type de prélèvement induit une légère douleur similaire à celle des interactions sociales entre deux souris.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus. La récupération des tissus post-mortem permettra une analyse des taux d’inactivation du gène cible par amplification quantitative de l’ADN.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, utiliser l’animal vivant est indispensable pour étudier les acteurs mis en jeu dans le maintien des tissus d’un organisme au cours du vieillissement. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu, notamment pour caractériser les compétitions/interactions existant entre des cellules inactivées pour le récepteur hormonal au sein des tissus d’un organisme multicellulaire. De plus la stimulation de croissance suite à l’inhibition de la voie de signalisation ne peut être obtenue que dans des modèles in vivo où les régulations hormonales peuvent se mettre en place. Notre objectif étant d’évaluer la possibilité de remplacement cellulaire au sein d’un tissu complexe, il ne peut être atteint que dans notre modèle de souris transgénique.

Réduction

Le projet impliquera un total de 130 animaux. Nous limitons systématiquement le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Chaque souris est utilisée pour un maximum de protocoles expérimentaux, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. La procédure expérimentale a été affinée pour éviter l'utilisation inutile de souris comme un ajustement des doses de tamoxifène à injecter. Le suivi longitudinal du taux d’inactivation du récepteur qui sera effectué par prélèvement de petites touffes de poils et de fèces au cours de la vie de la souris, permet de réduire substantiellement le nombre de souris nécessaire pour l’étude proposée. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée tout en tenant compte des impératifs de réduction. Les taux d’inactivation seront comparés au sein de chaque groupe par un test statistique adapté.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi en continu à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés quand cela est possible/nécessaire. Les prises de touffes de poils prélevés seront réduites au minimum nécessaire pour les analyses par amplification quantitative de l’ADN et les volumes injectés de tamoxifène seront adaptés au poids de chaque animal afin de ne pas induire de stress supplémentaire.

Choix des espèces

La souris est la seule espèce vertébrée qui permet une approche par transgénèse avec élaboration de modèles génétiques complexes. Dans le cadre d’une étude intégrée au sein d’un organisme du devenir du maintien des tissus, elle représente un modèle de choix. De plus, l’utilisation de souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées dans lesquelles les gènes de l’axe somatotrope peuvent être invalidés. La souris représente un modèle de choix pour l’analyse exploratoire de ces gènes impliqués dans l’homéostasie tissulaire au cours du vieillissement. Les premières études menées sur ces modèles transgéniques ont permis d’aborder des questions fondamentales au niveau du maintien de la fonctionnalité des organes qui n’auraient pas pu être obtenues à partir de lignées cellulaires. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes âgés de 3 mois ou d’un an, et seront suivies pendant six mois. Les deux âges choisis sont les plus adaptés à l’étude du maintien tissulaire au cours du vieillissement et sont assez éloignés des stades du développement où la croissance de l’animal peut perturber le remplacement tissulaire.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une puce sous-cutanée, des gavages répétés d'antibiotiques puis de solution fécale, des mises à jeun et des prélèvements de sang et de fèces, pour étudier le rôle du microbiote et des cellules MAIT dans une stéatose du foie induite. Le porteur indique des effets possibles de perte de poids, de selles liquides, de déshydratation et de prostration, avec euthanasie si l'état ne s'améliore pas. Il affirme que ces interactions complexes seraient "impossibles à reproduire" in vitro, ce qui rendrait le recours aux animaux "indispensable".

Objectifs

Les maladies métaboliques sont des affections qui touchent des sujets génétiquement prédisposés, chez lesquels le dialogue entre le microbiote intestinal et le système immunitaire est altéré. Bien que leur incidence soit en croissance et que leur impact socio-économique soit majeur, ces maladies ne connaissent pas de traitement curatif. Les malades présentent une dysbiose du microbiote intestinal, une altération de la barrière intestinale et une inflammation des tissus incluant le foie et les tissus adipeux. En plus des macrophages connus pour leur rôle dans l’inflammation, il a été récemment démontré que les cellules MAIT (mucosal-associated invariant T cells) jouent un rôle clé dans l’initiation et l’entretien de l’inflammation. Il est à noter que les cellules MAIT sont une sous-population de lymphocytes T particulièrement abondantes dans le sang, le foie, l'intestin et le tissu adipeux. Les MAIT reconnaissent des métabolites bactériens et sont aussi dotées de propriétés antibactériennes.

Bénéfices attendus

La compréhension du dialogue entre les cellules MAIT et le microbiote et le rôle des MAIT dans l’inflammation durant les maladies métaboliques et la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD pour "Non Alcoholic Fatty Liver Disease") pourrait permettre d’envisager à l’avenir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l’inhibition de ces cellules.

Procédures

Les souris seront soumises aux interventions suivante : - Implantation sous cutanée unique de puces pour l’identification individuelle - Gavages : 4 gavages seront réalisés. • Gavage quotidien avec un mélange d’antibiotiques pendant 1 semaine • 2 gavages avec un produit marqué à 10 semaines d’intervalle • Gavage deux fois par semaine de solution fécale pendant 2 semaines - 2 mises à jeun pendant 4 heures à 10 semaines d’intervalle - Prélèvement de sang : 2 prélèvements seront réalisés sur souris vigiles à 10 semaines d’intervalle. Un prélèvement unique de sang sera réalisé sur animal anesthésié. - 15 prélèvements de fèces provenant d’une défécation spontanée seront réalisés au minimum 1 fois par semaine - 84 pesées seront réalisées à une fréquence d’une pesée par jour.

Impact sur les animaux

Une observation quotidienne des animaux et après chaque geste expérimental sera effectuée incluant une vérification de l’état général de l’animal observé. Pour cette procédure, les nuisances prévisibles sont : une perte de poids, des selles liquides accompagnées d’un pli cutané persistant (synonyme d’une déshydratation importante), et/ou un état de prostration (souris immobile, dos voûté, peu réactive aux sollicitations des congénères ou du manipulateur, yeux fermés, absence de toilettage).

Devenir

L’étude portant sur une maladie hépatique, le prélèvement post-mortem du foie est nécessaire.

Remplacement

Les mécanismes impliqués dans le développement de la NAFLD mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte, qui sont impossibles à reproduire dans un modèle cellulaire ou de culture d’organe. Ainsi, utiliser uniquement une approche in vitro pour ce projet exclurait les différentes interactions pouvant survenir chez l’hôte. De ce fait, le recours aux animaux est indispensable.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux nécessaire a été déterminé en se basant sur les données acquises lors des expériences préliminaires, des études précédentes publiées dans la littérature, mais aussi grâce à un test de puissance permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Pour ce projet, nous utiliserons 4 groupes de souris conventionnelles (n = 20). Le nombre total d'animaux nécessaires est alors 20*4 = 80 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées par lot de 4 dans des cages collectives. L’eau et la nourriture seront disponibles à volonté et les paramètres ambiants seront contrôlés régulièrement (température, humidité…). Un enrichissement de leur milieu sera mis en place afin de favoriser le bien-être des animaux et se matérialisera par du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter, des tunnels en carton pour se cacher et des tiges métalliques pour grimper. La durée de l’expérience sera limitée à 12 semaines, temps nécessaire et suffisant pour la mise en place de la maladie, sans altérer l’état général de l’animal. Au cours de l’étude, les animaux seront examinés individuellement de façon quotidienne (à l’occasion de l’examen clinique et de la pesée) ce qui permettra de réagir le plus rapidement possible en cas d’anomalie.Dans le cas où un ou plusieurs points limites sont identifiés, la cause de ces signes sera recherchée afin d'apporter la solution appropriée. L'animal présentant ces points d'alerte fera l'objet d'une surveillance particulière afin d'être soigné et limiter sa douleur. Si ces signes, pour des raisons inconnues, persistent et l'état de santé de l'animal ne s'améliore pas, une décision de'euthanasie sera prise par le personnel compétant afin de mettre fin à la souffrance de l'animal.

Choix des espèces

Les souris sont couramment utilisées pour étudier les maladies métaboliques et l’effet du microbiote intestinal sur ces dernières. Ce modèle est facile à gérer (petite taille, très facile à manipuler et la maladie est facile à mettre en place) et reproduit plusieurs caractéristiques physiopathologiques de la stéatose hépatique développée par l'être humain. Ainsi, ce modèle sera utilisé pour étudier l’interaction entre les cellules MAIT et le microbiote intestinal dans le contexte de NAFLD. Au commencement de l'expérience, les souris seront de jeunes adultes (6-8 semaines) ce qui correspond à un âge où le métabolisme ainsi que le système immunitaire de cette espèce sont matures. Ceci limite leur fragilité et permet alors d’obtenir un modèle animal qui reflète au mieux la physiologie de l’humain adulte, âge de plus grande fréquence d'apparition des maladies métaboliques et de la stéatose hépatique.