Recherche fondamentale

5 236 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent neuf tests comportementaux moteurs (activité locomotrice, coordination, force d'agrippement, anxiété), jusqu'à quatre injections et une chirurgie cérébrale sous anesthésie, certaines lignées mutantes voyant environ 30 % des souriceaux mourir avant l'âge adulte. Le porteur étudie des formes génétiques de dystonie qu'il qualifie lui-même de rares, tout en mobilisant plus de cinq mille souris. Il reconnaît l'existence de modèles cellulaires et informatiques mais affirme qu'ils ne peuvent "pas encore se passer" de l'expérimentation animale, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La dystonie est un trouble moteur caractérisé par des contractions musculaires pathologiques, provoquant des postures et/ou des mouvements anormaux, qui sont très handicapants et douloureux dans les formes graves. Les possibilités de traitements médicaux restent limitées, parce que les mécanismes physiopathologiques de cette maladie sont encore mal connus. Des altérations des voies de signalisation impliquant l’adénosine monophosphate (AMP) cyclique dans les neurones du striatum sont associées à différentes formes génétiques de dystonies. Le but de notre travail est d’utiliser des modèles de souris porteuses de mutations dans les mêmes gènes que ceux impliqués dans certaines formes de dystonies. L’objectif scientifique est de mieux comprendre les mécanismes physiologiques de ces maladies. Le projet consiste à caractériser les déficits moteurs et comportementaux ainsi que les altérations du fonctionnement neuronal chez les souris mutantes. De plus, nous étudierons les effets de certaines molécules pharmacologiques chez les souris mutantes, notamment dans l’espoir de trouver des médicaments capables de réduire des déficits moteurs à l’origine de la dystonie. Bien que les formes de maladies étudiées soient rares, notre étude pourrait suggérer des pistes pour améliorer les traitements des dystonies en général et d’autres troubles des mouvements.

Bénéfices attendus

Le projet fera progresser les connaissances dans les domaines de la physiopathologie des dystonies. Nous chercherons à trouver des traitements pharmacologiques susceptibles de réduire les troubles moteurs détectés dans les souris mutantes. En cas d’effets bénéfiques, les molécules actives constitueraient de nouvelles pistes thérapeutiques pour soigner les dystonies avec des retombées à long terme en médecine humaine.

Procédures

- 9 tests du comportement moteur : activité locomotrice (sessions de 5 min à 32 h, au maximum 11 sessions espacées d’au moins 24 h pour un animal), coordination motrice et son apprentissage (sessions de 5 min en général, au maximum 7 sessions espacées de 5 min par jour, pendant 7 jours), force d’agrippement (maximum 6 tests de quelques secondes, espacés de 30 min), et anxiété (session journalière de 30 min à 5 min selon les tests, durant au maximum 7 jours) - Au maximum 4 injections intra-péritonéales (30 s) ou orales (30 s) d’agents pharmacologiques et même nombre d’injections des solvants utilisés pour dissoudre les agents - 1 chirurgie cérébrale sur animal sous anesthésie et analgésie pendant 30 min - Elevage de souris mutantes avec un phénotype dommageable (maximum pendant 6 mois) - En fin de procédure, euthanasie de tous les animaux par différentes méthodes en fonction du type de prélèvements et d’analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

L’étude du comportement moteur des souris correspond à des tests assez simples (procédures d’une durée variant entre 32 h et 10 s) qui n’induisent aucune douleur, seulement un stress léger lié à la découverte de l’environnement du test. Le projet comprend plusieurs injections d’agents pharmacologiques, espacées dans le temps, sur le même animal. Les agents pharmacologiques utilisés provoquent des changements comportementaux marqués pendant un temps limité (1 à 2 h), mais ne stimulent pas directement la douleur. Certaines nuisances sont attendues en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Dans une lignée de souris mutantes nécessaire au projet, une létalité anormale a été observée dans environ 30% des souriceaux présentant un type de mutations particulières, entre 10 et 30 jours après la naissance. Ils présentaient un arrêt de la croissance alors que les autres souriceaux avec les mêmes mutations atteignaient l’âge adulte après un développement apparemment normal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour réaliser des analyses biochimiques, histologiques et physiologiques

Remplacement

Nous étudions des fonctions spécifiques du système nerveux dont l’exploration requiert un cerveau avec le moins d'altérations possibles et donc l’expérimentation sur l’animal. Notre projet propose de disséquer les conséquences des mutations d’ADCY5 et de GNAL sur le contrôle moteur et l’apparition de mouvements anormaux, mettant en jeu différents réseaux neuronaux. Le projet utilisera des approches intégrées sur animal entier, nécessitant des souris transgéniques et des études comportementales sur l’animal vivant. Certains mécanismes cellulaires peuvent cependant être étudiés sur des cellules en culture. Des modèles mathématiques et computationnels ont été développés pour comprendre les mécanismes neuronaux que nous étudions. Cependant, nos connaissances sur les processus neurobiologiques sont limitées et les modèles in silico ne peuvent pas encore se passer de validations avec de l’expérimentation animale. Cependant, nous nous efforçons, autant que possible, d’évaluer nos approches et d’adapter nos expériences en fonction du développement des modèles computationnels ou en culture cellulaire.

Réduction

Nous chercherons à réduire le plus possible la variabilité expérimentale par des protocoles expérimentaux rigoureux et par l’utilisation de groupes d’animaux le plus stables possibles en termes génétiques et d’hébergement. Le fond génétique des souris correspondra à des lignées consanguines, et donc par définition présentant une variabilité génétique minime. De plus les groupes de souris avec les différents génotypes seront issus des mêmes portées. Au cas où les différences de genre s’avéraient ne pas présenter d’interactions significatives avec les effets des différentes mutations, nous utiliserions dans la suite de l’étude des groupes mixtes, permettant de limiter le nombre de souris d’un sexe non utilisables pour les expériences. Le nombre total d’animaux impliqués dans le projet est de 5236 souris au maximum dont 5058 dans les procédures expérimentales proprement dites et 178 souris avec un phénotype dommageable qui mourront avant leur utilisation dans les expériences. En effet, dans une lignée, au maximum 712 souris avec un génotype potentiellement dommageable seront produites, 534 incluses dans les procédures expérimentales et 178 non utilisables. D’une façon générale, les résultats seront analysés et interprétés grâce à des méthodes statistiques rigoureuses et éprouvées. La taille des groupes d’animaux inclus dans les expériences est estimée en se basant des travaux précédents. 10 animaux par groupe seront en général suffisants pour dégager des effets significatifs du point de vue statistique dans les tests comportementaux envisagés.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus au maximum et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Dans le projet, la souris sera utilisée afin de tirer profit des techniques de transgénèse très efficaces dans cette espèce. La souris est le modèle le plus utilisé pour les maladies humaines du mouvement. Pour ces études, il existe de nombreux tests comportementaux qui sont développés chez la souris. La souris a des mouvements coordonnés des pattes pour des comportements moteurs élaborés et elle est déjà utilisée dans des modèles de mouvements anormaux hyperkinétiques, particulièrement pertinents dans l’étude des pathologies étudiées ici. Le striatum murin, comporte également une organisation anatomo-fonctionnelle proche de celles des primates non humains et des humains. Cela en fait ainsi un modèle particulièrement utile à l’étude d’une maladie striatale, telle que les mouvements anormaux liés aux mutations des gènes que nous étudierons. Expériences chez des animaux adultes femelles et mâles. Les animaux utilisés seront adultes avec un âge supérieur à 8 semaines. Le projet s’intéresse à la pathogenèse et la thérapeutique des mouvements anormaux qui sont observés à l’âge adulte même si les symptômes apparaissent très souvent dès le plus jeune âge. C’est pourquoi, nous n’étudierons que des animaux adultes dans le cadre de ce projet. De plus, les femmes et les hommes peuvent être affectés par les maladies étudiées et c’est la raison pour laquelle des souris femelles et mâles seront incluses dans l’étude.

864 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est soumise à un régime gras pendant dix semaines pour provoquer obésité et diabète, et toutes reçoivent jusqu'à vingt-deux injections sous anesthésie locale et une dizaine de prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur cherche à neutraliser une protéine pour traiter la prise de poids provoquée par un médicament de la schizophrénie. Il affirme l'usage d'animaux vivants "indispensable", l'appétit et le comportement alimentaire étant selon lui impossibles à reproduire in vitro.

Objectifs

Le médicament étudié est utilisé pour le traitement de la schizophrénie. Contrairement à d’autres molécules, ce produit ne provoque pas d'effets secondaires notables. Cependant, le traitement par ce médicament a été associé à des augmentations de poids cliniquement significatives et à l’induction du diabète. Il a récemment été découvert qu'une protéine libérée par les cellules et les organes agit comme un stimulateur. L'augmentation systémique de cette protéine augmente de manière extracellulaire l'apport alimentaire, réduit la glycémie et favorise la génération de graisses au niveau systémique. La neutralisation de cette protéine apparaît comme une cible d'intérêt dans la lutte contre l'obésité, du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de cette étude expérimentale est de déterminer si la neutralisation de cette protéine peut traiter l'obésité induite par le médicament étudié.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider une nouvelle stratégie thérapeutique dans des modèles précliniques pour prévenir ou traiter l'obésité induite par certains médicaments.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections (pour un groupe 22 injections (sur 11 semaines), pour un un groupe 4, et pour un groupe 5 injections, durée 1 minute, sous anesthésie locale). La moitié des souris sera soumise à des régimes riches en gras pendant 10 semaines. Tous les animaux seront soumis à 10 micro-prélèvements de sang (durée 1min) et à 1 prélèvement de sang plus important en fin de procédure (durée 2min, sous anesthésie locale).

Impact sur les animaux

Les injections ou prélèvements sous anesthésie locale induisent des nuisances très limitées au site. La contention, les prélèvements et les injections peuvent stresser transitoirement les animaux. Les régimes riches en gras induisent une prise de poids et peuvent être obésogènes et induire le diabète. Les prélèvements de sang, très limités en volume, ne provoqueront qu'un inconfort local et transitoire.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Le nombre nécessaire d'animaux a été déterminé grâce à une analyse statistique préalable. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront suivis chaque jour pour observer leur comportement, leur score sera déterminé, et dès l'apparition d'un signe de douleur, les animaux recevront un antiinflammatoire non stéroïdien (metacam). Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale (Lidocaïne). Les animaux seront hébergés en groupe sociaux et recevront nourriture et boisson ad libitum. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour le projet proposé, la physiologie et la génétique de la souris sont suffisament proches de celles de l'être humain pour pouvoir tirer des conclusions valides des procédures envisagées. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules tumorales puis un transfert de cellules par voie rétro-orbitaire, avant d'être tuées pour analyser les cellules immunitaires de la tumeur. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les mouvements, réduire le toilettage et modifier le comportement social des souris. Il annonce une "ambition" de thérapie innovante ciblant une protéine des cellules immunitaires, en reconnaissant que l'effet anti-tumoral reste une hypothèse à valider.

Objectifs

La prise en charge thérapeutique des maladies cancéreuses reste un problème majeur de santé. Malgré des progrès significatifs dont des stratégies de détection précoce, les traitements afin d’améliorer la qualité et l’espérance de vie reste globalement en dessous des attentes. Les protocoles thérapeutiques ciblant les cellules tumorales consistent pour la plupart à l’utilisation de la chimiothérapie intervenant sur la prolifération cellulaire incontrôlée. Il en résulte une importante exposition des cellules saines à ces substances cytotoxiques, avec pour conséquence une toxicité importante à court terme et une réelle implication à moyen terme dans le développement d'autres tumeurs ou "récidives". Les récentes études ciblant de nouvelles approches thérapeutiques se sont intéressées au microenvironnement tumoral. La compréhension des processus immunitaires du microenvironnement tumoral permet l'identification de nouveaux acteurs jouant un rôle fondamental dans la genèse, la communication (interactions cellules-cellules) , le développement et la possibilité de récidive de la tumeur. Les tétraspanines (Tspans) font partie de ces nouveaux acteurs. Ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux tels que la migration, la communication, l'adhésion, la fusion ainsi que la formation de vésicules extracellulaires(EVs). Ce sont des marqueurs significatifs dans un grand nombre de cancers, tels que les cancers du sein, des ovaires ou de la prostate, ce qui en font de potentielles cibles thérapeutiques. La tétraspanine 29 ( Tspan29) ou CD9 est une molécule largement présente sur lescellules B régulatrices (Bregs), dont le rôle fondamental a été démontré dans le développement et la propagation du processus tumoral. Bloquer spécifiquement cette cible sur ces cellules devrait permettre de bloquer le processus tumoral à plusieurs niveaux. L’objectif de ce projet est d’étudier la tétraspanine 29 (Tspan29) ou CD9 comme cible potentielle sur les Bregs en émettant l’hypothèse qu’une action ciblée conduirait à une réduction de la progression tumorale.Plusieurs molécules visant spécifiquement le CD9 ont été identifiées en amont et seront testés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de contribuer à mieux caractériser le rôle des Bregs dans le cancer et l’intérêt de l’utilisation de bloqueurs des Tspans dans la genèse, la prolifération, la dissémination et la communication des cellules tumorales. Nous supposons qu’une action ciblée sur la molécule CD9 permettra de bloquer ou modifier les fonctions suppressives des Bregs CD9 et de leurs vésicules ce qui aura un effet bénéfique sur le cancer. Ainsi notre étude permettra d’aboutir à la sélection du ou des candidats permettant la meilleur inhibition de la molécule CD9 avec un effet anti-tumoral francs. Notre ambition est de développer et de proposer une approche innovante de la thérapie du cancer qui prenne en compte le microenvironnement de la cellule cancéreuse, notamment les Bregs.

Procédures

Les animaux seront soumis à une phase d'induction du modèle tumoral par injection en sous-cutané de cellules tumorales une seule fois. Puis une semaine après l'injection des cellules tumorales, un transfert adoptif de cellules par voie retro-orbitaire sera effectué une seule fois pour chaque souris. Les animaux ne seront pas soumis à d'autres actes, ni de prélèvements durant la phase d'expérimentation.

Impact sur les animaux

Pour tous protocoles avec un modèle tumoral, les animaux peuvent éprouver des effets indésirables : Un effet sur la mobilité de la souris ou une gêne dûe aux tumeurs sous-cutanées. Une diminution du toilettage avec l’apparition des tumeurs. Une perte de poids. Une modification du comportement social avec l’apparition des tumeurs.

Devenir

Tous les animaux inclus dans la procédure seront euthanasiés à la fin de celle-ci afin d'identifier les cellules immunitaires infiltrants les tumeurs et analyser les cellules spléniques en complément des données des mesures tumorales.

Remplacement

Dans nos premières phases de tests de caractérisation, les tests sur les animaux seront remplacés par des tests in-vitro sur cellules humaines. Néanmoins pour la suite du projet, l’animal reste essentiel afin de prendre en compte les interactions dans le microenvironnement et valider l’effet anti-tumoral in-vivo.

Réduction

Notre projet s’inscrit dans une démarche de la réduction du nombre d’animaux au cours des différentes phases. Nos collaborateurs synthétiseront de nombreux inhibiteurs qui pourraient nécessiter un nombre conséquent d’animaux. Néanmoins nous avons fait le choix de sélectionner que 8 inhibiteurs présentant l’interaction la plus efficace avec le CD9. De plus les molécules sélectionnées poursuivront une phase de caractérisation et validation in-vitro qui pourrait conduire en fonction des résultats à une diminution du nombre de molécules à tester in-vivo et donc du nombre d’animaux nécessaires. Les groupes seront constitués de 6 animaux par conditions (cf tableau) permettant une approche statistique pertinente. Nous opterons pour une répétabilité (triplicate) par expérimentation afin d’éliminer des biais potentiels, néanmoins celle-ci pourrait être réduite à 2 en l’absence de biais.

Raffinement

Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnant à base de frisure de papier kraft sera mis dans les cages des animaux. Si des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation des souris pourraient être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme pour les souris isolés ou en binôme. Les animaux seront conditionnés afin de limiter le stress lors de la manipulation. Ainsi avant toutes manipulations, un stimulus sonore (tapotement sur la cage) sera réalisé avant récupération pour les phases de manipulation. Les animaux associeront ce stimulus sonore à une manipulation à venir. Notre expérimentation sera basée sur des études préliminaires afin de déterminer le nombre de cellules à injecter permettant un développement tumoral avec un moindre impact sur le bien-être des souris. Des points limites seront définis afin d’éviter la détresse et la douleur lors de l’expérimentation. Un système de suivi avec un score sera mis en place (cf annexe). Celui-ci tiendra compte de différents signes cliniques. La mesure tumorale sera effectuée tous les deux jours 1 semaine après l’injection des cellules tumorale et le critère du volume tumoral sera un point limite permettant l’arrêt de l’expérimentation si celui-ci dépasse la valeur définie.

Choix des espèces

Les modèles murins sont largement utilisés avec de nombreuses données dans la littérature. Ce modèle tumoral étant déjà utilisé et référencé chez le rongeur, la mise au point n’est pas nécessaire. Le choix des espèces et souches est basé sur les études existantes. Les souris seront utilisées entre 6 semaines-8 semaines de vie en conformité aux articles de référence.

1 200 rongeurs, 1 080 souris et 120 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des injections de molécules et des prélèvements sanguins sous anesthésie, avant d'être tués pour analyser la distribution des produits dans leurs organes. Le porteur présente ces actes comme des prestations de service facturées à des clients, qui définissent eux-mêmes le protocole et l'espèce, la plateforme réalisant l'imagerie sur les modèles fournis. Il affirme que les études in vitro ne peuvent représenter à elles seules "la complexité du vivant" et justifie ainsi le recours à l'animal pour valider les molécules de ses partenaires.

Objectifs

De nos jours, de nombreux laboratoires de recherche publics et privés sont fortement intéressés par des prestations en imagerie chez le rongeur dans le domaine de l’oncologie afin de développer des nouveaux radiotraceurs pour l’imagerie in vivo qui permettraient d’améliorer le diagnostic ou le suivi de la réponse thérapeutique à terme chez des patients atteints de cancers. Notre plateforme spécialisée dans l’imagerie in vivo propose la réalisation de ce type prestations grâce à des équipements dédiés à l’imagerie du petit animal : scanner à rayons X, imageur optique (bioluminescence et fluorescence in vivo), imagerie radioactive en tomographie par émission de positions (TEP) et tomographie par émission mono-photonique (TEMP), ceci sur des animaux sains et des modèles animaux de diverses pathologies, dont les cancers.

Bénéfices attendus

La réalisation des prestations de service permet de faire avancer la recherche de nos partenaires et clients dans le domaine de l’imagerie et de l’oncologie. Il s’agit notamment de valider l’utilisation molécules capable de mettre en évidence, de façon non invasive par imagerie in vivo, certaines caractéristiques des tumeurs ; ceci dans le but de mieux identifier les cancers et pouvoir suivre leurs réponses à la thérapie.

Procédures

Les animaux seront soumis : - à une injection de cellules tumorales en sous-cutané réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats et souris) - durée environ 5 min. - à une injection d'une molécule d'intéret en imagerie in vivo en intraveineuse, intrapéritonéal ou intra-tumoral - réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats) ou sur animaux vigiles (souris) - durée environ 1-2min. Si besoin les injections pourront être répétées dans le temps à raison d'une injection/j maximum. - ou à une injection d'une molécule d'intéret en imagerie in vivo en intraveineuse via un cathéter inséré dans la veine caudale- réalisée sur animaux anesthésiés à l'Isoflurane (rats et souris) - durée environ 5 min. - éventuellement (si cela est nécessaire et demandé par le client) à un prélèvement de sang au niveau de la veine de la queue (rats) ou en rétro-orbitaire (souris) - réalisé sous anesthésie gazeuse - durée environ 1-2min.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont liées aux différentes séries d’injections et de prélèvement réalisées sur les animaux vigiles ainsi que le stress pouvant survenir lors de l'anesthésie pour les imageries.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des études de biodistribution ex vivo.

Remplacement

Les études ex vivo ou in vitro ne peuvent représenter à elles-seules la complexité du vivant. Pour l’étude du devenir de molécules à visées diagnostique et/ou thérapeutique, la physiologie globale de l’individu, son métabolisme entrent en jeu. La biodistribution de radiotraceurs ou d’agents de contraste requiert la détermination de paramètres pharmacocinétiques des molécules candidates sur des modèles animaux adaptés et l’imagerie fonctionnelle de tumeurs ou d’un organe particulier requiert leur fonctionnement à l’échelle de l’individu.

Réduction

Pour chaque projet, le design de l’étude est discuté et mis en place conjointement par le client et le personnel en charge en charge de la prestation dont plusieurs membres font partie du comité d’éthique local et de la Structure Bien Etre Animal de l’établissement et apportent un regard expert sur l’étude. Cet échange permet d’identifier les points pouvant être raffinés tels que le double emploi injustifié d’animaux, des procédures répétées injustifiées ou un nombre d’animaux inapproprié. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum tout en permettant l’exploitation des résultats. Leur nombre est calculé afin de garantir une signification statistique à l'étude menée. Les procédures d’imagerie présentent l’avantage de permettre le suivi d’un même animal dans le temps et donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la validation d’une étude.

Raffinement

Les modèles animaux choisis par nos clients sont reconnus par la littérature pour reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine ou pour l’expression d’une cible donnée. Des méthodes sont utilisées afin d’optimiser au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela, les conditions d'hébergement seront optimisées (portoirs ventilés, température, hygrométrie, luminosité, densité animale, enrichissement de milieu avec coton pour la nidification, bâtonnet de bois pour ronger et cabane de cachette). De façon usuelle, les cages (litière, cage, grille, couvercle et biberon) sont changées toutes les semaines. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de déceler les premiers signaux de stress, de douleur ou d'inconfort pour l'animal qui pourront être améliorés par l'administration d'antalgiques avant l'atteinte des points limites définis. Si aucune amélioration n’est observée, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale est déterminé par le client compétent dans le domaine et après une étude de la littérature scientifique sur le sujet afin de modéliser au mieux la pathologie à étudier. 90% des études réalisées sur notre plateforme sont réalisées sur des souris (modèles syngéniques ou xénogreffes de cellules cancéreuses). Les 10% restant sur des rats (modèles syngéniques). En accord avec la littérature scientifique dans le domaine, les animaux utilisés seront à l’âge adulte.

539 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de greffe tumorale sous-cutanée, trois injections et trois prélèvements sanguins sous anesthésie, avec un suivi par imagerie, pour étudier la distribution de nanoparticules lipidiques censées cibler les cellules cancéreuses. Le porteur signale un inconfort modéré après la chirurgie et un risque de nécrose des tumeurs. Les retombées annoncées, une avancée majeure contre le cancer, restent renvoyées à la recherche clinique future, et le porteur juge le recours à l'animal "incontournable" pour reproduire la complexité de l'organisme entier.

Objectifs

On observe depuis une dizaine d’années un nombre croissant d’applications médicales utilisant des médicaments à base d’acides nucléique. Ces petits fragments d’ADN ou d’ARN ont la capacité de moduler l’expression des gènes et offrent de nouvelles perspectives pour le traitement de certaines pathologies comme le cancer. Malheureusement, à ce jour les champs d’applications sont encore restreints du fait de la difficulté à transporter ces acides nucléiques jusqu’à leur cible cellulaire. Leur faible capacité à circuler dans l’organisme et à atteindre leur cible sans subir de dégradation est un frein majeur à leur développement. Les nanoparticules lipidiques sont l’un des systèmes d’administration pharmaceutique les plus utilisés dans le secteur pharmaceutique. Ce sont des vecteurs efficaces pour transporter différents types de traitements, notamment les acides nucléiques. L’application la plus récente est celle de la vaccination avec les vaccins anti COVID 19 à base d’ARN messager. Cependant, les LNP administrées par voie sanguine vont se stocker majoritairement dans le foie. Notre objectif est de développer de nouvelles particules lipidiques capable de cibler les cellules cancéreuses où elles pourront délivrer leur chargement thérapeutique en acides nucléiques.

Bénéfices attendus

La mise au point de nanoparticules lipidiques chargées en acides nucléiques ciblant les cellules cancéreuses serait une avancée majeure dans le traitement des cancers car elle permettrait d’exploiter le formidable potentiel thérapeutique de cette classe thérapeutique. Les applications des acides nucléiques sont encore limitées au traitement des maladies hépatiques et en vaccination et trouver le moyen de les transporter jusqu’aux tumeurs permettrait d’ouvrir un nouveau pan de recherche clinique.

Procédures

Les souris subiront sous anesthésie générale une petite chirurgie sous-cutanée pour induire une tumeur qui durera 10 minutes. et 3 injections d’une durée de 2 minutes. Trois prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale d’une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent ressentir un inconfort modéré et transitoire après la chirurgie (pendant 1 à 2 jours). Un risque de nécrose des tumeurs est possible et à surveiller.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à l’issue des procédures pour des analyses complémentaires sur les tisssus et les cellules.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le devenir in vivo de nos nanoparticules lipidiques et plus particulièrement le ciblage des cellules cancéreuses. Les interactions multiples entre les nanoparticules lipidiques, les protéines plasmatiques, le passage dans les différents organes (notamment le foie) et l’action du système immunitaire ne sont pas encore modélisables in silico. Le recours à l’animal est donc incontournable pour reproduire cette complexité et évaluer correctement la distribution des nanoparticules lipidiques dans l’organisme entier.

Réduction

Nous avons privilégié une étude longitudinale en imagerie qui contribuera à réduire le nombre d’animaux utilisés et à optimiser la quantité de données obtenues sur chaque animal. Chaque animal sera son propre témoin. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience sera construit afin d’éviter les biais expérimentaux. Une étude pilote sur quelques animaux nous permettra de mettre au point la technique.

Raffinement

Les procédures expérimentales s’effectueront sous anesthésie générale afin de réduire la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Un protocole analgésique adapté sera mis en place en cas de besoin pour la gestion de la douleur. Une surveillance quotidienne des animaux permettra de suivre leur bien-être. Une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites adaptés au-delà desquels la procédure sera arrêtée. La technique d’imagerie utilisée dans ce projet est une technique non invasive qui favorise le bien-être animal. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi afin de favoriser les comportements naturels.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris pour notre modèle de cancer car c’est une espèce pour laquelle les modèles sont bien documentés dans la littérature et pour laquelle nous avons une expertise. Les souris seront âgées de 8 à 12 semaines, correspondant à des souris adultes.