Recherche fondamentale
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Effet d’une stimulation non invasive sur l’insuffisance cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses d'une insuffisance cardiaque induite par délétion d'un gène, elles reçoivent des injections de tamoxifène, sont maintenues chaque jour dans un tube de contention pour une stimulation électromagnétique pendant trois à quatre semaines, puis subissent une échocardiographie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever le cœur. Le porteur indique un stress lié à la contention, atténué par une habituation préalable. Il présente cette stimulation non invasive comme une piste transposable à l'humain et affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la régulation cardiaque intégrée.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque est une pathologie sévère caractérisée par une incapacité du cœur à assurer sa fonction de pompe et à irriguer correctement les organes périphériques. Ainsi, une modification des propriétés contractiles et une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Bien que la transplantation cardiaque demeure le seul traitement radical, la pénurie de donneurs et les complications d’une lourde immunosuppression en limitent nécessairement les indications. L’assistance ventriculaire mécanique reste principalement une solution temporaire dans l’attente d’une transplantation et la resynchronisation bi-ventriculaire ne s’adresse qu’à une catégorie ciblée de patients. Il y a donc un besoin réel d’options thérapeutiques nouvelles et c’est dans ce cadre que s'inscrit notre projet de stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. Ses principes reposent sur l’induction de manière non invasive et de manière focale des courants électriques dans des régions endommagées, et ceci en fonction de la fréquence et de la durée de la stimulation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en place et valider l'effet potentiellement bénéfique de la stimulation électromagnétique répétée de basse intensité (LI-rMS) avec pour objectif premier d’améliorer la fonction cardiaque chroniquement défaillante. A plus long terme nous pensons que cette stratégie serait transposable chez l'Homme.
Procédures
Les interventions sur les animaux seront: 1) 3 injections de tamoxifène (1 injection par jour) la durée de l'intervention est de 15 secondes par souris. 2 ) Stimulation éléctromagnétique (la durée de la stimulation est de 10 minutes quotidienne, pendant 21 ou 28 jours successives selon les groupes de souris avec une fréquence de 20Hz ou 40Hz. 3) Echocardiographie réalisé en dernière étape de la procédure sous anethésie (durée environ 30 minutes, 5 mesures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion du gène étudié. La contention pour l'injection de tamoxifène et l'utilisation d'un tube à contention pour la stimulation éléctromagnétique pourrait générer du stress à l'animal, cependant le même expérimentateur sera chargé de l'acte et les souris seront préalablement habituées à la personne et le tube de contention.
Devenir
L'ensemble des animaux (n=180) sera euthanasié suite à cette procédure après la dernière étape d'echocardiographie, le tissu cardiaque sera prélevé pour des analyses morphologiques et moléculaires et ceci afin d'évaluer les effets potentiellement bénéfiques de la LI-rMS sur le coeur au niveau morphologique et moléculaire.
Remplacement
Seules des études sur les animaux permettent de savoir si l’inactivation ou la surexpression d’un gène ont un impact sur le remodelage et la fonction cardiaque. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle cellulaire in vitro qui puisse reproduire de manière intégrée la régulation physiologique et métabolique des paramètres cardiaques.
Réduction
L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 15 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 90 souris de la lignée SRF ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 180 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.
Raffinement
Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et suivies par un personnel compétent et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.La stimulation la stimulation électromagnétique de basse intensité (LI-rMS) sera précédée par une étape d'adaptation et d'habituation des souris au tube de contention afin de minimiser les phénomènes de stress. L’évolution du phénotype des souris sera surveillée par des personnes compétentes selon une grille de suivi qui sera mise en place. L'administration d’analgésique sera envisagée en cas de besoin. Enfin, la définition du point limite est clairement établie à partir d’un seuil d’insuffisance cardiaque observé qui déclenchera l’arrêt de l’expérience et l’euthanasie
Choix des espèces
La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène. Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et represente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages) et le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.
Rôle du récepteur des glucocorticoïdes et de son co-régulateur Lsd1 dans l’atrophie musculaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du tamoxifène puis des glucocorticoïdes par injection ou gavage, ou sont mises à jeun de 24 à 48 heures, pour étudier l'atrophie musculaire, avec des prélèvements de sang répétés à la queue. Le porteur indique une fonte musculaire pouvant atteindre 20 à 30 % du poids du muscle et affaiblir fortement les animaux, et précise ne prévoir ni anesthésie ni analgésique, l'anesthésie étant jugée plus "traumatisante" que les injections. Il affirme que l'étude de l'atrophie musculaire exige un "organisme entier" et que la souris est un modèle de référence.
Objectifs
Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) ont différents effets chez les mammifères, contribuant au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les agonistes synthétiques, par ex. la prednisone et la dexaméthasone (Dex) sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme, et certaines myopathies. Néanmoins, l'utilisation chronique de ces composés peut entraîner d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose, ou une atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont médiés par le récepteur des glucocorticoïdes (GR), un membre de la superfamille des récepteurs nucléaires. Dans le modèle classique, GR lié à une hormone est convoyé dans le noyau, où il se lie à ses éléments de réponse sur l'ADN de manière coopérative avec d'autres protéines appelées des corégulateurs. De plus en plus de preuves indiquent une spécificité tissulaire de ces corégulateurs. Lsd1 est un corégulateur qui interagit avec un autre membre des récepteurs nucléaires, le récepteur aux androgènes, dans les cellules cancéreuses de la prostate humaine. Nos données préliminaires montrent que Lsd1 interagit avec GR dans le muscle squelettique et que les niveaux de Lsd1 augmentent lors de la fonte musculaire induite par les glucocorticoïdes. De plus, les souris dépourvues de Lsd1 dans les myofibres ne parviennent pas à induire l’expression des gènes impliqués dans la protéolyse en réponse à la mise à jeun, ce qui indique que Lsd1 pourrait agir comme un coactivateur de GR pour favoriser le catabolisme musculaire. L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de Lsd1 dans les fibres musculaires adultes dans des conditions physiologiques et dans l'atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes soit par des traitements avec des composés analogues, soit par la mise à jeun.
Bénéfices attendus
Contrôler l'activité des GR en modulant celle des co-régulateurs tels que Lsd1 ouvrirait de nouvelles perspectives pour réduire les effets indésirables induits par les glucocorticoïdes.
Procédures
L'ensemble des animaux sera injecté au Tamoxifène par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous servira à étudier le rôle de Lsd1 dans le muscle sain subira ensuite une mesure de poids (30 sec/ souris), de glycémie (1 min/ souris), ainsi qu'un test de tolérance au glucose (IPGTT) et un test de tolérance à l’insuline (IPIST) (180 min au total / souris) par prélèvements sanguins au niveau de la veine caudale. Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre le rôle de Lsd1 dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 4 ne subira pas di'ntervention en dehors de l'injection au Tamoxifène mais sera mis à jeun de 24 à 48h.
Impact sur les animaux
L’injection de tamoxifène, de glucose, d'insuline et de dexaméthasone peut causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. La mise à jeun sur 24 - 48h pourra fortement affaiblir les animaux. L'injection d'insuline pourra éventuellement provoquer une hypoglycémie. Le gavage peut conduire à des fausses routes. L'incision au niveau de la queue pour les mesures de glycémie n'est pas douloureuse mais peut entrainer un inconfort chez l'animal. La présence de sang dans la cage peut générer un comportement agressif et ses congénères. Les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Il en va de même avec la mise à jeun pour laquelle la fonte musculaire peut atteindre 30%, pouvant de ce fait impacter la mobilité des animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque PE pour des études moléculaires et histologiques.
Remplacement
Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes endogènes (mise à jeun) et synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris est similaire à celle de l'homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.
Réduction
De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.
Raffinement
Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, une euthanasie sera réalisée. Une seule injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur animal vigile car l'anesthésie serait plus "traumatisante" que les injections sur animaux non anesthésiés. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.
Choix des espèces
Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et son co-régulateur Lsd1 dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc injectés au tamoxifène entre 7 et 11 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection. Pour les études métaboliques, les animaux seront mis à mort à deux temps : (i) à 15 semaines, âge auquel le muscle utilise essentiellement des acides gras pour produire de l'énergie, (ii) à 30 semaines, âge auquel le muscle squelettique utilise principalement des sucres.
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires de la mémoire associée au contexte de consommation d’alcool et cibler ces mécanismes avec la psilocybine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 802
320 souris et 802 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont entraînés à consommer de l'alcool pendant plusieurs semaines, reçoivent des injections répétées d'alcool, de lithium ou de psilocybine, une partie subissant une chirurgie cérébrale pour implanter des cannules ou injecter un vecteur viral, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-chirurgicales et un isolement sans enrichissement pour certains animaux. Il affirme que l'addiction est un mécanisme trop complexe pour être remplacé par des méthodes in vitro ou in silico.
Objectifs
L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle de la mémoire associée au contexte de la consommation d'alcool sur l'efficacité de la psilocybine à réduire la consommation d'alcool. Les objectifs secondaires seront d'étudier l'implication des récepteurs à la sérotonine et à la dopamine dans la réponse à la psilocybine en fonction des différents contextes de consommation d'alcool.
Bénéfices attendus
L'utilisation des psychédéliques dans le traitement de maladies psychiatriques est en plein renouveau depuis une petite dizaine d'années. Notre projet se place dans ce contexte et vise à mieux identifier les cibles moléculaires et les mécanismes cellulaires responsables de l'effet bénéfique de la psilocybine, un psychédélique issue de champignons, sur la réduction de la consommation d'alcool et sur la rechute après une période d'abstinence.
Procédures
Les souris seront soumises à des injections répétées (x 3) d'alcool ou de chlorure de lithium et une injection supplémentaire de psilocybine. Les rats recevront des injections de psilocybine et certains rats seront soumis à une chirurgie (30 minutes environ) visant soit à injecter un vecteur viral directement dans les structures cérébrales ciblées, soit à implanter des cannules d'enregistrement de l'activité dopaminergique. Les animaux seront également entrainés à consommer de l'alcool volontairement sur une période de 8 semaines à 4 mois.
Impact sur les animaux
Au cours des différentes expériences, les animaux ne subiront que des nuisances légères (injections uniques) ou modérées de courte durée (injections répétées - douleurs post-chirurgicales de palier 1-2). Les animaux consommeront volontairement de l'alcool pendant plusieurs semaines, certains animaux seront intégrés dans un protocole chirurgical visant à injecter un vecteur viral dans différentes structures du cerveau (durée de la nuisance: 3-4 jours). Les rats recevront 4 injections (3 de solution saline et une de psilocybine) au total. Les souris recevront entre 7 et 12 injections au cours des expériences de conditionnement de place. Dans certaines procédures, les animaux seront isolés et stabulés sans enrichissement du milieu. Ce manque d'enrichissement du milieu sera contrebalancé par des manipulations régulières voire quotidienne pour la majorité des animaux et par l'exposition à des contextes environnementaux différents aux cours des procédures fournissant ainsi un enricissement cognitif et psychomoteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque expérience. En effet, nous aurons besoin de récupérer les cerveaux pour effectuer des vérifications histologiques des sites d'injections et d'implantation, ou nous effectuerons des études de biochimie et de biologie moléculaire sur les tissus collectés.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Nous utiliserons une échelle de suivi du bien-être animl par espèce. Ces 2 échelles sont mondialement reconnues pour être suffisament prédictive de tout mal-être/douleur ou souffrance perçue par l'animal. En fonction des scores obtenus à ces échelles nous apporterons une réponse antalgique adaptée (dose croissante d'antalgique en fonction du score observé) et dose modérée immédiate pour les périodes post-opératoires chez le rat. Les animaux seront stabulés à plusieurs (sauf période transitoire de mesure de la consommation d'alcool individuelle pour certains rats), ils seront manipulés quotidiennement (enrichissement inter-espèces) et différents contextes environnementaux (texture du sol, décoration des murs, appuis sur des leviers conduisant à l'apparition de stimuli visuels et sonores) leur seront présentés (enrichissement environnemental).
Choix des espèces
Le rat est actuellement le modèle animal le plus couramment utilisé dans les études utilisant le paradigme de l'auto-administration opérante. Néanmoins, pour les études de préférence de place conditionné, le rat n'est pas le modèle idéal. En effet le rat ne développe pas de préférence de place conditionnée pour l'alcool. Donc pour les quelques expériences utilisant ce paradigme spécifique nous utiliserons la souris et plus précisemment la souche DBA /2J qui est connue pour présenter un comportement de préférence de place pour l'alcool supérieur à celui d'autres souches commes les C57Bl/6J ou encore les Swiss. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.
Role des ganglions de la base dans l’acte moteur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 900 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent jusqu'à deux chirurgies cérébrales, l'une pouvant durer quatre heures, puis des manipulations optogénétiques, des enregistrements électrophysiologiques et des injections intracérébrales, sous restriction d'eau et récompensés au sucrose pour apprendre à appuyer sur un levier à un signal sonore. Une partie subit une induction de la maladie de Parkinson, avec réduction de l'activité motrice et comportement de rotation. Le porteur revendique le rat comme "espèce de choix" et affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut reproduire la complexité des ganglions de la base.
Objectifs
La mise en œuvre de ces protocoles expérimentaux vise la compréhension et l’identification des activités neuronales impliquées au cours de l’exécution d’un mouvement volontaire chez des rats en situations physiologique ou lors de maladies motrices graves comme la maladie de Parkinson et une des complications motrices associées telle que les dyskinésies levodopa induite. Pour ce projet, nous utiliserons soit des rats de souche sauvage (Long Evans, ou GAERS) ou modifiés génétiquement (11 lignées différentes de rats transgéniques). Les objectifs principaux de ces protocoles sont l'identification et la manipulation de large ensembles et circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs. Pour réaliser ces objectifs, nous utilisons des approches technologiques de pointes chez l'animal combinant manipulations optogénétiques, enregistrements électrophysiologiques, et manipulations pharmacologiques (par injection intracérébrale). La tâche comportementale que nous avons mis au point consiste à entrainés des rats à effectuer un mouvement d’appuie sur un levier avec leur patte avant en réponse à un stimulus sonore ‘Go !’. L’accès à l’eau sera rationalisé pour ces animaux (restriction hydrique) et pour chaque essai réussi, ils recevront une dose de 40μL de solution de sucrose à 5%. Les expériences optogénétiques, d’enregistrement électrophysiologiques, et de manipulations pharmacologiques commenceront après apprentissage de la tâche chez des animaux normaux ou après induction de la maladie de Parkinson. Les effets de nos manipulations optogénétiques/pharmacologiques seront évalués sur les niveaux de performance moteurs liés à notre tâche et sur l’activité électrophysiologique enregistré en parallèle.
Bénéfices attendus
Ce projet original permettra d’amener des connaissances nouvelles et fondamentales sur le mode de fonctionnement normal et pathologique des ganglions de la base. Il permettra de définir les circuits neuronaux permettant l'expression et/ou l'inhibition de comportements moteurs et ainsi de mieux comprendre le mode d’action de stratégies thérapeutiques utilisées quotidiennement en clinique.
Procédures
Nos procédures expérimentales comportent aux maximum deux chirurgies, la première aura une durée maximale de 4 heures, la deuxième sera inférieure à 1 heure. Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux enregistrements électrophysiologiques. 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte. 4/ des effets indésirables moteurs unilatéraux inhérents à l'induction de la maladie de Parkinson (réduction de l'activité locomotrice et comportement rotatoire).
Devenir
Toutes les procédures sont terminales car les cerveaux des animaux seront prélevés pour analyse immunohistochimique.
Remplacement
Le but de se projet est de comprendre la physiologie et physiopathologie du réseau des ganglions de la base dans le contrôle de la motrivité volontaire. La seule manière d'atteindre nos objectifs est d'utiliser des approches in vivo mises en place chez l'animal se comportant ce qui nécessite donc le recours à l'utilisation d'animaux. A l'heure actuel, aucun modèle "in vitro" ou "in silico" ne peuvent reproduire la complexité et le mode de fonctionnement des ganglions de la base.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’anesthésiques et d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux et ont à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. Lors de la partie comportementale, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour diminuer leur niveau de stress lors des tests. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après chirurgie, et accrue dès qu’un signe d’appel est constaté. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances prolongées aux animaux avec des mesures de soulagement mis en place (réhydratation, réchauffement, et traitements vétérinaires si nécessaire).
Choix des espèces
Le rat est une espèces de choix car l’organisation des ganglions de base est inchangée au cours de l'évolution ce qui nous permet d'extrapoler les résultats que nous observerons à l'espèce humaine et donc de mieux comprendre le rôle de ces circuits dans certains troubles moteurs comme la maladie de Parkinson. Les rats sont des sujets de choix (par rapport au souris) pour toutes les expériences de comportements car ils sont moins sujet au stress et peuvent apprendre des tâches motrices plus complexes. La disponibilité et l'utilisation de rats transgéniques représente un outil précieux pour nos expériences d'optogénétique car elles permettent de manipuler de manière sélective des populations neuronales cibles. Dans ce projet nous utiliserons des rats génétiquement modifiés de type afin de manipuler différentes populations neuronales des ganglions de la bases. Le projet sera réalisé sur des rats agés de plus de 6 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau homogène pour une bonne reproductibilité des sites d’injection
Développement d’une méthode diagnostique et théragnostique dans le cadre de la maladie d’Alzheimer : enregistrement de l’activité de l’hippocampe par EEG
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un modèle de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une neurochirurgie pour implanter un dispositif d'enregistrement, puis des séances d'électroencéphalographie hebdomadaires pendant deux mois et, pour une partie, des injections quotidiennes dans l'abdomen, avant la mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur indique des douleurs post-opératoires et un hébergement en cage individuelle pour éviter que les animaux ne rongent le dispositif. Il présente cette technique comme un futur outil de diagnostic précoce chez l'humain, et affirme que ni la culture cellulaire ni les modèles informatiques ne reproduisent les interactions neurones-astrocytes visées.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation et de cognition des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Ce constat est notamment dû au fait qu’on ne peut pas diagnostiquer la maladie suffisamment tôt pour proposer un traitement dans la phase de mise en place, encore réversible, de la maladie. Il a été récemment identifié un stade auquel il est possible de stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Ce stade est notamment caractérisé par une activité anormale de l’hippocampe chez la souris. De manière intéressante, cette activité anormale de l’hippocampe a également été identifiée chez l’homme par des techniques d’imagerie médicale, qui restent couteuses et invasives. Cette activité de l’hippocampe est prédictive de l’apparition ultérieure de la pathologie chez l’homme. Ce projet vise à étudier la mise en place de cette activité par des techniques in vivo d’électroencéphalographie chez la souris afin de proposer cette technique en complément des techniques de diagnostic actuelles (reposant essentiellement sur des questionnaires cliniques) ou futures (marqueurs sanguins en cours de développement) mais également en suivi de l’efficacité d’un traitement. Des souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer qui manifestent, in vitro, cette activité anormale de l’hippocampe entre 1 mois et 3 mois post-natal seront utilisées. Cette technique in vivo d’enregistrement éléctroencéphalographique pourrait être facilement adaptable à l’homme et proposée en médecine de ville afin de statuer précocement sur la mise en place de la pathologie et proposer des thérapeutiques curatives précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de proposer une méthode diagnostique non invasive et peu couteuse, facilement mise en œuvre en médecine hospitalière et en médecine de ville et visant à mesurer l’activité hippocampale chez des patients susceptibles de présenter des troubles associées à la maladie d’Alzheimer. Chez l’homme, cette activité (mise en évidence par IRM) a été récemment associée aux phases précoces réversibles de la pathologie et est prédictive de l’évolution de la pathologie. Généraliser sa détection, par des techniques non invasives, pourrait permettre de proposer des traitements curatifs empêchant ou retardant l’évolution de la maladie. A l’heure actuelle, le diagnostic de la maladie est tardif car il est essentiellement clinique et s’appuie peu sur les techniques d’imagerie médicale qui restent couteuses. La technique d’électroencéphalographie pourra être envisagée à large échelle et proposée en médecine de ville ou en ambulatoire. Elle pourra également être associée aux méthodes de diagnostic en cours de développement (marqueurs sanguins, etc) pour confirmer le diagnostic, attester du stade de la maladie et proposer des thérapeutiques adaptées. Elle permettra également de suivre l’efficacité des thérapeutiques futures puisque la mise en place de l’activité anormale hippocampale semble être une des étapes critiques induisant l’irréversibilité de la neurodégénérescence.
Procédures
Les souris subissent une neurochirurgie pour une durée de 45 minutes, anesthésie incluse. L'activité des neurones cérébraux des souris sera enregistrée une fois par semaine pendant 1 heure sur une durée de 2 mois. Une partie des souris aura également des injections dans l'abdomen (durée 30 secondes) une fois par jour pendant 2 mois et demi.
Impact sur les animaux
Lors de l'installation du dispositif pour enregistrer l'activité des neurones, sous anesthésie générale, les nuisances ou effets indésirables pourront concerner d'eventuelles douleurs post-opératoires. Cet équipement nécessite de maintenir les animaux isolés en cages individuelles afin d’empêcher que les animaux ne cherchent à ronger le dispositif de leurs congénères. La perte du dispositif est un effet indésirable rare qui conduira à la mis eà mort de l'animal. L’injection quotidienne d’un traitement pharmacologique en intrapéritonéal peut éventuellement induire une douleur légère.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour effectuer des analyses des tissus cérébraux.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. L'activité des neurones est fortement influencée par la région à laquelle ils appartiennent mais également par l'interaction de ces neurones avec d'autres types cellulaires comme les astrocytes, notamment au sein de l'hippocampe. Ce modèle ne peut donc pas être remplacé par un modèle dépourvu de cette régionalisation et de ces interactions comme la culture cellulaire (in vitro). Même les modèles in vitro les plus performants (cultures tri-dimensionnelles ou organoïdes) ne permettent pas de reconstituer les interactions neurone-astrocyte qui sont impliquées dans la mise en place de l'hyperactivité de l'hippocampe. Par ailleurs, s'agissant des modèles computationnels, ceux-ci ne permettent pas de reproduire l'environnement physiologique dans lequel le peptide β-amyloide est libéré. Ils ne permettent pas non plus d'inclure tous les acteurs potentiels perturbés par cette pathologie.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupes et le nombre de répétitions des expériences sont réduites au maximum tout en optimisant l'interprétation statistique des résultats. Nous testerons 4 lots d'animaux transgéniques et contrôles que nous suivrons de manière hebdomadaire pour les enregistrements EEG : 1) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer suivis de 1 mois à 3 mois (périodes d’hyper puis d’hypoactivité hippocampique) : 15 animaux, 2) Souris non transgéniques contrôles suivis de1 mois à 3 mois : 15 animaux, 3) Souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. 4) Souris non transgéniques contrôles traitées par HC 030031 (Tocris) en injection ip (5 mg/kg/jour) de 14 jours post-natal à 3 mois : 15 animaux. Soit, au total, 60 animaux sur 5 ans. Afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées, nous commencerons les enregistrements sur les animaux de 1 mois : si l’hyperactivité n’est pas mise en évidence ou peu perceptible, le projet ne sera pas poursuivi.
Raffinement
Deux jours avant la phase d’implantation, de la nourriture hydratée appétante est disposée dans la cage des animaux à opérer afin de les conditionner à cette prise de nourriture pour une meilleure récupération post-opératoire. L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience, notamment suite à la chirurgie qui sera effectuée sous anesthésie générale. En post-opératoire les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires seront prévenues par injection systématique d’un antalgique. Les cages sont enrichies selon un programme mis en place dans l'animalerie. L'isolement sera limité par le fait que nous utilisons des cages avec grilles, en portoir ouvert, proches les unes des autres. Ainsi, des interactions soaciales persitent, notamment à travers l'olfaction (essentielle), la vision et l'audition. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés avant chaque enregistrement. Les critères de poids, d’apparence physique et de comportement seront pris en compte dans ce suivi. Nous utilisons des seringues microfines pour éviter des nuisances liées aux injections quotidiennes. Les injections seront réalisées en amont des procédures d’implantation et d’enregistrement électroencéphalographique pour éviter d’interférer avec celles-ci (au moins deux heures avant).
Choix des espèces
Les animaux seront utilisés dès 14 jours post-natal (groupe traité pharmacologiquement) car c'est le stade correspondant à la mise en place de la pathologie dans ce modèle. Les implantations seront effectuées à 26 jours post-natal pour démarrer les enregistrements à 1 mois qui correspond au stade pré-symptomatqiue de la maladie dans notre modèle. Les enregistrements seront effectués de manière longitudinale (1 fois/semaine) entre 1 et 3 mois post-natal, qui correspondent respectivement à la phase d’hyperactivité (phase critique réversible) et d'hypoactivité (phase irréversible) dans l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La phase d'hyperactivité semble être une étape critique dans le développement de la maladie et son identification par enregistrements électro-encépaholographiques permettrait un diagnostic précoce chez l'homme.
Vers le développement d’une nouvelle stratégie vaccinale anti-tumorale: étude de l’induction de réponses immunitaires efficaces par des nanoparticules dérivées de virus de plantes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à deux injections de nanoparticules dérivées d'un virus de plante et des injections de cellules, ainsi que jusqu'à dix prélèvements sanguins sous anesthésie, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique une réaction inflammatoire locale de courte durée au point d'injection. Les retombées annoncées, une nouvelle stratégie de vaccination contre le cancer, sont renvoyées à un projet ultérieur, et il affirme qu'un "organisme animal" est "nécessaire" pour démontrer l'initiation d'une réponse immunitaire.
Objectifs
Depuis plusieurs années de nouvelles innovations révolutionnent et complètent l’arsenal de thérapies anti-tumorales. En effet, si les thérapies classiques comme la chimiothérapie ou la radiothérapie peuvent être efficaces elles affectent aussi les cellules saines non cancéreuses et sont responsables de lourds effets secondaires. De plus, certaines tumeurs développent même une résistance aux traitements. C’est pourquoi la recherche de stratégies thérapeutiques se poursuit en s’appuyant sur la compréhension des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules cancéreuses. En particulier, il existe une population de cellules immunitaires qui sont de véritables chefs d’orchestre car elles sont capables d’induire et de contrôler une réponse immunitaire conduisant à la destruction des cellules tumorales mais pas des cellules saines. Alors développer des traitements qui ciblent ces cellules d’intérêt essentielles à la réponse immunitaire anti-tumorale est une stratégie thérapeutique prometteuse. Les nanoparticules sont des objets de petite taille (10-100 nm) et de composition variable (protéines, lipides…) qui peuvent pendant ou après leur synthèse être modifiés pour enfermer ou exposer différentes molécules d’intérêt (par exemple une molécule de ciblage et un agent thérapeutique). Les nanoparticules suscitent donc un grand intérêt pour des applications en vaccination antitumorale. Ce projet vise à étudier le potentiel thérapeutique d’une nouvelle nanoparticule protéique non-toxique dérivée d’un virus de plante qui peut renfermer à l’intérieur et/ou exposer à sa surface des molécules permettant son ciblage aux cellules d’intérêt et son activité anti-tumorale. Les molécules internalisées et exposées par cette nanoparticule peuvent être facilement remplacées par d’autres molécules ce qui permet de moduler la composition de la nanoparticule pour l’adapter au mieux à chaque type de cancer. Ici, nous souhaitons, en amont d’études sur des modèles de tumeurs, étudier si cette nanoparticule est capable de cibler les cellules d’intérêt et d’induire correctement une réponse immunitaire spécifique et robuste. Si les résultats sont concluants, nous mettrons en place un autre projet qui aura pour objectif d’étudier la capacité de cette nanoparticule à induire la destruction des cellules tumorales.
Bénéfices attendus
La nanoparticule plateforme de vaccination anti-tumorale de cette étude constitue une innovation intéressante qui pourrait enrichir les stratégies existantes pour lutter contre le cancer. En effet, si aujourd’hui les nouvelles immunothérapies ont certes permis d’améliorer la rémission de certains patients, d’autres demeurent résistants à ces composés. Pour ceux-ci, utiliser des nanoparticules innovantes seules ou en combinaison avec d’autres composés thérapeutiques déjà existants pourrait constituer une alternative thérapeutique. Par ailleurs, la fonctionnalisation de la nanoparticule utilisée dans cette étude est facilement modulable ce qui est un atout pour envisager des applications dans différentes pathologies tumorales.
Procédures
Au cours de l’expérimentation, les animaux seront soumis à plusieurs gestes techniques. Ils recevront : une ou deux injections de nanoparticules par voie intradermique dans l’oreille ou par voie sous-cutanée dans le flanc ainsi qu’une ou deux injections de cellules par voie intraveineuse. Par ailleurs, jusqu’à 10 prélèvements sanguins seront effectués. Ces trois types d’interventions (injections de nanoparticules ou de cellules et prélèvements de sang) seront tous réalisés sous anesthésie générale par un personnel compétent, habitué et formé au bien-être animal. L’anesthésie générale sera réalisée par induction gazeuse et durera 10 minutes pour les injections de nanoparticules, 1 minute pour les injections de cellules et 10 minutes pour les prélèvements sanguins. Par ailleurs pour les injections intraveineuses, l’anesthésié générale gazeuse sera complété d’une anesthésie locale au niveau du point d’injection. Les animaux se réveilleront rapidement (2 à 3 minutes) et en douceur de leur anesthésie. Les transferts de cellules se basent sur des protocoles largement décrits dans la littérature et sont des outils pour l’étude des caractéristiques de la réponse immunitaire provoquée par l’injection des nanoparticules. Les prélèvements sanguins quant à eux permettront de suivre au cours du temps dans le sang des animaux des marqueurs d’activation du système immunitaire comme par exemple, la production d’anticorps. Ils seront d’un volume adapté à la fréquence des prélèvements pour laisser le temps à l’organisme de l’animal de régénérer tout son volume sanguin avant le prélèvement suivant.
Impact sur les animaux
Les impacts cliniques prévus sur les animaux inclus dans cette étude sont décrits ci-dessous. Les injections de nanoparticules peuvent localement au niveau du site d’injection (oreille ou flanc) provoquer un une réaction inflammatoire locale courte et de faible amplitude qui pourrait causer une souffrance limitée (démangeaisons, rougeur cutanée, croûte) pour l’animal pendant au plus 2 jours. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir au niveau du site d’injection. La non-toxicité des nanoparticules a été vérifiée en amont ainsi, en elles-mêmes, les nanoparticules injectées ne seront pas sources d’effets indésirables. Les injections intraveineuses de cellules peuvent être la source du même genre de nuisance. Les cellules injectées proviendront d’animaux compatibles donc aucune réaction de rejet n’est à prévoir. Les prélèvements sanguins répétés (au plus 10) seront suffisamment espacés et d’un volume adapté pour laisser au temps à l’organisme de l’animal de regénérer son volume sanguin. Ainsi les animaux ne devraient que très légèrement être affaiblis par la réduction transitoire de leur volume sanguin. Après le prélèvement, au niveau du point de prélèvement du sang, une croûte pourrait se former et démanger l’animal, cette dernière devrait se résorber rapidement. Enfin toutes les manipulations répétées des animaux préalables aux injections et aux prélèvements sanguins peuvent être sources de stress. Pour limiter le stress et la douleur occasionnés par les injections et les prélèvements sanguins, les animaux seront placés sous anesthésie générale gazeuse parfois complétée avec une anesthésie locale au niveau du site d’injection. Les animaux seront toujours manipulés par du personnel compétent, habitué et sensibilisé au bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en sacrifice terminal en vue de récupérer les organes afin d’analyser les effets de la nanoparticule candidate sur la réponse immunitaire.
Remplacement
Lors d’études préliminaires in vitro nous avons obtenu des résultats très encourageants qui démontrent que les nanoparticules fonctionnalisées sont des outils prometteurs pour adresser spécifiquement une molécule bioactive aux cellules ciblées capables ensuite in vitro d’être fonctionnelles. Si ce type d’étude in vitro est une première étape pour la validation du potentiel thérapeutique des nanoparticules, il ne permet pas de démontrer qu’une réponse immunitaire est correctement initiée. Pour ces études, le recours à un organisme animal, dans lequel les cellules immunitaires interagissent entre elles de façon complexe au sein d’organes, est nécessaire. Nous pourrons alors étudier à l’aide de différents paramètres ou marqueurs la capacité des nanoparticules fonctionnalisées à favoriser l’initiation et le maintien d’une réponse immunitaire spécifique et robuste.
Réduction
Le nombre total de souris utilisées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Il est prévu de réaliser chaque expérimentation 4 fois afin de s’assurer que les effets observés soient constants et reproductibles d’une expérimentation à l’autre. Pour chaque condition testée, 3 animaux seront inclus par expérimentations pour atteindre au plus 12 souris par groupe. Si dès la troisième répétition d’expérience (effectif de 9 animaux) des effets sont mis en évidence par les tests statistiques alors nous ne réaliserons pas la quatrième répétition, ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adéquats qui permettront de mettre en évidence sur tous les paramètres étudiés des différences entre les groupes de souris (par exemple entre la nanoparticule d’intérêt et la nanoparticule contrôle ou entre la voie intradermique et la voie sous-cutanée pour les injections de nanoparticules).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupes dans des cages enrichies avec l’ajout de nids et de bâtons à ronger. Les animaux seront surveillés et manipulés par des personnes compétentes et formées au bien-être animal. Quotidiennement, leur état général sera surveillé afin de déterminer l’éventuelle présence de signes de stress ou de souffrance (attitude prostrée, dos voûté, démarche anormale, …). En cas d’atteinte d’un des points limites l’arrêt anticipé de l’expérimentation sera alors décidé. Les injections (intradermiques, intraveineuses, sous-cutanées) et les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress des animaux. Par ailleurs, dans le cas des injections par voie intraveineuse l’anesthésie générale sera complétée d’une anesthésie locale au niveau du site d’injection.
Choix des espèces
Les souris (Mus musculus) sont des mammifères dont le système immunitaire est très proche du système immunitaire humain tant du point de vue des caractéristiques des cellules immunitaires que des mécanismes globaux. En particulier, la type de cellules que nous souhaitons cibler dans cette étude est décrite avec des caractéristiques proches chez l’homme et chez la souris. Ainsi, pour nos études précliniques, la souris est un modèle de choix. Nous utiliserons des souris adultes jeunes (2 à 7 mois) qui possèdent un système immunitaire mature et fonctionnel.
Etude de l’inflammation dépendante des mastocytes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance qui va de léger à sévère. Elles subissent trois modèles d'inflammation provoquée, cutanée aux oreilles par application d'acide arachidonique, rénale et arthritique, avec des injections répétées et des prélèvements de sang et d'urine, avant la mise à mort pour prélever les organes. Le porteur indique attendre gonflement, douleur articulaire et mobilité réduite, une buprénorphine étant prévue en analgésie. Il affirme avoir déjà caractérisé l'enzyme visée in vitro mais conclut que le remplacement complet par des méthodes sans animaux est "impossible", l'inflammation étant décrite comme un processus trop complexe.
Objectifs
L'inflammation est un mécanisme clé dans la réponse immunitaire. Néanmoins, une inflammation excessive, par exemple suite à des infections ou d'origine auto-immunitaire présente un risque sanitaire sérieux. Des traitements anti-inflammatoires existent mais ont des effets secondaires potentiellement importants. Une meilleure compréhension des acteurs cellulaires et moléculaires est donc requise pour une prise en charge optimale et un développement thérapeutique ciblé contre les acteurs de l’inflammation. Les mastocytes représentent un type de cellules immunes primordial dans l'orchestration de l'inflammation, mais dont le rôle précis reste à découvrir. Afin de limiter l’expérimentation sur l’animal, nous avons préalablement mené des études in vitro, qui nous ont permis d’identifier et de caractériser une enzyme présente dans les mastocytes. Nous avons démontré que cette enzyme est nécessaire à la libération de médiateurs pro-inflammatoires in vitro. En effet, les mastocytes dépourvus de cette enzyme présentent une diminution significative de la sécrétion des molécules pro-inflammatoires. De plus, des molécules bloquant l’enzyme étudiée sont disponibles. C’est pour cela que nous émettons l’hypothèse que l’enzyme d’intérêt est un nouveau candidat pour le traitement ciblé de l’inflammation indésirable. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques, son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que l’utilisation de modèles inflammatoires in vivo chez la souris est indispensable. Nous prévoyons d’étudier le rôle de l’enzyme d’intérêt dans trois modèles inflammatoires in vivo. Dans chacun de ces modèles la gravité de l’inflammation de sera comparé entre les souris génétiquement invalidées pour l’enzyme étudiée, des souris traitées avec l’inhibiteur spécifique et des souris contrôles. Nous allons également reconstituer des souris dépourvues de mastocytes avec des mastocytes génétiquement invalidés pour l’enzyme étudiée ou contrôles. Ceci nous permettra d’évaluer la participation des molécules inflammatoires issues des mastocytes dans les pathologies étudiées. Ce projet aura donc pour objectif de consolider le rôle de l’enzyme en question dans l’inflammation dépendante des mastocytes et de la valider comme nouvelle cible thérapeutique potentielle.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus répondront à la fois à des questions de la recherche fondamentale en apportant une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’inflammation dépendante du mastocyte et également aux besoins de la recherche translationelle en permettant de valider la protéine d'intérêt comme nouvelle cible pour le développement de médicaments anti-inflammatoires à long terme.
Procédures
Modèle d’inflammation cutanée des oreilles: sur animaux vigiles: injection sous-cutanée d’un analgésique (1x, durée du geste
Impact sur les animaux
Les nuisances infligées aux animaux dans ce projet comprennent le stress et la douleur induits par la manipulation et l’injection des produits (i.p. et i.v.). L’application d’acide arachidonique déclenche une réaction allergique locale, caractérisée par un gonflement, de la chaleur et l’hypersensibilité cutanée. La douleur est attendue également suite au déclenchement de l’arthrite et l’inflammation rénale. Pour l’arthrite, la douleur dans les articulations des membres peut entrainer une mobilité réduite. Dans tous les cas, les protocoles expérimentaux prévoient la mise à mort à l’issue de la procédure. Les durées des procédures après déclenchement de l’inflammation sont variables en fonction de la pathologie declenchée (1 heure, 4 jours et 8 jours), ainsi limitant les nuisances potentielles, même légères, dans le temps. Une mise à mort anticipée aura lieu dès qu’un animal atteindra les points limites détaillés plus bas.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement et analyse des paramètres biochimiques des organes ciblés.
Remplacement
Les mastocytes dépourvus de la protéine d’intérêt ont été étudiés et caractérisés in vitro. Le mode d’action d’une molécule bloquant spécifiquement cette protéine a également été validé sur des cellules de cultures. Ces travaux préalables nous ont permis d’avoir recours à l’expérimentation animale de manière très ciblée en choisissant des modèles d’inflammation qui impliquent les mécanismes mis en évidence in vitro, notamment la sécrétion des médiateurs inflammatoires par les mastocytes. L'inflammation est un processus physiologique complexe impliquant le recrutement et l'activation de multiples acteurs cellulaires ainsi que les structures anatomiques; son étude in vitro reflète donc insuffisamment l'ensemble de ses mécanismes. C’est pour cela que le remplacement complet des modèles in vivo par des techniques in vitro dans le contexte de notre étude est impossible.
Réduction
Le nombre d’animaux est justifié par la nécessité d’atteindre des résultats statistiquement significatifs en utilisant des test statistiques adéquats. Le nombre a été calculé avec l’aide de l’assistant de conception expérimentale (NC3RS) et confirmé avec le logiciel invivostat, utilisant un calcul basé sur la puissance statistique 90% et signification à 5%. Ce nombre sera davantage réduit si les premières expériences effectuées avec les souris génétiquement modifiées ne montrent pas de différence comparable aux souris contrôles. Dans ce cas, les procédures ne seront pas appliquées sur les souris déficientes en mastocytes.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne en charge du projet. Afin de limiter la souffrance due aux injections sous-cutanées, i.p. et i.v., les injections seront réalisées avec des seringues à insuline très fines qui donnent une injection quasi indolore grâce au biseau à trois facettes. Les prélèvements sanguins par ponction à partir de la veine faciale seront réalisés avec une lancette pour animaux (traumatisme minime à l'encontre de l'animal). L’accès à l’eau pour une bonne hydratation des animaux sera contrôlé quotidiennement. Un traitement analgésique par injection sous-cutanée de buprénorphine à 0,1mg/kg est prévu pour tous les modèles d’inflammation. Si un animal démontre ressentir une douleur basée sur une expression modérée ou sévère, un renouvellement du traitement analgésique sera réalisée immédiatement. Afin d'assurer aux animaux les meilleures conditions d'hébergement, nous ajouterons dans la cage du coton, des maisonnettes en carton ou des tunnels ainsi que des bâtonnets de bois à ronger. Des points limites spécifiques à chaque procédure ont été définis. Pour toutes les procédures, tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort par inhalation de CO2 dans un système dédié.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Le modèle murin permet également l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus de nombreux outils expérimentaux et analytiques ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. De surcroît, le modèle d’inflammation rénale murin partage avec l’homme un nombre de néphrons fixés après la fin de la néphrogénèse contrairement aux poissons et aux batraciens. C’est également un modèle indispensable pour les essais pré-cliniques. Souris adultes âgées de 8 à 12 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé pour l'étude de l'inflammation dépendante des mastocytes. De plus, le nombre de mastocytes augmente avec l'âge ainsi augmentant le phénotype dans les modèles choisis. L'age de 8 semaines est indiqué dans la littérature spécifique sur ce modèle d'arthrite auto-inflammatoire.
Etude du rôle du microbiote dans le processus cancéreux de tumeurs digestives
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. On leur greffe un tissu tumoral sous la peau, puis on leur administre une bactérie par voie orale ou par injection dans la tumeur trois fois par semaine pendant six semaines, certaines étant réopérées pour retirer la tumeur avant deux mois d'observation, avant la mise à mort. Le porteur décrit un retentissement qu'il présente comme limité, avec une faible perte de poids. Il indique s'appuyer sur des données cliniques de patients pour réduire le recours aux souris, mais retient la souris greffée comme "modèle préclinique pertinent" pour le processus cancéreux.
Objectifs
Le cancer de l’anus est une tumeur rare encore peu étudiée mais très invalidante et dont la fréquence augmente. Sa prise en charge thérapeutique conduit encore à des conditions de vie dégradées et à des échecs thérapeutiques chez de nombreux patients. Une meilleure compréhension de ce cancer est donc nécessaire pour améliorer in fine cette prise en charge. Nos travaux portent sur des analyses, non pas uniquement des cellules tumorales elles-mêmes, mais également de leur environnement afin de mieux comprendre ces cancers. Ainsi, nous étudierons plus particulièrement l’impact du microbiote intestinal. Le microbiote (ensemble des micro-organismes - bactéries, virus, parasites, champignons non pathogènes, dits commensaux - qui vivent dans un environnement spécifique) et son équilibre sont maintenant bien connus pour jouer un rôle prépondérant pour notre Santé. Ainsi, un germe majeur de ce microbiote intestinal a été analysé dans les tumeurs de la tête et du cou et dans les tumeurs du rectum. Sa présence a été associée pour les premiers (tête et cou) à un bon pronostic, contrairement aux tumeurs du rectum. Le cancer de l’anus est proche à la fois des tumeurs tête et cou par la nature de l’épithélium et de celui du rectum par sa localisation. Notre étude a pour but, à la fois d’acquérir une meilleure connaissance biologique des cancers de l’anus et d’aider à déterminer s’il existe un intérêt à cibler cette bactérie dans la prise en charge thérapeutique des patients.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces travaux a pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la pathologie de ce cancer invalidant afin d’améliorer la prise en charge future des patients.
Procédures
Un premier groupe de souris sera greffé en sous-cutané avec du tissu tumoral sous anesthésie (20 minutes d’anesthésie pour la greffe qui nécessite une intervention chirurgicale très courte elle-même d’une durée de 2 min max). Ces souris recevront la bactérie d’intérêt par oral (animaux vigiles) ou bien par injection dans la tumeur (animaux anesthésiés) 3 fois par semaine (durée du geste < 30 secondes), pendant les 6 semaines de suivi de croissance tumorale avant d’être euthanasiées pour analyse post-mortem. Un deuxième groupe de souris sera greffé avec la tumeur (sous anesthésie : durée 20 min) et traité avec la bactérie de la même façon (injections intratumorales sur animaux anesthésiés ou gavage sur animaux vigiles : durée du geste
Impact sur les animaux
Ce travail porte sur des cancers qui se développeront chez des souris greffées. Selon la localisation de la greffe, la tumeur peut ne pas avoir de retentissement sur l’état général (croissance uniquement locale en sous-cutané) ou bien avec un retentissement général qui reste limité dans notre expérience (faible perte de poids, traitement antalgique permettant la prise en charge de la douleur induite par l’intervention chirurgicale). La durée est celle de l’expérience, de 6 à 14 semaines maximum. De plus, les nuisances attendues lors de l’administration de la bactérie seront celles liées à l’injection intra-tumorale ou par le gavage de produits non toxiques et non irritants.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Les données cliniques de tumeurs de patients ont été largement utilisées afin d’obtenir un maximum d’information sans avoir recours à l’animal. Elles permettent aussi de définir au mieux le plan expérimental ayant recours aux souris dans le but de réduire le nombre d’animaux. De même, des analyses sur du matériel congelé nous permettent de remplacer des approches chez l’animal pour sélectionner le modèle tumoral le plus susceptible d’être colonisé par la bactérie.
Réduction
Les analyses moléculaires préliminaires portent sur des tissus déjà congelés (pas de recours à de nouveaux animaux pour cette analyse) et permettront de ne greffer sur l’animal que les tumeurs de la collection présentant un intérêt pour l’étude. Une première expérience pilote sur un nombre faible d’animaux permettra de choisir le modèle d’infection le plus efficace qui sera utilisé dans la suite du projet. Le test de Mann-Whitney sera utilisé pour comparer le développement de métastases dans les différentes conditions.
Raffinement
Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et avec l’administration d’analgésique pour couvrir la période per et post-anesthésie. Les souris seront suivies au minimum 3 fois par semaine. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective, l’état des animaux.
Choix des espèces
Le modèle de souris greffé avec des tumeurs dérivées de tumeur de patient est reconnu comme un modèle préclinique pertinent pour étudier le processus cancéreux. Souris nudes adultes afin de pouvoir réaliser une greffe en sous-cutané de tumeur.
REPMOD-Évolution et réversion des modes de reproduction: les bases génétiques de l’oviparité et de la viviparité chez le lézard vivipare (Zootoca vivipara)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
260 lézards vivipares vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant du "sans réveil" au modéré, une partie tuée pour prélèvement, l'autre relâchée sur ses lieux de capture ou gardée captive à vie pour les hybrides. Les femelles subissent des échographies répétées sur animal éveillé puis sont mises à mort pour prélever leurs oviductes, tandis que d'autres individus subissent une biopsie de la queue sans anesthésie ni analgésie. Le porteur justifie l'absence d'anesthésie par la petite taille des animaux et leur capacité à régénérer la queue. Il affirme que l'étude de l'expression des gènes exige des tissus frais d'animaux vivants et écarte l'usage d'échantillons de muséum.
Objectifs
Le but du projet est de comprendre la génétique de la reproduction, et son évolution. Le modèle unique du “lézard vivipare” (Zootoca vivipara) comprend différents types de reproduction au sein de la même espèce. En effet, certains lézards pondent des œufs, d’autres donnent naissance à des juvéniles déjà formés, et certaines lignées de ces lézards qui donnaient naissance à des jeunes se sont remis à pondre des œufs au cours de l’évolution. Ces différentes situations vont nous permettre d’étudier l’expression des gènes dans les organes reproducteurs des femelles et décrire la structure de ces organes afin d’en comprendre leur fonctionnement, qui permettra d’expliquer l’apparition des différentes formes de reproduction chez les différentes lignées de Z. vivipara.
Bénéfices attendus
Ce travail va apporter des connaissances sur les différences génétiques présentes dans les différents types de reproduction du lézard vivipare qui sont encore inconnus. Plus généralement, ce travail sera une contribution majeure à la compréhension de l’évolution de la reproduction chez les vertébrés. Ce travail permettra aussi de mieux comprendre l’histoire de l’évolution de Z. vivipara. Les génomes obtenus grâce à cette étude seront mis à disposition de la communauté scientifique. Sur le long terme une meilleure compréhension de la reproduction du lézard vivipare permettra de mettre en place des programmes plus adaptés à sa sauvegarde. Les scientifiques de ce projet, ainsi que plusieurs des partenaires impliqués dans ce projet, sont investis dans des associations de vulgarisation scientifique et de protection des reptiles qui permettent à la fois de mieux faire connaitre ces animaux mais aussi de faire évoluer la législation vers une meilleure protection de leurs habitats. Ils participeront à des conférences grand public autour de la protection des reptiles en partenariat avec des ONG dans le domaine de l’écologie.
Procédures
Types d’interventions prévues : 1. Pour 120 femelles sauvages, et au maximum 40 femelles issues de croisements hybrides, des échographies seront effectuées sur animaux vigiles car l’intervention ne dure que quelques minutes, et sera effectuée 2 à 3 fois par semaine. Lorsque les organes reproducteurs seront à la bonne phase du cycle reproductif, les femelles seront euthanasiées selon une méthode réglementaire. 2. Des biopsies de queue seront réalisées sur 100 individus, pour analyser les bases génétiques de la reproduction de 40 mâles et de 20 femelles (les femelles sauvages utilisées pour les croisements hybrides), ainsi que 40 animaux hybrides issus de ces croisements. Cette intervention est très rapide et sera effectuée sans anesthésie ni analgésie due à la petite taille de l'animal et à leur capacité à régénérer leur queue. Une désinfection des instruments médicaux utilisés et de la queue sera effectuée pour chaque individu. En dehors de ces procédures les manipulations seront réduites au minimum pour limiter le stress des animaux.
Impact sur les animaux
Les populations de Zootoca vivipara en France et en Autriche sont suivies depuis de nombreuses années par les écologues et leur maintien en captivité est bien maitrisé. Tous les lézards qui ne seront pas mis à mort dans le cadre de l’action seront relâchés aux points GPS de leur capture (à l’exception des individus hybrides qui seront maintenus en captivité jusqu’à leur mort naturelle).
Devenir
En ce qui concerne les femelles utilisées pour l’intervention 1, elles seront euthanasiées afin de prélever leurs oviductes. Il s’agit de la seule technique qui actuellement permette d’obtenir des informations de qualité sur l’expression des gènes dans un organe spécifique. En effet, les ARNs (qui permettent d’obtenir les données d’expression des gènes) se dégradent très rapidement et il est nécessaire d’utiliser des tissus frais pour les obtenir. En ce qui concerne les femelles et les mâles utilisés pour la reproduction, ils pourront être relâchés à leur point de capture. Il est important de noter que ces individus pourront être utilisés pour plusieurs croisements avant d'être relâchés. Les animaux issus de croisements de lignées différentes (hybrides) ne pourront pas être relâchés dans la nature et seront gardés en élevage jusqu’à leur mort naturelle.
Remplacement
Les gènes liés à la reproduction des lézards vivipares ne sont pas encore connus. Il est donc obligatoire de travailler sur des animaux vivants pour les découvrir. L’étude de l’expression des gènes (ARN), contrairement à celle de l’ADN, nécessite d’utiliser des tissus frais. Il n’est donc pas possible d’utiliser des échantillons déjà présents dans les muséums ou des laboratoires de recherche. Dans le futur, nous travaillons à la mise en place de solution pour ne plus avoir à utiliser d’animaux vivants pour étudier les gènes que nous aurons identifiés au préalable (utilisation de lignées de cellules d’organes reproducteurs de reptiles en laboratoire).
Réduction
Un échantillon maximal de 260 individus semble optimal pour obtenir des résultats précis et exploitables (en dessous de ce nombre on court le risque de ne pas réussir à identifier les différences génétiques et donc de ne pas pouvoir répondre à la question scientifique motivant ces expériences). Le nombre d’animaux soumis à la biospie de la queue (100 lézards au lieu des 260 de l’étude) a été réduit, car la queue pourra être prélevée en même temps que les organes reproducteurs des femelles (160 femelles sont concernées).
Raffinement
Pour limiter le stress et coller le mieux possible à l'écologie de l'espèce, l'élevage sera effectué en milieu semi-naturel en extérieur par groupe de maximum 12 individus par bac de pâture de 1100L. Ils comprennent à la fois de la terre pour que les animaux puissent s'enfouir, des cachettes et des plantes pour imiter le milieu naturel. Il permet de minimiser le contact entre l’Homme et les animaux et donc de réduire le stress des lézards. Une supplémentation en nourriture et un arrosage selon la saison est prévu. Suite à la capture, une acclimatation d’une semaine avant manipulation sera effectuée dans une animalerie (UV et température contrôlée en terrarium) pour permettre d’identifier et traiter les éventuels parasites présents sur les animaux sauvages et éviter des risques de contamination. En ce qui concerne les manipulations des animaux notamment lors des échographies, elles seront effectuées dans les conditions les moins stressantes possibles (température basse, luminosité basse), le plus rapidement possible afin de limiter le stress lors de la contention en main. Le personnel intervenant sur les lézards aura été préalablement formé par des personnes capacitaires pour cette espèce. Bien qu’une douleur sera toujours présente lors des biopsies de l’extrémité de la queue, celle-ci sera réduite par l’utilisation de matériel adapté (ciseaux bien aiguisés) et de personnel formé pour cette procédure. Ceci permettra que cette procédure soit rapide et effectuée dans des conditions d’asepsie (désinfection du matériel entre chacun individu et application de Chlorhexidine diluée sur la plaie après la biopsie) qui permettent une cicatrisation rapide. L’animal sera de plus placé sur du sopalin pendant les jours suivant la biopsie pour limiter les risques d’infection et permettre une meilleure visualisation de la plaie pour suivre la cicatrisation. Les points limites suivants ont été définis : les animaux présentant des signes d’infection (pus + nécrose de tissus), un abattement, une léthargie ou une anorexie supérieure à 7 jours seront exclus de l’étude et pourront être euthanasié selon avis vétérinaire. Les animaux trop maigres seront mis en quarantaine et nourri quotidiennement, ils ne seront réintégrés dans l’étude qu’après reprise de poids et stabilisation. Les animaux adultes dont la queue est inférieure à 2cm ne seront pas utilisés pour la biopsie de queue, ils seront soit intégrés au groupe qui sera euthanasié (femelles) soit relâchés (mâles).
Choix des espèces
Les différences génétiques entre les animaux qui pondent des œufs, et ceux qui donnent directement naissance à des nouveau-nés ne sont pas connues. Ces analyses ne peuvent donc pas être simulées, et nécessitent le recours à des animaux vivants. Pour répondre à cette question, il est nécessaire d’avoir des animaux très proches possédant ces modes de reproductions différents : c’est le cas du lézard vivipare (Zootoca vivipara) qui est ainsi un modèle de choix unique pour cette recherche. Les animaux utilisés seront des adultes matures sexuellement. Une partie des femelles issues du milieu sauvage seront utilisées pour étudier leurs organes reproducteurs. Les mâles et les femelles issus du milieu sauvage restant seront utilisés pour la reproduction (obtention de lignées hybrides). Les nouveau-nés issus de ces croisements (individus hybrides) seront, pour une partie, utilisés pour étudier leurs organes reproducteurs (femelles), et pour une autre partie, gardés en captivité jusqu’à leur mort naturelle (mâles et femelles surnuméraires).
Rôle de CD44 au cours des complications hépatiques liées à l’obésité
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'une alimentation riche en graisses, elles subissent des prélèvements sanguins et des injections intrapéritonéales destinées à provoquer une fibrose du foie, avant la mise à mort. Le porteur décrit une perte de poids et des lésions possibles au site d'injection, rougeur, infection ou nécrose. Il indique mener des travaux in vitro en parallèle, mais affirme l'expérimentation in vivo "nécessaire" pour reproduire les interactions entre organes.
Objectifs
L’obésité augmente le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires mais s‘accompagne également de complications hépatiques. Ces complications sont fréquentes mais sous estimées, en raison de leur évolution « silencieuse ». Ces altérations hépatiques vont d’un simple foie gras, avec ou sans inflammation, pouvant progresser jusqu’au cancer du foie. Plusieurs facteurs sont impliqués dans la progression de ces complications, comme la résistance à l'insuline, le microbiote intestinal, les stress cellulaires et l'inflammation. Cependant, aucun traitement pharmacologique n’est encore disponible et une meilleure compréhension de l'évolution de ces complications est nécessaire pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre équipe de recherche s’intéresse à une protéine que l’on retrouve à la surface des cellules immunitaires, appelée CD44. Celle-ci joue un rôle dans l’inflammation du foie. Chez les patients atteints de complications hépatiques, la présence de CD44 est augmentée dans le foie en comparaison aux patients sains. De plus, la neutralisation de CD44 prévient et corrige les complications hépatiques, en régulant le recrutement et l’activation de cellules immunitaires dans le foie. Par l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour inactiver le gène CD44 dans toutes les cellules de l’organisme (CD44 Knock Out (KO) systémique), et soumis à un régime favorisant l’apparition de complications hépatiques, nous serons en mesure de démontrer l’implication et le rôle de CD44 et d'observer les conséquences biologiques lors de sa suppression au cours des complications hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la validation in vivo du rôle de la glycoprotéine CD44 dans un contexte de complications hépatiques liées à l’obésité et de décrypter les mécanismes physiopathologiques dans la mise en place et la progression des maladies chroniques du foie.
Procédures
En fonction des procédures, les animaux seront soumis à deux prélèvements sanguins maximum. Les animaux nourris avec une alimentation riche en graisses seront prélevés deux fois, en milieu et en fin de régime. Ces prélèvements ne dureront pas plus d'une minute maximum. Des injections intra-péritonéales seront également effectuées pour étudier le développement de la fibrose hépatique. Ces injections ne durent que quelques secondes et leur fréquence ne dépassera pas deux injections par semaine.
Impact sur les animaux
Avant l’arrivée aux points limites décrits dans chaque procédure, les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous serons très attentifs. Ces effets indésirables sont principalement la perte de poids chez l’animal. Les injections par voie intra-péritonéale pourront entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose...).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Nous utiliserons pour chaque procédure un nombre minimum d'animaux qui nous permet de réaliser des études statistiques robustes et pertinentes.
Remplacement
Pour répondre à l’exigence de remplacement, des études seront réalisées in vitro sur des lignées cellulaires afin de mettre au point les différentes conditions expérimentales avant de réaliser les expériences sur les cellules primaires. Il est nécessaire de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et les différents types cellulaires présents dans un organe.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons un schéma de croisement qui génère 50% de souris WT et 50% de souris KO (50% de souris contrôles et 50% de souris dont le CD44 est non-fonctionnel) ce qui évite la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure utilise un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes (tests non-paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA). Nous avons déterminé au travers de nos différents travaux publiés que le nombre adéquat d'animaux à intégrer par groupe doit être compris entre huit et dix. Ce nombre est communément admis et utilisé dans l'ensemble des études publiées dans le domaine du métabolisme. Nous choisirons dans cette demande un nombre fixe de dix animaux par groupe afin d'obtenir une puissance statistique suffisante. Les expériences seront reproduites une seconde fois pour confirmer la significativité statistique quand celle-ci est proche d'être atteinte lors du premier set d'expérience.
Raffinement
Pour répondre au raffinement, l'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un enrichissement systématique et les personnes réalisant les différentes procédures respecteront les règles éthiques lors des manipulations et sacrifices des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par les animaliers et nos surveillances régulières nous permettront d'identifier précocement tout signe de stress ou de souffrance afin d'appliquer les points limites.
Choix des espèces
La souris est une espèce très utilisée dans les études fondamentales et métaboliques. C’est une espèce facile à utiliser grâce à sa natalité importante. Notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont obtenues sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour réaliser des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Pour la procédure 1 (souris mâles), la mise sous HFD ou Western Diet sera effectuée à environ 8-10 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise. En effet, un régime riche en graisse induit une prise de poids importante. L’utilisation d’un tel régime peut durer jusqu’à 32 semaines, d’où la nécessité d’avoir des animaux relativement jeunes. Pour la procédure 2 (souris mâles ou femelles), le traitement au CCl4 débutera à environ 7-8 semaines d’âge, lorsque le poids des souris se stabilise.
Elaboration d’un modèle rongeur porteur d’un microbiote humain permettant de tester des stratégies nutritionnelles individualisées sur des pathologies liées au vieillissement
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dix étant proposés à l'adoption et les autres tués à l'issue pour prélèvements. Ils reçoivent un microbiote humain, un traitement au polyéthylène glycol qui provoque une forte diarrhée, puis de nombreux gavages et prélèvements sanguins, avec un hébergement individuel. Le porteur décrit une perte de poids et des troubles du comportement à surveiller, dont l'agressivité, l'arrachage de poils et l'automutilation. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne reproduit l'interaction entre microbiote et hôte et retient le rat comme modèle établi.
Objectifs
La proportion des personnes âgées (60 ans et +) représentera un tiers de la population française à l’horizon 2050. Cette population est très hétérogène et se caractérise, pour les extrêmes, par des individus en bonne santé, actifs, en bon état nutritionnel et vivant en général chez eux et par des individus dépendants, vivant parfois en institution et en état de sous-nutrition chronique (population fragile). Le déclin progressif des fonctions physiologiques et cognitives avec l’âge entraine cet état de fragilité qui favorise l’apparition de pathologies. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant dans l’intestin. Des études chez l’homme ont montré que la composition et les fonctions du microbiote intestinal jouent un rôle central dans de nombreuses pathologies. Des déséquilibres de la biodiversité du microbiote intestinal (dysbiose) apparaissent d’autant plus marqués que les sujets sont dans un état de santé fragile. Une corrélation étroite existe, chez les personnes âgées, entre état de santé et profil de microbiote. Des études de transfert de microbiote de rongeurs ont clairement identifié que ces dysbioses liées à l’âge peuvent jouer un rôle décisif vis-à-vis de pathologies ou complications liées au vieillissement : ainsi, il a été montré que le transfert d’un microbiote issu de souris âgées à des souris axéniques (sans microbiote) s’accompagne, chez les souris receveuses, de modifications mimant des caractéristiques métaboliques et immunitaires d’un organisme âgé. De nombreuses stratégies nutritionnelles ou pharmacologiques sont encouragées pour lutter contre ou ralentir le déclin physiologique au sens large lié à l’âge. Du fait de ces altérations du microbiote, des stratégies innovantes le prenant en compte doivent être maintenant considérées, nécessitant notamment des modèles animaux expérimentaux. Les rongeurs sont les modèles précliniques principaux, ainsi, notre projet consiste à développer et valider un modèle de rats à microbiote humain permettant ainsi d’étudier l’effet d’une dysbiose sur l’apparition de la fragilité liée à l’âge (pathologie et état de sous nutrition chronique). Nous allons implanter un microbiote de personnes âgées saines ou fragiles à des rats puis nous comparerons l’effet de cette transplantation sur la physiologie de l’hôte par rapport à des rats implantés avec un microbiote d’adulte jeune sain. Nous développerons ainsi un modèle préclinique original
Bénéfices attendus
La composition du microbiote, plus que l’âge, pourrait être un déterminant important d’un vieillissement sans pathologie. Des études se sont intéressées à des transferts de microbiote depuis des individus âgés vers des animaux sans microbiote et cela a permis de montrer l’apparition d’une partie du phénotype âgé, tel que l’inflammation de bas grade observée au cours du vieillissement ou de certains phénotypes associés au vieillissement. L’originalité de notre étude est que l’on s’intéresse aux différences majeures existant au sein des sujets âgés : c’est-à-dire comparer un microbiote de jeune avec un microbiote d’âgé en santé et un microbiote d’âgé présentant un syndrome de fragilité. Ce type d’étude qui s’intéresse à la diversité de phénotype et de microbiote n’a encore jamais été faite. Nous avons au préalable mené une étude clinique au cours de laquelle la fragilité d’individus âgés a été évaluée selon différents critères (questionnaires de dépendance, alimentaires, tests physiques et cognitifs). Au sein de cette population âgée nous avons pu déterminer quels étaient les plus représentatifs de la population âgée saine et de la population âgée fragile. Leur microbiote intestinal a été analysé quantitativement et qualitativement. En implantant à des rats le microbiote intestinal d’humains âgés en bonne santé ou en fragilité, nous souhaitons appréhender le lien causal des dérèglements du microbiote humain et des dérégulations métaboliques associées à la fragilité liée à l’âge. La mise en place d’un tel modèle est aujourd’hui indispensable pour prendre en compte de façon objective le microbiote dans les stratégies de prise en charge préventive de la fragilité des séniors. Ceci n’a, à notre connaissance, jamais été fait malgré la demande des partenaires socio-économiques. Nous aurons ici des échantillons d’origine clinique bien caractérisés qui seront transplantés aux animaux, participant ainsi à la validation du modèle. Le développement de ce modèle de rongeur, s’il permet de mettre en place une fragilité chez le rongeur âgé, nous permettra ensuite de tester des stratégies nutritionnelles innovantes et personnalisées ciblant spécifiquement les dérèglements du microbiote. Ces stratégies développées et testées chez les rongeurs permettront ensuite le développement de solutions de types probiotiques, prébiotiques ou symbiotiques à destination des séniors dans un but de préservation de leur autonomie.
Procédures
→Pour un premier groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang pour un test de tolérance au glucose. - 1 gavage d’une solution de glucose. - Chaque manipulation sera sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes. →Pour un second groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang dans pour l’étude de la perméabilité intestinale. - 1 gavage d’une molécule fluorescente destinée à mesurer la perméabilité intestinale. - Chaque manipulation sera sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes. → Pour un troisième groupe d’animaux, les interventions seront les suivantes : - 6 prélèvements de sang à la fin de l’étude. - 5 prélèvements de fèces au cours de la procédure. - 13 gavages au cours de la procédure - Chaque manipulation sera faite sur animal vigile et durera en moyenne 2 minutes pour les gavages et prélèvement de sang et 5 minutes pour les prélèvements de fèces. - Anesthésie générale gazeuse de tous les animaux par isoflurane à la fin de la procédure. - Injection unique d’analgésique à tous les animaux en fin de procédure. - 1 prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie. Tous les animaux sont concernés et cela durera 5 à 10 minutes maximum.
Impact sur les animaux
L’aspect le plus dommageable de ce protocole réside principalement dans le traitement au polyéthylène glycol, destiné à diminuer le microbiote, qui peut entrainer un inconfort lors des gavages. Suite au traitement, les rats développeront une forte diarrhée sur 1 à 2 jours et peuvent subir une légère perte de poids. De plus, les prises de sang peuvent s’accompagner de douleur et de stress. Dans le cadre de ce projet, aucune mortalité consécutive au traitement n’est attendue. Des nuisances peuvent aussi survenir lors de l’isolement des animaux. Des changements au niveau de leur comportement seront à surveiller (absence toilettage, hypoactivité, agressivité, trychophaghie, maigreur, hypo-réactivité, comportement de fuite, automutilation). Nous n’avons actuellement pas de recul sur les effets indésirables liés à la transplantation de matières fécales de personne âgée fragiles sur des rats. Les individus donneurs n’étaient pas porteurs de pathologie transmissible. Nous pouvons imaginer que les conséquences sur le rat se limiteront à une diminution de l’efficience des métabolismes protéique et énergétique et à la mise en place d’une inflammation chronique de bas grade.
Devenir
Dix animaux seront gardés en vie et placés à l'adoption. Les autres animaux seront mis à mort pour prélèvements sanguins nécessaires à la caractérisation de leur état physiologique.
Remplacement
La présente étude vise à comprendre les mécanismes complexes d’interaction entre le microbiote intestinal et l’hôte, son implantation chez le modèle rongeur et l’impact de différents microbiotes sur le métabolisme et l’immunité des animaux au niveau corporel d’une part et au niveau de tissus et organes spécifiques d’autre part. Ainsi, aucune méthode in vitro n’existe à ce jour permettant d’évaluer l’impact de ces microbiotes variés sur le métabolisme et l’immunité des rongeurs. Les mécanismes sous-jacents étant par ailleurs non entièrement élucidés, et l’interaction microbiote-hôte, dans le cadre du vieillissement, peu étudiée, il est difficile de pouvoir identifier des cibles prioritaires et donc un modèle in vitro fiable pour caractériser les interactions hôte-microbiote.
Réduction
Nous avons raisonné le nombre d’animaux selon une étude statistique permettant à la fois de mettre en évidence les potentiels effets des transferts de microbiote tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. La mesure de la masse musculaire, des activités enzymatiques, des paramètres biochimiques (insuline et glucose en particulier) et de l’expression de gènes dans divers tissus représentent une part importante des analyses que nous allons réaliser. Cette analyse détermine que 15 animaux minimum sont nécessaires pour obtenir une différence significative entre les lots en prévoyant une possible perte de quelques animaux au cours de leur vieillissement. Par ailleurs, l’espérance de vie de cette souche de rat étant de 24 mois, nous ne pouvons pas exclure que quelques animaux puissent mourir naturellement durant notre protocole expérimental. En effet, nous achetons les rats à 12-13 mois et les faisons « vieillir » jusqu’à 18 mois dans nos installations pour des raisons de disponibilité auprès des fournisseurs et pour éviter le transport d’animaux âgés (plus sensibles à ce type de stress) et afin qu’ils s’adaptent au mieux à nos locaux avant l’étude. Les échantillons obtenus sur les animaux seront mutualisés entre plusieurs laboratoires. L’objectif est d’avoir une vue la plus complète possible du transfert du microbiote sur un panel le plus large possible de paramètres physiologiques, métaboliques et immunitaires des rats. Par ailleurs, des animaux « tests » seront utilisés au début de l’étude pour permettre un transfert de compétences entre 2 partenaires (notamment la réalisation des tests de tolérance au glucose) et éviter ainsi la duplication de l’étude.
Raffinement
Trois semaines avant la procédure, les animaux passeront de deux à un par cage car un suivi quotidien de leur consommation alimentaire individuelle est nécessaire. Nous avons besoin de faire un pair-feeding (PF). Les rats PF recevront une ration inférieure à leur ingéré spontané : à plusieurs par cage, le dominant mangera plus et laissera les restes aux autres. Aussi, la baisse de consommation d’un animal nous alerte rapidement sur son état de santé/stress. Les cages seront conformes à la réglementation (1800 cm3), transparentes placées côte à côte afin qu’ils puissent se voir, s’entendre et se sentir et nous inclurons des enrichissements (bâtons à ronger, matériel pour la nidification, maisons). Les animaux seront pesés tous les jours et seront observés 7j/7 par des animaliers expérimentés. En cas d’apparition d’un point limite, l’animalier alertera les responsables de l’étude qui observeront l’animal et renseigneront le tableau des points limites. Si 3 points notables (réversibles) ou 1 point grave (irréversible) sont observés, selon les symptômes et l’arbre décisionnel, il pourra être apporté à l'animal des soins (nettoyage de plaie, prise d’antalgique, d’anti-inflammatoire). Si blessures, souffrance et stress ne peuvent être soulagés, l’animal sera euthanasié par inhalation de CO2. Les sondes de gavages sont fines (diamètre externe de 2,5 millimètres), à bords arrondis et adaptées (8cm) pour empêcher les blessures et réduire l’inconfort. De plus, les animaux seront entrainés aux manipulations pour réduire le stress et améliorer le bien-être. Pour les gavages, ils seront habitués à être maintenus en contention et à voir une seringue arriver au niveau de leur bouche. Aussi, la sonde leur sera présentée plusieurs fois avant utilisation. Suite au traitement PEG, les animaux auront une forte diarrhée, une surveillance accrue sera mise en place durant les 2 jours suivant le traitement. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution saline sera réalisée. Pour les prélèvements de sang dans la veine caudale, un anesthésique local, la lidocaïne, sera utilisé pour anesthésier la zone de piqure. Les prélèvements seront réalisés par un manipulateur formé et expérimenté. Les animaux seront habitués à être maintenus en contention et à être manipulés afin de réduire le stress. Pour le prélèvement de sang terminal, les animaux recevront un traitement analgésique par injection sous-cutanée puis seront anesthésiés par voie gazeuse.
Choix des espèces
La présente étude vise à montrer l’impact d’un microbiote humain de jeune adulte, d’adulte âgé en bonne santé ou d’adulte âgé fragile, sur le métabolisme et l’immunité du receveur, le rat. Dans ce domaine, de nombreuses études ont prouvé l’intérêt de ce modèle rat pour appréhender le rôle causal du microbiote dans le développement de pathologies chroniques chez l’humain (ex : diabète, obésité). Le rongeur est ainsi le modèle animal le plus utilisé pour tester l’effet global d’un transfert de microbiote sur le métabolisme corporel et tissulaire. Le rat WISTAR est une lignée non consanguine polyvalente utilisée dans toutes les disciplines de la recherche médicale et biologique. Sa longévité ainsi que sa pathologie tumorale en font un modèle de choix pour les études à long terme, notamment pour les études de vieillissement. C’est un rat albinos de manipulation aisée et réceptif aux entrainements aux manipulations. Par ailleurs, la lignée de rat Wistar a été utilisée dans de nombreux travaux des participants au projet présenté dans la saisine, dans le cadre d’études sur le vieillissement et les métabolismes impactés. L’étude concerne le vieillissement. Les animaux que nous utiliserons, au moment de l’expérimentation, seront donc des animaux âgés de 18 mois minimum ce qui correspond à 60 ans en age humain chez cette lignée, âge à partir duquel on considère qu’une personne est âgée selon l’OMS. Les rats seront achetés à 13-14 mois et nous les laissons « vieillir » dans nos installations pour des raisons de disponibilité auprès des fournisseurs, d’évitement d’un transport d’animaux âgés (plus sensibles à ce type de stress) et afin qu’ils s’adaptent au mieux à nos locaux avant l’étude.
Rôle de la signalisation de TSLP dans le mélanome et l’immunothérapie
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intradermique de cellules tumorales sous anesthésie puis, trois fois par semaine pendant trois semaines, un traitement de l'oreille qui provoque une inflammation cutanée, développant une tumeur locale et des métastases dans les ganglions avant la mise à mort. Le porteur décrit cette dermatite induite, épaississement, rougeur et desquamation de l'oreille. Il indique que les cibles ont d'abord été identifiées in vitro et in silico, mais présente l'expérimentation in vivo comme "nécessaire" pour comprendre une réponse immunitaire impliquant plusieurs organes.
Objectifs
Le mélanome est une tumeur du système pigmentaire de la peau. Il apparait souvent sous la forme d’une tache pigmentée pour ensuite évoluer en métastases, en faisant un cancer très agressif. Normalement, notre système immunitaire nous protège des cancers en éliminant les cellules cancéreuses. Cependant, ces cellules tumorales peuvent bloquer notre système immunitaire, conduisant donc à la progression de la tumeur, ce qui impacte négativement le pronostic des patients atteints de mélanome. Les mécanismes mis en place par les cellules cancéreuses et qui stoppent notre système immunitaire sont à ce jour mal connus. Le projet vise donc à déterminer ces facteurs, dans le but d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour améliorer les traitements actuels qui restent peu efficaces dans le cadre du mélanome. Nous nous intéressons particulièrement à une molécule qui est connue pour moduler la réponse immunitaire, et qui est associée à un mauvais pronostic dans les cancers du pancréas et sein. Il a été suggéré que cette molécule pourrait aussi être associée au mélanome. L’objectif du projet est donc d’identifier le rôle de cette molécule dans la progression du mélanome, et de déterminer via quels mécanismes cette molécule induit la croissance tumorale. De plus, nous évaluerons l’effet de son blocage thérapeutique, en combinaison avec des thérapies déjà existantes mais peu efficaces pour voir si cela améliore le traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les signaux et cellules impliquées dans la réponse immunitaire et la croissance tumorale au cours du mélanome. Ceci permettra l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, lesquelles seront testées pour déterminer si leur blocage pourrait être un traitement potentiel en clinique pour améliorer la qualité de vie et survie des patients atteints de mélanome.
Procédures
258 souris seront anesthésiées et injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée: 5min x 9 traitements = 45min). La durée totale de la procédure par souris est de 51minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 48 souris seront injectées par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires (durée: 12min). Par la suite, ces 48 souris seront anesthésiées puis injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Enfin, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée : 5min x 9 traitements : 45min). La durée totale de la procédure est de 63 minutes. Lors de la troisième partie du projet, 126 souris seront anesthésiées puis injectées en intradermique avec des cellules tumorales (durée: 6min). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés et traités 3 fois par semaine pendant 3 semaines avec un analogue de la vitamine D sur l’oreille (durée : 5min x 9 traitements : 45min). Ces souris seront ensuite injectées par voie intra-péritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée: 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30). La durée totale de la procédure par souris est de 52 minutes 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux inoculés avec des cellules tumorales développeront une tumeur au niveau locale et des métastases au niveau des ganglions lymphatiques. Le traitement des oreilles des animaux par l'analogue de la vitamine D induira une légère inflammation de type dermatite atopique au fur et à mesure du traitement, se caractérisant par une épaisseur, rougeur et desquamation de l’oreille. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, les animaux seront euthanasiés pour étudier la réponse immunitaire impliquée dans la croissance tumorale, à savoir 432 animaux.
Remplacement
Les cibles (cellules et récepteurs) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de progression tumorale.
Réduction
Ces souris seront utilisées afin d’étudier le rôle de la signalisation de la cytokines étudiée dans la progression du mélanome. Nous réaliserons une expérience pilote sur la réponse des différentes lignées cellulaires injectées en intradermique pour explorer de manière étendue les différentes interactions présentes au niveau du microenvironnement tumoral. La 1ère expérience pilote permettra de choisir la lignée qui fera l’objet des expérimentations du projet. La 2ème expérience pilote nous permettra de définir la dose d'anticorps bloquants à injecter. Dans un but de réduction du nombre de souris utilisées dans ce projet, l'oreille droite sera traitée avec l'analogue de la vitamine D alors que l'oreille gauche, servant de contrôle, sera traitée avec de l'éthanol. Les groupes comporteront 12 souris (paramètres étudiés : fréquence des cellules T et croissance tumorale), ce qui permettra d’avoir des résultats statistiquement interprétables selon les paramètres étudiés à l’aide d’un test statistique.
Raffinement
La greffe tumorale par le biais d’injection intradermique, le traitement topique avec du MC903 et la prise de photos nécessitent une anesthésie gazeuse légère (2.5% d’isoflurane) de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. Le nid sera retiré lors des traitements, mais sera remis dès la fin des traitements. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la progression tumorale (prise de photos, mesure de la taille de la tumeur à l’aide d’un pied à coulisse) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Les points limites, précis et gradés pour chacune des procédures expérimentales sont définis en fonction de la grille d’évaluation de la douleur que nous avons mis en place. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de tumeurs qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale des tumeurs de 5mm sur les oreilles, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement ou peau percée au-dessus de la tumeur.
Choix des espèces
La réponse immunitaire dans le contexte tumoral met en jeu différents organes comme la peau et les ganglions lymphatiques, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réaction. Le modèle animal choisi pour étudier le mélanome est la souris car son système immunitaire est proche de celui de l'Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. De plus, la peau des souris présente des similitudes avec la peau humaine, rendant ce modèle pertinent pour l'étude du mélanome. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines de vie afin d'étudier le système immunitaire à l'âge adulte.