Recherche fondamentale

80 rats Wistar âgés de 18 mois vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent chaque jour une solution bactérienne et subissent quinze prélèvements de sang sur animal vigile, une restriction alimentaire entraînant environ 10 % de perte de poids et une mise en cage individuelle. Le porteur teste un probiotique censé limiter la fonte musculaire, présenté comme un futur produit à destination des séniors. Il affirme qu'évaluer l'effet sur le muscle rend "nécessaire" le passage par l'animal.

Objectifs

Le projet vise à valider in vivo la capacité d'un probiotique (Limosilactobacillus muscosae seul ou en association avec L. casei) à limiter la fonte musculaire chez des rats dénutris, animaux modèles du syndrome de fragilité de l'Homme.

Bénéfices attendus

Le projet participera au développement d'un nouveau probiotique à destination des séniors favorisant la sensibilité à l'insuline et améliorant la régulation de la glycémie. Cet effet santé du probiotique permettra de limiter la fonte musculaire liée à l'âge (sarcopénie) et donc de limiter la dépendance des personnes âgées fragiles.

Procédures

Les animaux recevront une solution bactérienne quotidiennement et subiront des mesures de composition corporelle, de mesure de leur métabolisme protéique et l'analyse de leur sensibilité à l'insuline. ceci impliquera au total 15 prélèvements de sang sur animaux vigiles répartis sur la durée du projet de 1 mois.

Impact sur les animaux

Perte de poids (environ 10%) associée à une restriction alimentaire. Stress associé à une mise en cage individuelle.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure, des prélèvements d'organes devant être effectués pour analyses.

Remplacement

Ce projet vise à valider cette propriété in vivo et à tester son efficacité sur la masse musculaire. L'action d'un probiotique est à la fois directe (sur les cellules intestinales) mais aussi indirecte (sur d'autres organes via des médiateurs). Pour tester l'effet de ce probiotique sur le métabolisme musculaire, il est donc nécessaire de passer par une expérimentation sur animaux modèles.

Réduction

Pour ce projet 80 animaux seront utilisés. Ils seront répartis en 5 groupes de 16 animaux. Le nombre d'animaux a été limité au nombre minimum nous permettant d'avoir des résultats significativement différents entre les groupes, ce nombre a été déterminé par test statistique et grâce à l'expérience du laboratoire sur l'utilisation de ce modèle animal.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un enrichissement de leur milieu de vie et seront observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite l’animalier alertera les responsables de l’étude. Les animaliers et les responsables de l’étude effectueront une observation plus poussée de l’animal et renseigneront le tableau d’observation des points limites. Si 3 points limites notables ou 1 point limite grave sont observés, nous utiliserons l’arbre décisionnel afin de décider si l’animal sera soigné ou euthanasié.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des rats Wistar âgés de 18 mois. Notre laboratoire possède une forte expérience d'utilisation du rat âgé en tant que modèle de la sarcopénie humaine. Le rat est un animal de choix pour les études sur le vieillissement, son espérance de vie étant de 24 mois.

48 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation d'alpha-synucléine agrégée dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie, pour accélérer une pathologie proche de la maladie de Parkinson et chercher des marqueurs de la maladie dans leur sang. Le porteur indique que les souris développent une démarche saccadée et des troubles de l'équilibre, signes à l'apparition desquels elles sont tuées avant que ne survienne une paralysie du train postérieur. Sur le remplacement, il affirme que le projet ne peut être réalisé qu'in vivo et qu'il n'existe "pas de méthode alternative" à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le projet vise à identifier des marqueurs moléculaires de la maladie dans le sang de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable du vivant de l’animal et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 48 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin d’accélérer l’apparition des signes cliniques moteurs, qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet développent des signes cliniques lors de leur vieillissement qui conduiraient irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à rechercher des biomarqueurs dans le sang. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Dans le cadre de cette étude pilote, les nombres de 12 animaux par lot sont déterminés afin de permettre la collecte d’une quantité de sang suffisante chez au moins 8 souris, pour isoler une quantité suffisante de vésicules extracellulaires d’origine neuronale. Concernant la détection d‘alpha-synucléine pathologique dans les vésicules extracellulaires neuronales, le test t de Student bilatéral non apparié et l'ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak seront appliqués. Concernant les analyses des microARN, les tests P-value, test exact de Fisher et FDR (False Discovery Rate) seront utilisés.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée chez un animal soumis à une anesthésie générale, permettant de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé et maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de dépilations qui peuvent être observées chez quelques souris femelles au delà de l’âge de 7 mois. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort, afin d’éviter des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, espèce qui peut être modifiée génétiquement pour produire une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. L’expresssion de cette protéine dans cette espèce permet l’accélération de la maladie après inoculation d‘alpha-synucléine agrégée. Les souris sont adultes lors de l’inoculation, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie par perfusion intra-cardiaque sans réveil afin de pouvoir réaliser des prélèvements de sang.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur puis des injections et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour tester si un anesthésique, la dexmédétomidine, freine la croissance tumorale. Le porteur affirme que ces effets multiparamétriques ne sont pas modélisables ailleurs que dans un "être vivant entier". Les tumeurs peuvent nécroser ou saigner, et toutes les souris sont euthanasiées pour analyse des tissus.

Objectifs

Des études rétrospectives ont suggéré un possible rôle anti tumoral des anesthésiques après observation d’une diminution de récidives métastasiques et une meilleure survie chez les patients ayant reçu ces produits. Le but du projet est donc d'étudier si un anesthésique utilisable en chirurgie oncologique induit une réponse anti-tumorale in vivo en diminuant la croissance tumorale et en augmentant la survie. C'est aussi de démontrer si les effets anti-tumoraux de cet anesthésique peuvent être potentialisés par les traitements anti-cancéreux conventionnels et en fin de démontrer si cet anesthésique diminue le stress glucocorticoïde. Le dernier objectif est de démontrer si les effets anti-tumoraux médiés par cet anesthésique, s'ils existent, impliquent une réponse du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Démontrer si l'anesthésique étudié pourrait être un nouvel agent anti-tumoral in vivo. Ce résultat pourrait amener à des essais randomisés contrôlés chez l'homme car actuellement cet agent est utilisé comme complément analgésique per-opératoire et n'a aucune recommandation spécifique en chirurgie oncologique.

Procédures

Génération de tumeurs après injection de cellules sous anesthésie générale (1 fois, durée 5 minutes) -traitement par injection (1 fois, durée 1 minute) -prélèvements sanguins sous anesthésie (2 fois, durée 3 minutes) -

Impact sur les animaux

Greffe et croissance de tumeurs (risque de nécrose intratumorale, voire de saignements intratumoraux).

Devenir

Euthanasie pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les effets des traitements anticancéreux seuls ou en association impliquent des processus multiparamétriques mettant en jeu des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. On ne peut donc se contenter de l'étudier uniquement in vitro ou in silico, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que l'association dun anesthésique aux traitements anticancéreux conventionnels potentialiseraient la réponse anti-tumorale. . La compréhension de cette potentialisation et sa reproduction in vivo ouvriraient la possibilité d'associer systématiquement ces agents au cours des chirurgies oncologiques chez l'homme afin de diminuer le risque de récidives grâce à une destruction potentialisée des cellules tumorales résiduelles.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes de souris déterminés en nombres pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous regrouperons les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les réusltats seront analysés selon des méthodes de statistiques non paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux,, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réaliséés sous anesthésie générale à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver l'efficacité d'une association de traitements anti-cancéreux afin d'augmenter la réponse anti-tumorale chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse mais également afin de vérifier l'absence de toxicité qui pourrait être majorée par l'association de traitements. Le modèle souris est le modèle mammifère de choix en oncologie préclinique. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, mimant la population de patients.

752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales et de médicaments sous anesthésie, pour tester l'effet antitumoral d'un antihistaminique repéré lors d'un criblage. Le porteur décrit l'usage d'animaux vivants comme "indispensable", l'impossibilité de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro étant invoquée. Les tumeurs peuvent provoquer perte de poids et ulcérations, et toutes les souris sont euthanasiées pour analyse des tissus.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans une recherche qui vise à améliorer l'efficacité de la thérapie anti-tumorale utilisant certains lymphocytes. Nous avons effectué in vitro un criblage à haut débit sur 2100 composés afin d’identifier de nouveaux activateurs de lymphocytes. Nous avons ainsi identifié un antihistaminique. L'objectif du projet est d’évaluer l'effet antitumoral de cette molécule chez des souris immunocompétentes comparé à son effet sur des animaux immunodéficients. Nous étudierons également si l'efficacité de cette molécule peut être améliorée en présence de traitement d'immunothérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie pharmacologique antitumorale efficace dans plusieurs types de cancer. En cas de succès, cette stratégie pourra être utilisée pour améliorer la prise en charge des cancers humains.

Procédures

Injection une à cinq fois de médicaments sous anesthésie générale: durée 1 minute. Injections de cellules tumorales sous anesthésie générale: durée 1 minute. Imagerie in vivo (luminescence) pour un type tumoral, une fois sous anesthésie générale, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (contentions, injections) peuvent induire du stress à l’animal ainsi qu’une légère douleur au site d’injection.. La croissance tumorale, la chimiothèrapie et l'immunothèrapie peuvent induire une perte d’appétit et donc une perte de poids. La croissance tumorale peut engendrer l’apparition d'ulcérations ou infection au site de la tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem de tissus et d'organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car, ce projet visant à tester l'efficacité des traitements anticancéreux et à confirmer l'activation du système immunitaire, ne peut qu’être effectué chez l’animal en raison de l'impossibilité de reconstruire un système immunitaire fonctionnel in vitro/ex vivo à la limite des technologies actuelles.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été déterminé rationnellement par calcul de puissance. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris déterminés pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés (test ANOVA pour comparer l’effet étudié entre les groupes). Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de sizzlenests et maisons en carton ou tunnels). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie des animaux, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement. La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par le fait que la souris est le modèle le plus couramment utilisé et admis en cancérologie prélinique. Les souris âgées de 6-8 semaines (18-20g à la livraison) seront utilisées dans ces études. A ce stade de développement, le système immunitaire est à maturité. Ceci correspond à la population de patients visée. Les animaux sont utilisés au stade adulte (6-8 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire puis des prélèvements sanguins répétés, pour mesurer le comportement de molécules candidates-médicaments. Le porteur reconnaît l'existence de modèles cellulaires de criblage mais affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer un "organisme vivant" et décrit ces analyses comme "incontournables". Tous les rats sont tués, l'administration de molécules empêchant selon lui leur réemploi.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal. En effet, il est indispensable d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques (PK), pharmacodynamiques (PD) et d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination (ADME) des molécules car ce sont des éléments cruciaux pour la sélection de candidats médicaments. Les analyses de PK, PD et de métabolisme ont considérablement amélioré le taux de succès de la recherche et du développement de médicaments ces vingt dernières années pour trois raisons principales : (i) ces études ont été incorporées en routine dès les phases précoces de découverte de nouvelles molécules, (ii) les scientifiques ont une meilleure connaissance des enzymes et des transporteurs impliqués dans le métabolisme des médicaments ainsi que des différences entre les espèces et individus, (iii) des stratégies d'optimisation des propriétés métaboliques et pharmacocinétiques des molécules ont été établies et appliquées à la recherche et au développement de médicaments. Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées. Il s'agit notamment d'évaluer des paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. Ces analyses, qui aident à la détermination de la dose à administrer, sont incontournables et doivent être réalisées avant de passer aux études de toxicologie et d'efficacité des molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose du cathéter, les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 20 minutes). Les animaux seront anesthésiés pour effectué l'administration des molécules pharmaceutiques (durée d'intervention 10 minutes). Le sang des animaux vigiles sera prélevé plusieurs fois au cours de la procédure, l'animal sera alors contenu pour retirer le capuchon en métal et effectuer le prélèvement et le flush du cathéter (durée d'intervention 3 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation du cathéter chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h, c'est pourquoi une analgésie de type buprénorphine sera systématiquement appliquée en post-chirurgical pour pallier à une éventuelle souffrance. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau des zones incisées, une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée. En cas d'infection majeure, l'animal sera soumis à un traitement par antibiothérapie. Une observation clinique quotidienne sera également mise en place afin d'évaluer l'état général des animaux opérés.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental.

Remplacement

Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées. Il s'agit notamment d'évaluer des paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. Ces analyses, qui aident à la détermination de la dose à administrer, sont incontournables et doivent être réalisées avant de passer aux études de toxicologie et d'efficacité des molécules.

Réduction

Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est déterminé et est réduit à son minimum pour chaque groupe. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

La pose d'un cathéter veineux va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre d'anesthésie et de ponction lors du prélèvement sanguin chez ce dernier. Les expérimentateurs sont exclusivement des personnels formés à l'expérimentation animale et maîtrisent les bons gestes garantissant le bien-être animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale, et une analgésie sera mise en place pour soulager les animaux. Les points finaux seront évalués quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...) et le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites ont été établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement : - défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion; - lésion non résorbée dans la zone d'implantation du cathéter malgré les soins; - infection non contrôlée dans la zone d'implantation du cathéter malgré les antibiotiques. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet (rat) est recommandée par les agences de réglementation pour les études de métabolisme, de pharmacocinétique et de toxicologie. Cette espèce est la plus utilisée et il s'agit d'un excellent modèle pour ce type d'études. Ainsi, il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans cette espèce. Les multiples homologies de séquences entre le rat et l'Homme rendent ce modèle prédictif du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, il présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent plusieurs chirurgies de six à sept heures, une injection de traceur dans le cerveau ou la pose d'une chambre d'enregistrement, puis sont entraînés à des tâches cognitives sous contrôle hydrique pendant des mois avant d'être tués pour analyse du cerveau. Le porteur revendique le primate non-humain comme "modèle de choix" pour comprendre le cerveau humain et présente ces recherches sur la conscience comme fondamentales. Il évoque des bénéfices thérapeutiques renvoyés au moyen et long terme, dans l'épilepsie ou les troubles de la conscience.

Objectifs

La connectivité étendue du claustrum avec le cortex suggère son implication dans les fonctions cognitives supérieures, y compris la conscience. Des résultats récents chez la souris remettent en question la globalité des interactions entre le cortex et le claustrum et donc leur implication dans les fonctions cognitives supérieures telles que la conscience. L’objectif du projet est donc de clarifier le role du claustrum dans les fonctions corticales chez le primate non-humain en réalisant des investigations anatomiques et physiologiques. Nos travaux préliminaires suggèrent que le macaque présente des caractéristiques inattendues propres aux primates concernant l'intégration du claustrum dans le réseau cortical global, il occupe une position centrale et est fortement connecté avec l’ensemble du cortex. L'achèvement de ces travaux dans le cadre du présent projet nous permettra de construire une matrice détaillée des connections entre le claustrum et le cortex afin de déterminer la centralité du claustrum dans le réseau cortical interaréal. En fonction du contexte, l’activité cérébrale transite rapidement entre deux états cérébraux fondamentaux en fonction du contexte : un état au repos et un état actif. Les transitions rapides entre différents états et leurs distributions spatiales en fonction des exigences comportementales sont une caractéristique majeure et encore mal comprise du cerveau. Notre hypothèse de travail est que la position centrale du claustrum dans le réseau cérébral lui confère un rôle privilégié en facilitant l'orchestration des changements rapides d'états du cerveau. Nous aborderons cette question en utilisant des enregistrements multisites de plusieurs aires corticales et du claustrum lors de différents états comportementaux chez le PNH. Nous mettrons en relation les modèles de connectivité fonctionnelle et anatomique à grande échelle. Ces résultats pourraient permettre des progrès sans précédent dans la compréhension des fonctions cognitives supérieures chez les primates.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Le choix des animaux est significatif : Le macaque est un modèle de choix pour les neuroscientifiques du monde entier, il possède de nombreuses aires corticales similaires à celles de l’homme, avec des propriétés fonctionnelles et cognitives comparables. Seul le singe présente une hiérarchie des aires corticales qui ressemble étroitement à celle de l'homme. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent que le claustrum des primates présente des différences significatives par rapport au claustrum des rongeurs, ce qui pourrait être directement pertinent pour les processus cognitifs, y compris les transitions entre différents états du cerveau, que nous abordons ici. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez le singe sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux à grande échelle qui sont probablement impliqués dans les fonctions cognitives les plus élevées, y compris les différents états de conscience, mais aussi dans l'épilepsie. Le lien avec l'épilepsie est plausible car une des hypothèses sur le rôle du claustrum est qu’il prévient la propagation incontrôlée de vagues d’activité excitatrice en stabilisant le réseau cortical par rétroaction inhibitrice. Ainsi les bénéfices à moyen et/ou long terme seraient l’utilisation de nos résultats à des buts thérapeutiques en médecine appliquée dans le traitement des troubles de la conscience et des épilepsies e.g. par stimulation du claustrum, après validation sur des modèles précliniques.

Procédures

Pour l’étude des connections anatomiques, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à l’injection de traceur dans le cerveau (1 chirurgie de 6-7 heures) avant d’être euthanasiés pour analyser le marquage neuronal. Pour l’étude des connections fonctionnelles, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à la fixation d’une chambre d’enregistrement (3 chirurgies de 6-7 heures à plusieurs semaines d’intervalle). Les animaux sont entraînés à effectuer des tâches comportementales cognitives et l’activité cérébrale est enregistrée pendant plusieurs mois sur animale vigile. Les animaux sont ensuite euthanasiés pour vérifier avec précision les sites d’enregistrements.

Impact sur les animaux

Le bien-être de l’animal suivant les procédures chirurgicales fait l’objet d’un suivi régulier afin d’adapter le niveau d’antalgiques au besoin . En dehors de la période post-opératoire, les effets indésirables potentiels sont principalement liés à l’hygiène de l’implant : en cas d’infection ou d’inflammation constatée autour de l'implant, lors des soins réguliers de l'animal par les expérimentateurs, une intervention rapide est prévue en consultation avec le vétérinaire (e.g. antibiogramme et traitement antibiotique). Il existe un risque rare que l’implant devienne non fonctionnel (casse, réaction de rejet tissulaire, infection non contrôlée par voie systémique), dans ce cas l’implant est retiré lors d'une procédure chirurgicale, la plaie nettoyée parfaitement et refermée, et l'animal traité par antibiotiques. Dans chacun de ces cas le protocole est interrompu et l’animal placé sous surveillance accrue. Toutes les expériences sur les animaux sont réalisées dans le souci du bien-être des animaux. La condition de base de toutes les expériences avec des singes éveillés et entraînés au comportement est la coopération de l'animal afin qu'il puisse accomplir les tâches comportementales de manière concentrée, persévérante et précise. Or, il n'est capable de le faire que s'il n'est ni malade, ni apeuré, ni distrait. D'autre part, l'ensemble de la situation d'élevage des singes joue un rôle décisif. En effet, seul un animal vivant dans un environnement intact et stimulant est motivé et curieux, et peut donc être entraîné. Il est réalisé un suivi régulier du poids et du niveau d’hydratation de l’animal (pendant la période de contrôle hydrique), de l‘hygiène de l’implant et du niveau de douleur suite aux actes chirurgicaux. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 10 animaux est nécessaire à la validation scientifique projet (quantification des connexions du claustrum et validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Nous avons démontré par ailleurs que la mise en évidence des voies neuronales par IRM de diffusion (tractographie) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Notre approche pour la réduction du nombre d’animaux se base sur une amélioration des techniques utilisées, une approche statistique prospective et le partage des données acquises dans ce projet. Le nombre de traceurs pouvant être utilisé simultanément a été augmenté de 3 à 4, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Notre expérience montre que le risque d’une mauvaise position du site d’injection (contamination de l’aire adjacente ou de la matière blanche sousjacente), liés aux limites de résolutions de l’IRM et de la caméra du système de navigation cérébrale (1mm), représente environ 25% des cas. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux que nécessaire une fois que 8 régions différentes du claustrum auront été correctement ciblées (e.g. si toutes les injections de traceurs étaient correctement placées dans deux animaux, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux pour cette procédure). Le nombre d'animaux utilisés est déjà réduit au niveau indispensable (1 animal par site d’injection permet d’obtenir la connectivité empirique pour ce site pour des connexions impliquant plus de 8 neurones par région). Nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage de voie et la tractographie (IRMd) et les données de ce projet y seront intégrées afin d’augmenter la puissance statistique. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l'IRMd, absolument non invasive. La modélisation (modèles linéaires généralisés) des comptes issus du traçage de voie et de la tractographie, permettrons de caractériser la variabilité intra- et interindividuelle pour ces deux types de mesures de la connectivité. Pour l’étude de la connectivité fonctionnelle, deux animaux constituent le minimum internationalement reconnu pour la publication des résultats. D'autres animaux sont prévus uniquement si cela s'avérait absolument nécessaire, par exemple si l'un des animaux tombait malade et serait retiré de l'expérience. Toutes les données issues de ce projet seront partagées dans un premier temps avec les différents collaborateurs directement impliqués dans l’analyse des données et la modélisation et, dans un deuxième temps, via des sites de partage pour l’utilisation de ces données par la communauté scientifique (e.g. Zenodo).

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie. Une grille de score post-opératoire nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Ces critères prennent en compte l'apparence de l'animal, les signes cliniques (température et les fréquences cardiaque et respiratoire), son comportement, la prise de nourriture et de boisson et l'aspect de la zone opérée. Le suivi de la douleur est évalué par 2 ou 3 personnes indépendantes (expérimentateurs et zootechniciens). Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, en supprimant la procédure chirurgicale d’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce au nouveau système de navigation cérébrale qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par des caméras infrarouge pour la navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous pouvons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre l’homme et le carnivore est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications démontrent une forte homologie entre le connectome cortical de l’homme et du PNH mais également de nombreuses différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur sous la peau et des injections répétées, avec imagerie et prélèvement sanguin, pour étudier un gène impliqué dans l'infiltration lymphocytaire des tumeurs du sein triple-négatives. Le porteur décrit le modèle murin comme "incontournable" et affirme que l'étude de ces infiltrations immunitaires ne peut se faire que dans un "animal entier". Toutes les souris sont euthanasiées pour analyse du sang et des tissus.

Objectifs

Un traitement par des agents chimiothérapeutiques, notamment les anthracyclines, est souvent utilisé pour réduire la taille des tumeurs avant chirurgie ou radiothérapie chez les patients atteints de cancer du sein. Récemment, il a été montré dans notre laboratoire que la présence de lymphocytes infiltrants les tumeurs après chimiothérapie est associée à un meilleur pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein de type triple-négatif (TNBC) qui est particulièrement agressif. Des publications récentes montrent que le traitement des patientes par chimiothérapie, notamment par les anthracyclines, pourrait favoriser la réponse immunitaire en provoquant la mort des cellules cancéreuses et permettre ainsi la présentation d'antigènes tumoraux induisant l'activation d'une réaction immunitaire spécifique, qui se traduit notamment par l’infiltration de la tumeur par les cellules immunitaires. Une analyse génomique récente menée dans notre laboratoire sur des échantillons provenant de patients TNBC après chimiothérapie a conduit à l'identification d'une combinaison de quatre gènes liés au système immunitaire et dont le niveau d'expression est corrélé au niveau d’infiltrats lymphocytaires intratumoraux. Un des gènes appartenant à cette signature génomique, a été trouvé en relation négative avec la présence de TILs. En d’autres termes, une expression élevée de ce gène inhibe l’infiltration des cellules du système immunitaire dans la tumeur.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge de certains cancers du sein (triple-négatifs) dans le cas ou l'attraction lymphocytaire est inhibée, si l'hypothèse est vérifiée.

Procédures

Injections: 5 par souris, durée 1 minute, sous anesthésie locale. Imagerie in vivo sous anesthésie générale: 1 fois, durée 15 minutes. Prélèvement de sang sous anesthésie 1 fois, durée 5 minutes.

Impact sur les animaux

Nuisances liées à la présence de tumeurs greffées sous la peau.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour analyses post-mortem sur le sang et les tissus.

Remplacement

Le but de ce projet est de déterminer l’implication du gène HLF (pour Hepatic leukemia factor) dans l’inhibition de l’infiltration des tumeurs du sein par les lymphocytes. Des études biostatistiques ont montré que lorsque ce gène est surexprimé dans les cellules tumorales de patientes souffrant de cancer de type TNBC, une inhibition de l’attraction lymphocytaire est constatée et corrélée à un mauvais pronostic. L’étude in vivo de l’infiltration lymphocytaires de tumeurs du sein induites chez la souris exprimant ou non HLF est indispensable afin de confirmer le rôle joué par ce gène dans ce processus et qui pourrait devenir une cible pour de nouvelles stratégies thérapeutiques. En effet, l'étude de ces infiltration en rapport avec l'immunité ne peut se faire que dans un animal entier.

Réduction

les lots d'animaux nécessaires seront réduits au nombre minimal nécessaire afin d'obtenir des résultats statistiquement valables. Un nombre minimum de 30 souris dans chaque lot a été déterminé comme nécessaire pour avoir des données fiables. Cependant, si les résultats obtenus avec une première série de 10 souris dans chaque série donnent des résultats significatifs et robustes, le nombre de souris utilisées sera diminué. Les résultats seront analysés statistiquement par analyse de variance.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront faites sous anesthésie générale (injections des tumeurs, imagerie in vivo) ou locale. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La lignée tumorale murine 67NR établie à partir d’une tumeur du sein spontanée chez la souris BALB/c est largement utilisée dans la littérature comme modèle d’étude des cancers de type TNBC. Cette lignée exprime le gène HLF et nous avons réussi à supprimer son expression par la technique CRISPR/Cas9. Le modèle murin est par conséquent incontournable dans notre projet pour l’étude in vivo du rôle joué par ce gène dans la réponse immunitaire antitumorale et en particulier dans l’infiltration des tumeurs par les lymphocytes. A partir de 6 semaines, pour que les souris aient un système immunitaire mature.