Recherche fondamentale

142 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pancréatique leur est greffée sous la peau, puis elles reçoivent chaque jour pendant cinq semaines une injection d'une molécule candidate, la taille de la tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur cite parmi les signes possibles la prostration, l'ulcération de la tumeur, l'automutilation et des vocalises. Il présente le recours à la souris comme "indispensable" et justifie le choix de souris immunodéficientes par un coût réduit et des autorisations moins contraignantes que pour des espèces qu'il dit "plus évoluées".

Objectifs

Le cancer du pancréas est une tumeur maligne très grave. Asymptomatique et métastatique, il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement efficace. L’urgence à laquelle la recherche est confrontée nous a amené à développer de nouveaux agents pour combattre ces cancers. Dans ce contexte, des inhibiteurs contre des protéines essentielles dans les tumeurs ont été développé et se sont avérés très efficace sur plusieurs lignées cellulaires dérives des patients. Des résultats prometteurs obtenus, montrent une réduction significative du taux de prolifération cellulaire. L'efficacité de cette famille des molécules est justifiée par son affinité pour une protéine clef dans le processus de carcinogenèse pancréatique. Dans ce contexte, ce projet a l'objectifs d'évaluer si ces molécules ont un effet curatif et sont efficaces pour réduire la tumeur dans ce modèle animal en ciblant ce proteine.

Bénéfices attendus

Notre objectif est de présélectionner la meilleure molécule candidate pour poursuivre nos essais précliniques.

Procédures

Une injection de cellules tumorales (par voie sous-cutanée) sera effectuée. Lorsque le volume de la tumeur est suffisant, les animaux seront traités quotidiennement par une injection d’une solution par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue de 0.5 mL, aiguille de 27G pendant 5 semaines. L’intervention dure 20-30 secondes. 2 fois par semaine, la taille des tumeurs seront mesurés avec un pied à coulisse. L’intervention dure 20-30 secondes.

Impact sur les animaux

Des signes de maladie peuvent être : cyphose dorsale, prostration, diminution du poids de l’animal, volume tumoral >1,5 cm3, ulcération de la tumeur, automutilation, vocalises. Bien que nous n'avons jamais observé de lésions chez les souris dues à cette procédure, les injections répétées quotidiennenment pourraient générer des lésions cutanées. Nous tenons à souligner que ces inhibiteurs n'ont montré aucune toxicité lors d'expériences précédentes aux doses qui seront utilisées dans ce projet, en traitements quotidiens pendant un mois.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever les tissus pour différents analyses.

Remplacement

Concernant le remplacement, le recours aux animaux est indispensable pour ce projet. De nombreuses données antérieures ont été réalisées sur des cellules en culture, y compris celles provenant de patients humains. Cependant, nous avons besoin d'un modèle animal pour prouver que le composé et ses dérivés induisent un effet antitumoral dans un modèle beaucoup plus complexe proche de l'être humain. C'est pourquoi nous ne pouvons pas remplacer l’étude chez l’animal vivant.

Réduction

Toutefois, nous n'utiliserons que le nombre de souris nécessaires pour l'exploitation statistiques des données, à savoir 142 individus (4 groupes de 8 souris pour chaque somposé, 8 souris control pour touts les composés, et 6 souris de plus au cas où certaines souris ne les développeraient pas) conformément à la règle de réduction.

Raffinement

Concernant le raffinement, les souris seront hébergées collectivement (4 à 5 animaux par cage de 530cm 2 ) et le milieu sera enrichi par la présence dans chaque cage de matériel de nidation : en alternance tiges de papier, abris en carton, pelotes de lanières de papier. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. Le changement des litières aura lieu une fois par semaine. En ce qui concerne le protocole d'injection, la solution sera chauffée avant l'injection. De plus, nous avons déterminé des points limites à ne pas franchir pour respecter le bien-être de l’animal: un contrôle quotidien de l'état clinique de nos animaux sera réalisé selon un système d’évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) pour différents critères physiologiques et comportementaux (tableau de score fourni en annexe). Tout animal obtenant un score total supérieur ou égal à 7 ou un score de 3 dans une des catégories sera mis à mort.

Choix des espèces

Les souris immunodéficiences sont des modèles très répandus dans la littérature et établis depuis longtemps. Leur utilisation est simple, peu coûteuse, rapide et permet de s’affranchir d’autorisations plus complexes et restrictives concernant des espèces animales plus évoluées Les animaux seront âgées de 4 semaines au moment de leur réception afin d’obtenir des souris adultes et en pleine forme (poids supérieur à 20g) au moment de commencer l’expérimentation. En effet, nous prévoyons une période d’acclimatation de 7 jours minimum après réception avant d’inoculer les cellules en sous-cutanées puis encore 2 à 3 semaines d’attente pour obtenir une tumeur d’un volume satisfaisant. Le traitement commencera alors sur des souris âgées entre 7 et 9 semaines selon la vitesse de développement de la tumeur.

576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'une heure, onze injections sur animal éveillé et trois tests comportementaux dont le RNT ne précise pas la nature, pour étudier les neurones impliqués dans le sevrage aux opiacés. Le porteur indique induire une aversion liée au sevrage tout en cherchant à la minimiser, et met les souris à mort pour prélever leur cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne reproduisent pas l'organisation cérébrale et que les souris génétiquement modifiées utilisées n'existent que chez cette espèce.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à identifier le rôle des circuits neuronaux participant au développement de troubles cérébraux, en mettant l'accent sur les troubles émotionnelles négatifs induit par la dépendance et le sevrage aux substances aux opiacés. Ce projet est centré sur les récepteurs aux opiacés. Le système opioïde est un système neuromodulateur complexe composé de trois récepteurs (mu, delta et kappa) activés par des peptides opioïdes endogènes. Le système opioïde régule la douleur, les processus de récompense, la régulation des réponses émotionnelles et des réponses au stress. Les altérations de ce système sont centrales dans le développement de troubles addictifs et de l'humeur. L’objectif de ce projet vise à déterminer le rôle des neurones exprimant les récepteurs aux opiacés dans différentes régions cérébrales dans le processus de sevrage aux opiacés.

Bénéfices attendus

Les implications sont à la fois fondamentales et cliniques, car elles nous permetteront une meilleur connaissance des mécanismes moléculaires responsables des états émotionelles négatifs suite au sevrage aux opiacés. Ce projet aura de nombreux bénéfices, en particulier d’identifier les neurones critiques dans le développement de l’état émotionnelle négatif pendant le sevrage aux opiacés. Ceci permettra de caractériser les mécanismes d’adaptation du cerveau à l’exposition répétée aux opiacés, afin d’identifier de nouvelles cibles neuronales pour des traitements pour la prévention et le traitement du sevrage aux opiacés et de faire face à la forte augmentation de la dépendance et de la consommation d’opiacés dans le monde.

Procédures

Procédure chirurgicale sous anesthésie générale 1 fois pendant 1 heure avec une injection d’anesthésiant local et une injection d’analgésique pendant la chirurgie. Injections multiples sur animal vigile pour administrer les traitements, qui fera un total de 11 injections sur animal vigile par souris. Chaque injection sur animal vigile dure 30 secondes. Nous allons effectuer 3 tests comportementaux par souris (chaque test dure entre 6 et 30 minutes).

Impact sur les animaux

Chirurgie stéréotaxique : Pendant la chirurgie, il y a un risque de surdose d’anesthésiant et d’hypothermie due à l’anesthésie. Il existe aussi un risque d’inflammation ou de réouverture du site d’incision,. Injections multiples : Les souris seront injectées il y a donc la possibilité d’irritation du site d’injection. Tests : les tests comportementaux choisis ne posent aucun risque corporel pour l’animal et il y aura un jour de repos entre chaque test. Les symptômes de sevrage seront minimisés en utilisant le plus faible pour induire une aversion. De plus, les tests ne durent pas plus de 30 minutes

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvement du cerveau

Remplacement

"Remplacement" : les effets comportementaux des opiacés ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires, qui par nature ne récapitulent ni la complexité de l’organisation cérébrale en réseaux neuronaux complexes. L’étude de ces effets nécessite donc l’analyse d’organismes vivants et entiers. De plus nous utiliserons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler les circuits neuronaux répondant aux opiacés, ces modèles n’existent que chez la souris.

Réduction

"Réduction" : les animaux utilisés étant consanguins, la variabilité phénotypique est limitée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant potentiellement en évidence un effet statistiquement significatif. De plus ces études se feront de manière longitudinale, afin de tester plusieurs paramètres (dépression et anxiété) chez le même animal afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité interindividuelle attendue, les groupes expérimentaux destinés à caractériser les comportements liés aux effets effets aversifs des opiacés seront constitués de 12 souris chacun.

Raffinement

"Raffinement": nous avons choisi d’utiliser des protocoles expérimentaux qui minimisent au maximum l’inconfort des animaux tout en permettant néanmoins d’étudier les réponses comportementales au sevrage à la suite d’une administration d’opiacés. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux de 3 à 5 animaux par cage, et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger, une ‘’maison’’ en carton, et des papiers absorbants pour faire un nid. Enfin, les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie (anesthésique profond et un anesthésique local autour du site de chirurgie) et les animaux recevront un traitement antidouleur (traitement par un anti-inflammatoire). La température corporelle de l’animal sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté jusqu’au complet réveil de l’animal. Les animaux seront ensuite suivis et la souffrance sera évaluée. Des points limites prédictifs seront établis permettant d’interrompre l’étude limitant ainsi la souffrance, la douleur et le stress pour l’animal.

Choix des espèces

La sourisest aujourd’hui utilisée comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies de son génome (99 % identique à celui de l'homme). De plus, le modèle souris permet la création de lignées génétiquement modifiées (délétion/surexpression globale ou locale d’un gène ou d’un marqueur neuronal, manipulation de neurones ciblés). Pour notre étude, l’utilisation de la souris souris génétiquement modifiée est centrale, car elle nous permet d’étudier spécifiquement les neurones qui répondent aux opiacés, de manipuler leur activité et d’en voir les conséquences sur le comportement. Aucun autre organisme ne permet d’utiliser cette approche très puissante. Les modèles étudiés étant des modèles de pathologie neuropsychiatrique se manifestant principalement à l’âge adulte chez l’humain, les études se feront chez des animaux ayant atteint le stade mature de leur développement, c’est à dire au minimum 2 mois pour les modèles souris.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un antibiotique dans l'eau puis un gavage de bactéries E. coli, avant des traitements à base de phages administrés par gavage trois fois par semaine pendant deux semaines, le côlon étant ensuite prélevé. Le porteur précise que les souris sont génétiquement modifiées et développent spontanément un cancer colorectal, mais affirme arrêter l'expérience avant que la maladie n'affecte leur état. Sur le remplacement, il indique avoir mené des essais in vitro mais juge l'étape in vivo "nécessaire" pour vérifier l'efficacité du traitement.

Objectifs

Les Escherichia coli (E. coli) sont des bactéries colonisant naturellement le tractus digestif. Ces bactéries sont dans la plupart des cas inoffensives. Cependant, elles ont tendance à céder et à acquérir du matériel génétique pouvant dans certains cas les rendre pathogènes pour l’Homme. Ce matériel génétique peut être composé de facteurs de virulences (toxines par exemple) et/ou de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques rendant leur éradication extrêmement difficile voir dans certains cas impossible (bactéries dites multi-résistantes). A titre d’exemple, Santé publique France estime pour l’année 2015 à 125 000 le nombre d’infections par des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques en France et à plus de 5 500 le nombre de décès imputables à ces bactéries. Ces chiffres étant en constante augmentation, de nouvelles méthodes d’éradication de ces bactéries sont nécessaires pour continuer à traiter efficacement les patients. Le projet aura comme objectif d’éliminer le portage digestif des E. coli possédant soit des gènes codant pour des toxines soit des gènes de multi-résistance aux antibiotiques. Dans ce projet, nous utiliserons au maximum 220 souris. Les animaux seront hébergés dans des cages standards avec un accès illimité à l’eau et à la nourriture et le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale.

Bénéfices attendus

D’une façon globale, ce projet apportera la preuve de concept in vivo que notre traitement peut être une excellente approche pour éliminer le portage digestif de bactéries E. coli indésirables (producteurs de toxine et/ou multi-résistants aux antibiotiques). La production de notre traitement décolonisateur testé est peu couteuse et extrêmement facile à mettre en place (son administration est elle aussi extrêmement simple). Ainsi, si la preuve de concept de leur pourvoir décolonisant sur nos bactéries modèles s’avère être un succès, il serait alors envisageable d’imaginer de développer chez des patients porteurs de bactéries similaires cette stratégie thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront tous gavés, ce qui représente un maximum de 220 souris. Le gavage se fera sur animal vigile par du personnel expérimenté, habitué à cet acte qui hormis la contention n'induit aucune douleur à l'animal et ne dure que quelques secondes. En ce qui concerne la fréquence des gavages, les animaux recevront tous 1 gavage des souches bactériennes d'intérêt. Les traitements décolonisateurs seront administrés quand à eux 3 fois par semaine pendant 2 semaines (110 souris). Si les expériences sont un succès, nous les répèterons en administrant le traitement décolonisateur seulement 1 seule fois (un maximum de 110 souris).

Impact sur les animaux

Les animaux se verront administrer un antibiotique via l'eau de boisson. Cette pratique est très fréquente pour faciliter l'implantation intestinale de souches bactériennes d'intérêts et n'entraine aucune gêne chez les animaux. L'administration des bactéries se fera par gavage. Cet acte n’induit pas de nuisance particulière hormis un stress léger lié à la contention de l’animal. Les souches bactériennes utilisées sont couramment employées au laboratoire et n’induisent aucun stress ou dégradation de l’état général de l’animal. Les effets indésirables résident plus dans le modèle murin lui-même, puisque les souris utilisées sont altérées génétiquement et développent spontanément un cancer colorectal. Cependant l’expérience sera arrêtée bien avant que la pathologie ne se traduise par un impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux auront reçu des antibiotiques, des bactéries et des phages. C'est pour cela qu'ils seront mis à mort. De plus, nous voulons nous assurer que les phages ont été capable d'éliminer les bactéries associées à la muqueuse intestinale et pour cela, les côlons doivent être récupérés et les animaux mis à mort.

Remplacement

Notre approche expérimentale inclut une première analyse in vitro ayant démontré l’efficacité des traitements décolonisateurs utilisés in vivo. Cependant, la densité du microbiote intestinal est telle dans le tractus digestif, que l’étude de l’efficacité des traitements décolonisateurs in vivo est nécessaire pour nous assurer qu’ils sont réellement efficaces.

Réduction

Nous n’utiliserons que le nombre nécessaire d’animaux pour la bonne interprétation des données. D’expérience, nous savons que les expériences de colonisations intestinales par des E. coli nécessitent 10 animaux/lot (il y a une grande variabilité en termes de colonisation et moins de souris rend l’interprétation impossible). En effet, le laboratoire a publié des données comparant chez des souris prédisposées à développer le cancer colorectal, la colonisation d’une souche de E. coli de laboratoire à celle d’une souche de E. coli associée au cancer colorectal chez l’Homme. Les groupes comportaient entre 14 et 17 animaux. Par ailleurs, le laboratoire réalise de nombreuses infections bactériennes de souris dans le cadre de l’étude du pouvoir inflammatoire des E. coli associés à la maladie de Crohn, une maladie inflammatoire chronique de l’intestin. Bien souvent les chiffres de colonisations présentent des variations et le nombre d’animaux utilisés s’en trouve impacté. Des groupes de 8-12 animaux sont fréquemment constitués. Nous prévoyons une administration répétée ou unique des traitments décolonisateurs. Les epxériences d'administration unique ne seront faites que si l'administration répétée montre un effet bénéfique. Si ce n'est pas le cas, l'expérimentation prenda fin.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans une salle climatisée avec un cycle jour/nuit de durée égale et un taux d'humidité constant. Les animaux auront libre accès à la boisson et à la nourriture. Le milieu sera enrichit à l’aide de maisons en plastique. Un suivi quotidien des animaux sera effectué de manière à repérer toute détresse animale. Le poids des souris sera également suivi avec attention car c’est un très bon marqueur de pathologies intestinales et de la sévérité d’une diarrhée. Nous utiliserons également un système de score de manière à limiter au maximum la souffrance et définir des points limites. Si un animal présente des signes de douleur, un antalgique lui sera administré par gavage pour en contrôler la prise. Les expériences seront réalisées en toute sécurité, notre animalerie permettant notamment la manipulation de pathogènes.

Choix des espèces

Pour les souris de fond génétique sauvage, nous gaverons des animaux âgés de 6-8 semaines. C'est un âge classiquement utilisé dans les expériences de gavage et d'étude de la colonisation intestinale par les bactéries. Pour les souris prédisposées à développer le cancer colorectal, nous gaverons des animaux âges de 6 semaines. C'est l'âge classique pour ce modèle.

72 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour pendant 14 jours une injection sous-cutanée d'isoprénaline pour provoquer un stress cardiaque, une partie recevant en fin de protocole une injection d'un inhibiteur, avant prélèvement du cœur. Le porteur indique que le traitement augmente la fréquence et le débit cardiaques et que l'inhibiteur peut provoquer une hypertension. Sur le remplacement, il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier le remodelage cardiaque et qualifie le recours aux animaux d'"indispensable".

Objectifs

Le stress adrénergique cardiaque peut entraîner un remodelage physiologique du cœur, comme on l'observe en réponse à l'entraînement physique. Cependant, lorsque ce stress est chronique, il conduit à un remodelage cardiaque défavorable qui est associé à un dysfonctionnement. À ce jour, le principal traitement efficace pour limiter le remodelage myocardique consiste à réduire la surcharge de pression. Par conséquent, il est impératif de mieux comprendre les voies de signalisation qui sous-tendent les (mauvaises) adaptations cardiaques dépendantes du stress adrénergique afin de fournir des pistes pour le développement de nouvelles thérapies. En réponse à la stimulation des recepteurs β-adrénergiques, le myocarde produit des quantités accrues d'oxyde nitrique (NO). Jusqu'à récemment, on considérait que la signalisation du NO impliquait principalement l'activation des voies de la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) (GMPc-PKG). Cependant, le NO peut également se fixer directement de manière covalente aux résidus thiol de cystéines, un processus appelé Snitrosylation (SNO). Ce second mécanisme a été moins étudié et fait l'objet du présent projet. La SNO est une modification post-traductionnelle réversible majeure impliquée dans la régulation de l'activité des protéines ; il permet également de protéger les protéines contre l'oxydation irréversible des fragments thiols. Ce processus a été bien décrit dans les mitochondries où il est associé à une production réduite d’espèces réactives de l’oxygène. Les myofilaments cardiaques sont également rapportés comme étant sensibles à l'oxydoréduction et, par conséquent, potentiellement affectés par la signalisation du NO. La question est de tenter de mieux comprendre comment la SNO des protéines myofilamentaires est impliquée dans la régulation de la machinerie contractile cardiaque. L’objectif du projet NitrosoCard est de tester l'hypothèse selon laquelle, en réponse au stress adrénergique, la eNOS (enzyme responsable de la synthèse de NO) peut se relocaliser vers les mitochondries pour moduler la SNO de protéines clés dans la régulation de la réponse du cœur à une situation de stress.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de mieux identifier les voies de signalisation impliquées dans la réponse du coeur à un stress adrénergique. En effet, il est bien connu qu'un stress adrénergique transitoire peut aboutir à une adaptation bénéfique du coeur alors qu'un stress chronique peut conduire à un remodelage cardiaque défavorable. Néanmoins, à ce jour, les mécanismes cellulaires permettant d'expliquer qu'un même stimulus puisse aboutir à des réponses adaptatives différentes n'ont jamais été identifié

Procédures

Les animaux seront traités quotidiennement, pendant 14 jours, avec un agoniste des récepteurs β-adrénergiques, l’isoprénaline, par injection sous-cutanée (une injection sous cutanée tous les jours pendant 14 jours). A la fin des 14 jours, certains animaux (groupe taités avec l'inhibiteur des NOS, L-NAME) reçoivent une dernière injection cette fois en intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Le traitement sub-chronique à l’isoprotérénol peut avoir des conséquences sur l’état de bien-être des animaux (principalement augmentation de la fréquence et du débit cardiaque). Les animaux seront donc surveillés, tout particulièrement dans les heures qui suivent l’injection sous-cutanée d’isoprotérénol, par un personnel habilité et formé pour ce type d'acte expérimental. L'injection de L-NAME peut aussi être à l'origine de stress (hypertension artérielle). Dans ce cas aussi, les animaux seront particulièrement surveillés dans les heures suivant l'injection. Les autres expérimentations seront réalisées sur des organes, des cellules, des myofilaments isolés et necessiteront l'euthanasies des animaux avant le prélèvement des tissus.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement du coeur et ainsi permettre l'isolement primaire de cardiomyocytes, de mitochondries ou des analyses biochimiques.

Remplacement

Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle de substitution in vitro pour évaluer l’impact du stress adrénergique sur le remodelage myocardique. Par ailleurs, l’utilisation d’animaux permet d'étudier des mécanismes cellulaires qui ne peuvent être analysés chez le patient. Par conséquent l'utilisation de modèles animaux apparait comme indispensable à la réalisation de ce protocole.

Réduction

Un grand nombre d'expérimentations sera réalisé sur des cellules ou des mitochondries isolées. Cette approche permet, en contrôlant un grand nombre de paramètres et ainsi en réduisant la variablité d'une expérience à l'autre, de limiter le nombre d'animaux utilisés. De plus, la taille du coeur du rat permet de collecter une grande quantité de matériel biologique et permettra, à partir d'un même coeur de réaliser diffrentes évaluations (biochimie, immuno-précipitation, protéomique).

Raffinement

Les animaux sont stabulés une semaine après leur arrivée, avant toute procédure, afin de s’acclimater à leurs conditions d’hébergement. Afin de permettre la formation de groupes sociaux, les rats sont hébergés en cages de 3 individus avec un enrichissement du milieu (tubes, coton, bâtons à ronger). La nourriture est standard ad libitum et un accès à de l’eau fraiche. La température et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont visités quotidiennement par un animalier formé qui contrôle le bien-être des animaux à l’aide d’une fiche intégrant les différents point limites. Ainsi, en se basant sur cette grille, un score sera attributé à chaque animal afin d'évaluer son état de bien être ou de souffrance. Les résultats de cette observation permettront, en se basant sur un arbre décisionnel, d'opter, si necessaire, soit pour une stratégie d'analgésie soit pour la mise de la mort de l'animal.

Choix des espèces

Le rat est un modèle de choix car la physiologie cardiaque des rongeurs présente de grandes similitudes avec celle de l’homme. Le modèle rongeur a l’avantage de permettre des investigations depuis l’étage cellulaire et moléculaire jusqu’aux mesures in vivo. L’utilisation des même tissus (coeur) ex vivo puis pour des analyses biochimiques permet de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours du protocole expérimental. Les animaux seront utilisés à un stade jeune adulte (rats de 12-15 semaines) afin de pouvoir travailler sur un système cardiovasculaire mature et sans facteurs de complications

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique, des prélèvements sanguins répétés, et selon les groupes une pompe implantée chirurgicalement sous la peau ou des injections d'anticorps trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur indique vouloir moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur, afin d'améliorer les traitements de thérapie génique. Il affirme que le rat Sprague-Dawley est le seul petit modèle reproduisant cette réponse et que le modèle animal reste "incontournable".

Objectifs

La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAV) constituent des outils de choix. Une seule injection de ces vecteurs permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, un des facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène in vivo est la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV. L’initiation ou non de cette réponse immune cellulaire semble être dépendante de nombreux facteurs (voie d'administration, dose injectée, tissu cible, transgène thérapeutique...) et son impact sur l’efficacité du transfert de gène reste à ce jour difficile à prédire. Nous avons récemment développé un modèle animal dans lequel nous observons une réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur. Ce modèle semble reproduire la réponse immune observée chez l’humain. La génération de ce modèle animal ouvre un champ d’applications important pour aider au développement de médicaments de thérapie génique innovants plus efficaces et plus sûrs sur le plan immunologique pour prévenir un rejet du transfert de gène. Ainsi, fort de ces constats, nous proposons de tester, dans notre modèle de rats, 2 stratégies pour moduler la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur et ainsi prévenir le rejet lié au transfert de gène. La première stratégie consistera à utiliser une molécule (l’interleukine 34 (IL-34)) pour favoriser l’émergence de cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes T) régulatrices impliquées naturellement dans la modulation des réponses immunitaires. La seconde stratégie repose sur le constat que les cellules effectrices humaines expriment fortement un marqueur de surface (le CD45RC) à l’inverse des cellules aux propriétés régulatrices Un anticorps ciblant ce marqueur spécifique sera utilisé pour moduler l’action des cellules immunitaires effectrices. L’objectif scientifique de ce nouveau projet est de développer une stratégie pour moduler la réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer une méthode pour prévenir la réponse immunitaire anti-vecteur et permettre ainsi d’améliorer les traitements de thérapie génique à l’aide d’AAVr.

Procédures

Les rats recevront une injection unique de solution saline ou d’un vecteur viral en Intraveineuse. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Des prélèvements sanguins sous anesthésie seront réalisés régulièrement pendant toute la durée du protocole soit 7 pour les suivis 1 mois et 10 pour les suivis 3 mois. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. Pour les animaux inclus dans la première stratégie d’immunomodulation, des pompes seront placées chirurgicalement sous la peau du dos des rats permettant de diffuser un immunomodulateur sur plusieurs jours. Le temps d’anesthésie, de préparation du champ opératoire et de la chirurgie est d’environ 30 mn. La recharge s’effectuera tous les 15 jours à travers la peau et s’effectue en moins de deux minutes sous anesthésie. Pour les animaux inclus dans la deuxième stratégie d’immunomodulation, les anticorps seront injectés en intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 4 semaines. En cas de stress marqué, dû à la répétition des procédures, les animaux seront anesthésiés, le temps de réaliser l’injection soit environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Les animaux ressentiront une légère douleur au point du prélèvement sanguins et au point d’injection de l’intraveineuse et de l’intrapéritonéales dû à la pénétration de l’aiguille. La répétition des injections intrapéritonéales peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux ressentiront une douleur modérée dû à l’incision de la peau pour la mise en place de la pompe rechargeable.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post-mortem.

Remplacement

L’enjeu majeur des protocoles de thérapie géniques développés à l’aide d’AAV consiste à s’affranchir de la réponse immunitaire anti-vecteur observée chez l’humain. À ce jour, il n’est pas possible de reproduire in vitro un système immunitaire et encore moins de le combiner avec des cellules d’autres organes (également transduits par le vecteur de thérapie génique). Le modèle animal demeure donc incontournable. Pour ce protocole précis, nous avons choisi un modèle de rat Sprague-Dawley, car c’est le seul modèle de petit animal, qui développe une réponse immunitaire anti-AAV similaire à celle observée chez l’humain.

Réduction

Chez l’Homme, l’apparition d’une réponse immune dirigée contre le vecteur de thérapie génique ainsi que son intensité varient d’un individu à l’autre. Cette variabilité a également été observée dans une étude précédente réalisée au laboratoire où environ 60% des animaux injectés développent une réponse immunitaire. De manière à avoir des résultats statistiquement interprétables, le nombre d’animaux par groupe devra être porté à au moins 10 .

Raffinement

Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.). En cas d’observation d’un mal être de la part de l’animal, un examen clinique sera réalisé à l’aide d’une grille de score afin d’évaluer le degré de souffrance de l’animal. Selon le score enregistré et l’arbre décisionnel, certaines actions seront mises en place comme l’utilisation d’analgésique, une surveillance accrue, ou une euthanasie.

Choix des espèces

Dans la majorité des études de thérapie génique ou d'immunologie, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation du rat est justifiée à la fois par la preuve de concept de modélisation de la réponse immune anti-AAV ainsi que par la possibilité de constituer des groupes suffisamment larges pour effectuer des analyses statistiques. De plus, des études fonctionnelles réalisées in vivo dans un contexte de transplantation d’organes chez le rat mettent en évidence les propriétés immunorégulatrices de l’anti-CD45RC et de l’IL34. Le but de cette étude est d’apporter une preuve de concept de l’effet de ces molécules sur la réponse immunitaire dirigée contre le vecteur dans un contexte de transfert de gène. Les rats seront injectés entre 6 et 10 semaines, à l’âge adulte afin d’avoir un système immunitaire mature.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette prestation menée pour des laboratoires partenaires utilise des souris porteuses d'une mutation reproduisant une maladie liée aux immunoglobulines G4, avec injections de composés et prélèvements de sang et d'urine sur des animaux dès l'âge de deux semaines maintenus avec leur mère. Le porteur indique n'administrer aucun analgésique, au motif qu'il fausserait la réponse immunitaire observée. Il affirme que le modèle doit être évalué à l'échelle de l'"organisme entier" et qu'aucune méthode alternative ne le permet.

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies associées aux immunoglobulines G4 (IgG4-RD). Ces maladies sont des troubles fibro-inflammatoires chroniques graves à médiation immune qui se traduisent souvent par des niveaux élevés de protéines dans le sang (IgG4), dans les urines et par le développement de masses semblables à des tumeurs touchant plusieurs organes chez l’homme. Ses différentes manifestations cliniques rendent son diagnostic difficile. Les traitements conventionnels visent à atténuer l'inflammation par l'utilisation anti-inflammatoires mais le taux de rechute (40%) et les conséquences de leur prise sur le long terme sont importants. Le présent projet propose d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les IgG4-RD afin d’augmenter les chances de rémission. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin très bien caractérisé nommé LATY136F qui développe spontanément un syndrome lymphoprolifératif ayant des caractéristiques immunopathologiques semblables aux IgG4-RD chez l’homme. Ce modèle nous permet d’envisager l’étude de composés à visée thérapeutique afin d’évaluer leur efficacité sur la mise en place et l’évolution des IgG4-RD. Pour cela, nous évaluerons les différentes populations cellulaires du système immunitaire de ces souris après injection de composés thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité des composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques graves associées aux IgG4. La prévalence exacte de ces maladies n’est pas connue en partie à cause de son diagnostic difficile à établir et à les dissocier des maladies chroniques connues. Actuellement, les traitements reposent sur l’utilisation d’agents anti-inflammatoires et 40% des patients sont en rechutes. Ainsi, la découverte de nouveaux agents thérapeutiques est nécessaire afin d’augmenter les chances de rémission des patients. Ce projet permettra d’évaluer à la fois l’effet des composés thérapeutiques sur l’initiation et le développement des IgG4-RD.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’injection intra-péritonéale (i.p) ou sous-cutanée (s.c) de composés thérapeutiques visant à diminuer ou empêcher le développement spontané du syndrome lymphoprolifératif chez les souris LatY136F, modèle qui reflète les maladies associées aux IgG4 chez l’homme. Chaque individu sera manipulé pour : - les collectes de sang et d’urine à J0 et en fin d'expérimentation (=10 semaines) pour déterminer l'évolution des protéines dans le sang et les urines et d'en conclure sur l’efficacité du traitement. Cette intervention est rapide et dure environ 2 minutes par souris pour la récolte du sang et de l'urine. - les pesées hebdomadaire (30 secondes par souris) - les injections des composés thérapeutiques par voie i.p ou s.c en fonction du type de molécule et de la demande des partenaires. La durée d’injection par voie i.p est de 30 secondes par souris. La durée d’injection par voie s.c est de 3 min et 30 secondes temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection. -les anesthésies générales gazeuses à l’isoflurane dans le cas d’injection des composés thérapeutiques en s.c d'une durée de 3 minutes. L’expérimentation se terminera lorsque les souris auront 12 semaines. Le jour de l’arrêt expérimental, les souris seront mises à mort pour le prélèvement des organes lymphoïdes et non lymphoïdes en vue de l’immunophénotypage et des études histologiques.

Impact sur les animaux

Les tests d’efficacité de composés thérapeutiques sur les maladies liées aux-IgG4 n’entraineront pas d’effet indésirable chez les animaux dans la mesure où les doses injectées sont préalablement testées pour leur toxicité chez nos laboratoires partenaires. Toutefois, lors de l’expérimentation les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques pouvant engendrer du stress notamment lors des contentions, des collectes de sang et d’urine, des pesées hebdomadaires et des injections de composés thérapeutiques pendant 10 semaines. Les injections n’entraineront pas de douleur. Tous les actes techniques seront réalisés par du personnel expérimenté et expert afin de limiter les contraintes subies par l’animal. Toutes les souris seront mises à mort à la fin de l’expérimentation pour la collecte des organes dans le but d’analyser la réponse immunitaire suite aux traitements

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Ainsi, le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par groupe expérimental, les deux sexes confondus, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules, doses ou durées de traitement sont à tester. Dans la mesure du possible, les expériences sont multiplexées afin d’utiliser un seul groupe contrôle pour plusieurs groupes tests.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier, que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Ce protocole demande également l’utilisation d’animaux jeunes de 2 semaines nés au sein de notre animalerie. Les animaux seront maintenus avec leur mère pour la première injection et sevrés ensuite vers 21 jours. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. Toutefois, nous veillerons au bien être animal par une surveillance quotidienne des animaux par du personnel qualifié. Tout fait notable sera consigné sur une grille de score évaluant la souffrance et le stress des animaux. Les points limites sont clairement déterminés et les animaux identifiés par une alerte feront l’objet d’une surveillance accrue et des actions seront mises en place pour palier à divers problèmes tels qu’une observation bijournalière par le personnel expérimentateur ; l’ajout de gel Diet / pâtée SAFE Energy, l’ajout de coton…

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des animaux à des âges différents dans la mesure où le développement de la pathologie observé est progressif. Afin de vérifier l’effet des composés thérapeutiques, nous traiterons des souris âgées de 2 semaines avant l’apparition des premiers symptômes pour vérifier si le traitement empêche ou retarde la maladie ; puis sur des souris âgées de plus de 3 semaines lorsque la pathologie est mise en place pour vérifier l’effet du traitement sur les symptômes.