Recherche fondamentale

624 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun jusqu'à treize heures, des gavages, des prélèvements sanguins à la queue avec incision, des injections et une chirurgie de prélèvement en veine porte, et pour certaines seize semaines d'alimentation grasse et sucrée induisant obésité et pré-diabète. À la fin, toutes sont mises à mort par dislocation cervicale pour prélever leurs organes. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'animal pour cette "physiologie intégrée" entre intestin, pancréas et foie.

Objectifs

Le diabète de type 2 est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique, c'est-à-dire par un taux trop élevé de glucose dans le sang. Cette maladie, qui survient généralement avec l’âge, touche davantage les personnes obèses. Elle se caractérise par une insulino-résistance et une perte progressive des capacités de sécrétion d’insuline par les cellules béta pancréatiques, l’hormone qui régule la glycémie. A l’heure actuelle, les traitements utilisés ciblent soit l’action de l’insuline soit sa sécrétion, alors qu’un ciblage des 2 composantes serait plus efficace. Par conséquent, il est crucial d’identifier de nouveau mécanismes contrôlant simultanément l’action et la sécrétion d’insuline pour mieux réguler l’hyperglycémie des patients diabétiques. Le projet vise à valider un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la régulation de la glycémie qui implique un dialogue entre l’intestin, le pancréas et le foie via la sécrétion d’une hormone intestinale appelée GLP1, qui est produite par les cellules intestinales après un repas et qui va réguler l’action et la sécrétion d’insuline. Ainsi, l’objectif est de valider chez la souris ce nouveau mécanisme intracellulaire en l’étudiant de manière concomitante dans l’intestin, le pancréas et le foie afin de définir s’il pourrait constituer à l’avenir une nouvelle piste de traitement préventif et/ou curatif de l’hyperglycémie chez les patients diabétiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet de recherche est de valider une nouvelle hypothèse mécanistique impliquée dans le contrôle de la glycémie et de mettre en évidence de futurs moyens de prévention et/ou traitement du diabète de type 2. Si nos hypothèses sont validées chez la souris, nous initierons ensuite des tests chez l’homme et tenterons d’identifier des molécules capables de réguler ce mécanisme intracellulaire.

Procédures

Au cours des 4 procédures décrites dans ce projet, les souris seront soumises à : - des mises à jeun (1 à 3 selon les procédures) d’une durée de 6h30 à 13h maximum. - un gavage unique sur animal vigile (durée: 30 secondes) - des prélèvements sanguins de petits volumes (entre 2 et 6 selon les procédures) à la queue des souris pour les mesures de glycémie et d’insuline, associés à une incision unique de la queue puis un grattage du coagulum pour les prélèvements successifs. - des injections (1 à 2 selon les procédures) sur animal vigile lors des tests métaboliques (durée: 30 secondes). - une chirurgie associée à une analgésie 30 minutes avant l’anesthésie générale afin de réaliser un prélèvement sanguin en veine porte. - une alimentation riche en graisse et en sucre durant 16 semaines consécutives qui va induire une prise de poids des souris sans altérer leur mobilité.

Impact sur les animaux

- une prostration, la présence de sang dans la canule ou un gonflement de l’œsophage potentiel suite au gavage. - une sensation de faim et une hypoglycémie suite à la mise à jeun de 12-13h. Ces modifications physiologiques peuvent donc être responsable d’un stress chez l’animal et d’une baisse d’activité les conduisant à nicher dans leur nid. - une douleur transitoire au point d’injection lors des injections au cours des tests métaboliques. - Une hyperglycémie transitoire au cours des test métaboliques. Ces variations de glycémie sont des réponses physiologiques transitoires qui n’affectent pas l’état général des souris. L’hyperglycémie provoquée lors des tests revient à la normale au bout de 90 minutes. - une obésité liée à l’alimentation riche en lipides et en sucrose et un pré-diabète associé à une hyperglycémie modérée. Nos études préalables démontrent que leur prise de poids ne les empêche pas de se mouvoir dans la cage et d’accéder et la mangeoire et que leur pré-diabète ne modifie pas de manière majeure leur prise hydrique ni leur besoin d’uriner.

Devenir

A la fin des procédures, toutes les souris seront mises à mort par dislocation cervicale pour le prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Ce projet vient compléter des données déjà obtenues in vitro dans des lignées cellulaires de chacun des tissus d’intérêt (colon, foie et pancréas). Néanmoins il s’agit ici d’aller plus loin et de montrer qu’il y a une co-régulation de notre nouveau mécanisme intracellulaire dans ces 3 organes suite à un repas et que cela est nécessaire pour un contrôle optimal de la glycémie. Il s’agit donc d’un projet de physiologie intégrée où aucune alternative non animale n’est disponible. D’autre part, on veut également déterminer si ce nouveau mécanisme physiologique est dépendant ou pas du sexe, et ce paramètre n’est pas analysable autrement que sur animal.

Réduction

Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, nous allons comparer différents traitements en même temps afin de n’avoir qu’un groupe de souris contrôle. Le nombre de souris est calculé au plus juste tout en offrant la puissance statistique nécessaire pour l’interprétation des résultats scientifiques. Les paramètres mesurés étant très variables d’une souris à l’autre, un nombre minimal de 12 souris par groupe est nécessaire. Nous envisageons de potentiellement répéter une fois les procédures afin de compléter les études si nécessaires (soit 24 souris/groupe au maximum en final).

Raffinement

Les souris sont surveillées individuellement 3 fois/semaine et nous utilisons des points limites adaptés à nos procédures. Les gavages seront réalisés par une personne expérimentée à l’aide d’une sonde de gavage adaptée à la taille des souris. Pour les souris soumises à une alimentation riche en lipides et en sucrose, le nombre de souris par cage est diminué pour qu’elles aient suffisamment de place pour se mouvoir. L’alimentation hypercalorique va induire une prise de poids qui ne gêne pas la motricité des souris qui peuvent toujours accéder à la mangeoire. Néanmoins, des croquettes seront rajoutées dans la litière. Pour les prélèvements en veine porte qui nécessite une chirurgie, les animaux sont analgésiés 30 minutes avant d’être anesthésiées.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car leur physiologie est « proche » de l’homme pour le contrôle de la glycémie. Selon les procédures, nous utiliserons soit des souris adultes de 10-12 semaines qui ont terminé leur croissance et ont un poids compatible pour la contention, les gavages et prélèvements sanguins, soit des souris de 5 semaines quand il s’agit de les nourrir avec une alimentation riche en graisse et sucre, dont les effets métaboliques sont plus marqués si débutée rapidement après le sevrage.

840 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des bruits de deux à huit heures par jour pendant jusqu'à 180 jours, exposition pouvant provoquer un stress chronique et des dommages de l'oreille, une partie subissant aussi la pose chirurgicale d'implants cardiaques ou neuronaux. Le porteur étudie les effets du bruit sur les circuits auditifs et choisit la gerbille pour son audition proche de celle de l'humain. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet de simuler un système auditif entier de millions de neurones.

Objectifs

On distingue la surdité qui est un terme générique désignant la diminution de l’acuité auditive. La grande majorité des surdités sont neurosensorielles et ont essentiellement pour origine l'oreille interne et la transduction mécano-électrique de la vibration sonore en activité neurale. Actuellement, en l’absence de traitement curatif, la surdité neurosensorielle nécessite d’être compensée par une prothèse auditive. L’exposition à un bruit excessif est la première cause environnementale de surdité neurosensorielle. Une exposition supérieure à 105 dB d’une heure provoque ainsi des dommages irréversibles. Les dommages dépendent à la fois du niveau de l’intensité sonore et de la durée de l’exposition. La législation du travail a fixé des seuils de tolérance, en prenant comme base un niveau d’exposition moyen sur 8h : • Au-delà de 80 dB SPL (sound pressure level), des dispositifs de réduction du bruit doivent être proposés (casques par exemple). • Au-delà de 85 dB SPL, ces dispositifs doivent être utilisés et contrôlés. • Au-delà de 87 dB SPL (casques inclus), le bruit doit être réduit. La surexposition sonore dans les mégalopoles, constitue une menace grandissante pour l’audition à l’échelle planétaire. Les conséquences au niveau central des surexpositions au bruit sont peu étudiées. Les conséquences du bruit sur la santé des individus et leurs interactions sociales restent également un sujet de recherche actif. Il existe une grande variabilité individuelle dans la sensibilité aux atteintes auditives déclenchées par le bruit. L’objectif majeur de notre projet de recherche est le suivant : Etudier les conséquences sur les réseaux neuronaux auditifs et la santé des individus d’un son d’intensité moyenne/forte dans la durée. Nous caractériserons la façon une exposition sonore continue impacte les circuits auditifs centraux chez un modèle animal, la gerbille, dont les gammes de fréquences sont plus similaires à celles entendues par l’Homme que la souris habituellement utilisée. Cette analyse se fera à plusieurs échelles : i) modifications anatomiques, ii) modifications fonctionnelles des réseaux, iii) modifications comportementales et iv) modifications physiologiques. Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets globaux du bruit sur la santé en reliant pour la première fois les atteintes physiologiques, cérébrales et comportementales.

Bénéfices attendus

Le suivi des animaux pendant et après l’exposition sonore, du point de vue de l’activité neurale, des modifications anatomiques et de l’évolution des performances comportementales, permettra de mieux appréhender les effets physiologiques et cognitifs du bruit auquel sont confrontés les humains quotidiennement. La plupart des études précédentes ont étudié chaque variable séparément, mais c’est bien dans la relation entre ces différents effets que l’on développera une vision d’ensemble scientifiquement pertinente. Un point crucial est que faire plusieurs mesures sur un même animal est donc non seulement scientifiquement utile mais est éthiquement intéressant puisque cela permet de réduire drastiquement l’usage d’animaux. Certaines questions importantes mais peu étudiées comme l’adaptation des performances du cerveau à la présence durable de bruit environnemental quotidien seront ainsi résolues.

Procédures

Tous les groupes d’animaux subiront des expositions sonores de 2h à 8h par jour pendant au maximum 180 jours. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit chez les rongeurs. En parallèle de ces expositions sonores, deux groupes d’animaux sont soumis à trois interventions. Dans la première intervention, des chirurgies ponctuelles à poser des implants physiologiques (activité cardiaque, premier groupe), neuronaux (deuxième groupe) et une puce d’identification (les deux groupes) sont susceptible d’entrainer des douleurs post opératoires minorées par des antalgiques. La pose d’implants et la mesure préalable de l’audition des animaux nécessitent leur anesthésie pendant environ 4h. Si la procédure se déroule bien, les animaux récupèrent de ces chirurgies en quelques jours. La deuxième intervention est une phase d’habituation puis d’enregistrement de l’activité neurale ou cardiaque, elle est réalisée sur l’animal en liberté ou tête fixée, elle s’étale sur plusieurs jours, environ 1 à 2h par jours, sans douleur pour l’animal. La troisième intervention est un suivi comportemental de l’animal, il ne comporte aucune privation hydrique ou alimentaire ni douleur. L’animal est ensuite mis à mort. Pour un troisième groupe d’animaux, l’enregistrement neuronal est fait durant l’anesthésie, celle-ci dure 8h à 9h mais l’animal est ensuite mis à mort. Ces animaux ne subissent donc qu’une intervention.

Impact sur les animaux

Les gerbilles seront exposées à des bruits pendant 2h à 8h par jour. Ces expositions peuvent potentiellement induire un stress chronique et possiblement des dommages de l’oreille. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité liée au bruit, au moins à l’échelle de quelques semaines, chez les rongeurs. Des chirurgies ponctuelles visant à enregistrer l’activité cérébrale, à poser des implants physiologiques (activité cardiaque) ou neuronaux seront effectuées. Les animaux récupèrent de ces chirurgies généralement en quelques jours. Les nuisances associées sont des douleurs post-opératoires minorées par des antalgiques.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans les procédures expérimentales seront mis à mort à la fin de chaque ou plusieurs procédures car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. En effet, il n’est pas possible actuellement de simuler de manière pertinente les effets des entrées sensorielles sur des circuits cérébraux composés de millions de neurones densément connectés, en interaction avec l’évolution des niveaux de stress des animaux.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant.

Raffinement

Les animaux seront regroupés pour réduire le stress d’isolement social et des jouets d’enrichissement seront disposés dans la cage. Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. S’il apparaissait un état général de l’animal anormal (notamment suite aux chirurgies) en considérant tous les critères généraux de bonne santé d’un animal de laboratoire (poids - pesée tous les 1 à 2 jours la 1ère semaine de stimulation ou après chirurgie - stress, comportement, pelage), celui-ci sera mis à mort immédiatement. En particulier les points suivants entraineront une mise à mort immédiate : - Chirurgies ou implantation de puces : douleur au niveau des interventions (prurit sévère, saignement infection), absence de prise alimentaire et d’hydratation spontanée. - Stimulation sonore : prostration, douleur au niveau de la tête et des oreilles

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux gerbilles, modèle de laboratoire dont le système auditif et les performances auditives sont très similaires à l’homme. En particulier, les gerbilles, contrairement aux souris ou rats sont capables d’entendre et traiter des sons basse fréquence correspondant aux signaux de parole chez l’homme. D’autre part, sa relative petite taille (deux à trois fois le poids d’une souris) rend la plupart des équipements existants pour la souris compatibles avec la gerbille. C’est donc un modèle animal très bien adapté à l’étude de l’audition au niveau central. Enfin, l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble. Le projet impliquera principalement des animaux adultes prioritairement ET/OU âgés d’au moins P90 (90 jours d’âge) afin de pouvoir étudier les effets du bruit sur le système auditif. Dans le cas d’expérimentations visant à établir l’effet des expositions bruyantes sur le développement du cortex auditif, les gerbilles seront éventuellement exposées (via des enceintes acoustiques) en portée avec leur mère avant le sevrage.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes sous-cutanées de cellules tumorales, une ablation des testicules pour une partie d'entre elles, puis des traitements par gavage et injections quotidiennes pendant 28 jours, la croissance des tumeurs pouvant provoquer douleur et irritation. Le porteur cherche à cibler des cellules responsables de la récidive du cancer de la prostate et affirme avoir mené en amont les études en culture 2D et 3D, aucun système in vitro ne reproduisant selon lui les stades du développement tumoral. Les souris atteignant un score de souffrance élevé seront mises à mort avant le terme.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes en France et le second en termes de mortalité par cancer. Pour les cancers de la prostate invasifs, la seule thérapeutique proposée est la castration chimique (déprivation en androgène) qui est efficace, dans un premier temps, mais dans 100% des cas la tumeur récidive en étant agressive (métastases). Dès lors, il n’existe aucun traitement efficace conduisant inéluctablement au décès du patient. Une équipe de recherche a identifié des cellules potentiellement initiatrices de cette récidive tumorale dans la prostate chez la souris, Dans un modèle de souris génétiquement modifié développant un cancer de la prostate résistant à la castration, la proportion de ces cellules est fortement augmentée. Ces cellules ont pu être isolées et caractérisées, ce qui a permis de déterminer deux cibles thérapeutiques théoriques exprimées par ces cellules. En utilisant deux drogues, chacune agissant sur une de ces cibles, nous montrons que ces drogues sont très efficaces pour tuer ces cellules et que leur effet est additif dans un modèle de culture en 3D, et ce en présence et en absence d’androgène. Ces cellules ont aussi été identifiées chez l’Homme. Sur une lignée cellulaire humaine de ce type de cellules issue d’une tumeur prostatique de patient, nous avons montrés la même efficacité de ces drogues. L’objectif de ce projet est d’évaluer/confirmer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques, administrés seul ou en combinaison, sur le développement et la récidive tumorale chez la souris ayant reçue préalablement une greffe de ces cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire d’identifier les cellules responsables de la récidive tumorale et de les cibler de façon thérapeutique. Les études préliminaires in silico et in vitro nous ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire possédant les propriétés requises à l’initiation de la récidive et en faisant donc une population cellulaire candidate. Des expériences in vitro, qui inhibent les capacités progénitrices et prolifératives de ces cellules nous ont permis de trouver deux protéines cibles. Ce projet permettrait de définir in vivo, chez la souris, si leurs inhibiteurs, administrés seuls ou en combinaison, sont capables d’inhiber le développement tumoral et/ou faire régresser une tumeur déjà établie dans un contexte naïf (présence d’androgènes) ou d’hormonothérapie (castration). Ces tests seront faits sur des tumeurs d’origine murine mais aussi humaine.

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des injections sous-cutanées de cellules tumorales primaires ou de lignées humaines. - 2- Des observations des tumeurs sous anesthésie gazeuse durant 30 min (isoflurane) après maximum trois mois de développement tumoral. - 3- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique (injection sous cutanée 30 min avant l’intervention puis à J+1 et à J+2 si nécessaire). - 4- Des traitements en injections (de moins d’une minute) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 5- Des traitements en gavage (de moins d’une minute) tous les quatre jours pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions au cours des procédures : Pour la première partie, l’ensemble des souris (32), réparti en deux lots, sera soumis aux interventions 1 et 2. Pour les deux autres parties, les animaux seront soumis aux interventions 1 et 2 et les autres interventions dépendront ensuite des groupes : - le groupe A (96 souris) subira une chirurgie de castration (intervention 3) puis les animaux recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5. - le groupe B (96 souris) recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5.

Impact sur les animaux

Toutes les souris de la demande d’autorisation recevront par voie sous cutanée (bas du dos) deux injections (une à droite et une à gauche) mais toutes n’auront pas de développement de tumeur. S’il y a prise de greffe et formation de tumeur sous cutanée, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une certaine douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau à l’origine de démangeaison et d’irritation. L’ablation des testicules (procédures 2 et 3) est un acte non douloureux car réalisé sous anesthésie et analgésie mais il peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies et des séances d’imageries sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égal à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il a dû être exclue (pas de prise de greffe tumorale). En revanche il ne sera pas mis à mort tout de suite si sa présence peut éviter l’isolement d’un individu encore en procédure. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de la durée de la procédure de prélever différents organes et la tumeur afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé. Cet animal pourra appartenir soit à la branche des animaux témoins servant de référence, soit à une branche d’animaux traités.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps mené l’étude par différentes approches pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique et de sa récidive post-castration.

Réduction

Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé est calculé de manière à obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. En supposant une efficacité de greffe de cellules tumorales de 50%, il faudrait alors doubler l’effectif car une greffe sur deux ne se développera pas. Cependant, nous avons prévu deux injections de cellules par animal soit 1 prise de greffe par animal, ce qui compense cette efficacité faible. Comme indiqué précédemment, si la prise de greffe se montre plus élevée que 50%, nous ajusterons le nombre d’animaux à la baisse pour les étapes suivantes. Au contraire, si un des types cellulaires testés ne génère pas de tumeur, les expériences se basant sur l’injection de ces cellules ne seront pas réalisées. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 16 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris durant la croissance des greffes tumorales, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors des mesures de tumeur par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car c’est le meilleur modèle connu pour éviter toute réaction immunitaire et rejet de greffe de cellules tumorales tout particulièrement pour les cellules humaines.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Issues de croisements, elles développent les symptômes de l'ataxie de Friedreich, démarche titubante, tremblements et parfois crises d'épilepsie spontanées servant de point limite, puis reçoivent une injection unique de vecteur et passent des tests comportementaux. Le porteur teste une thérapie génique visant à réintroduire une protéine manquante et affirme que le recours à l'animal est "obligatoire" pour avoir une vue globale des effets. Il indique avoir d'abord testé les vecteurs en culture cellulaire.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich est une maladie génétique caractérisée principalement par une perte progressive de la coordination des mouvements volontaires, ce qui entraîne une démarche ébrieuse. Ce symptôme s’accompagne d’autres atteintes, comme des problèmes cardiaques entraînant souvent le décès des patients. Cette maladie touche 1 personne sur 30 000 et est à ce jour incurable, ce qui rend indispensable le développement de stratégies thérapeutiques. Au vu de la complexité de la maladie, le recours au travail sur animal est obligatoire afin d’avoir une vue globale sur tous les effets du traitement. Dans cet objectif, nous avons généré une souris modèle reproduisant les symptômes neurologiques de la maladie. Notre approche thérapeutique consiste en de la thérapie génique qui va permettre de réintroduire la protéine manquante, la frataxine. L’équipe a déjà mené des essais prometteurs, qui doivent désormais être optimisés avec de nouveaux vecteurs. Il est connu qu’un excès de frataxine entraîne une toxicité. Notre étude va se diviser en deux axes principaux : la validation de l’efficacité du vecteur après injection intraveineuse, et une étude de dose-réponse pour déterminer la quantité minimale de vecteur suffisante pour corriger les symptômes de manière significative. Le vecteur qui permet de restaurer un faible taux de frataxine sera injecté par voie intraveineuse. Deux cohortes seront utilisées : une traitée avant l’apparition des symptômes (60 souris) et une traitée après l’apparition des symptômes (100 souris). Les souris seront suivies au cours du temps par des tests comportementaux et de conduction nerveuse (procédures modérées). La dernière partie de l’étude consistera à étudier un éventuel effet dose-réponse du traitement, afin de déterminer la dose minimale efficace (120 souris). Aucune nuisance n’est attendue dans ces procédures, et les animaux seront surveillés de manière à détecter précocement tout éventuel effet délétère. Ce projet mobilisera au total un maximum de 280 animaux en procédure de classe « modérée ». Tous les animaux seront utilisés pour les analyses et il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin de ce projet.

Bénéfices attendus

L’ataxie de Friedreich touche environ 1 personne sur 30 000, et aucun traitement n’est développé à ce jour. Le but ultime de ce projet est donc de trouver une thérapie efficace pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et si possible de stopper ou au moins ralentir la progression de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique, pratiquée sous anesthésie par inhalation d’isoflurane. Cette procédure dure quelques minutes du début de l’endormissement à la fin de l’injection. Les tests comportementaux pratiqués par la suite de façon hebdomadaire ne provoquent pas de douleur.

Impact sur les animaux

Les lignées utilisées pour l'élevage n'ont pas de phénotype dommageable, seuls les animaux issus de ces croisements présentent le phénotype ataxique à partir de 9 semaines et présentent un phénotype dommageable à partir de 19 semaines. Le phénotype exprimé se traduit par des difficultés progressives de mouvement et coordination qui apparaissent à partir de 4 semaines, mais non visible en cage d’hébergement. Les difficultés de mouvement sont accompagnées de tremblements qui s’intensifient avec l’âge. Le phénotype n’est toutefois pas considéré comme ataxique avant 9 semaines. A ce stade, les animaux présentent une démarche ébrieuse typique des ataxies, qui est retrouvée également chez les patients. A partir de 19 semaines, les souris mutantes peuvent présentér des crises épileptiques spontannées, ce qui est un point limite pour l’euthanasie. Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’injection ni aux tests de comportement.

Devenir

Les animaux sont euthenasiés pour prélever des tissues pour des analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Le but ultime du projet est de trouver une thérapie efficace pour l’ataxie de Friedreich afin d’améliorer la vie des patients et si possible de stopper ou au moins ralentir la progression de la maladie. Les nouveaux vecteurs utilisés ont d’abord été testé dans des cellules en culture afin de remplacer l’animal, mais afin de déterminer leur efficacité in vivo, il est indispensable de réaliser notre approche sur un modèle murin de la maladie.

Réduction

Il est estimé que le projet mobilisera sur 5 ans 280 animaux au maximum avec enchainement séquentiel et conditionnel des procédures. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaire afin d’obtenir une puissance statistique suffisante. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux, les mêmes animaux seront utilisées pour réaliser les analyses fonctionnelles, histologiques, moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Un soin particulier sera apporté aux animaux et dès les premiers signes d’ataxie de la nourriture gélifiée sera mise à disposition dans la cage. Nous avons établi des points limites suffisamment prédictifs adaptés à notre modèle. De plus, nous avons mis en place une grille de suivi individuel pour suivre au plus près la santé de chaque animal.

Choix des espèces

La souris est l’espèce privilégiée pour ce projet en raison de sa proximité génétique avec l’Homme (98% d’homologie). Son anatomie et physiologie sont très bien caractérisées. De plus, plusieurs modèles de l’ataxie de Friedreich ont déjà été développés chez la souris.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur cinq ans. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes du parasite du paludisme avec l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des péritonites granulomateuses, de la douleur et de l'angoisse, avant d'être saignées à mort par ponction cardiaque. Le porteur produit ainsi des anticorps et reconnaît l'existence d'alternatives non animales, anticorps recombinants et aptamères, qu'il écarte faute de moyens techniques. Il conclut au recours "nécessaire" à l'animal pour obtenir ces anticorps.

Objectifs

Le paludisme est un problème de sante publique, majeur qui sévit dans plus de 100 pays et fait plus de 600 000 morts par an surtout chez les jeunes enfants. Chez les femmes enceintes, l’infection par Plasmodium peut causer leur mort et celle de leur enfant ainsi qu’un poids de naissance inférieur à la normale entraînant une mortalité très fréquente après la naissance. Depuis 2021, un vaccin est disponible sur le marché. La prise d’antipaludéens et l’utilisation de moustiquaires imprégnées augmentent la résistance du parasite aux antipaludéens. La maladie est causée par le parasite Plasmodium, un protozoaire appartenant au phylum des Apicomplexes. Parmi les 6 espèces qui infectent l’Homme, deux sont les plus repandues : Plasmodium faciparum et Plasmodium vivax. Le cycle de vie du parasite, entre un hôte mammifère et un moustique du genre Anophèle, est complexe. La partie la mieux connue de ce cycle est la phase érythrocytaire se déroulant chez le mammifère, durant laquelle les parasites se multiplient dans les érythrocytes de l’hôte. Cette phase est responsable de la classique anémie fébrile ainsi que des complications liées à l’adhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium aux cellules endothéliales de la microcirculation sanguine, en particulier celles des vaisseaux sanguins du cerveau. Notre laboratoire étudie les facteurs de virulence de Plasmodium falciparum et Plasmodium vivax, les deux espèces les plus mortelles pour l’Homme. Nous nous intéressons, en particulier, au stade sanguin du cycle du parasite. Nous étudions les mécanismes mis en jeu par le parasite pour s’attacher au globule rouge, y pénétrer et s’y développer. Cette phase érythrocytaire, peut-être reproduite in vitro dans des systèmes de culture de globules rouges humains. Nous avons identifié plusieurs protéines d’intérêt exprimées par le parasite lors de son cycle de vie dans le globule rouge. Afin de les étudier, nous allons produire, chez le rongeur, des anticorps polyclonaux (AcP) dirigés contre ces protéines. Ces anticorps nous permettrons de localiser ces protéines dans le parasite, d’étudier leur niveau d’expression ainsi que leur importance dans les autres stades du cycle de vie de Plasmodium.

Bénéfices attendus

Notre compréhension du paludisme est limitée par des outils de recherche tels que les anticorps. Il existe en effet peu d’anticorps spécifiques contre les différentes espèces disponibles. Ce projet a pour but de produire un outil qui sera indispensable dans la lutte contre cette maladie. Les anticorps sont essentiels pour faire progresser notre connaissance sur le fonctionnement du parasite. Nous pouvons étudier l’expression de ces molécules dans les différents stades du parasite en utilisant les techniques suivantes : ELISA, Western Blot, les procédures d’immunoprécipitation, l’immunofluoromicroscopie et l’immunoélectromicroscopie. Avec des anticorps spécifiques nous sommes en mesure de mieux comprendre l’implication des protéines responsables de la virulence chez Plasmodium.

Procédures

1) Une prise de sang (une minute) par animal par mois pendant 2 mois. 2) Une injection IP (une minute) chaque 3 semaines par animal pendant 9 semaines. 3) L'exsanguination par ponction intra-cardiaque (5 minutes) à la fin de l’expérience, préalablement anesthésiées par injection par voie intrapéritonéale (une minute).

Impact sur les animaux

Dans des très rares cas les animaux peuvent mal supporter les protéines recombinantes et ils peuvent montrer une réaction inflammatoire élevée. Les souris recevront les protéines individuelles en présence d’adjuvant Complet de Freund (CFA) pour la première injection et l'adjuvant Incomplète de Freund (IFA) pour les autres. L’utilisation de l’adjuvant CFA par voie IP peut induire des effets indésirables comme des péritonites granulomateuses et de la douleur et de l'angoisse. Les souris peuvent montrer des signes cliniques et comportementaux de souffrance et ou d’angoisse, comme les yeux mi- fermé, le poil hérisse, le dos vouté ou il ne veut plus bouger, l'absence de toilettage ou il se tienne à l'écart du groupe.

Devenir

Tous les animaux ayant un titre d’anticorps satisfaisant seront mis à mort afin d’obtenir une quantité de sérum suffisant. Tous les animaux n’ayant de titre d’anticorps satisfaisant seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni remplacés, ni adoptés.

Remplacement

L’alternative possible à l’emploi de sérums murins serait d’employer les sérums prélevés chez des personnes vivant en zone d’endémie, porteuses d’anticorps contre les antigènes d’intérêts et d’immuno-purifier les immunoglobulines spécifiques par affinité sur les antigènes recombinants. Les expériences d’autre groupes de recherche ont montré que les anticorps ainsi obtenus sont de faible affinité pour des protéines spécifiques, avec un titre très faible et ne fonctionnent pas pour les protéines intracellulaires qui ne sont pas exposée à la réponse immunitaire de l'hôte. Il existe aujourd'hui des alternatives non animales pour produire les anticorps telles que les anticorps recombinants et les aptamères (courts fragments d'ADN ou d'ARN qui peuvent se lier à des cibles telles que des protéines). Cependant, une bibliothèque de gènes d'anticorps de plasmodium n'a pas encore été constituée, ce qui rend cette technique hors de portée pour le moment. Pour nos besoins de recherche, la sélection d'aptamères spécifiques à une cible nécessiterait des protéines recombinantes solubles relativement pures. Le génome de Plasmodium est riche en adénine et en thymine, jusqu'à 70 %. Ce biais est un problème omniprésent lorsque l'on essaie de produire des protéines recombinantes solubles et, par conséquent, il est relativement rare d'avoir des protéines recombinantes pures à utiliser. Le manque de pureté de ces protéines recombinantes entraînera une sélection d'aptamères non spécifiques conduisant à des signaux non spécifiques. Pour le moment nous n'avons pas la capacité technique pour développer cette méthode. Le recours à l’animal est nécessaire car ces anticorps ne peuvent être obtenus qu’après immunisation d’une espèce animale.

Réduction

Nous avons choisi d’immuniser un seul groupe de 5 souris par protéine recombinante pour connaître dans un premier temps, leur degré d’immunogénicité et dans un deuxième temps les sérums de souris qui présentent une forte immunogénicité dans chaque groupe seront poolés afin d’avoir une quantité de sérums suffisante pour une étude approfondie et répétée. Par expérience, le nombre de souris minimum pour avoir suffisamment de sérum pour nos tests immunologiques est de 5 souris. Sachant que les souris peuvent réagir différemment à l'immunisation et certaines souris présentent une immunogénicite élevée tandis que d'autres présentent une faible immunogénicité. Nous prévoyons de fabriquer en moyenne 6 anticorps par an, ce qui porte le nombre final à 150 souris sur une période de cinq ans. SEBA à répondu que pour ce projet il n'y a pas de considérations statistiques à évaluer.

Raffinement

Les souris peuvent tolérer plus ou moins bien les protéines recombinantes injectées. Dans de rares cas, ces immunisations peuvent entrainer une réaction inflammatoire élevée. Elles peuvent induire des signes cliniques et comportementaux de souffrance et/ou d’angoisse, comme les yeux mi-fermés, le poil hérissé, le dos vouté voire même une paralysie partielle, l'absence de toilettage ou se tenir à l'écart du groupe. En fonction de la grille standard comportementale/clinique de la SBEA, les animaux obtenant un score de 2 points pourront bénéficier, si nécessaire, de mesures d’amélioration des conditions d’hébergement (enrichissement, chaufferette) et de l’alimentation (gel diététique). Les souris présentant un score supérieur à 2, considéré comme point limite, seront mises à mort par exposition au CO2 suivie d’une dislocation cervicale afin de s’assurer de la mort de l'animal par un arrêt total et durable des mouvements cardio-respiratoires. Les animaux feront l'objet d'une surveillance régulière et dans le cas où des signes de souffrance sont détectés, il sera envisagé de réduire la quantité de protéine injectée, voire d’arrêter la procédure pour limiter la douleur. Dans les cas où les signes de souffrance apparaissent immédiatement après l'injection de l’antigène, nous pouvons également limiter la douleur par l'utilisation d'une anesthésie et d'une analgésie avant chaque immunisation.

Choix des espèces

Nous avons choisi de produire nos anticorps chez la souris car nous savons par des expériences antérieures que les protéines recombinantes de plasmodium sont très immunogènes chez la souris. Les souris utilisées pour les immunisations seront âgées de 6 semaines, âge auquel on obtient une bonne réponse immune et une préhension correcte pour l’immunisation et le prélèvement sanguin.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections d'un inducteur chimique de tumeurs une fois par semaine pendant six semaines et des inoculations bactériennes par voie oro-gastrique, avec une perte de poids attendue dans les derniers mois. Le porteur étudie comment la co-infection par Helicobacter pylori et Escherichia coli favorise le cancer gastrique et colorectal, et affirme que seul un "organisme entier" permet d'étudier cette réponse. Les souris atteignant 20 % de perte de poids ou des signes de souffrance seront mises à mort avant le terme.

Objectifs

Environ 18% des cancers sont causés par un agent infectieux, dont la bactérie Helicobacter pylori, responsable de l’infection chronique la plus répandue dans la population mondiale. H. pylori est reconnue comme le facteur de risque majeur du cancer gastrique (CG), souvent associé à un mauvais pronostic. H. pylori pourrait aussi être impliquée dans le développement du cancer colorectal (CCR), tout comme des souches pathogènes de la bactérie Escherichia coli. Un évènement important dans la genèse de ces cancers, est la dysbiose du microbiote gastrique et intestinal, respectivement observée chez les patients atteints de CG et de CCR, et confirmée dans le modèle animal murin. Comment la co-habitation de différentes bactéries dans le même hôte peut influencer leur potentiel pathogène respectif, est la question principale à laquelle se propose de répondre ce projet. Notre hypothèse est que H. pylori et E. coli pourraient favoriser des mécanismes oncogènes communs, exacerbés par leur co-habitation dans le même hôte et impactant leur pathogenèse respective. Basé sur le développement du modèle souris de co-infection, H. pylori-E. coli, les objectifs de ce projet sont : - D’analyser si la sévérité des lésions inflammatoires gastriques induites par H. pylori peut être modulée par la présence de E. coli dans le compartiment intestinal et inversement. - De déterminer si ces mécanismes sont associés à des effets locaux ou systémiques. - De définir si les mécanismes impliqués dans les processus de tumorigenèse sont communs aux deux infections. Les évènements d’instabilités génétiques et de régulation épigénétique jouent un rôle essentiel dans la promotion des mécanismes de tumorigenèse. Ainsi, une fois établi le modèle de co-infection chez la souris et combinant différentes approches, les conséquences de la présence de ces deux bactéries seront analysées sur les mécanismes de régulation à l’origine d’un développement tumoral, dont la méthylation de l’ADN et son impact sur la réponse globale de l’hôte à ces conditions d’infection.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes à l'origine du développement des cancers gastrique et colorectaux induit par H. pylori et E.coli pathogène. D’autre part, peu de chose sont connues sur l’impact réel de la co-infection par ces deux pathogènes dans l’initiation et/ou promotion de la tumorigenèse. De plus ces données peuvent aboutir à des stratégies de dépistage et/ou prévention du développement du cancer gastrique ou colorectal ou nous permettre d’identifier certaines cibles thérapeutiques.

Procédures

- Injections intra-péritonéales (30 secondes) d’inducteur de tumeurs une fois par semaine pendant 6 semaines ou d’inhibiteur pharmacologique trois fois par semaine pendant 1 mois (fréquence sur l’ensemble de la procédure = 1 fois ou 2 fois avec intervalle de 2 mois ou fois avec intervalle de 2 mois). - Inoculations de suspensions bactériennes ou de streptomycine par voie oro-gastrique 2 fois toutes les deux semaines à 2 reprises espacées de 24 heures (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiellement attendus sont modérés. Ils sont attendus durant la période de traitement par l’inducteur de tumeurs pendant 6 semaines sous forme de baisse de mobilité dans les 48h suivant l’injection IP, comme cela a été rapporté pour la lignée murine particulièrement sensible A/J. Nous ne savons pas si ces effets seront observés pour les C57BL/6, ils ne sont pas rapportés dans la littérature. Durant la progression du protocole, il est envisageable que les groupes recevant une double-infection, et pour lesquels nous anticipons une accélération ou aggravation des lésions pré-tumorales, présentent une perte de poids modérée dans la dernière phase de l’essai (6 à 9 mois post-infection).

Devenir

La mise à mort des souris à la fin de l'expérience est indispensable pour nous permettre de prélever l'estomac et donc de quantifier les bactéries H. pylori qui ont colonisé cet organe. D’autres organes seront également prélevés pour analyses histologiques et moléculaires qui sont indispensables pour le but final de l’étude qui est d’évaluer la carcinogenèse.

Remplacement

Seul un modèle in vivo permet de répondre aux questions complexes soulevées par ce projet, i.e. étudier la réponse d’un organisme entier à une infection ou une co-infection via la mobilisation de son système immunitaire et les conséquences sur les mécanismes de tumorigenèse. Dans le cas de l’infection par H. pylori, le modèle souris permet de récapituler l’ensemble de la cascade d’évènements décrits en pathologie humaine, allant de la gastrite chronique aux lésions pré-cancéreuses que sont les dysplasies gastriques. La réponse immunitaire observée chez la souris reflète parfaitement celle observée chez l’Homme. De même, la souris est une espèce de choix pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli car elle est permissive à l’infection par ce pathogène opportuniste sans nécessité de manipulations génétiques ou de modification du statut immunitaire des animaux. De plus la littérature concernant ces infections est abondante et les modèles expérimentaux bien établis, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en limitant le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, l’utilisation du modèle souris se justifie parfaitement car il remplit la condition essentielle de reproduire plusieurs aspects des pathologies observées chez l’Homme. D’autre part, l’utilisation d’un carcinogène est nécessaire pour diminuer les temps d’expérience. Dans ce contexte, le modèle murin de carcinogenèse AOM-induit est parfaitement adapté.

Réduction

Dans nos expériences, le nombre d’animaux par groupe test est calculé au plus juste pour être statistiquement significatif en utilisant des modèles hiérarchiques (ou modèles à effets mixtes). Ce projet comprend trois procédures qui s'articulent sur un nombre de 16 animaux par groupe. Ce nombre est similaire à certaines études du même type et il est proche des estimations que réalisées par notre statisticien (pour des tailles d'effets proches de 1). Les effectifs proposés semblent donc dimensionnés par rapport aux objectifs du projet. Le succès d'infection par animal rentre également en considération. L’ensemble des organes d’intérêt sera prélevé à l’issue des différentes expériences, de fait les animaux ne pourront pas être réutilisés. Les fèces seront prélevées longitudinalement (toutes les deux semaines) et conservés congelés en vue d’étude futures visant à définir les dysbioses associées aux infections et au développement de la pathologie sans avoir à reprogrammer des expériences similaires.

Raffinement

Les faibles doses d’inducteur de tumeurs utilisées engendreront des effets néfastes modérés sur les souris. Nous serons vigilants en particulier au cours des 6 semaines de traitement par l’inducteur de tumeurs afin de prévenir au plus tôt tout signe évident de détérioration de l’état général des animaux. Des hydrogels seront mis à disposition des animaux. Nous utiliserons une feuille d'observation : tout animal présentant des signes de souffrance, tels que l'apparence du poil affectée ou un changement de leur comportement, sera noté selon une grille et mis à mort si son état le nécessite ou en cas de perte de poids >20%. En référence à notre expertise de ces modèles murins d’infection, l’observation des animaux infectés par chaque bactérie en absence d’inducteur de tumeurs ne montre aucune modification de comportement ou physique qui pourrait indiquer une quelconque souffrance. Chacune des bactéries n’induit pas de signes digestifs tels que la diarrhée après administration. Si la procédure 1 indique que la co-infection permet d’observer une synergie dans le développement pathologique sans adjonction d’inducteur de tumeurs, les procédures 2 et 3 seront menées sans inducteur de tumeurs, ce qui réduira les nuisances et améliorera le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nos deux laboratoires ont une longue expérience du modèle souris d’infection par H. pylori ou par E. coli et nous possédons des souches adaptées à la colonisation des souris. De plus, dans le cadre de notre étude, le modèle murin est adapté car il reproduit de nombreux aspects des pathologies humaines étudiées. Nous utilisons des souris C57BL/ 6, mâles, âgées au début de l’expérience de 4 à 6 semaines. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 6 semaines). Il s’agit du stade le plus largement décrit et validé dans les publications. A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation aisée et leur système immunitaire est mature.

10 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés en vie à l'issue. Huit reçoivent une perfusion intraveineuse de 15 à 30 minutes sous contention manuelle prolongée, suivie de prélèvements de sang répétés pendant 28 jours, deux autres restant en réserve. Le porteur compare deux formulations d'un composé test et affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang "au niveau de l'organisme entier", d'où le recours "indispensable" à l'animal. Les points limites prévoient l'exclusion de tout chat montrant agressivité, troubles de l'équilibre ou douleur aux sites de prélèvement.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont: - de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un élément test mis en solution sous deux formulations différentes aprés une simple administration intraveineuse (perfusion de 15-30 minutes) et de les comparer entre elles. - de vérifier certains paramètres hématologiques pour évaluer la pharmacodynamie de l'élément test.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques de l'élément test présent dans deux formulations différentes. Et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, impact sur la pharmacodynamie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une administration des formulation test par voie intraveineuse. 1 seule administration / animal Durée: 15-30 minutes Des prélèvements sanguins seront réalisés: 1 ou 2 prélèvements par jour maximum. Volume de sang prélevé entre 2 et 2.5 mL. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute. prélèvement aura lieu avant administration, 2 prélèvements le jour de l'administration, puis 1 prélèvement par jour pendant 3 jours puis 1 prélèvement par semaine jusqu'à 28 jours aprés administration.

Impact sur les animaux

L'administration de l'élément test est une administration intraveineuse par perfusion de 15 à 30 min. Cela va necessité une contention longue dans la durée pour l'animal. La contention sera manuelle. Durant la phase d'acclimatation les animaux auront une péride d'entrainement pour s'habituer à cette durée de contention. La manipulation des animaux se fera par un personnel formé.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

10 animaux seront inclus dans ce projet. 8 animaux seront administrés et 2 animaux seront des animaux de réserve si besoin.Si les 2 animaux de réserve ne sont pas utilisés, ils pourront retourner dans le stock. Les 8 animaux administrés seront répartis en 2 groupes de 4 animaux. Chaque groupe recevra une formulation test. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats interprétables.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 (2 males et 2 femelles par groupe). De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Les points limites spécifiques de ce projet sont: - Un comportement agressif de l'animal au cours de la perfusion - Problèmes de comportement général (mouvements anormaux, perte d'équilibre, prostration) - Douleurs importantes au niveau des sites de prélèvements. Si un des points limites est atteint l'animal sera exclu du projet. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Espèce de choix pour ce type d'étude. Adulte, age supérieur à 1 an. Poids d'animaux compris entre 2.5 et 6 Kg.

10 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des séances d'imagerie sous anesthésie, l'injection de traceurs dans le cerveau ou la pose d'une chambre d'enregistrement par trois à quatre chirurgies de six à sept heures, puis des enregistrements cérébraux pendant plusieurs mois sur animal vigile entraîné à des tâches, sous contrôle de la boisson. Le porteur justifie ce contrôle hydrique par la coopération de l'animal et euthanasie les dix individus pour analyser leur cerveau. Les retombées annoncées pour les troubles humains de la conscience et l'épilepsie sont renvoyées au moyen et long terme.

Objectifs

La connectivité étendue du claustrum avec le cortex suggère son implication dans les fonctions cognitives supérieures, y compris la conscience. Des résultats récents chez la souris remettent en question la globalité des interactions entre le cortex et le claustrum et donc leur implication dans les fonctions cognitives supérieures telles que la conscience. L’objectif du projet est donc de clarifier le role du claustrum dans les fonctions corticales chez le primate non-humain en réalisant des investigations anatomiques et physiologiques. Nos travaux préliminaires suggèrent que le macaque présente des caractéristiques inattendues propres aux primates concernant l'intégration du claustrum dans le réseau cortical global, il occupe une position centrale et est fortement connecté avec l’ensemble du cortex. L'achèvement de ces travaux dans le cadre du présent projet nous permettra de construire une matrice détaillée des connections entre le claustrum et le cortex afin de déterminer la centralité du claustrum dans le réseau cortical interaréal. En fonction du contexte, l’activité cérébrale transite rapidement entre deux états cérébraux fondamentaux en fonction du contexte : un état au repos et un état actif. Les transitions rapides entre différents états et leurs distributions spatiales en fonction des exigences comportementales sont une caractéristique majeure et encore mal comprise du cerveau. Notre hypothèse de travail est que la position centrale du claustrum dans le réseau cérébral lui confère un rôle privilégié en facilitant l'orchestration des changements rapides d'états du cerveau. Nous aborderons cette question en utilisant des enregistrements multisites de plusieurs aires corticales et du claustrum lors de différents états comportementaux chez le PNH. Nous mettrons en relation les modèles de connectivité fonctionnelle et anatomique à grande échelle. Ces résultats pourraient permettre des progrès sans précédent dans la compréhension des fonctions cognitives supérieures chez les primates.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Le choix des animaux est significatif : Le macaque est un modèle de choix pour les neuroscientifiques du monde entier, il possède de nombreuses aires corticales similaires à celles de l’homme, avec des propriétés fonctionnelles et cognitives comparables. Seul le singe présente une hiérarchie des aires corticales qui ressemble étroitement à celle de l'homme. De plus, nos résultats préliminaires suggèrent que le claustrum des primates présente des différences significatives par rapport au claustrum des rongeurs, ce qui pourrait être directement pertinent pour les processus cognitifs, y compris les transitions entre différents états du cerveau, que nous abordons ici. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez le singe sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux à grande échelle qui sont probablement impliqués dans les fonctions cognitives les plus élevées, y compris les différents états de conscience, mais aussi dans l'épilepsie. Le lien avec l'épilepsie est plausible car une des hypothèses sur le rôle du claustrum est qu’il prévient la propagation incontrôlée de vagues d’activité excitatrice en stabilisant le réseau cortical par rétroaction inhibitrice. Ainsi les bénéfices à moyen et/ou long terme seraient l’utilisation de nos résultats à des buts thérapeutiques en médecine appliquée dans le traitement des troubles de la conscience et des épilepsies e.g. par stimulation du claustrum, après validation sur des modèles précliniques.

Procédures

Pour l’étude des connections anatomiques, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à l’injection de traceur dans le cerveau (1 chirurgie de 6-7 heures) avant d’être euthanasiés pour analyser le marquage neuronal. Pour l’étude des connections fonctionnelles, les animaux seront soumis sous anesthésie générale à des examens d’imagerie (1 scanner de 10min et 2 sessions d’IRM de 3-5 heures chacune) puis à la fixation d’une chambre d’enregistrement (3 chirurgies de 6-7 heures à plusieurs semaines d’intervalle). Les animaux sont entraînés à effectuer des tâches comportementales cognitives et l’activité cérébrale est enregistrée pendant plusieurs mois sur animale vigile. Les animaux sont ensuite euthanasiés pour vérifier avec précision les sites d’enregistrements.

Impact sur les animaux

Le bien-être de l’animal suivant les procédures chirurgicales fait l’objet d’un suivi régulier afin d’adapter le niveau d’antalgiques au besoin . En dehors de la période post-opératoire, les effets indésirables potentiels sont principalement liés à l’hygiène de l’implant : en cas d’infection ou d’inflammation constatée autour de l'implant, lors des soins réguliers de l'animal par les expérimentateurs, une intervention rapide est prévue en consultation avec le vétérinaire (e.g. antibiogramme et traitement antibiotique). Il existe un risque rare que l’implant devienne non fonctionnel (casse, réaction de rejet tissulaire, infection non contrôlée par voie systémique), dans ce cas l’implant est retiré lors d'une procédure chirurgicale, la plaie nettoyée parfaitement et refermée, et l'animal traité par antibiotiques. Dans chacun de ces cas le protocole est interrompu et l’animal placé sous surveillance accrue. Toutes les expériences sur les animaux sont réalisées dans le souci du bien-être des animaux. La condition de base de toutes les expériences avec des singes éveillés et entraînés au comportement est la coopération de l'animal afin qu'il puisse accomplir les tâches comportementales de manière concentrée, persévérante et précise. Or, il n'est capable de le faire que s'il n'est ni malade, ni apeuré, ni distrait. D'autre part, l'ensemble de la situation d'élevage des singes joue un rôle décisif. En effet, seul un animal vivant dans un environnement intact et stimulant est motivé et curieux, et peut donc être entraîné. Il est réalisé un suivi régulier du poids et du niveau d’hydratation de l’animal (pendant la période de contrôle hydrique), de l‘hygiène de l’implant et du niveau de douleur suite aux actes chirurgicaux. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 10 animaux est nécessaire à la validation scientifique projet (quantification des connexions du claustrum et validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Nous avons démontré par ailleurs que la mise en évidence des voies neuronales par IRM de diffusion (tractographie) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Notre approche pour la réduction du nombre d’animaux se base sur une amélioration des techniques utilisées, une approche statistique prospective et le partage des données acquises dans ce projet. Le nombre de traceurs pouvant être utilisé simultanément a été augmenté de 3 à 4, réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. Notre expérience montre que le risque d’une mauvaise position du site d’injection (contamination de l’aire adjacente ou de la matière blanche sousjacente), liés aux limites de résolutions de l’IRM et de la caméra du système de navigation cérébrale (1mm), représente environ 25% des cas. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux que nécessaire une fois que 8 régions différentes du claustrum auront été correctement ciblées (e.g. si toutes les injections de traceurs étaient correctement placées dans deux animaux, nous ne prévoyons pas d’utiliser plus d’animaux pour cette procédure). Le nombre d'animaux utilisés est déjà réduit au niveau indispensable (1 animal par site d’injection permet d’obtenir la connectivité empirique pour ce site pour des connexions impliquant plus de 8 neurones par région). Nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage de voie et la tractographie (IRMd) et les données de ce projet y seront intégrées afin d’augmenter la puissance statistique. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l'IRMd, absolument non invasive. La modélisation (modèles linéaires généralisés) des comptes issus du traçage de voie et de la tractographie, permettrons de caractériser la variabilité intra- et interindividuelle pour ces deux types de mesures de la connectivité. Pour l’étude de la connectivité fonctionnelle, deux animaux constituent le minimum internationalement reconnu pour la publication des résultats. D'autres animaux sont prévus uniquement si cela s'avérait absolument nécessaire, par exemple si l'un des animaux tombait malade et serait retiré de l'expérience. Toutes les données issues de ce projet seront partagées dans un premier temps avec les différents collaborateurs directement impliqués dans l’analyse des données et la modélisation et, dans un deuxième temps, via des sites de partage pour l’utilisation de ces données par la communauté scientifique (e.g. Zenodo).

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie. Une grille de score post-opératoire nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Ces critères prennent en compte l'apparence de l'animal, les signes cliniques (température et les fréquences cardiaque et respiratoire), son comportement, la prise de nourriture et de boisson et l'aspect de la zone opérée. Le suivi de la douleur est évalué par 2 ou 3 personnes indépendantes (expérimentateurs et zootechniciens). Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, en supprimant la procédure chirurgicale d’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce au nouveau système de navigation cérébrale qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par des caméras infrarouge pour la navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous pouvons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre l’homme et le carnivore est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications démontrent une forte homologie entre le connectome cortical de l’homme et du PNH mais également de nombreuses différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.