Recherche fondamentale

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une atrophie musculaire est déclenchée chez la souris adulte par injections, puis une partie reçoit un métabolite dans l'eau de boisson, avant la mise à mort pour prélever les muscles. Le porteur indique que les animaux ne montrent pas de signe de souffrance avant sept mois et fixe les expériences au plus tard à douze semaines après le déclenchement. L'étude teste si ce complément freine la fonte musculaire liée au cancer, aux myopathies ou au vieillissement.

Objectifs

Une fonte musculaire sévère est associée à de nombreuses pathologies chroniques comme le cancer, les myopathies et le vieillissement. Cette perte de masse musculaire (atrophie) est très délétère pour le patient, affectant sa qualité de vie mais aussi réduisant la réponse aux traitements et la survie. Il n’existe aujourd’hui pas de traitement efficace permettant de freiner cette fonte musculaire. Un nouveau modèle de souris génétiquement modifiées a été généré, développant une perte de masse musculaire progressive, induite chez l’animal adulte, et récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les travaux portent sur la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans cette atrophie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. L’atrophie est induite chez l'animal adulte par des injections d'une molécule inductrice. Avant ce traitement inducteur, les animaux ne présentent aucune pathologie. Les premiers résultats expérimentaux sur ce modèle, montrent que la perte de masse musculaire est en partie causée par un déséquilibre entre la synthèse et la dégradation des protéines musculaires. Une diminution d’un métabolite essentiel à de multiples fonctions cellulaires a été mise en évidence dans les muscles atrophiés. L'objectif du projet est de tester, dans un premier temps, si la restauration de ce défaut par supplémentation orale avec le métabolite pendant 4 à 12 semaines pourrait avoir un effet bénéfique sur le muscle, comme cela a déjà été observé dans d’autres modèles de pathologie musculaire. Les souris seront mises à mort à 4 et 12 semaines après le traitement inducteur. Dans un second temps, l'évaluation de la pathologie musculaire nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie et la mesure de l’accumulation de protéines marqueurs dans le muscle des animaux. Les souris seront mises à mort 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les muscles seront prélevés et analysés. Pour ce projet un maximum de 200 souris seront nécessaire.

Bénéfices attendus

A ce jour il n’existe pas de traitement permettant de maintenir ou de récupérer la masse musculaire dans les cas d’atrophies pathologiques ou lors du vieillissement. Le métabolite auquel nous nous intéressons est une piste prometteuse dans le traitement de l’atrophie et l’amélioration de la qualité de vie et la survie des patients, il a déjà fait ses preuves dans d'autres modèles de pathologie musculaire. En supplémentant les animaux ,nous espérons voir une amélioration de l'état du muscle, un ralentissement de l’atrophie.

Procédures

Tous les animaux recevront 4 injections consécutives à l’âge de 10 semaines environ, espacées de 24heures. Ensuite, 4 semaines après ces injections, un lot d'animaux recevra 2 injections, espacées de 12 heures. Les souris seront mises à mort après ces injections. Les animaux seront vigiles lors des injections qui ne durent que quelques secondes et sont réalisées par des personnels expérimentés. Une partie des animaux sera traitée par voie oral via une solution buvable contenant un métabolite pendant 4 à 12 semaines après induction du transgène. Ce traitement sera introduit dans l'eau de boisson. Un prélèvement de sang sera fait en point terminal sous anesthésie générale profonde et ces souris seront mises à mort sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La présence du métabolite dans l’eau de boisson pourrait induire une diminution transitoire de consommation de boisson, notamment par la présence d’un gout inhabituel. Nous vérifierons que l'hydratation des animaux est correcte en évaluant les plis de peau. Suite au traitement inducteur de notre mutation, chez la souris adulte, les animaux développent une perte de masse musculaire progressive récapitulant l'atteinte musculaire observée dans les maladies chroniques. Les souris ne présentent pas de signe de souffrance avant 7 mois après cette induction. Les expériences seront réalisées au plus tard 12 semaines après l’induction du processus d’atrophie musculaire, à un stade où leur état général n’est pas altéré, et où aucune modification de leurs déplacements et prise de nourriture n’est observée. L’évaluation du flux de dégradation des protéines nécessite l'injection d'un inhibiteur du processus de dégradation des protéines nommé autophagie. Les souris seront mises à mort maximum 24 heures après les injections de l'inhibiteur. Les injections régulières sur 4 jours et sur 24h peuvent induire une douleur transitoire au point injection.

Devenir

mise à mort afin de collecter les muscles et les organes pour des analyses biochimique, histologiques et métabolomiques approfondies

Remplacement

Des expériences dans les cellules seront réalisées en amont, et de manière complémentaire. Cependant, les modèles in-vitro ne permettent pas une étude de traitement au-delà de quelques jours. Le modèle murin est essentiel pour étudier les conséquences musculaires des maladies chroniques et également étudier l’impact des défauts musculaires sur le métabolisme global de l’organisme.

Réduction

Le nombre d’animaux minimal permettant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs sera utilisé. Le maximum de données pouvant être générées à partir d’un même groupe d’animaux sera recherché. Des conseils auprès de collaborateurs expérimentés et une consultation approfondie de la littérature permettent d'optimiser les expériences et réduire la variabilité donc le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Des effectifs de 10 animaux maximum par groupe seront utilisés. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la robustesse des résultats obtenus. Afin de réduire le nombre d’animaux, la seconde partie du projet ne sera réalisée que si le traitement, réalisé en première partie du projet, montre un effet satisfaisant sur le maintien de la masse musculaire. Enfin, des échantillons collectés dans la première partie seront utilisés comme controle de la seconde partie du projet.

Raffinement

Le traitement avec le métabolite d'intérêt sera ajouté à l'eau de boisson, cela limitera le stress chez l’animal. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée pour détecter les signes de mal-être ou de souffrance. Les animaux seront pesés 2 à 3 fois par semaine pendant les 4 premières semaines de traitement (en même temps que le renouvellement de l’eau tous les 2 à 3 jours) puis toutes les semaines. La durée du traitement pourra être ajustée en fonction du comportement, du poids et de l'état des animaux. Des points limites suffisamment prédictifs seront mis en place pour éviter toute souffrance des animaux et au-delà desquels la procédure sera arrêtée. Les animaux seront mis à mort immédiatement si signes de souffrance.

Choix des espèces

Le modèle murin permet le développement d'animaux génétiquement modifiés. La physiologie musculaire des souris est considérée suffisamment proche de celle de l’homme pour que l’on puisse en tirer des données extrapolables. La souris est un modèle très accessible, de maintien aisé et manipulable génétiquement afin de répondre au questionnement scientifique. Le projet porte sur la compréhension des mécanismes impliqués dans l'atrophie musculaire induite par l'activation d'une signalisation d'intérêt, après la phase de croissance post-natale du muscle, dans le muscle adulte. L’induction du transgène est donc réalisée à la fin de cette croissance post-natale vers 10 semaines environ. L'étude à deux stades 4 semaine et 12 semaines après l'induction de l'expression du transgène est motivée par des résultats expérimentaux préalables.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie est créée chirurgicalement sous anesthésie, puis un substitut de peau humaine est greffé sous leur peau, avant leur mise à mort échelonnée à deux, quatre et douze semaines pour prélever la zone greffée. Le porteur signale la douleur de la chirurgie et le stress de l'isolement d'une semaine, atténués selon lui par l'analgésie et des cages transparentes. Le projet évalue la tenue dans le temps d'un substitut cutané destiné à traiter des plaies humaines.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la fonctionnalité au cours du temps d’un substitut cutané humain greffé sous la peau, ainsi que la dégradation progressive de la matrice support de ce substitut cutané humain. Le substitut cutané humain est un produit de thérapie innovante développé en utilisant des cellules humaines isolées à partir d’un prélèvement de peau humaine et cultivées sur une matrice biologique support. Le substitut cutané humain, ou la matrice biologique support, sera greffé sur des souris dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Des prélèvements de la région greffée seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support afin de réaliser un ensemble d'analyses.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer tout ou partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. De nombreux substituts cutanés biosynthétiques ont été développés et sont pour certains utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique,… mais leur efficacité et leur tenue dans le temps ne sont pas très bonnes. Il est donc important et nécessaire d’évaluer la fonctionnalité et la stabilité de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies ou de remplacer une peau nécrosante.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support effectuée sous anesthésie générale. Un substitut cutané humain ou une matrice biologique support sera placé sous la peau par l’intermédiaire d'une incision qui sera ensuite refermée. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures après. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes seront observées quotidiennement et photographiées 2 fois par semaine, et un scoring de différents paramètres sera effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant une semaine après la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture effectués au niveau de la peau incisée, et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, puis elles seront replacées à 2 par cage.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de matrice biologique support peut engendrer une souffrance mais sera limiter au maximum pa r l'utilisation d’une couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées pendant une période transitoire d‘une semaine, nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les points de suture au niveau de la peau incisée et qu’elles ne se retirent le substitut cutané humain ou la matrice biologique support placé sous la peau, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris au cours de cette période transitoire d’une semaine de voir au moins une de ses congénères. A l’issue de la semaine d’hébergement en cage individuelle, les souris seront replacées à 2 par cage.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 30 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support, 2 semaines, 4 semaines et 12 semaines, avec 5 souris par temps de prélèvement, par injection intrapéritonéale d’une surdose d’euthanasique effectuée sous anesthésie gazeuse . Un prélèvement sera effectué au large de la zone de greffe de substitut cutané humain ou de la matrice biologique support pour la réalisation d’un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité du substitut cutané humain évalué et de suivre la dégradation progressive de la matrice biologique support au cours du temps.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts cutanés greffés, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation de greffes cutanées. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un stress subi en début de vie, elles reçoivent deux injections d'un vecteur viral dans le cerveau par chirurgie, une puce sous la peau, puis sont soumises à des tests dont une suspension par la queue de six minutes, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur décrit la suspension par la queue comme génératrice de stress et une douleur locale après l'opération. L'objectif est de comprendre comment un stress juvénile installe l'anxiété à l'âge adulte, avec l'espoir de cibles thérapeutiques.

Objectifs

Pendant la petite enfance, l'enfance et l'adolescence, l'expérience et l'environnement façonnent l'organisation des neurones qui forment la base de la perception et du comportement des adultes. Les circuits cérébraux s'adaptent en fonction des stimulations sensorielles, motrices et sociales pendant des périodes dites critiques. Un certain nombre de troubles neurodéveloppementaux, notamment les troubles du spectre autistique et la schizophrénie, sont connus pour être associés à des anomalies de ces voies cérébrales. Certains neurones du cerveau sont impliqués dans ces périodes critiques et participent à la consolidation des circuits. Un facteur de transcription est capté par ces neurones dans le cerveau, et cela de manière concomitante avec le début de la période critique. Des souris soumises à un stress juvénile précoce présentent des comportements de type « anxieux » à l'âge adulte. Chez ces souris, des changements d'expression de ce facteur dans le cerveau sont aussi observés. De manière générale, le but de ce projet est donc de savoir comment le stress juvénile affecte le cerveau et les troubles de l’humeur comme l’anxiété. Ce projet étudiera les changements du comportement lors de l'installation de l’anxiété chez les souris adultes ayant subi un stress postnatal. De cette façon nous pourrons identifier les mécanismes qui se mettent en place lors de périodes critiques. Ainsi, des souris naïves subiront un stress postnatal précoce. Nous réaliserons ensuite des injections avec un outil viral qui permettra de rapporter une molécule d’intérêt pour augmenter l’expression du facteur de transcription. Grâce à une batterie de tests comportementaux, nous étudierons le comportement anxieux de ces souris à l’âge adulte. Nous nous attendons à obtenir une réduction du comportement anxieux chez les souris ayant reçu les injections de l’outil viral. De plus, une modification dans le fonctionnement et le développement des neurones est attendue.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété. Il fournira aussi de nouvelles cibles de traitement pour les troubles du développement du cerveau caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux d'une population de neurones appelés les interneurones.

Procédures

Deux injections (une par hémisphère) seront réalisées dans le cerveau avec des outils viraux chez chaque souris au début de l'âge adulte. Le temps total de la procédure de chirurgie est d'environ 30 min (incluant 10/15 min d'injection). Implantation sous-cutanée d'une puce de radiofréquence sera faite sur les animaux pour enregistrer leurs interactions sociales dans un test comportemental. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique (durée = 30 minutes). Un test comportemental cognitif où l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test durera 4 semaines. Un test comportemental étudiant le stress durera 6 minutes. Une injection de produits anesthésiques : durée moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce projet comprend des injections intracérébrales, une douleur locale post-opératoire peut apparaitre au niveau du site d'injection. Lors du test étudiant le stress, les souris seront suspendues par la queue pendant 6 minutes, ce qui peut engendrer un stress.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Nos recherches portent sur les effets du stress postnatal sur la plasticité du cerveau. Elles nécessitent des modèles animaux pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement à l'âge adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de la naissance à l'âge adulte. Il est donc nécessaire d'étudier un système dans son ensemble, à cet égard la souris est un modèle pertinnent car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.

Réduction

Des travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections intracérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales ainsi que des prérequis statistiques nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. En fonction de la répartition en cloche des données nous utiliserons un test statistique paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux (stressée, contrôles et stressées + traitées avec un vecteur viral).

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Toute la procédure chirugicale sera réalisée sous anesthésie. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les injections pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. En post-opératoire une solution d’une crème cicatrisante sera appliquée localement sur les plaies. Une surveillance du site d'injection après les injections et de l'état des animaux sera réalisée pour réagir à tout signe de souffrance La modification du comportement (posture voûtée, poil hirsute, lenteur des mouvements, rétrécissement orbitaire) sera traitée par analgésique en intrapéritonéale. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'Homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité du cerveau et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines, en particulier dans le cadre de maladies neurologiques étant donné que la souris présente une organisation du système nerveaux proche de celle de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'adolescence. Des injections intracérébrales seront effectuées pour modifier l'effet du stress reçu lors de la période postnatale car à cet âge cette région du cerveau est encore plastique. Le comportement sera évalué à l'âge adulte, lorsque le phénotype anxieux se manifeste.

29 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie pour implanter une mini-pompe qui diffuse un édulcorant directement dans le cerveau, puis des prélèvements sanguins répétés sur animal vigile lors de tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur signale une perte de poids après l'opération et prévoit la mise à mort de tout animal perdant plus de 10 % de son poids. L'objectif reste de comprendre pourquoi les édulcorants dérèglent le métabolisme du glucose, sans application thérapeutique annoncée.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont l’une des principales causes de décès des personnes atteintes de diabète de type 2 ou d’obésité. Plusieurs études scientifiques ont montré un lien de cause à effet entre l’apparition de ces pathologies et la consommation excessive de sucre. C’est pourquoi, l’utilisation de substituts de sucre, les édulcorants (sucres non nutritifs : SNNs) est en augmentation. L’utilisation de ces édulcorants tout en remplaçant la saveur sucrée n’entraine pas d’augmentation de la glycémie à court terme. Cependant, consommés régulièrement, les substituts de sucres non nutritifs (SNNs) peuvent provoquer une augmentation de la prise alimentaire et une augmentation de la glycémie. Il a été montré que la consommation de SNN sur une courte période pouvait diminuer la sensibilité à l’insuline en réponse à un test de tolérance au glucose réalisé chez des sujets sains. Ces dysfonctionnements métaboliques seraient dus aux récepteurs au goût sucré qui lient ces SNNs. Ces récepteurs sont retrouvés sur la langue mais aussi dans tout l’organisme et en particulier dans le cerveau, au niveau de l’hypothalamus. L’objectif de ce projet sera d’étudier l’effet (les effets) d’un édulcorant à long terme sur la (les) réponse(s) de l’hypothalamus, en particulier de déterminer si les SNNs diffusés dans le cerveau induisent une augmentation de la glycémie, augmentent l’expression des récepteurs liant les SNNs dans l’hypothalamus et si l’hypothalamus joue un rôle primaire ou secondaire dans la commande qui entraîne le contrôle nerveux de la sécrétion d’insuline et la prise alimentaire. Un ensemble de marqueurs sanguins pouvant également affecter la réactivité des vaisseaux sanguins sera dosé. Ce projet sera réalisé chez 29 rats.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations nous permettront de mieux comprendre pourquoi et comment la consommation d’édulcorants entraine un dysfonctionnement du métabolisme du glucose et quel est le rôle de l’hypothalamus.

Procédures

Les 29 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d’antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles sont prévus : 5 fois 55 à 105 µl durant deux heures pour le test de tolérance au glucose pour les 29 rats, quatre jours plus tard, 5 fois 5 µl durant deux heures pour le test de sensibilité à l’insuline pour 20 rats, 5 fois 55 à 105 µl pendant 10 minutes à la fin de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Les 29 rats subiront des chirurgies. Des injections ainsi que des prélèvements de sang sur animaux vigiles sont prévus. L’effet indésirable attendu est la perte de poids après chirurgie : c’est pourquoi les rats seront observés quotidiennement, pesés tous les 2 jours après la chirurgie et la consommation de nourriture et de boisson mesurées tous les deux jours. L’état général des animaux sera examiné minutieusement (poids, posture, comportement, cicatrisation, état de la plaie). Dans le cas de signes de douleur (posture, mobilité) le traitement analgésique pourra être prolongé et le début des tests retardés. Si un animal présentait une perte de poids persistante pendant plus de deux jours (10% du poids initial), il sera écarté de l’étude et mis à mort (par inhalation progressive de CO2) si son état ne s’améliorait pas.

Devenir

Les 29 rats ayant subi une chirurgie pour la mise en place d’une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez le rat, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

Les procédures concernant l’installation du modèle expérimental et les prises de mesures ont été optimisées et standardisées. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Les analyses simultanées des groupes expérimentaux seront réalisées par. Les conditions d’application des analyses seront vérifiées (seront réalisés selon ces conditions. Des études précédentes ont servi à définir le nombre d’animaux par groupe. Les expériences à mener imposent de tester différentes doses d’édulcorants. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, la dose la plus faible sera étudiée en premier. Si celle-ci s’avérait suffisante pour induire une hyperglycémie(différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h inversé. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à bâtonnet de bois et rouleaux de carton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent le bien-être des animaux. Le personnel a été formé et maîtrise tous les actes à réaliser. Le travail avec les animaux s’effectue en conditions calmes et maitrisées. Les chirurgies seront réalisées par des personnes compétentes sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une injection d’anesthésique local sous cutanée sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection dans la cavité abdominale de liquide physiologique réchauffé sera donnée en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (rouleau de carton et bâtonnet de bois). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.

Choix des espèces

Le rat est une espèce très étudiée par la communauté scientifique, la bibliographie est abondante nous apportant des données d’intérêt dans notre projet, et permettant ainsi la réduction du nombre d’animaux utilisés. Les expériences seront réalisées sur des rats jeunes adultes, âgés de 8 semaines lors de la chirurgie, cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique du rat, et de 12 semaines à la fin des tests ce qui nous permettra de comparer ces résultats à ceux des rats ayant consommés les édulcorants par voie orale que nous avons obtenus dans un autre projet.

221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un produit allergène et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles, ainsi que des injections, pour étudier les cellules mémoires de la peau dans un modèle d'eczéma. Le porteur affirme que l'eczéma "ne génère pas de signe de douleur apparente" chez la souris. Les organes sont prélevés après la mise à mort, et il conclut que le recours à des souris transgéniques est "indispensable".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à étudier l'effet de la persistance de l’allergène sur la maintenance dans la peau d'une population de cellules immunitaire particulière, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans la peau. Les eczémas se développent suite à des contacts répétés avec un allergène de l’environnement, induisant, chez certains individus, la production de cellules spécifiques de cet allergène. Lorsque ces cellules pénètrent dans la peau , elles induisent une poussée d’eczéma et certaines d’entre elles acquièrent alors des propriétés mémoires, c’est à dire une capacité à répondre très rapidement et plus efficacement à des expositions ultérieures au même allergène. Ces cellules mémoires, récemment décrits dans la littérature, ont la capacité de persister pendant de longs mois dans la peau, sans recirculer dans les organes lymphoïdes ou le sang. Pour survivre dans le tissu, ces cellules ont besoin de capter un certain nombre de signaux présents dans leur environnement tissulaire. Toutefois, la nature de ces signaux et leur importance relative reste encore mal caractérisée à ce jour. S'appuyant sur la récente mise en évidence de la capacité des allergènes de nature chimique à persister jusqu’à 1 mois dans la peau, cette étude vise à caractériser l’impact de la persistance de l’allergène sur la biologie des cellules mémoire résidant dans la peau. Ce projet permettra une meilleure connaissance du cycle de vie de ces cellules dans la peau et s’inscrit dans un projet plus global de développement d’une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules mémoires résidant dans la peau.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 30 à 45 minutes. Les animaux pourront également être injectés (5 injections au total) avec un produit permettant d'induire sélectivement la délétion de gènes cibles. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Il est connu que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'induction de l'eczéma peut conduire les souris à se gratter mais aucun signe excessif de grattage n'a jamais été observé. Les souris seront raser sur le ventre en vigile et recevront plusieurs injections au cours de la procèdure ce qui pourra engendrer un leger stress ponctuel.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort et certains organes sont utilisés pour analyse de la reponse immunitaire

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules étudiées dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisés. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que les expériences de ce projet durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Par ailleurs, la question biologique adressée dans ce projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques qui existent seulement chez la souris. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de l'expérience de l'équipe ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que pour la procédure 1, 3 souris par groupe seront suffisantes pour determiner la bonne dose de tamoxifène à injecter, et qu'afin de minimiser le nombre d'animaux, les doses les plus fortes seront utilisées uniquement si les doses les plus faibles, testées en 1er, n'ont pas été suffisantes pour obtenir l'effet attendu. Les expérimentations décrites ici indiquent donc le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux sera réalisée. Une grande importance sera donnée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux des animaux. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Par ailleurs, la question biologique adressée dans ce projet nécessite l’utilisation d’animaux transgéniques qui existent seulement chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires ou l’induction de différentes populations de lymphocytes mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules mémoires résidant dans la peau sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter les résultats de cette étude à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées, au minimum 2 semaines, au sein de l'animalerie avant d'entrer dans les protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-12 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.